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Progetto di un ASIC per un dosimetro in diamante monocristallino
No full textIl progetto DIARAD dell’INFN (Istituto Nazionale di Fisica Nucleare) nasce dalla
cooperazione delle sezioni INFN delle Università di Roma Tre, Roma Tor Vergata
e dell’Università di Torino, al fine di realizzare un dosimetro costituito dall’elemento
sensibile in diamante e dall’elettronica di lettura integrata su silicio.
Nello specifico la sezione di Roma Tre si è occupata della progettazione elettronica, la
sezione di Tor Vergata dello sviluppo del sensore in diamante e la sezione di Torino di
effettuare misure sui primi esemplari del sensore.
Nel mio lavoro di dottorato mi sono occupato dello sviluppo di un ASIC (Application
Specific Integrated Circuit) atto ad integrare le correnti provenienti dal sensore in
diamante, nonché del progetto del banco di prova per eseguirne le verifiche funzionali.
Nella fase preliminare, in collaborazione con la sezione di Roma Tor Vergata, ho definito i
requisiti di progettazione in termini di intervallo di correnti, durata del tempo di integrazione
e numero di canali di acquisizione. Successivamente mi sono dedicato al progetto
dell’ASIC, partendo da una analisi della letteratura inerente per verificare quali tipi di canali
di acquisizione fossero più idonei per l’applicazione come dosimetro.
Ho definito due tipologie di elettronica di lettura, la prima dedicata all’acquisizione delle
correnti durante il funzionamento con dose tipica dei piani di trattamento (di norma 1 pA –
200 pA); la seconda l’ho invece progettata in modo da avere la possibilità di valutare
le correnti di buio del sensore (tipicamente minori di 1pA), al fine di poterne ottenere
una piena caratterizzazione anche senza l’ausilio di strumentazione esterna (elettrometri).
All’interno del circuito integrato ho previsto un generatore di corrente capace di generare
correnti dell’ordine delle centinaia di fA (1 _ 10ı15A), per poter verificare, in una prima fase
di test, il funzionamento dei canali di integrazione senza collegare il sensore in diamante
all’ASIC.
Per questo lavoro di dottorato ho utilizzato la tecnologia a 0.18um della UMC con cui ho
sviluppato tutte le librerie di componenti, sia analogici che digitali, necessarie allo sviluppo
di un ASIC: dalle singole porte logiche, agli operazionali e ai pad di ingresso/uscita.
Il design kit fornito dalla fonderia UMC non è pienamente integrato con l’ambiente
Cadence che ho utilizzato per la fase di progettazione e verifica, per cui mi sono occupato
dello sviluppo di uno script che consente di realizzare le simulazioni Montecarlo,
modificando e predisponendo automaticamente le netlist per l’avvio della simulazione.
Nel periodo di tempo necessario alla realizzazione fisica dell’ASIC da parte della fonderia,
mi sono dedicato allo sviluppo della scheda di test, realizzata con componenti elettronici
commerciali. Questa scheda di test, controllata da una FPGA di tipo Xilinx Spartan III è
capace di generare tutti i riferimenti ed i segnali di controllo necessari all’ASIC per il suo
corretto funzionamento.
Realizzata la scheda di test mi sono dedicato quindi allo sviluppo del programma
(firmware) dell’FPGA, progettato con una architettura del tipo a logica cablata. Per
acquisire i dati, tramite interfaccia USB, ho realizzato un applicativo in C++ completo di
interfaccia grafica e basato sulle librerie grafiche Qt4.2.
Tramite il banco di test così realizzato ho potuto effettuare le verifiche funzionali sull’ASIC,
che hanno avuto esito parzialmente positivo. Infatti, avendo previsto le protezioni contro le
scariche elettrostatiche anche sui pad di ingresso analogici e visti i livelli dei segnali in
corrente da dover analizzare, ho riscontrato che le piene funzionalità dell’ASIC sono
degradate quando i canali di acquisizione sono collegati al mondo esterno, mentre
risultano pienamente funzionanti e con comportamento conforme ai requisiti se lavorano
con i segnali di test generati all’interno dell’ASIC stesso.
Per questo motivo ho realizzato una seconda revisione del circuito, rimuovendo dai circuiti
analogici tutte le protezioni. Inoltre, prendendo spunto da questo problema, ho progettato
e aggiunto sullo stesso chip un circuito per correggere le correnti di perdita introdotte dai
dispositivi di protezione. Questo circuito è costituito da una rete di bilanciamento delle
protezioni stesse che è possibile regolare per mezzo di due DAC. Ho terminato quindi il
mio lavoro di dottorato inviando alla fonderia la seconda revisione dell’ASIC.
In base alla validità del progetto DIARAD, è stato richiesto ed ottenuto un finanziamento
PRIN con titolo di ricerca Dosimetri a base di diamante sintetico monocristallino per
applicazioni in radioterapia clinica
Diamond lumped elements and multi-fingers MESFETs
No full textImproving in growing large area polycrystalline diamond films by CVD process has highlighted the possibility of producing integrated circuits for specific applications.
In order to create a Monolithic Microwave Integrated Circuit (MMIC) based on diamond, we need to design and develop all fundamental components for this goal, from power active device to matching or polarization networks based on passive elements: inductors, capacitors and resistors.
For these reasons, during the doctorate research activity, we’ve designed and constructed multi-finger MESFETs, rectangular multi-turn inductors and square capacitors. To obtain these devices, we’ve developed and optimized the use of air-bridge technique and gold electroplating on polycrystalline diamond substrate with small dimensions (1 cm2). This technique is a standard process in GaAs and Si MMIC manufacturing, but it was never used before on diamond devices.
Multi-finger MESFETs were realized on H-terminated polycrystalline diamond. The adopted device structure is a typical coplanar multi-finger gate RF layout fabricated by optical photolithography except for gate realization which is performed by e-beam lithography. In this structure, Ti/Au source and drain ohmic contacts are realized by thermal evaporation. Device active area is then defined by reactive ion etching in oxygen and argon plasma, accomplishing at the same time electrical isolation among FET structures. It is worth to note that the isolation pattern was established in order to force the drain to source current flow underneath the gate, thereby avoiding parasitic resistance effects. I-shaped Al-gate electrode was defined by a single-layer e-beam lithography process in order to achieve different gate lengths (0.5, 1.0, 2.0, 4.0 μm) followed by e-beam evaporation.Referring to polycrystalline diamond inductors, we’ve constructed multi-turn devices with
conductor width W=20 μm, spacing between turns S=20 μm and inner diameter Di =100
μm, varying the number of turns n from 1.5 to 5.5. The innermost turn is connected to
other circuitry by using a conductor that passes under air-bridges.
Instead, for diamond capacitors, we’ve chosen the square configuration having the
following parameters: dielectric thickness d = 2 μm height, material dielectric constant εr =
2.6 (PMMA) and plates area that varies from 50x50 μm2 to 200x200 μm2.
We’ve simulated the frequency behavior [0-20 GHz] either of diamond inductors or
capacitors using the SONNET electromagnetic simulator. For inductors having W=S=20
μm and Di =100 μm, we expect inductance values from 0.66 nH (for 1,5 turns) to 9.3 nH
(for 5.5 turns) while for diamond capacitors with square configuration and d = 2 μm, εr =2.6
(PMMA) we expect capacitance values from 0.04 pF (for 50x50 μm2 area) to 0.52 pF (for
200x200 μm2area)
Paradigmi, modelli, teorie della mente : questioni di pedagogia tra formazione e traduzione
No full textL’approccio della Grounded Theory applicato alla valutazione della qualità delle interazioni on line in un contesto universitario
No full textRoma, i papi e il vicario dalla grande guerra alla crisi del '31
No full textLa tesi di dottorato verte sul governo ecclesiastico di Roma dal 1914 al 1931. I papi che si susseguono in questo arco storico sono due, Benedetto XV e Pio XI, il primo per l’intero periodo del suo pontificato, dal ’14 al ’22, il secondo soltanto per la prima parte, quella che si conclude sostanzialmente con la svolta contraddistinta da alcuni eventi vicini e collegati tra loro: la firma dei Patti Lateranensi (febbraio 1929), il passaggio di consegne alla Segreteria di stato vaticana tra il card. Gasparri e il card. Pacelli (febbraio 1930), la nomina del card. Marchetti a presidente dell’Opera per la preservazione della fede e per la provvista di nuove chiese in Roma (agosto 1930) e infine la morte, prossima alla nota crisi nei rapporti tra Chiesa cattolica e regime fascista, del card. vicario Basilio Pompilj (maggio 1931). L’arco temporale della ricerca copre in effetti l’intero svolgimento della funzione di vicario del papa per il governo della diocesi di Roma da parte della stessa persona, il suddetto card. Pompilj,
All’inizio del periodo il Vicariato vive una certa crisi di rapporti con la cittadinanza e l’autorità pubblica, incline a non dare spazio a manifestazioni pubbliche della fede. Al termine dello stesso periodo, invece, la comunità cristiana sembra poter contare sulla quasi totalità dei romani, esprimendosi secondo modalità estremamente visibili e coinvolgenti l’intera città. Il momento di svolta viene individuato nel triennio successivo alla guerra, dal ’19 al ’21. Durante la guerra infatti l’azione dell’autorità ecclesiastica non riesce a discostarsi dall’assistenza alla popolazione colpita. Immediatamente dopo gli eventi bellici, invece, viene attuato uno slancio di attività fondato sulla collegialità sacerdotale e sul coinvolgimento di tutte le associazioni cattoliche che prende avvio da un piano consapevole di cui sono responsabili principali sia Benedetto XV sia il gruppo dirigente del Vicariato in evidente ed efficace sinergia. Si svolgono tre congressi eucaristici e due congressi catechistici, viene fondata una rivista diocesana ed un’opera specifica per le vocazioni. Il processo di avvicinamento tra chiesa e città conosce un momento di peculiare rilevanza con la processione del 28 maggio 1922, conclusiva del XXVI congresso eucaristico internazionale, il primo del dopoguerra. La conquista degli spazi cittadini del centro storico continua e si sviluppa sempre più nel corso del pontificato di Pio XI. Tutta la città sembra cattolica e lo manifesta, favorita anche dal nuovo clima di relazioni tra Santa Sede e autorità politica italiana. Ciononostante la città cresce tanto impetuosamente da non consentire alla diocesi, povera di risorse, di raggiungerla nei suoi nuovi quartieri.
La firma dei Patti, tuttavia, provoca uno sbandamento nel gruppo dirigente del Vicariato. Il card. Pompilj manifesta apertamente la sua contrarietà alle modalità della trattativa ed alla fiducia riposta nelle autorità politiche italiane. Pio XI è costretto a cercare nuove strategie e nuove energie per l’evangelizzazione della periferia cittadina, ormai cresciuta a dismisura e in disordine. La malattia e la morte dell’anziano vicario si accompagnano con l’emersione di tali novità, impersonate dal card. Marchetti Selvaggiani, destinato ad interpretare il governo diocesano con maggiori risorse e secondo modalità più vicine alla personalità attiva del pontefice
Implementation of groundwater numerical models in geological contexts of urban areas
No full textThe work presented in this thesis is a combined process of conceptual and numerical modeling of Rome’s aquifer system; it is carried out by a phase of data collecting and archiving ,and a phase of study in depth of the conceptual geological setting (both phases realized in collaboration with Igag-CNR); then, the geological setting has been translated into a hydrogeological framework, starting from hydrologic and hydrogeologic data and previous regional studies; this phase included extraction of information from the database and the data elaboration into cross sections and modeled surfaces. Finally, the conceptual hydrogeological model has been used to build a numerical model by using the finite-difference code MODFLOW2000® and the graphical interface GroundwaterVistas® 5.41(ESI). Modeled area extends on a basin-scale in an area of 237402 m2 including high urbanization zones, as the hystorical center of the City; the complexity of the geological setting of the roman sector, the complications in groundwater and surface water flux due to the modification of the natural hydrologic setting and the lack of valid series of head data, river flux and k measurements, strongly increase the uncertainty on model results.The work has been developed by those steps
- Creation of database capable to collect hydrogeological data as: well logs, head measurements, spring discharge, pumping tests;
- Collecting 2950 well data ; 326 have been used to construct cross sections and top surfaces;
- building top surfaces of: Plio-pleistocene complexes (including Monte Vaticano and Monte Mario Formation), Ponte Galeria Formation, alluvial basal gravel; moreover, the maximum erosional surface of Tiber alluvial valley has been built
- implementation of a quasi-3D steady state numerical model set up with 8 layers, a horizontal cell discretization of 50 x 50 meters, for a total area of 237402 m2
- model calibration, carried out on following parameters: recharge in urban and non urban areas, complexes hydraulic conductivities, General Head boundaries hydraulic conductivity, drain and river bed hydraulic conductivity; calibration was performed by a trial-and-error method based on head target residuals statistics and by 5 autosensitivity analysis;
- Computation of inflows and outflows both for the whole model and for each hydrostratigraphic unit.
- Comparison between the 10-years averaged aquifer system’s water balance (Capelli et alii, 2005) and the model’s water budget
Le pratiche commerciali scorrette nelle professioni intellettuali
No full textQuesto studio è rivolto all'analisi delle possibili vie di interazione tra la nuova
disciplina in tema di pratiche commerciali scorrette recentemente introdotta nel
codice del consumo agli articoli 18 - 27- quater, e il quadro normativo relativo alle
“professioni intellettuali”.
L'interrogativo che pone è quello del “se” e “come” le nuove disposizioni siano applicabili al professionista che esercita una libera professione, sottoposto in ragione degli interessi generali che l'attività involge, ad una regolamentazione nazionale che è tutta imperniata sul “decoro” e sulla “correttezza professionale”.
La tesi è strutturata in quattro capitoli e prende le mosse, nel primo, dall'analisi del
significato e delle implicazioni -nell'ordinamento nazionale in generale e delle
professioni in particolare - del nuovo approccio al diritto comunitario dei
consumatori inaugurato con la direttiva 2005/29/Ce - matrice della disciplina in
esame, che introduce il divieto generale di porre in essere “pratiche commerciali
scorrette tra professionista e consumatore”.
Si opera, quindi, la disamina della nozione innovativa di “pratica commerciale” e
del vasto orizzonte temporale preso in considerazione dal legislatore che guarda a
tutta l'attività del professionista e non solo al contratto. Il capitolo affronta, poi, il problema relativo ai limiti soggettivi di operatività della novella con riguardo alla categoria delle professioni intellettuali di difficile definizione. In particolare, la previsione dell'art. 19, secondo comma, lett. d) costituisce uno snodo essenziale del percorso di ricerca rivolto a comprendere se, nel settore in esame, vi siano gli spazi e le ragioni per una disciplina che diverga dalle regole generali in materia di pratiche commerciali scorrette. La norma, difatti, sembra porre una “deroga” per le leggi specifiche che regolamentano le “professioni
regolamentate” e per i relativi “codici deontologici”, ove rivolti a garantire “elevati
livelli di correttezza professionale”.
Nella disciplina comunitaria, il settore delle professioni “regolamentate” rappresenta un vulnus al principio dell'armonizzazione massima delle disposizioni normative nazionali imposta dal legislatore comunitario e, di riflesso, nella disciplina nazionale di recepimento un ambito “non pregiudicato” dalla novella.
Per tali ragioni, il tema delle pratiche commerciali scorrette del professionista
intellettuale sembra collocarsi, dunque, in una cornice normativa un po' “sfuocata” sia sotto il profilo definitorio che sotto il profilo applicativo. Poiché il perimetro di applicazione della normativa non si presenta del tutto chiaro e lineare, l’esame della definizione di professione regolamentata accolta dall’art. 18, comma 1, lett. n) cod.cons., sia in positivo (con riferimento alle attività professionali che comprende) sia in negativo (con riferimento a quelle attività che possono qualificarsi “non regolamentate”) è condizione necessaria dello studio.
La definizione in argomento è analizzata facendo ampio riferimento a quella più
dettagliata fornita in tema di riconoscimento di qualifiche professionali e all'ampia
casistica dei provvedimenti dall'Autorità garante della concorrenza e del mercato.
Si pone, poi, a confronto la definizione mutuata dal diritto comunitario con le
espressioni polisenso usate nel nostro ordinamento per indicare le professioni
intellettuali cercando di tracciarne le linee di demarcazione. A conclusione di questo primo segmento della ricerca, incentrato sui profili
definitori, si pone in evidenza il legame di complementarietà e coerenza che sembra
sussistere tra i tre capisaldi comunitari in materia di professioni regolamentate che
hanno profondamente inciso sull'ordinamento nazionale ovvero il d.lgs. 6 novembre
2007, n. 206, di attuazione della direttiva 2005/36/CE (c.d. direttiva unica) relativa
al riconoscimento delle qualifiche professionali, il d.lgs. 26 marzo 2010 n. 59, che recepisce l’importante direttiva 2006/123/CE sui servizi nel mercato interno (c.d. Bolkeinstein), e per finire la disciplina delle pratiche commerciali scorrette, e della
necessità di leggere l'ultima alla luce delle altre due.
Il secondo capitolo dell'elaborato è dedicato all'analisi del complesso sistema di valutazione della scorrettezza della pratica commerciale di cui all’art. 20 cod. cons.,
norma centrale attorno alla quale muove l’intero impianto normativo, nel quale si fa largo uso di clausole generali di cui si indaga il contenuto. Inoltre, si traccia l'identikit del “consumatore medio del servizio professionale” alla luce delle peculiari caratteristiche del mercato dei servizi professionali ovvero:
l'asimmetria informativa e il conseguente rischio per il consumatore di incorrere in
fenomeni di selezione avversa e gli effetti esterni prodotti dalle prestazioni intellettuali.
Con riferimento alla configurabilità in concreto di pratiche commerciali ingannevoli
e aggressive nel settore professionale si pone in rilievo il problema relativo alle modalità e ai limiti con cui questi servizi si possono proporre ai consumatori nonostante le recenti misure di liberalizzazione che hanno introdotto significativi germi di innovazione. E del resto la “sospetta” mancata emissione di provvedimenti dell'Autorità garante che abbiano come destinatari i liberi professionisti e/o gli ordini professionali per aver posto in essere pratiche commerciali scorrette sembra
porre in risalto sia la peculiarità del rapporto cliente/consumatore – professionista
intellettuale sia la difficile congiunzione dei sistemi normativi in esame.
Nel terzo capitolo del presente elaborato si dedica particolare attenzione al ruolo
dell’autoregolamentazione nel nuovo quadro normativo.
In particolare, si definiscono i tratti essenziali della definizione generale di “codice di condotta”, cristallizzata a livello normativo all'art. 18, comma 1, lett. f) cod. cons., in riferimento alla possibilità o meno di comprendervi anche la nozione di codice
deontologico.
La soluzione del problema non riveste un interesse solo esegetico in quanto può
determinare un diverso ambito di applicazione della disciplina ed una diversa rilevanza verso il consumatore delle condotte che violino i precetti deontologici e delle fattispecie tipiche di pratiche commerciali coinvolgenti i codici di condotta.
Si affronta, poi, il delicato tema del rapporto tra la nuova normativa introdotta agli artt. 18 ss. e la piattaforma normativa e deontologica nazionale delle professioni domandandosi se si pongano su piani paralleli destinati a non incontrarsi in alcun punto o se possano a tratti sovrapporsi ed avere delle interferenze.Il quarto capitolo tratta il tema della tutela del consumatore avverso le pratiche commerciali scorrette poste in essere dall'esercente una professione intellettuale.
In specie, si indaga sulla natura del sistema di tutela apprestato dal nuovo articolato
normativo e ci si chiede se la competenza generale dell'Autorità Garante della
Concorrenza e del Mercato incontri limiti normativi con rifermento al settore
professionale e se vi sia una competenza esclusiva degli ordini professionali sulle
comunicazioni commerciali degli esercenti una professione.
Segue, poi, la trattazione del tema dell’applicabilità dei rimedi individuali propri della nostra tradizione civilistica su cui, formalmente, la nuova disciplina non
incide, pur essendo destinata ad avere su di essi delle inevitabili interazioni.
Inoltre, stante le peculiarità dell’ordinamento professionale cui necessariamente appartiene il libero professionista e la rilevanza che in esso rivestono i codici deontologici, si ritiene indispensabile lo studio della responsabilità disciplinare.
L'analisi si snoda cercando di individuare attraverso quali vie la disciplina delle
pratiche commerciali scorrette attraversi le specificità del settore professionale
modificandosi parzialmente e/o imponendo nuovi cambiamenti nell'ordinamento delle professioni.
Dunque, si propone un approccio alla disciplina delle professioni dall'angolo visuale del cliente – consumatore, domandandosi se la novella si traduca in una nuova “guarentigia” per questa particolare categoria di professionisti, salvaguardata dall'uniformazione imposta dal diritto comunitario e quali siano le rationes della particolare attenzione normativa ad essa dedicata
Neuroglobina: aspetti cellulari, molecolari e biomedici
No full textAlthough globins are among the best-investigated vertebrate proteins, no other distinct types of globins have been identified so far in this taxon. In 2000, it was identified a third globin type in humans and rodents. This protein was predominantly expressed in the brain, and therefore they have called it neuroglobin (Ngb). The discovery of Ngb aroused a great interest among scientific community inducing to consider heme-globins not only as mere O2 storage/delivery proteins. Ngb is a highly conserved protein, with an evolutionary rate that is about threefold slower than that of myoglobin and hemoglobin. Thus, Ngb has remained largely unchanged during evolution, pointing to an important role of this protein. In particular, an important role in neuroprotection has been addressed to Ngb, especially against ischemia and oxidative stress-related neurodegenerative diseases, but many divergences between in vivo and in vitro experimental approaches still render unclear the biological role of this novel globin. Several mechanisms underlying Ngb neuroprotective effects have been proposed. Indeed, Ngb has been hypothesized: (i) to act as an O2 buffer, (ii) to facilitate O2 diffusion to the mitochondria, (iii) to catalyze the formation and the decomposition of reactive nitrogen and/or oxygen species, and (iv) to be part of intracellular signaling pathways by inhibiting the dissociation of GDP from Gα proteins and triggering the release of the Gβγ complex, and by reducing cytochrome c. Although it is unlikely that Ngb has so many distinct roles, there is no doubt that Ngb displays a protective function(s) in the brain. The emerging neuroprotective role of Ngb arises the challenge to investigate the mechanisms able to modulate its expression. Indeed, a significant contribution to highlight the role played by Ngb in neuroprotection could derive from the identification of Ngb endogenous modulator(s) (e.g., neuroactive hormones and neurotransmitters), but, as far as we know, no Ngb involvement in the hormone signal transduction pathways has been identified yet. Thus, aim of this project is to approach to the knowledge of Ngb physiological role (i) identifying Ngb endogenous modulator(s), (ii) identifying the molecular mechanisms responsible of Ngb expression and induction, and (iii) the role played by Ngb in neuroprotective signaling pathways. In the first part of the project was evaluated if sex steroid hormones may act as endogenous modulators of Ngb levels in SK-N-BE human neuroblastoma cell line and in mouse primary hippocampal neurons. The reported results indicate that physiological concentration of the estrogen 17β-estradiol (E2), but not androgens, acts as endogenous modulator of Ngb in both cell models. This effect is mediated by estrogen receptor β (ERβ) via genomic and extranuclear signals involving p38/MAPK pathway. In the second part, the involvement of Ngb in the neuroprotective effects of E2 against H2O2-induced toxicity has been investigated in SK-N-BE cells. Indeed, E2 exerts a protective effect against the H2O2-induced injury, and requires ERβ. E2 pretreatment impairs H2O2-induced caspase-3 and PARP activation, enhancing cell viability. However, in Ngb-silenced SK-N-BE cells E2 was unable to counteract the H2O2-induced decrease in cell number and the activation of the pro-apoptotic cascade suggesting that Ngb can be regarded as part of signals activated by E2 to exert neuroprotective effects, definitely validating the role played by Ngb as an anti-apoptotic neuroprotective globin. Thus, it has been clarified the Ngb sub-cellular localization to understand how this novel globin can intercept the apoptotic pathway. Therefore, in SK-N-BE cells has been demonstrated that Ngb is expressed in the nucleus, mitochondria and is scattered in the cytoplasm. E2 reallocates Ngb mainly at mitochondria strengthened the hypothesis that Ngb directly interferes with the intrinsic pathway of apoptosis, being mitochondria just the starting site of this process. Indeed, it has been assessed that Ngb co-immunoprecipitates with cytochrome c in mitochondrial fraction and this association is enhanced pretreating SK-N-BE cells with E2, suggesting that E2-induced reallocation of Ngb facilitates Ngb-cytochrome c interaction. Remarkably, E2 pretreatment before the addition of H2O2 strongly enhances Ngb co-immunoprecipitation with cytochrome c. This E2 effect is stronger during oxidative stress condition rather than in basal condition and requires ERβ activity. Thus, the mechanism underlying Ngb protection against H2O2 stress is the interception of the intrinsic pathway of apoptosis interfering directly with cytochrome c release.
In the light of Ngb neuroprotective potential, linked with E2-mediated signals, the third part of the project was aimed to characterize the E2-mediated regulation of Ngb levels in astrocytes, where E2 exerts a well known anti-inflammatory effect. In mouse primary cortical astrocytes E2 affects Ngb expression at physiological concentration. The effect of E2 on Ngb levels specifically requires ERβ, confirming also in astrocytes the direct involvement of ERβ in Ngb modulation, as already reported for human neuroblastoma SK-N-BE and mouse hippocampal neurons. Although it has been established that Ngb is an E2-inducible protein and that, from a functional point of view, the E2-mediated Ngb upregulation allows to promote the E2-induced outcomes, also a putative role of Ngb as a compensatory protein responding to challenging stimuli, must be considered. The finding that lipopolysaccharide (LPS) is able to increase Ngb protein levels, although with a lesser degree compared with E2, further provides an additional contribution to understand the role of Ngb also as offsetting protein. Interestingly, although both E2 and LPS are able to increase Ngb protein levels, a negative cross-talk between ERs and LPS-induced signal (i.e., NFκB) seems to be present. In fact, ERα-activated signals (which are not involved in E2-mediated Ngb upregulation) block LPS-mediated Ngb increase, whereas on the other hand, LPS impairs the ERβ-induced upregulation of Ngb protein levels. Therefore, the co-activation of ERα and ERβ is pivotal to regulate Ngb expression in presence of LPS-activated signals (i.e., NFκB). Despite LPS, via NFκB, is able to increase Ngb levels, the role of this globin is not addressed to promote LPS effects, as observed for E2. Indeed, Ngb seems to be pivotal to mediate the E2 anti-inflammatory effects (i.e., inhibition of IL-6 and IP-10 synthesis), since Ngb knocking down prevents the protective effect of E2. As a whole, the well known neuroprotective effects elicited by E2 may, at least in part, be explained by an enhanced Ngb expression in neurons and astrocytes. The principal role played by Ngb in the brain could be the reduction of neuronal death by resetting the trigger level of apoptosis and inhibition of pro-inflammatory molecules expression, leading to the onset of physiological response to stress. E2 acts to accelerate Ngb neuroprotective effect rapidly enhancing its protein levels in both neurons and astrocytes. In addition, the possibility that other hormones and neurotransmitters may upregulate Ngb levels in brain a potential new opportunity for the development of neuroprotective strategies and drugs against stroke damage, inflammation, neurodegenerative diseases (e.g., Alzheimer’s and Parkinson’s disease), excitotoxicity, and injuries related to oxygen or glucose deprivation
"Quorum sensing” e “pyoverdine signaling” : possibili bersagli per lo sviluppo di inibitori della virulenza di Pseudomonas aeruginosa
No full textPseudomonas aeruginosa is a major opportunistic pathogen in the hospital setting, and P. aeruginosa chronic lung infection is the main cause of morbidity and mortality in cystic fibrosis (CF) patients. P. aeruginosa infections are difficult to eradicate by conventional antibiotic therapy due to the inherent antimicrobial resistance of the bacterium and its propensity to acquire new resistances. The search for new drugs capable of inhibiting specific virulence-related traits of P. aeruginosa is a promising strategy to face with infections caused by multidrug-resistant P. aeruginosa. This approach offers the advantage of reducing the bacterial adaptability to the host environment, thus providing the host immune system with a better chance of clearing the infection without creating the selective pressure generally caused by conventional antibiotics. In P. aeruginosa, quorum sensing (QS) and pyoverdine signaling systems regulate a number of virulence phenotypes which are critical for P. aeruginosa pathogenicity, and therefore represent ideal targets for the development of novel anti-Pseudomonas drugs. QS is a cell-density dependent global regulatory system which relies in the production of a signal molecule that accumulates in the growth medium in a way that is proportional to the cell density. P. aeruginosa has three interconnected QS systems, namely las, rhl and pqs, based on the production of distinct signal molecules and organized in a hierarchical fashion with the las QS system on top. In the whole, these QS systems regulate ca. 10% of P. aeruginosa genes, including several virulence genes. Pyoverdine is a high-affinity iron chelator (siderophore) which binds Fe(III) in the extracellular milieu and delivers it to the cell through receptor-mediated active transport. Pyoverdine also acts as signal molecule, enhancing the expression of a number of P. aeruginosa virulence factors.
The aims of my PhD work were the development of novel high-throughput screening systems to be used for the detection of compounds able to inhibit QS and pyoverdine signaling and, subsequently, the characterization of the effects on P. aeruginosa virulence of the molecules identified by the screening experiments.
With regard to the screening system for QS inhibitors, a reporter system (PA14-R3) was developed, consisting in a P. aeruginosa lasI defective mutant, unable to produce the N-3-oxo-dodecanoyl-homoserin lactone (3OC12-HSL) signal molecule and carrying the lux bioluminescence genes under the control of the rsaL promoter, inserted as a single copy in a neutral site of the P. aeruginosa chromosome. PA14-R3 was able to detect 3OC12-HSL concentrations in a 150 pM - 3 μM range, and showed high specificity towards 3OC12-HSL, while not being significantly influenced by other acyl-HSLs produced by P. aeruginosa or by other bacterial pathogens that can coexist with P. aeruginosa in the lung of CF patients. The wide range of response and the high sensitivity and specificity of PA14-R3 made this biosensor a convenient tool for the direct micro-volumetric determination of 3OC12-HSL levels in P. aeruginosa laboratory cultures as well as in clinical samples, by non-linear interpolation from a standard curve obtained with purified 3OC12-HSL. The PA14-R3 biosensor was efficiently employed for direct measurements of the levels of 3OC12-HSL in culture supernatants of P. aeruginosa strains that differ in 3OC12-HSL production and for the quantification of 3OC12-HSL in sputa from CF patients with known history of colonization by P. aeruginosa.
A novel screening system for QS inhibitors (QSI) was developed, based on the co-cultivation of
PA14-R3 with the P. aeruginosa wild-type strain PA14. In this system, the wild-type strain provides the PA14-R3 biosensor with the 3OC12-HSL required for luminescence emission. The addition of a molecule with inhibitory activity towards any process related to QS would reduce the emission of luminescence by the biosensor with respect to a control co-culture without any inhibitor added. This system would allow the detection of any inhibitory compound targeting one or more of the following steps: i) expression/activity of signal molecule biosynthesis enzymes; ii) expression/activity of signal receptors; iii) import/export of signal molecules. The PA14-R3/PA14 co-culture was validated as screening system for QSI compounds by testing the response of the system to furanone C30, a well-known QSI, and subsequently employed in a pilot screening for potential QSI in a commercial chemical library consisting of 1,120 FDA-approved drugs, selected for their high chemical and pharmacological diversity as well as for their known bioavailability and safety in humans. The screening led to the identification of a number of QS-inhibiting compounds, among which a teniacide drug (QSI-1), able to cause a decrease in the 3OC12-HSL production of about 50% and active at physiologically meaningful concentrations. The ability of QSI-1 to equally reduce the bioluminescence emission in both a PA14-R3/PA14 co-culture and a culture of PA14-R3 alone in presence of exogenously added 3OC12-HSL suggested that QSI-1 was likely to inhibit the sensing, rather than the synthesis or import/export of the signal molecule. In addition to 3OC12-HSL, QSI-1 also showed a relevant inhibitory effect on the production of the rhl QS signal molecule, namely C4-HSL. The effect of QSI-1 on the production of several QS-dependent virulence determinants in P. aeruginosa was thus investigated. The presence of a 10 μM QSI-1 in the culture medium determined a strong reduction of pyocyanine, rhamnolipids, and elastase production. Finally, the QSI-1 was tested for its ability to inhibit P. aeruginosa virulence in the Galleria mellonella (major wax moth) model of infection. A concentration of 15 μM QSI-1 almost completely abrogated the pathogenicity of P. aeruginosa in larvae inoculated with a lethal dose of P. aeruginosa PA14.
A screening system for pyoverdine signaling inhibitors (PSI) was developed, consisting in a P. aeruginosa PAO1 strain carrying the lux genes under the control of the signaling-responding pvdE promoter. In this system, the addition of a molecule with inhibitory activity towards pyoverdine signalling and/or pyoverdine synthesis would determine a decrease in the emission of luminescence by the biosensor and in pyoverdine-specific fluorescence. This system was used to screen a commercial chemical library for putative PSI, leading to the identification of an antimycotic drug (PSI-1) capable of reducing pyoverdine signaling and pyoverdine production in P. aeruginosa PAO1 by > 50%. In addition to the type I pyoverdine produced by P. aeruginosa PAO1, PSI-1 was also shown to reduce pvdE transcription and pyoverdine synthesis in type II and III pyoverdine-producing P. aeruginosa strains. A preliminary investigation was conducted to tentatively determine the molecular target(s) of PSI-1. PSI-1 was active against selected mutant strains impaired in different steps of the pyoverdine signaling pathway, suggesting that the inhibitory activity of PSI-1 does not depend on inhibition of pyoverdine signaling. Further experiments showed that PSI-1 was capable of reducing the transcription of the pvdS gene, encoding the alternative sigma factor PvdS, which is a central regulator essential not only for pyoverdine production but also for the expression of a number of P. aeruginosa virulence genes. PSI-1 at 10 μM concentration determined a relevant decrease in both transcription and expression of (i) pyoverdine synthesis genes, (ii) the toxA gene, which encodes the exotoxin A, a major determinant of P. aeruginosa virulence, and (iii) the prpL gene, encoding the extracellular protease PrpL. Further experiments are in progress to assess the effect of QSI-1 and PSI-1 in a mouse model of infection.
The evidence that QSI-1 and PSI-1 are effective in inhibiting crucial signaling processes for P. aeruginosa virulence and consequently reduce the expression of many virulence factors of P. aeruginosa sets the basis for further investigation focused on the characterization of the mode of action these drugs with the ultimate aim of using these compounds for the development of an anti-virulence strategy against P. aeruginosa infection
Climate Change and Future Impacts on Food Security
No full textThis briefing, written in response to the drought in the Horn of Africa which has undoubtedly led to the huge scale of the disaster, looks at the role that climate change has played in the current crisis, which has been caused by people and policies as much as by weather patterns.Qoraalkani wuxuu ka jawaabayaa abaarta ku habsatay Geeska Afrika, taasoo keentay dhibaatooyin farabadan, wuxuuna baarayaa sida isbeddelka cimiladu uu doorka uga qaatay mashaqada taagan, oo ka timid xagga siyaasadda iyo arrimaha cimileed.Questo briefing, scritto in risposta alla siccità nel Corno d'Africa che ha indubbiamente portato all'enorme portata del disastro, esamina il ruolo che il cambiamento climatico ha giocato nella crisi attuale, che è stata causata dalle politiche tanto quanto da fattori meteorologici