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小腸オリゴペプチド輸送体の組織及び細胞内分布の免疫化学的解析と薬物輸送特性
No full text1.オリゴペプチド輸送担体cDNAクローン(PepT1)の薬物輸送能の検討
PepT1 cRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に微注入しその遺伝子産物の輸送活性を、ceftibuten及びcefadroxilをモデル基質として測定した結果、両薬物ともジペプチド[^C]GlySarと同様の輸送を示した。このことから本輸送担体がβ-ラクタム抗生物質をも基質として受け入れ輸送することが明らかとなった。また[^C]GlySarとceftibuten及びcefadroxilとは共存により相互に阻害が見られたことから、これらが全て同一の認識部位を介して輸送されてることが示された。PepT1の翻訳開始領域付近に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて小腸の全mRNAにより発現する輸送に対する阻害効果を検討した結果、ほぼバックグランドレベルまで抑制された。ことから、上記薬物の消化管吸収が本輸送担体によってほぼ説明できることも示すことが出来た。
2.PepT1の小腸上皮細胞における細胞内局在性および組織間分布の検討
PepT1のカルボキシ末端部分のペプチドを合成、免疫しポリクローナル抗体(anti-PepT1/C)を得ることが出来た。この抗体を用いて、刷子縁膜及び側基底膜のWestern解析、また小腸その他の臓器の組織切片固定標本に対して免疫組織染色を行い、光学顕微鏡及び電子顕微鏡レベルで観察した結果、PepT1が小腸上皮細胞の刷子縁膜にのみ局在する事を明らかにすることが出来た。
3.以上の結果からオリゴペプチド輸送担体として単離したcDNAクローンPepT1がβ-ラクタム抗生物質に対しても輸送活性を持ち、小腸上皮細胞の刷子縁膜に局在し、薬物の消化管からの吸収に寄与していることを実証することが出来た。研究課題/領域番号:08772166, 研究期間(年度):1996出典：研究課題「小腸オリゴペプチド輸送体の組織及び細胞内分布の免疫化学的解析と薬物輸送特性」課題番号08772166
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-08772166/）を加工して作成金沢大学医薬保健研究域薬学系research repor
小腸モノカルボン酸輸送体の組織及び細胞内分布の免疫化学的解析と薬物輸送の分子機構
No full text・MCT1のカルボキシ末端16アミノ酸残基に対する特異抗体(anti-MCT1/C16)を調製することに成功した。Anti-MCT1/C16は、既にMCT1タンパク質の存在が明らかなラット赤血球及び心臓の膜画分に対しても交差反応を示した。
・研究代表者らがこれまでモノカルボン酸の輸送実験に用いてきたラット空腸刷子縁膜(BBM)小胞をCa^沈殿法により調製し、Western解析を行ったところ、MCT1と考えられる約42kDaのタンパク質を検出することができた。
・このことから、膜小胞を用いた輸送実験で観察されたモノカルボン酸輸送にMCT1が関与していたことが示唆された。
・免疫組織化学的手法を用いたラット消化管各部におけるMCT1の臓器分布と細胞内局在性の検討を行ったところ、消化管全体を通したMCT1の分布は、胃、小腸の一部、盲腸、結腸で多く、空腸、回腸では相対的に少ないことが明らかとなった。
・MCT1はすべての臓器で、主に未分化な細胞の側基底膜(BLM)側に多い傾向がみられたことから、未分化な細胞の分化に必要なエネルギーを積極的に取り入れるのに機能していることが考えられた。また、盲腸と結腸ではそれ以外の細胞のBLM側にもみられた。下部消化管に棲息する嫌気性細菌は未消化食物や分泌液、脱落した上皮細胞に含まれる糖質を嫌気的に分解して増殖のためのエネルギーを得るが、その代償として主に酢酸、プロピオン酸、酪酸なだの短鎖脂肪酸が管腔内に蓄積することが知られており、このことと、深く関係しているのではないかと思われた。また、空腸に着目するとcryptでは根元付近のBLMに強くみられ、絨毛部では微絨毛にはMCT1がはっきりとは存在せず側膜上部、特にtight junction直下に、強くみられた。
・以上の結果とMCT1がプロトン共輸送により駆動されることを考えあわせることにより、本輸送担体が消化管管腔内からのモノカルボン酸系薬物の吸収に関与する可能性が示唆された。研究課題/領域番号:09771974, 研究期間(年度):1997 – 1998出典：「小腸モノカルボン酸輸送体の組織及び細胞内分布の免疫化学的解析と薬物輸送の分子機構」研究成果報告書 課題番号09771974
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-09771974/)を加工して作成金沢大学医薬保健研究域薬学系research repor
ペプチドトランスポーターを利用した腫瘍特異的抗がん剤デリバリー
No full text本研究は、正常組織においてはその発現が小腸および腎臓の上皮細胞刷子縁膜に局在するオリゴペプチドトランスポーターを分子標的とした腫瘍特異的な抗がん薬の送達が可能であるかを検証することを目的として検討を行った。
そこで、ヒト肺、乳腺、胃、結腸、膵臓、膀胱、子宮頸部、皮膚、骨あるいは白血球、リンパ球に由来する各種株化腫瘍細胞を培養後、全RNAを調製し、Super Script II Reverse TranscriptaseおよびOligo dT primerを用いてcDNAを合成した。得られたcDNAを用いてLight Cycler(Roche Diagnostics)によりリアルタイム定量PCR解析を行った。その結果、既知の代表的なオリゴペプチドトランスポーターであるPEPT1の発現量は白血病細胞由来ML-1細胞で最も高く、次いでNakajimaおよびCaco2に顕著な発現が見られた。PEPT2は殆どの細胞に発現が見られた。これらペプチドトランスポーターの発現量を放射性標識グリシルザルコシンおよびベスタチンの取り込み活性と比較した結果、トラスポーター発現量と輸送活性とが必ずしも一致しないことから、新規のペプチドトランスポーターの存在が示唆された。ヒトゲノムデータベースに対して検索を行ったところ、PEPT1およびPEPT2に相同性を持つトランスポーター様の構造を有する新規遺伝子PEP3の存在が認められたことから、この分子がん細胞に発現する第3のペプチドトランスポーターである可能性が考えられた。
これまでの研究成果をふまえて、今後は例えば、PEPT1をin vivoでの発現効率が高いアデノウイルスベクターを用いて、in vivoで本来PEPT1を発現しない臓器に強制発現することにより新たな輸送機能を発現させ、その基質となる薬物の体内動態を能動的に制御する等、薬効標的部位におけるトランスポーターの発現を積極的に制御することによる新たな能動的薬物動態制御法の樹立を目指す必要があるものと考えられる。研究課題/領域番号:12771460, 研究期間(年度):2000-2001出典：「ペプチドトランスポーターを利用した腫瘍特異的抗がん剤デリバリー」研究成果報告書 課題番号 12771460（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12771460/)を加工して作成金沢大学理工研究域research repor
共焦点レーザー顕微鏡を用いたペプチドの細胞内動態解析と脳実質細胞標的化への応用
No full text脳毛細血管内皮細胞の吸着介在型エンドサイトーシス(AME)機構を利用したペプチドの脳内送達を目指して、蛍光標識した合成塩基性テトラペプチド(H-MeTyr-Arg-MeArg-D-Leu-CONH(CH_2)_8NH_2、NBD-C-001-C8)をモデル化合物として、培養脳毛細血管内皮細胞における細胞内動態を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析した。更に放射性標識ペプチドを用いて定量的な実験も併せて行った。その結果、
1.NBD-C-001-C8の細胞への内在化(取り込み)過程を、共焦点レーザー顕微鏡によって得られる光学的断層像について経時的に形態観察を行ったところ、細胞内にエンドサイトーシスを示す顕著な顆粒状染色が見られ、細胞表面吸着と細胞内移行とが分別可能であることがわかった。
2.蛍光標識された顆粒は、取り込み約10分から30分にかけてluminalからanti-luminal方向へと経時的に深部へと移行した。このことは、画像解析によりその蛍光強度を定量化することによっても確認され、確かにペプチドの細胞への内在化が進行していることを実証することに成功した。
3.ペプチドの内在化はプロタミン、ダンシルカダベリン等により阻害され、AMEによる内在化であることが示された。
4.細胞の糖鎖選択的消化酵素処理により細胞表面の吸着サイトとしてヘパラン硫酸の関与が示唆された。
5.以上の結果は放射標識ペプチド([^I]001-C8)を用いた定量実験の結果と良い一致を示した。
これらにより、脳毛細血管内皮細胞のAME機構を蛍光標識体を用いた形態的観察、及び放射性標識体を用いた定量実験それぞれの結果により実証することに成功した。本研究の成果は、これまで困難であったペプチド性医薬品の脳送達が、分子に適当なカチオン性修飾を施すことにより可能になることを示すものと考えられる。研究課題/領域番号:07772237, 研究期間(年度):1995出典：研究課題「共焦点レーザー顕微鏡を用いたペプチドの細胞内動態解析と脳実質細胞標的化への応用」課題番号07772237
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-07772237/）を加工して作成金沢大学薬学部research repor
トランスポーター発現アデノウイルスベクターを用いたペプチド様抗がん剤の脳腫瘍送達
No full text本研究は、ペプチド様抗がん剤の脳移行障壁となっている血液脳関門にペプチドトランスポーターであるhPEPT1を発現させ、抗がん剤の脳移行性を向上させることを目的として、ペプチド性抗がん剤を輸送するhPEPT1と黄色蛍光タンパク質とのキメラ化タンパク質を発現するアデノウイルスベクターAdhPEPT1-EYFPを作製した。AdhPEPT1-EYFPによるhPEPT1のペプチド輸送活性のin vitroでの発現を、研究代表者等がこれまでに不死化、樹立したラット脳毛細血管内皮細胞RBEC1を用いて[^3H]グリシルサルコシンを基質に検討した。その結果、AdhPEPT1-EYFPを感染させたRBEC1で、経時的な[^3H]グリシルサルコシン取込みの上昇がウイルスの用量依存的に見られた。AdhPEPT1-EYFP感染細胞による[^3H]グリシルサルコシン取り込みには、hPEPT1の特徴pH依存性および10mM非標識グリシルサルコシンによる阻害がみられた。RBEC1細胞におけるhPEPT1-EYFPキメラ遺伝子のmRNAレベルでの発現は、RT-PCR法により確認した。発現したhPEPT1-EYFPキメラタンパク質の細胞膜への発現は蛍光顕微鏡を用いて確認した。正常細胞である初代培養脳毛細血管内皮細胞を用いても検討を行ったが、RBEC1と同様な結果が得られた。hPEPT1-EYFPのin vitroでの発現が確認できたことから、in vivo発現についても予備的な検討を行った。Takasato等の方法に従い、ラットの内径動脈にAdhPEPT1-EYFPウイルス溶液を灌流し感染を行った。本実験は手術法が複雑であることから、手術が成功した2例についてのみ感染動物を2日間飼育した後、Oldendolfに従ってbrain uptake index法によりペプチド脳移行性の検討を試みた。その結果、[^3H]カルノシンの脳移行性は非感染動物と比べて上昇する傾向がみられた。以上、本ベクターを用いることによって、in vivoでhPEPT1機能を誘導できる可能性が示された。また、がん細胞での発現が認められるOCTNおよびOATPトランスポーターの検討も行った。研究課題/領域番号:12217054, 研究期間(年度):2000出典：研究課題「トランスポーター発現アデノウイルスベクターを用いたペプチド様抗がん剤の脳腫瘍送達」課題番号12217054
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12217054/）を加工して作成金沢大学大学院・自然科学研究科research repor
BBB指向性トランスポーター発現アデノウイルスベクターを用いた抗がん剤脳腫瘍送達
No full text中枢へ抗がん剤を送達するためには、その移行障壁となる血液脳関門(BBB)を克服する必要がある。そこで本研究では、脳腫瘍に焦点をあて、ペプチドトランスポーターをBBBに発現させることにより、ペプチド様抗がん剤を選択的に送達することを目的として以下の検討を行った。
1.ペプチド性抗がん剤を輸送するオリゴペプチドトランスポーターhPEPT1を発現するアデノウイルスベクターAdhPEPT1-EYFPを作製し、血液脳関門におけるペプチド輸送機能発現を株化細胞RBEC1を用いてin vitroで確認した。AdhPEPT1-EYFPの感染効率はその他の培養細胞と比較してあまり高いものではなかったが、放射性標識カルノシンを基質とした輸送活性はGFP発現アデノウイルス感染細胞あるいは非感染細胞と比較して、約10倍程度の取り込み上昇が見られた。
2.In vivoでの輸送機能発現を検討するに当たって、まずは感染効率の高い肝臓を用いてin vivoでの外来オリゴペプチドトランスポーター導入により、どの程度のペプチド化合物の組織移行性向上が見られるかを検討した。マウスにAdhPEPT1-EYFPを静脈投与し、hPEPT1-EYFPの発現をRT-PCRならびにWestern blot、凍結切片の免疫染色により検討したところ、いずれの実験によってもhPEPT1-EYFPの発現が確認された。そこで、AdhPEPT1-EYFPに感染したマウスにカルノシンを静脈内投与して、30分後に肝臓への組織移行性を評価したところ、カルノシンのKp値は約7倍に増大した。このことから本ベクターを用いてin vivoにおいても臓器レベルでペプチド輸送活性を有効に付与できることが示された。一般に脳移行性の低い化合物について同様の検討を行った場合、例えば細胞間隙にのみ分布するイヌリンを用いて測定すると、約0.2程度の値がえられる。このことから、もし仮にAdhPEPT1-EYFPによる脳毛細血管内皮細胞への発現効率が肝臓の35分の1以上であるとするならば、血液脳関門においても何らかの輸送活性が検出できる可能性が考えられた。研究課題/領域番号:13218052, 研究期間(年度):2001出典：「BBB指向性トランスポーター発現アデノウイルスベクターを用いた抗がん剤脳腫瘍送達」研究成果報告書 課題番号13218052
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-13218052/)を加工して作成金沢大学理工研究域research repor
Regulatory role of ezrin on transportsome at the blood placenta barrier
No full text胎盤関門の物質輸送を担うトランスポータータンパク質複合体の制御因子としてエズリンの役割を解明することを目的とした。胎盤関門細胞株TR-TBTsや妊娠ラット、エズリン遺伝子欠損マウスを用いて研究を行ったところ、エズリンは合胞体性栄養膜細胞の母体血側細胞膜の裏打ちタンパク質として妊娠経過に伴う胎盤の成熟と共に時期特異的に発現し、ヒポタウリン輸送系(Slc6a13)やその他の輸送系を細胞膜へ局在化させる機能を担うとともに機能調節因子として働くことが示唆された。This study was aimed to clarify the regulatory role of ezrin on transporter complex (transportsome) at the placenta barrier. Our study using syncytiotrophoblast cell line TR-TBTs, pregnant rats as well as knockout mice lacking ezrin, scaffold protein that links membrane proteins to the cortical actin, have suggested that ezrin is located at the apical membrane of syncytiotrophoblasts during the course of pregnancy and works as a functional regulator in the transportsome containing a hypotaurin transporter Slc6a13.研究課題/領域番号:20590158, 研究期間(年度):2008– 2010出典：研究課題「胎盤関門のダイナミクスを制御するトランスポーター-エズリン複合体」課題番号20590158
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-20590158/20590158seika/）を加工して作成金沢大学附属病院research repor
Clinical pharmacokinetic study for management of drug side effects
No full textラット及びヒト肝細胞を用いたゲムシタビンの取り込み実験やラットの肝潅流実験、ヒト試験により、800 mg/SLV以下の投与量では、クレオシドトランスポーターENT2を介した低親和性の肝取り込みの飽和が回避でき、膵癌肝転移に対する術後肝動注化学療法が早期に開始できる可能性が示された。また、腎機能低下患者における抗MRSA薬リネゾリドの体内動態と血小板減少に関しては、リネゾリドおよび代謝物の血中濃度がともに腎機能障害が高度になるほど上昇し、血小板減少率も上昇する傾向が確認できた。さらに、経腸栄養剤長期投与によって小腸や肝臓のトランスポーターや代謝酵素の発現が変動することが示された。We investigated hepatic uptake of gemcitabine (GEM) in rat and human. The uptake mechanism involved high- and low-affinity saturable components with Km values of micromolar and millimolar order, respectively. Our results suggested that the hepatic extraction of GEM is predominantly mediated by the low-affinity nucleoside transporter ENT2 at clinically relevant hepatic concentrations of GEM, the uptake would not be completely saturated. This is critical for hepatic arterial infusion (HAI), because saturation of hepatic uptake would result in a marked increase of GEM concentration, abrogating the advantage of HAI over i.v. administration in terms of severe adverse events. We investigated pharmacokinetics of linezorid (LZD) in rat and human. The incidence of thrombopenia was increased according to the increase of plasma concentration of LZD. We also found that long-term enteral nutrition affected that the expression of transporters and metabolic enzymes in the liver and small intestine.研究課題/領域番号:23590173, 研究期間(年度):2011-04-28 – 2015-03-31出典：研究課題「副作用マネジメントと毒性回避のための臨床薬物動態研究出」課題番号23590173
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-23590173/23590173seika/)を加工して作成金沢大学附属病院research repor
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
No full textThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
- …
