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膜電位依存性カリウムMチャネルの遺伝子クローニング
Full text link交換神経節細胞等でアセチルコリンはムスカリン性受容体を刺激し、緩除な興奮性シナプス(slow EPSP)を生じる。我々は、ムスカリン性受容体刺激によりMと呼ばれる膜電位依存性カリウム(K)チャンネルの制御機構について、研究してきたが、正確な制御メカニズムが未だ理解されていない。Mカリウムチャンネルの制御機構を知る目的を果たすために、Kチャンネルの遺伝子をとり、アミノ酸配列により、考えられるイオンポアの特性を推定し、制御機構例えばどういうキナーゼによるリン酸化があり得るかを推定することにした。RANソースとしてニューロブラストーマNG108-15細胞を培養した。RNAをアフリカツメガエカル卵母細胞に分注し、2〜5日培養する。膜電位を-80mVに固定し、約1分脱分極刺激を加え、Mチャンネルの開口によるる外向き電流を記録した。あるいは電位を-30mVに固定し-60mVへのステップをかけ、Mチャンネルの閉口による内向き電流を測定した。その結果、Mチャンネルをコードするクローンをひろうことは難しいことが判明した。そこで、抑制クローニングを用いることとし、小脳よりンチャネルのような不活化しないでんりゅうに関与するクローンを拾った。そのcDNAは、474個のアミノ酸をコードするもので、膜を12回貫通する構造をもつことがわかった。酵母や線虫のゲノム計画でみつかったももと20-35%の相同性をもっていたが、ほ乳類では知られていない新規のたんぱく質であった。このたんぱく質を卵母細胞に発現したところ、それ自身では電流を通さなかった。今後このたんぱく質の性質を詳しく調べるつもりである。研究課題/領域番号:09257219, 研究期間(年度):1997出典：研究課題「膜電位依存性カリウムMチャネルの遺伝子クローニング 」課題番号09257219
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09257219/）を加工して作成金沢大学医学部research repor
イノシト-ルリン脂質代謝産物によるK+チャンネルの制御機構
Full text link1.アセチ-ルコリンを、伝達物質とするニュ-ロブラスト-マ由来NG108-15細胞を培養した。
2.NG108-15細胞を、マウス胎児後肢横紋筋細胞の上に培養(co-culture)した。
3.NG108-15細胞、筋細胞両方に、ガラス微小電極を刺入し膜電位の測定を行った。
シナプスス反応(M.E.P.P.S)を記録し、NG108-15細胞がアセチ-ルコリンを放出し、筋細胞がそのアセチ-ルコリンに反応している事を確認した。
4.NG108ー15細胞に、さらにもう1本、IP_3を充めたガラス管を刺入し、電気泳動的に細胞内にIP_3を注入し、その際、シナプス反応が増加することを確認した。
5.IP_3によるシナプス反応の増加(プレシナブスファシリテ-ション)が、細胞外液中のCaによらないものである事を確認するため、IP_3注入時のシナプス反応促進を、Ca^フリ-条件下やCaブロッカ-であるニフェジピンやBa^存在下で測定した。
6.以上、IP_3注入時に生じるファシリテ-ションはプレシナプス膜の過分極でもなく、また細胞外から流入するCaでもないことを確認した。研究課題/領域番号:01641512, 研究期間(年度):1989出典：研究課題「イノシト-ルリン脂質代謝産物によるK+チャンネルの制御機構」課題番号01641512
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-01641512/）を加工して作成金沢大学医学部research repor
Aキナーゼアンカータンパク(AKAP)依存的シナプス後電位: 終止の分子メカニズム
Full text link中枢、末梢神経の受容体刺激による膜興奮性変調に関与するシナプス電位のうちでも、特にslow EPSPの発生機序の解明は短期記憶のメカニズムを考える上で重要である。しかし、長らく未解決のままであった。この課題に対し、申請者らは、上頚神経節神経細胞の電位依存性カリウムチャネルであるM(KCNQ2/3)チャネルのムスカリン性アセチルコリン受容体刺激による電流抑制のシグナル伝達経路でのAKAP150の役割を解析してきた。
今回、アセチルコリンにより活性化されるポストシナプス側でのムスカリン受容体反応での分子メカニズムを理解し、この知識を痴呆症の治療に役立てるため、Mチャンネルの受容体による抑制機序の解明と、そこに関わるAKAP依存的シグナル伝達の解明をし、記憶、学習の分子基盤として新しい視点を提供することとした。
KCNQ2/3チャンネルのアミノ酸配列上PKCによるリン酸化サイトは12ケ所(セリンの7ヶ所とスレオニンの5ヶ所)あり、カルチニューリンが(PKC依存的な)セリンのリン酸を脱リン酸化するか否かをアラニン置換(アラニンスキャンニング)で検討し、PKCとカルチニューリンとKCNQチャンネルの相互作用部位を確定した。その部位での脱リン酸化を実験した。また、IQ配列の変異によるチャンネル抑制の変化を観察した。チャンネルのIQ部位のトリプトファンによる蛍光変化により、両者の親和性の強さ、Ca依存性を測定した。最後に、KCNQ抗体でプルダウンされる分子の中にムスカリン受容体とAKAPがが存在する事を見い出した。研究課題/領域番号:17024020, 研究期間(年度):2005出典：「Aキナーゼアンカータンパク(AKAP)依存的シナプス後電位: 終止の分子メカニズム」研究成果報告書 課題番号17024020
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17024020/)を加工して作成金沢大学医薬保健研究域医学系research repor
ニュ-ロブラスト-マ・グリオ-マ雑種細胞におけるシナプス形成・伝達機構
Full text link1.前年度の調査で、ジプチリ-ルcAMPやプロスタグランディンが効率よくシナプス形成を行う事を知り得たので、それらを用いてNG108-15筋スナプスを形成した。
2.イノシト-ル1,4,5三リン酸の細胞内注入。ホルボ-ルジプチレ-トとブラジキニンの細胞外からの投与によるシナプス伝達効率の変化を観察し、いずれも上昇させた。
3.細胞外と細胞内のCaの役割を、細胞外からのCaの流入を抑える条件下でシナプス伝達を調査した。
4.脳型(m1タイプ)のムスカリン性アセチ-ルコリン受容体遺伝子を、トランスフェクトしたNG108-BM8が、PI代謝を高める事を確認したので、それらの細胞相互間で、シナプス(ムスカリン性)結合が生じないかを調査したが結果はネガティブであった。研究課題/領域番号:01638508, 研究期間(年度):1989出典：研究課題「ニュ-ロブラスト-マ・グリオ-マ雑種細胞におけるシナプス形成・伝達機構」課題番号01638508
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
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コリン性シナプス形成の調節機構
Full text link研究課題/領域番号:57213010, 研究期間(年度):1982出典：研究課題「コリン性シナプス形成の調節機構」課題番号57213010
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
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ラット新生仔脳及びCD38ノックアウトマウス脳のADPリボシルシクラーゼの精製
Full text link細胞内のCaをセカンドメッセンジャーとするCaシグナリングは、数多くの受容体の下流に存在する重要な信号伝達機構の一つである。
T型リンパ球や脳にも存在するADPリボシルシクラーゼ活性の大部分はCD38抗原であることがわかってきた。しかし、脳内にはCD38以外の新しいADPリボシルシクラーゼ活性を持つ分子が存在することを考え、脳型ADPリボシルシクラーゼの精製を行うため、野性株マウス脳内のシクラーゼ活性を比較した。
(1)ジクラーゼ活性は、驚いた事に視床下部に高く、続いて小脳や下垂体後葉であった。
(2)CD38のメッセンジャーRNA発現を調査したところ、活性値の分布と同じであった。
(3)CD38ノックアウトマウスでは、シクラーゼ活性は極端に低く、視床下部でもほとんど活性やmRNAは検出できなかった。
(4)シクラーゼの酵素活性産物であるサイクリックADPリボース(cADPR)濃度は、野生型マウスに比して、CD38ノックアウトマウスでは低かった。
(5)視床下部に細胞外からcADPRを与えたところ、オキシトシンの分泌は見られたが、ノックアウトの視床下部からは検出できなかった。この事から、CD38がcADPRのトランスポート活性を有している事も判明した。(Nature 446,41-45,2007)
以上、脳型シクラーゼの90%がCD38である事を種々の方法で証明した。当初の目的のCD38以外のシクラーゼの精製は、非常に困難な課題である事が判明した。研究課題/領域番号:16650068, 研究期間(年度):2004 – 2006出典：「ラット新生仔脳及びCD38ノックアウトマウス脳のADPリボシルシクラーゼの精製」研究成果報告書 課題番号16650068
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16650068/)を加工して作成金沢大学医薬保健研究域医学系research repor
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
モノクローナル抗体および破傷風菌毒素によるカルシウムチャンネルの解析
Full text link研究課題/領域番号:58570034, 研究期間(年度):1983出典：研究課題「モノクローナル抗体および破傷風菌毒素によるカルシウムチャンネルの解析」課題番号58570034
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-58570034/）を加工して作成金沢大学がん研究所research repor
イノシトールリン脂質代謝産物によるK^+チャンネルの制御機構
Full text linkパッチクランプ電流測定法により、ブラジキニン(BK)が、細胞内セカンドメッセンジャーを使ってチャンネルを抑制している事を次のようにして証明した。
1.NG108-15神経腫瘍細胞をポリオルニチン塗布皿上に移し、1nMジブチリール cAMPを加え、2週間培養を続け、電気生理学的計測に好適な大きさの分化した細胞を育てた。
2.二段引き電極作製器で、先端径1〜2μmのガラス電極を作り、140mMKCIをつめ、細胞表面にタッチし、陰圧にした上で細胞表面膜と電極間に(ギガオーム)シールを施した。
3.電極電圧を+40mV(細胞膜電粒-80mV)にクランプ(保持)、約40pSのユニットコンダクタンスを持つチャンネル(NG108-15細胞におけるCa^-依存性-K^+チャンネル電流)をさがし出した。
4.この記憶状態で細胞外にBKを投与し(パッチ下の受容体を除く遠隔地の)BK受容体を刺激した所、開口チャンネル数および開口確率の上昇を観察した。以上の結果は細胞内伝達物質を介してBKのシグナルが40pSK^+チャンネルに伝わっている事を示している。研究課題/領域番号:63641510, 研究期間(年度):1988出典：研究課題「イノシトールリン脂質代謝産物によるK^+チャンネルの制御機構」課題番号63641510
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-63641510/）を加工して作成金沢大学医学部research repor
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