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Nanopartículas poliméricas direcionadas para o tratamento de fibrose
No full textDissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de FarmáciaFibrosis is a result of the tissue healing process being dysregulated after various forms of tissue damage. Anti-fibrotic medicines (small molecules) targeting TGF-β are mostly utilized in idiopathic pulmonary fibrosis and myelofibrosis. One of two FDA-approved IPF270 medicines, pirfenidone (PFD), suppresses TGF-β production and activation. However, medication discontinuation typically results in adverse effects. Due to the complex interplay of various signaling pathways in fibrosis, multitarget medication may be necessary to create new treatments. Targeted manipulation of protein expression is promising for complete disease control. Messenger RNA (mRNA) has recently emerged as a clinically relevant tool to enable high protein concentration in vivo with lower costs than protein-based drugs, and without the safety issues associated with standard DNA-based gene therapies, such as the risk of carcinogenic mutations and the need to translocate to the nucleus. Moreover, mRNA-based drugs offer controlled protein expression owing to natural degradation pathways which ensure their activity is temporary. Polymeric nanoparticles (NP) can be used to deliver messenger RNA to improve protein expression control (mRNA). Recently, we have demonstrated that specific polymeric NPs can deliver more efficiently mRNA into dermal fibroblasts than to other cell types which can be an opportunity to control fibrotic processes. In the context of this thesis, we have further investigated the formulation to enhance its bioactivity. Initially, we investigated the impact of modifying the end groups of the polymer NPs with a range of small molecules in transfection efficiency. Then, we evaluated the effect of the monomer proportion in the polymer in transfection efficiency. Moreover, we established polymer structure: transfection activity correlations. Finally, we evaluated the transfection efficiency of the NPs to transfect non-fibroblast cells such as endothelial cells. Overall, our study demonstrates the potential of polymeric NPs for the intracellular delivery of mRNA.A fibrose resulta do facto de o processo de cicatrização dos tecidos ser desregulado após várias formas de lesão dos tecidos. Os medicamentos anti-fibróticos (pequenas moléculas) que têm como alvo o TGF-β são maioritariamente utilizados na fibrose pulmonar idiopática e na mielofibrose. Um dos dois medicamentos aprovados pela FDA para fibrose pulmonar, a pirfenidona (PFD), suprime a produção e a ativação do TGF-β. No entanto, a interrupção da medicação resulta normalmente em efeitos adversos. Devido à interação complexa de várias vias de sinalização na fibrose, pode ser necessária uma medicação com múltiplos alvos para criar novos tratamentos. A manipulação orientada da expressão proteica é promissora para o controlo total da doença. O ARN mensageiro (ARNm) surgiu recentemente como uma ferramenta clinicamente relevante para permitir uma elevada concentração de proteínas in vivo, com custos inferiores aos dos medicamentos à base de proteínas e sem os problemas de segurança associados às terapias genéticas padrão à base de ADN, como o risco de mutações cancerígenas e a necessidade de translocação para o núcleo. Além disso, os medicamentos baseados em ARNm oferecem uma expressão controlada da proteína devido a vias naturais de degradação que garantem que a sua atividade é temporária. As nanopartículas poliméricas (NP) podem ser utilizadas para transportar o ARN mensageiro, a fim de melhorar o controlo da expressão proteica (ARNm). Recentemente, demonstrámos que as NPs poliméricas específicas podem transportar mais eficazmente o ARNm para os fibroblastos dérmicos do que para outros tipos de células, o que pode constituir uma oportunidade para controlar os processos fibróticos. No contexto desta tese, investigámos ainda mais a formulação para melhorar a sua bioatividade. Inicialmente, investigámos o impacto da modificação dos grupos terminais das NPs de polímero com uma gama de pequenas moléculas na eficiência da transfecção. Depois, avaliámos o efeito da proporção do monómero no polímero na eficiência da transfecção. Além disso, estabelecemos correlações entre a estrutura do polímero e a atividade de transfecção. Finalmente, avaliámos a eficiência de transfecção das NPs para transfectar células não fibroblásticas, como as células endoteliais. No geral, o nosso estudo demonstra o potencial das NPs poliméricas para a entrega intracelular de mRNA
Relatórios de Estágio e Monografia intitulada “ A disfunção da barreira hemato-encefálica no envelhecimento saudável e na demência: porquê, como, para quê?”
No full textRelatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de FarmáciaThe blood brain barrier (BBB) is an indispensable structure that maintains the central nervous system (CNS) microenvironment for a correct neuronal function. It is composed by high specialized microvessels, surrounded by astrocytes, pericytes, neurons and microglia cells, which tightly control the influx and efflux of substances to the brain parenchyma. During aging, the BBB becomes impaired, and it may contribute to the development of neurodegenerative and neurological disorders including Alzheimer’s disease and other dementias. Restoring BBB can be a strategy to prevent disease onset/development and reduce the symptoms of these conditions. This work reviews the principal mechanisms associated with BBB breakdown in healthy and unhealthy aging, as well as biomarkers and methodologies that assess its impairment. Complementarily, potential therapeutic targets for restoring the normal function of the BBB in ageing are herein discussed.A barreira hemato-encefálica (BHE) é uma estrutura indispensável para a manutenção do microambiente do sistema nervoso central (SNC), necessário para um adequado funcionamento neuronal. É composta por microvasos altamente especializados, rodeados por astrócitos, pericitos, neurónios e células da microglia, cuja interação dinâmica controla rigorosamente o influxo e efluxo de substâncias para o parênquima cerebral.No decorrer do envelhecimento, a BHE sofre alterações celulares e bioquímicas, que podem comprometer a sua função e contribuir para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas e neurológicas, como a doença de Alzheimer e outras demências. Restaurar a estrutura e funcionamento da BHE pode ser uma estratégia para prevenir o aparecimento/ progressão de doenças e reduzir os sintomas destas condições patológicas. Este trabalho faz uma revisão crítica dos principais mecanismos associados à disfunção da BHE durante o envelhecimento saudável e não saudável, bem como dos biomarcadores e metodologias que avaliam essa disfunção. Complementarmente, são discutidos potenciais alvos terapêuticos para restaurar a funcionalidade da BHE no envelhecimento
PROJETAR CRISPR-BASE EDITORS PARA RESGATAR A DOENÇA MACHADO-JOSEPH NUM MODELO NEURONAL DERIVADO DE DOENTE
No full textDissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de FarmáciaSpinocerebellar ataxia type 3 (SCA3), also known as Machado-Joseph disease (MJD), stands as the most prevalent form of autosomal dominant inherited ataxia globally. MJD is characterised as a neurodegenerative disorder with late onset, arising from an abnormal expansion of CAG repeats situated within the exon 10 of the ATXN3 gene, situated on chromosome 14q32. This results in the anomalous expansion of a polyglutamine (polyQ) tract within the Ataxin-3 protein deubiquitinase which forms toxic species and protein aggregates that culminates in neurodegeneration. Currently, there is no therapy able to modify or delay disease progression. With the emergence of iPSC models and the advent of next-generation gene-modifying enzymes like the CRISPR system, we have at our disposal extremely promising tools for the modelling and treatment of MJD. In this thesis, we aimed at engineering CRISPR-base editors to rescue Machado-Joseph disease in a novel patient-derived neuronal model of this neuropathology.Here, we report the first model of MJD patient-specific neurons based on iPSC directed neuronal differentiation. We achieved the creation of remarkably uniform neuronal cultures from gene edited MJD isogenic lines within just 7 days. Unfortunately, we faced challenges in maintaining these cultures for long-term downstream analysis. Nevertheless, our observations revealed that autophagic processes are impaired in initial stages of cultured MJD neurons.Moreover, we explored the innovative CRISPR base editor technology for precise nucleotide transition to target the ATXN3 gene and rescue MJD by two distinct strategies - induction of nonsense mutations or modulation of gene splicing - with the goal of reducing the expression of the toxic Ataxin-3 polyQ tract. We show that cytosine base editors can efficiently target and edit the endogenous ATXN3 gene in HEK293T cells, demonstrating efficient ATXN3 gene silencing or exon-skipping of the CAG-encoding exon 10. This latter translated into the reduction in Ataxin-3 full-length protein and formation of a C-terminal truncated Ataxin-3 lacking the polyQ tract. Nevertheless, the editing efficacy was limited for patient-derived iPSCs, and optimisations to further enhance it are currently under investigation.In conclusion, we have provided evidence that the direct differentiation of MJD neurons is a powerful tool in the context of disease modelling and showcased the potential of CRISPR base editors as novel therapeutic avenue for MJD treatment and other polyglutamine disorders. Overall, we believe in the capability of CRISPR-base editors for the development of personalised therapies towards clinical translation into MJD patients.A ataxia espinocerebelosa tipo 3 (SCA3), também conhecida como doença de Machado-Joseph (MJD), é a forma mais prevalente de ataxia autossómica dominante em todo o mundo. A MJD é caracterizada como uma doença neurodegenerativa de início tardio, resultante de uma expansão anormal de repetições CAG situadas no exão 10 do gene ATXN3, localizado no cromossoma 14q32. Isso resulta na expansão anómala de uma sequência de poliglutaminas (polyQ) na proteína deubiquitinase Ataxina-3, formando espécies tóxicas e agregados proteicos que culminam em neurodegenerescência. Atualmente, não existe terapia capaz de modificar ou atrasar a progressão da doença. Com o surgimento de modelos de iPSCs e a inovação de enzimas de próxima geração de modificação genética, como o sistema CRISPR, temos à nossa disposição ferramentas extremamente promissoras para modelar e tratar a MJD. Nesta tese, tivemos como objetivo desenvolver editores de bases CRISPR para resgatar a doença de Machado-Joseph num novo modelo neuronal derivado de doentes com esta neuropatologia.Aqui, relatamos o primeiro modelo de neurónios específicos de doentes com MJD baseado na diferenciação neuronal direcionada por iPSCs. Conseguimos criar culturas neuronais bastante uniformes a partir de linhas isogénicas MJD, editadas geneticamente, em apenas 7 dias. Infelizmente, enfrentámos desafios na manutenção dessas culturas para análises a longo prazo. No entanto, as nossas observações revelaram que os processos autofágicos estão comprometidos nas fases iniciais dos neurónios MJD.Além disso, explorámos a inovadora tecnologia CRISPR base editor para edição especifica de nucleótidos visando o gene ATXN3 e resgatando a MJD por duas estratégias distintas - indução de mutações sem sentido ou modulação do splicing de genes - com o objetivo de reduzir a expressão da sequência de poliglutaminas tóxicas da Ataxina-3. Mostrámos que os editores de bases de citosina podem direcionar e editar eficientemente o gene ATXN3 endógeno em células HEK293T, demonstrando silenciamento eficiente do gene ATXN3 ou exclusão do exão 10 que codifica CAG. Isso traduziu na redução da proteína Ataxina-3 com comprimento total e na formação de uma Ataxina-3 truncada na extremidade C-terminal, sem a sequência de poliglutaminas. No entanto, a eficácia da edição foi limitada em iPSCs derivadas de doentes, e otimizações para aumentá-la ainda estão sob investigação.Em conclusão, fornecemos evidências de que a diferenciação direta de neurónios MJD é uma ferramenta poderosa no contexto de modelar doenças e demonstrámos o potencial dos editores de bases CRISPR como uma nova via terapêutica para o tratamento da MJD e outras doenças que envolvam poliglutaminas. No geral, acreditamos na capacidade dos editores de bases CRISPR para o desenvolvimento de terapias personalizadas com vista à translação clínica para doentes com MJD.FCTH202
Compreender o papel de vesículas extracelulares derivadas de células de cancro colorectal com KRAS mutado na ativação e exaustão de células T
No full textDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaColorectal cancer is, nowadays, the third type of cancer with highest rates of incidence, and the second deadliest. Among these cases, about 40% have mutations in KRAS, a gene that when mutated induces immune escape and cancer progression. Clinically, a KRAS inhibitor has already been introduced, but, although initially it reverses oncogenic KRAS-induced immunosuppression, tumors recur shortly after treatment begins, suggesting that alternative immunosuppressive mechanisms exist to impair an effective anti-tumor response. Our understanding on those mechanisms is insufficient, and clearly needs to be attained in order to improve treatment efficacy and patients’ overall survival.Aiming to identify mediators of immunosuppression upon KRAS inhibition, we focused in understanding if extracellular vesicles (EVs) released from colorectal cancer cells harboring KRAS mutation can alter the phenotype of activation/exhaustion of T cells, as a potential immune invasion mechanism.Considering the well-known role of microRNAs on cell communication and their presence in EVs, we started by performing an in-silico analysis to identify microRNAs that target immune checkpoint molecules, through database and with publicly available microRNA sequencing data from colorectal cancer isogenic cell lines and of the corresponding EVs (DLD-1: KRAS wild-type and mutated alleles; DKs-8: only KRAS wild- type allele, mimic the inhibition of KRAS).Thus, we hypothesize that the deregulation of microRNAs targeting immune checkpoint molecules that accompanies KRAS inhibition is likely to promote exhaustion (inactivation) of infiltrating T cells, thus triggering tumor immune evasion.To validate this hypothesis, we started by quantifying EVs in the conditioned media from 3D and 2D cultures, with or without KRAS silenced. We observed a higher amount of EVs from 2D to 3D conditions, meaning that 2D culture cells, produce less extracellular vesicles. Further, 3D cultures of KRAS-silenced cells secreted significantly less EVs than control cells. More so, despite no significant differences were observed in terms of RNA amount carried by EVs from 2D and 3D cultures, a tendency for an increase of RNA, smallRNAs and microRNAs enclosed in the EVs secreted by KRAS-silenced cells was observed. We also observed a direct correlation between the total RNA, smallRNAs or microRNAs carried by EVs by 2D and 3D cultures of KRAS-silenced and control cells.To evaluate the role of EVs-enclosed microRNAs on T-cell exhaustion upon KRAS-inhibition we treated T-cells with conditioned media derived from 3D cultures of KRAS-silenced and control cells. T-cells seem to be activated upon treatment with conditioned medium of KRAS mutated CRC (control) cells, as a higher expression of CD69 was observed by flow-cytometry, T-cells exhaustion markers were evaluated – CTLA-4, TIGIT, PD-1 and PD-L1 – but no differences were observed in their expression levels between the different conditions, implicating a lack of exhaustion on T-cells. However, PD-1 and PD-L1 showed a tendency to be downregulated in T-cells treated with conditioned medium from KRAS mutation silenced CRC cells, implying a role of G13D KRAS mutation in promoting T-cell exhaustion. Such effect is possibly mediated by EVs, since in the majority of the results, the depletion of EVs from the conditioned medium, abolished the observed differences. In summary, this work tried to provide mechanistic insight on the mechanisms governing immune evasion upon KRAS-inhibition. It will certainly lead to future studies aiming to validate the identified microRNAs as biomarkers to identify patients that may benefit from KRAS-inhibition and immunotherapy combinatorial treatment.O cancro colorretal é, atualmente, o terceiro tipo de cancro com maiores taxas de incidência, sendo também o segundo cancro mais mortal. Entre estes casos, cerca de 40% tem mutações no KRAS, um gene que quando mutado induz escape imunológico e progressão cancerígena. Clinicamente, já estão a ser utilizados inibidores de KRAS, mas, apesar de inicialmente reverterem a imunossupressão induzida pelo KRAS mutado, os tumores recorrem pouco tempo depois do início do tratamento, sugerindo a existência de mecanismos imunossupressores alternativos que prejudicam a eficiências das respostas anti-tumorais. Sabe-se ainda muito pouco em relação a estes mecanismos, pelo que é claramente necessário a sua compreensão de forma a podermos melhorar a eficácia dos tratamentos e a sobrevivência dos doentes. Com o objetivo de identificar mediadores da imunossupressão após a inibição do KRAS, focamo-nos em compreender se as vesículas extracelulares (EVs) libertadas por células do cancro colorretal com KRAS mutado poderiam alterar o fenótipo de ativação/exaustão de células T, como um potencial mecanismo de evasão imune. Considerando o já conhecido papel dos microRNAs na comunicação celular e a sua presença em EVs, começamos por realizar uma análise in-silico para identificar microRNAs que alvejam moléculas de controlo imune, através de dados de base e com dados de sequenciação de microRNAs, disponíveis ao público, de linhas isogénicas de cancro colorretal e dos seus correspondentes EVs (DLD-1: alelos KRAS wild-type e mutado; DKs-8: apenas o alelo KRAS wild- type, mimetizando assim a inibição do KRAS). Assim sendo, foi hipotetizado que a desregulação dos microRNAs que alvejam moléculas de controlo imune que acompanham a inibição do KRAS terá um papel na promoção de exaustão (inativação) de células T infiltradas, e assim despoletando a evasão imune tumoral.Para validar esta hipótese, começamos por quantificar EVs em meios condicionados de culturas 2D e 3D, com ou sem o KRAS silenciado. Observamos maiores concentrações de EVs em culturas 3D, comparado com as culturas 2D, demonstrando que as culturas 2D produzem menos vesículas extracelulares. Demonstramos ainda que, em culturas celulares 3D, com a inibição do KRAS, secretam menos EVs do que as células controlo.Ainda assim, apesar de não se terem observado diferenças significativas no que toca à quantidade de RNA transportado pelas EVs de culturas 2D para 3D, há uma tendência para o aumentos de RNA, pequenos RNAs e microRNAs no interior das EVs quando o KRAS mutado é silenciado. Observamos ainda uma correlação direta entre o RNA total, pequenos RNAs ou microRNAs transportados por EVs em condições 2D e 3D de células controlo ou com KRAS silenciado. Para avaliar o papel dos microRNAs transportados nas EVs na exaustão de células T após a inibição do KRAS, tratamos células T com meio condicionado derivado de culturas 3D de células controlo e com KRAS silenciado. As células T parecem ser ativadas após o tratamento com meios condicionados de células de CRC com KRAS mutado (controlo), uma vez que foram observadas maiores expressões de CD69 por citometria de fluxo. Os marcadores de exaustão de células T foram avaliados – CTLA-4, TIGIT, PD-1 e PD-L1 – mas não foram observadas diferenças nos seus níveis de expressão entre as diferentes condições, sugerindo a ausência de exaustão nas células T. No entanto, o PD-1 e o PD-L1 mostraram uma tendência a estarem subexpressos em células T tratadas com meios condicionados de células de CRC com KRAS mutado silenciado, sugerindo um papel do KRAS G13D mutado na promoção de exaustão de células T. Este efeito é possivelmente mediado por EVs, dado que a maioria dos resultados deixaram de ter diferenças entre condições quando os EVs foram depletados dos meios condicionados. Em suma, este trabalho, ainda que muito no início, visou fornecer novos conhecimentos mecanísticos nos mecanismos de evasão imune após a inibição do KRAS. E irá eventualmente levar a estudos futuros que irão visar a validação dos microRNAs identificados como biomarcadores para identificar pacientes que poderão beneficiar da inibição do KRAS e tratamentos com combinação de imunoterapia
Comunicação entre neutrófilos e células endoteliais num contexto de Traumatismo Cranioencefálico: Papel do eixo CXCL8-CXCR2
No full textDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaTraumatic brain injury (TBI) is considered the leading cause of death and disability worldwide. TBI occurs due to various external mechanical forces, originating structural and functional changes that result in neuronal injuries, divided into primary and secondary brain injuries. The blood-brain barrier (BBB) dysfunction, excitotoxicity, brain edema, and neuroinflammation are some of the most described adverse effects of TBI. Despite its high prevalence, the therapies available at present have focused only on treating the acute effects. Thus, there is an urgent need to identify an effective strategy to counteract both the acute and chronic consequences that arise after a TBI. Neutrophils are the first cells of the peripheral immune system to infiltrate the trauma site and are intimately involved in the initiation, development, and resolution of TBI. Interestingly, elevated levels of CXCL8 have been detected in the cerebrospinal fluid of patients correlating with BBB dysfunction and increased mortality. The chemokine CXCL8 is an essential component of neutrophil transmigration and a powerful modulator of neuroinflammation in TBI through binding to its receptor CXCR2, the most important receptor in chemotaxis. This receptor is highly expressed by neutrophils and endothelial cells. Moreover, under basal conditions, CXCL8 appears to be present at low levels, but it is upregulated in pathological conditions.Thus, we hypothesize that the CXCL8-CXCR2 axis could be responsible for the chemotaxis of neutrophils, migrating from the bloodstream to the brain site, under TBI conditions. For this, we used a human endothelial cell line (hCMEC/D3) subjected to an elevated hydrostatic pressure (EHP) corresponding to 70mmHg above atmospheric pressure for 1h in a hyperbaric chamber. Our results showed that direct exposure to EHP leads to BBB hyperpermeability through transcytosis mediated by caveolae, with no alteration in clathrin-mediated endocytosis, nor on the paracellular trafficking (with no alterations in TEER values). Considering that caveolae are critical for transcytosis and Cav-1 is the major protein constituent of caveolae. We further evaluated the phosphorylation of Cav-1 at tyrosine residue Tyr14, necessary for vesicle formation. Importantly, we observe not only an increase in Cav-1 total protein levels but also in i t s p h o s p h o ry l a t e d f o r m . A f t e r t h a t , w e d i s c l o s e t h e p l a y e r s i n v o l v e d i n n e u t r o p h i l s ’ transmigration through BBB, using differentiated HL-60 (HL60 cells treated with 1.3% DMSO for 3 days). Importantly, the inhibition of caveolin’s vesicle formation fully prevented the transmigration of neutrophils, as well as, the inhibition of all NOX enzymes, or specifically NOX- 1 (preventing the formation of reactive oxygen species). Furthermore, we also observed that E- selectin and ICAM-1 are required for this migration. Finally, we demonstrated that inhibition of the CXCR2 receptor completely prevented the migration of neutrophils in conditions of TBI, as well as after direct incubation of endothelial cells with CXCL8, showing that activation of CXCR2 is a key step in this migration. Overall, our results suggest that the axis CXCL8-CXCR2 could have an impact on neutrophils migration across BBB under TBI conditions, as well as the transcellular transport could be the chosen pathway for the efflux of neutrophils into the brain, with the interaction of adhesion molecules (i.e., ICAM-1), and production of reactive oxygen species.O traumatismo crânio encefálico (TCE) é considerado a principal causa de morte e incapacidade pelo mundo. O TCE ocorre devido a diversas forças mecânicas externas, originando alterações estruturais e funcionais que resultam em lesões neuronais, que podem ser divididas em lesões cerebrais primárias e secundárias. A disfunção da barreira hematoencefálica (BHE), a excitotoxidade, o edema cerebral e a neuroinflamação são alguns dos efeitos nefastos do TCE mais bem descritos. Apesar da sua elevada prevalência, as terapias disponíveis no momento têm se focado somente em tratar os efeitos agudos. Assim, torna-se urgente a necessidade de identificar uma estratégia efetiva que contrarie quer as consequências agudas quer as crónicas que surgem após um TCE. Os neutrófilos são as primeiras células do sistema imune periférico a infiltrar-se no local do trauma e estão intimamente envolvidos na iniciação, desenvolvimento e resolução do TCE. Curiosamente foram detectados níveis elevados de CXCL8 no líquido cefalorraquidiano de pacientes correlacionados com a disfunção da BHE e o aumento de mortalidade. A quimiocina CXCL8 é um componente essencial da transmigração dos neutrófilos e um poderoso modulador da neuroinflamação no TCE através da ligação ao seu receptor CXCR2, o receptor mais importante na quimiotaxia. Este receptor é altamente expresso pelos neutrófilos e células endoteliais, e em condições basais parece estar presente em níveis baixos. Por outro lado, os seus níveis estão aumentados numa situação de patologia.Assim, colocamos a hipótese de que o eixo CXCL8-CXCR2 poder ser responsável pela quimiotaxia dos neutrófilos para o local do trauma em condições de TCE. Para tal, utilizámos uma linha celular endotelial humana (hCMEC/D3) exposta a uma pressão hidrostática elevada (PHE) correspondente a 70mmHg acima da pressão atmosférica durante 1h numa câmara hiperbárica.Os nossos resultados mostraram que a exposição direta à PHE conduziu à hiperpermeabilidade da BHE através de transcitose mediada por cavéolas, sem alterações na endocitose mediada por clatrina, nem no tráfego paracelular (sem alterações nos valores de TEER). Considerando que a cavéola é fundamental para a transcitose e que a Cav-1 é a principal proteína constituinte da cavéola, avaliámos também a fosforilação da Cav-1 no resíduo de tirosina Tyr14, necessário para a formação de vesículas. É importante ressaltar que observamos não apenas um aumento nos níveis totais da proteína Cav-1, mas também na sua forma fosforilada. Em seguida, para percebermos quais os mediadores envolvidos na transmigração de neutrófilos através da BHE, utilizámos células HL-60 diferenciadas (células HL60 tratadas com DMSO 1,3% por 3 dias). A inibição da formação de vesículas de caveolina impediu completamente a transmigração de neutrófilos, bem como a inibição de todas as enzimas NOX, ou especificamente NOX-1 (impedindo a formação de espécies reactivas de oxigénio). Além disso, também observámos quea E-selectina e a ICAM-1 são necessárias para esta migração. Finalmente, demonstrámos que a inibição do recetor CXCR2 impediu completamente a migração de neutrófilos em condições de TCE, bem como após a incubação direta de células endoteliais com CXCL8, mostrando que a ativação do CXCR2 é um passo fundamental para esta migração. Em suma, os nossos resultados sugerem que o eixo CXCL8-CXCR2 poderá ter um impacto na migração de neutrófilos através da BHE em condições de TCE, bem como que o transporte transcelular poderá ser a via escolhida para o efluxo de neutrófilos para o cérebro, com a interação de moléculas de adesão (i.e., ICAM-1) e a produção de espécies reactivas de oxigénio.FCTOutro - Pest-C/S AU/UI3282/2013-2014; - CNC. IBILI UID/NEU/04539/2013; - FCOMP-01-0124-FEDER-028417; - POCI-01-0145-FEDER-007440; - BrainHealth2020 (CENTRO-01-0145-FEDER-000008
Separação de lenhina e hemiceluloses de licor negro usando membranas de matriz mista
No full textTese de Programa Doutoral em Biorrefinarias apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaKraft black liquor (BL) is considered a byproduct of the pulp and paper industry, which is generated from the kraft pulping process. It is a complex mixture of organic and inorganic components. The most important organic components of BL are lignin and hemicelluloses. These biopolymers have been identified as potential feedstocks for biorefineries to develop a green economy. Within the framework of this thesis, studies were performed for the separation and recovery of these biopolymers from BL. Among the different methods, the major emphasis was given to preparation and application of mixed matrix membranes (MMM) for BL fractionation.Work started with the characterization of different BL samples obtained from different collection points from a pulp industry to analyze the variability in its composition. It was found that the composition of BL changed based on the point of collection and showed difference mainly in the dissolved solid content due to difference in polysaccharide content. Subsequently, the point of sample collection was fixed to minimize the effect of concentration variation on the performance of the membranes used during the filtration of BL.To fractionate BL into hemicellulose and lignin-rich streams, MMM for ultrafiltration (UF) and nanofiltration (NF) were prepared. It was Intended to obtain hemicellulose and lignin rich streams sequentially by integrating the UF and NF processes. First, UF membranes were used for the filtration of BL to concentrate hemicelluloses, while its permeate was filtered by NF membranes to separate lignin. UF membranes using ZnO nanoparticles (NP) and NF membranes with carbon-based NP (carbon nanotubes and activated carbon - AC) were prepared. These membranes were characterized by water and BL filtration experiments and other physiological properties, such as surface and pore morphology, surface roughness and hydrophilicity. The membrane with the best overall performance was selected for each UF and NF process. It was observed that the selected MMM were the most efficient for BL fractionation and had better flux and fouling resistance compared to simple polymeric membranes. Fouling resistance analysis, showed that most of the percentage of original water flux (> 95%) of prepared UF and NF membranes, which were used for BL filtration, was recovered by the cleaning process. The optimal conditions for the UF and NF process were identified by performing two sets of filtration experiments for each process in crossflow and dead-end filtration modes. In dead-end filtration mode, the effects of temperature, pressure, feed concentration and pH were optimized. Further in crossflow mode, the effects of cross flow velocity, pressure and feed volume reduction were optimized for UF and NF. The optimal operating conditions for UF using 0.5% ZnO-based membranes were found as 60 ºC, 3 bar and original pH of BL. While, for NF, performed using 0.1% AC-based membranes, optimal performance was achieved at 40 ºC, 12 bar and pH 11.5. These findings suggested that the prepared MMM can effectively fractionate BL into hemicellulose and lignin-rich streams with minimal fouling when used under optimal conditions.In the following studies, the extraction of hemicelluloses and lignin from BL by precipitation was investigated. For lignin precipitation, the performance of different organic and inorganic acids was compared to sulfuric acid by comparing yield and purity of the extracted lignin. Two organic acids (lactic and acetic acid) were selected for lignin precipitation and the extraction process was optimized by studying the effects of pH, and temperature. For hemicellulose extraction, two precipitation methods were studied, namely antisolvent precipitation using acetone and acidification using acetic acid along with an organic solvent. In the first method, both lignin and hemicellulose were precipitated from BL in two sequential steps. While through second method only hemicellulose was precipitated maintaining the lignin in the residual liquor. The optimal conditions for hemicellulose extraction were identified by studying the effects of temperature, pH, and solvent/BL ratio.As a last step of this study, the valorization of lignin was examined by producing lignin nanoparticles (LNP). The optimal conditions for the preparation of LNP were identified including lignin concentration, surfactant concentration, and pH. The prepared LNP also showed some antibacterial activity.Overall, this work demonstrates the potential for the separation and purification of lignin and hemicelluloses from BL using a variety of methods, including the use of MMM and chemical precipitation. The recovery of these biopolymers and their valorization can contribute to the sustainability of environment and paper industry. Further optimization studies and economic analysis of these processes will help in determining their feasibility on a larger scale.O licor negro (LN) é um subproduto do processo de cozimento Kraft utilizado no fabrico de pasta de celulose. É uma mistura complexa, constituída pelos químicos de cozimento e componentes de biomassa dissolvidos. Os componentes orgânicos mais importantes do LN são a lenhina e hemiceluloses. No âmbito desta tese, foram realizados diferentes estudos para a separação e recuperação destes biopolímeros a partir do LN, principalmente usando membranas de matriz mista (MMM).Inicialmente, caracterizaram-se diversas amostras de LN recolhidas em distintos pontos de amostragem do processo de cozimento kraft de uma empresa de produção de pasta. A composição foi principalmente analisada em termos de sólidos totais, conteúdo orgânico e inorgânico e concentrações de lenhina e hemicelulose. Verificou-se que a composição do LN dependia do local de amostragem e, portanto, fixou-se o ponto de coleta das amostras minimizando assim o efeito da variação de concentração do LN durante o processo de filtração.Para fracionar o LN em correntes ricas em hemicelulose e lenhina, foram preparadas MMM para ultrafiltração (UF) e nanofiltração (NF). O objetivo foi obter correntes ricas em hemicelulose e lenhina integrando os processos de UF e NF de forma sequencial. Pretendia-se concentrar a hemicelulose no retido do processo de UF, enquanto o permeado deste processo era posteriormente filtrado por membranas de NF preparadas para concentrar a lenhina.As membranas de UF foram preparadas utilizando nanopartículas (NP) de ZnO e as membranas de NF com NP de carbono (nanotubos de carbono - CNT e carvão ativado - AC) usando distintas concentrações de NP. Estas membranas foram posteriormente caracterizadas quanto à sua morfologia de superfície e poros, bem como a sua hidrofilicidade. Avaliou-se o desempenho destas membranas em termos de fluxos de permeação através de testes de filtração apenas com água e LN.Com base nestes estudos, selecionaram-se as membranas que demonstraram o melhor desempenho na filtração de LN (fluxo e rejeição de lenhina ou de hemicelulose) para o processo de UF e de NF. Comparando com membranas poliméricas simples, as MMM selecionadas apresentaram uma maior resistência à colmatação, com recuperação de >95% do fluxo inicial após uma etapa de limpeza, demonstrando assim o potencial de reutilização destas membranas. As condições ótimas de operação de UF e NF foram identifica das após a realização de um conjunto de testes em modo de filtração em fluxo cruzado (crossflow) e em escoamento frontal (dead-end). Os processos de UF e NF foram otimizados usando uma célula de filtração operada em fluxo cruzado de forma a avaliar os efeitos da pressão, velocidade de escoamento tangencial e redução do volume da alimentação. As condições de operação ótimas encontradas para UF usando membranas com 0.5% de ZnO foram: 60 °C, 3 bar e pH original de LN. Para a NF usando membranas com 0,1% AC, o desempenho ótimo foi alcançado a 40 °C, 12 bar e pH 11,5. Esses resultados sugerem que as membranas de matriz mista preparadas podem fracionar eficientemente o LN em correntes ricas em hemicelulose e lenhina com mínima obstrução dos poros quando usadas sob condições ótimas.Nos estudos seguintes, foi investigada a extração de hemiceluloses e lenhina do licor negro por precipitação ácida. Para a precipitação de lenhina, comparou-se o desempenho de diferentes ácidos orgânicos e inorgânicos com o ácido sulfúrico, tendo em conta os valores de rendimento e pureza da lenhina extraída. Selecionaram-se 2 ácidos orgânicos (ácido lático e ácido acético) para a precipitação de lenhina e o processo de extração foi otimizado estudando os efeitos do pH e temperatura. Para a extração de hemiceluloses, estudaram-se 2 métodos de precipitação: a precipitação anti-solvente usando acetona e a acidificação usando ácido acético na presença de um solvente orgânico. No primeiro método, tanto lenhina quanto hemicelulose foram precipitadas do LN em dois passos sequenciais. Primeiro, a lenhina foi precipitada pela acidificação do LN e em seguida o sobrenadante foi usado como fonte de hemicelulose. Enquanto isso, através do método de acidificação, somente a hemicelulose foi precipitada, mantendo a lenhina na solução residual. Identificaram-se as condições ótimas para a extração de hemiceluloses com elevado rendimento e pureza avaliando os efeitos da temperatura, do pH e da razão solvente/LN.Por último, estudou-se a valorização da lenhina através da produção de nanopartículas de lenhina (NPL). Identificaram-se as condições ótimas para a preparação de LNP considerando os efeitos da concentração de lenhina, da concentração de um surfactante e o do pH. As NPL preparadas demonstraram possuir alguma atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus. No geral, este trabalho foi capaz de demonstrar o potencial de aplicação de membranas e processos de precipitação química para a separação e purificação de lenhina e hemiceluloses do licor negro.Outro - Project Inpactus – innovative products and technologies from eucalyptus, Project N.º 21874 funded by Portugal 2020 through the European Regional Development Fund (ERDF) in the frame of COMPETE 2020 nº246/AXIS II/201
Ecodesign baseado em Avaliação de Ciclo de Vida para embalagens de medicamentos
No full textTese de Doutoramento em Engenharia do Ambiente apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA embalagem pode ser um aspecto crítico no desempenho ambiental dos produtos farmacêuticos. Para melhorar o desempenho ambiental das embalagens farmacêuticas, são necessárias avaliações abrangentes de ciclo de vida (Avaliação de Ciclo de Vida - ACV) e abordagens de concepção ecológica (ecodesign) com base em ACV. O principal objetivo desta tese é propor uma abordagem de ecodesign baseada em ACV para fornecer informações e recomendações de melhoria do desempenho ambiental e apoiar o ecodesign de embalagens de medicamentos. Em primeiro lugar, é realizada uma ACV de diferentes tipos de embalagens de medicamentos (blister, frasco e saqueta) para quatro medicamentos selecionados (comercializados em farmácias comunitárias na Europa). As opções de embalagem (tipos, materiais, peso e volume) disponíveis para o mesmo medicamento são avaliadas com base numa seleção de medicamentos comercializados em Portugal, representativos do mercado Europeu. Diferentes rotas de distribuição e modos de transporte são modelados. Alternativas de final-de-vida são avaliadas com base nas opções atuais de descarte de embalagens de medicamentos após o uso: devolução à farmácia (reciclagem e incineração) e recolha de resíduo doméstico (aterro e incineração).Em segundo lugar, é apresentada uma nova abordagem de ecodesign baseada em ACV para embalagens de medicamentos, avaliando oportunidades de melhoria do desempenho ambiental das embalagens, e fornecendo recomendações de ecodesign para apoiar o setor farmacêutico. A abordagem de ecodesign foi aplicada para embalagens comercializadas em farmácias em Portugal. Adicionalmente, é proposta uma ferramenta simplificada de ecodesign para embalagens de medicamentos, com base na abordagem de ecodesign desenvolvida, para apoiar a decisão nas fases iniciais do design de embalagem, quando a informação disponível é limitada. Por fim, são desenvolvidas recomendações de ecodesign dirigidas aos stakeholders, ilustradas em fichas com exemplos de ecodesign, para promover uma comunicação eficaz com o setor farmacêutico.Os resultados da ACV mostram que há uma variação elevada dos impactes entre as embalagens alternativas para o mesmo medicamento, sendo mais significativa para blisters (até cinco vezes) do que para frascos e saquetas. A fase de produção dos materiais é a que mais contribui (até 98%) para os impactes de ciclo de vida, seguida do transporte, final-de-vida e embalamento (até 27%, 25% e 12%, respectivamente). Os impactes de transporte por camião são mais significativos para embalagens mais volumosas, pois a quantidade de embalagens transportadas é limitada pelo volume e não pelo peso. Comboio e navio apresentam melhor desempenho ambiental. A opção de final-de-vida por devolução à farmácia apresentou impactes de final de vida menores (do que a incineração e o aterro) devido aos benefícios da reciclagem e recuperação de energia.A abordagem de ecodesign baseada em ACV para embalagens de medicamentos quantificou os impactes ambientais, avaliando oportunidades de melhoria para o desempenho ambiental das embalagens e propondo recomendações. Os estudos de ACV de três estratégias de ecodesign desenvolvidos mostram que melhorias na concepção das embalagens podem reduzir significativamente (até 70%) os impactes de ciclo de vida. As recomendações de ecodesign orientadas para as partes interessadas do setor farmacêutico incluem exemplos (de processos de tomada de decisão no ciclo de vida da embalagem), quantificando a redução do impacte de uma solução de ecodesign em comparação com um exemplo original. As recomendações destacam o uso de embalagens de menor volume, e evitando o uso de elementos supérfluos, reduzindo custos de materiais e produção e impactes de transporte; a seleção de meios de transporte com menor impacte ambiental, considerando o local de produção das embalagens; e a utilização de veículos elétricos para distribuição às farmácias. A ferramenta simplificada de ecodesign mostrou potencial para fornecer informações ambientais sobre as embalagens de medicamentos baseadas em ACV, identificando os principais aspectos da embalagem que causam impacte, e permitindo escolhas (materiais, meios de transporte) nas fases iniciais do processo de concepção.Esta tese mostra como o ecodesign baseado em ACV quantifica impactes ambientais e apoia na incorporação de informações ambientais na fase de concepção, seleção de materiais e produção de embalagens, incluindo a logística de distribuição e consumidores finais. Também enfatiza a importância de realizar ecodesign para embalagens específicas, com base em estudos de ACV, para melhorar o desempenho ambiental e fornecer recomendações, bem como promover a incorporação do ecodesign baseado em ACV nas etapas iniciais de concepção das embalagens. Finalmente, esta tese fornece orientações para as partes interessadas e futuras regulamentações, auxiliando na transição para a descarbonização do setor farmacêutico.Packaging can be a critical aspect of the environmental performance of pharmaceutical products. To improve the environmental performance of pharmaceutical packaging, comprehensive life cycle assessments (LCA) and ecodesign approaches based on LCA are needed. The main goal of this thesis is to propose an ecodesign approach based on LCA to provide insights and recommendations for improving the environmental performance and supporting ecodesign of pharmaceutical packaging. Firstly, an LCA of different types of pharmaceutical packaging (blister, bottle and sachet) for four selected medicines (commonly commercialized in community pharmacies in Europe) is performed. Alternative packaging options (types, materials, weight, and volume) available for the same medicine are assessed based on a selection of commercialized medicines in Portugal, representing the European market. Different distribution routes and transport modes are modeled. End-of-life alternatives are evaluated based on the current options treatment of pharmaceutical packaging after use: take-back (recycling and incineration) and domestic waste collection (landfill and incineration).Secondly, a novel ecodesign approach based on LCA for pharmaceutical packaging is presented, assessing opportunities to improve the environmental performance of packaging, and providing ecodesign recommendations to support the pharmaceutical sector. An application of the ecodesign approach is performed for packaging commercialized in pharmacies in Portugal. Furthermore, a streamlined ecodesign tool for pharmaceutical packaging is proposed, based on the ecodesign approach developed, to support the early-stage decision of packaging design when limited information is available. Finally, ecodesign recommendations oriented to stakeholders are developed, illustrated in sheets with examples of ecodesign, to promote an effective communication with the pharmaceutical sector.The results of a comprehensive LCA show that there is a high variation of impacts within the alternative packaging for the same medicine, being more significant for blisters (up to five times) than for bottles and sachets. The materials production phase is the highest contributor (up to 98%) to life cycle impacts, followed by transportation, end-of-life and packing process (up to 27%, 25% and 12%, respectively). Truck transportation impacts are more significant for larger-size packaging due to the amount of packaging transported being limited by volume rather than weight. Train and ship presented better environmental performance for transport. Take-back presented lower end-of-life impacts (than incineration and landfill) due to benefits from recycling and energy recovery.The ecodesign approach LCA-based for pharmaceutical packaging developed quantified the environmental impacts, assessing opportunities to improve the environmental performance of packaging and proposing recommendations. The LCA studies developed of the three ecodesign strategies showed that improvements in packaging ecodesign can significantly reduce (up to 70%) the life cycle impacts. Ecodesign recommendations oriented to stakeholders include examples (of decision-making processes in the packaging life cycle), quantifying the impact reduction of an ecodesign solution compared to an original example. Ecodesign recommendations highlight the use of smaller-size packaging and avoiding superfluous elements, which reduces material and production costs, and transportation impacts; the selection of modes of transportation with less environmental impact, considering the packaging production location; and the use of electric vehicles for pharmacy distribution. The streamlined ecodesign tool developed showed potential to provide environmental information on pharmaceutical packaging based on LCA, identifying the main drivers of the impact of packaging and allowing choices (materials, transportation modes) in early stages of the design process.This thesis shows how ecodesign based on LCA quantifies environmental impacts and supports the incorporation of environmental information in the design phase, material selection, and packaging production, until distribution logistics and the final consumers. It also emphasizes the importance of performing ecodesign for specific packaging, based on LCA studies, to improve environmental performance and provide more effective recommendations to stakeholders, as well as to promote the incorporation of ecodesign based on LCA in the early stages of packaging design process. Finally, this thesis provides directions for pharmaceutical stakeholders and future regulations, helping the transition for decarbonization of the pharmaceutical sector
Um novo mecanismo de reparação da membrana plasmática dependente de Cx43 necessário para a função vascular
No full textTese de Programa de Doutoramento em Ciências da Saúde apresentada à Faculdade de MedicinaEfficient plasma membrane repair mechanisms (PMR) have been evolutionary developed by cells to counteract membrane injuries that can compromise their function and viability. The chronic exposure to blood flow-related forces renders endothelial cells particularly prone to plasma membrane damage. Although it is conceivable that endothelial cells have evolved a highly efficient PMR system to cope with this stress-inducing environment, the underlying mechanisms and signalling pathways remain largely unknown. Underpinned in preliminary data suggesting that Connexin43 (Cx43), a protein canonically associated with gap junction-mediated intercellular communication, has a role in PMR, we aimed to explore in more detail whether Cx43 acts as a player in membrane repair response of endothelial cells upon plasma membrane injury, using a mouse cardiac endothelial cell (MCEC) line and resorting to diverse cellular and biology approaches. In this work, we showed that MCEC activate an extracellular calcium-dependent PMR response after membrane wounding elicited by different plasma membrane damage inducers, including the small holes elicited by the bacterial pore-forming toxin Streptolysin O (SLO). Grounded on the data gathered in this study we propose a model in which Cx43 participates in endocytosis-associated PMR of cardiac endothelial cells upon SLO-induced damage, instead of being involved in membrane repair processes that involves the outward budding of the plasma membrane. Altogether, this study establishes a new non-canonical role for Cx43 in PMR of endothelial cells and sheds some light on the Cx43-associated PMR mechanisms triggered by injured endothelial cells, linking key players of endocytosis and autophagy in this process. Of note, a deeper knowledge of the molecular players and mechanisms underlying PMR response of endothelial cells is of utmost importance to develop strategies that tackle membrane repair impaired-associated vascular disorders. Direct intercellular communication can be mediated by gap junctions but can also occur through tubular structures named tunnelling nanotubes (TNTs), which connect the cytoplasm of neighbouring cells and facilitate the transport of molecules, ions and pathogens. Although the formation of TNTs between cardiomyocytes has been reported, the effect of ischaemia on this process remains unclear. In this work, we also assessed the impact of ischaemia and oxidative stress on TNT-mediated communication between cardiac cells. Our data showed that cardiac cell lines and neonatal primary cultures of cardiomyocytes subjected to in vitro ischaemia form more TNTs than control cells. Moreover, antioxidants prevented ischaemia-induced TNT formation, suggesting that oxidative stress regulates this process. Furthermore, this work identified troponin T as a new specific marker of cardiomyocyte-derived TNTs, which allows for the identification of heterocellular TNT connections between cardiomyocytes and other resident cells in the heart, such as fibroblasts. Our results also revealed the presence of TNT-like structures in rat and human hearts. Rat hearts subjected to global ischaemia in the ex vivo Langendorff system showed increased formation of TNTs. Altogether, this study demonstrates that ischaemia affects the formation of TNTs in the heart and sheds new light on the disease-associated deregulation of communication between cardiac cells.Mecanismos eficientes de reparação da membrana plasmática (RMP) têm sido evolutivamente desenvolvidos pelas células para eliminarem danos na superfície celular que possam comprometer a sua função e viabilidade. A exposição crónica a forças relacionadas com o fluxo sanguíneo torna as células endoteliais particularmente suscetíveis a danos na membrana plasmática. Embora seja expectável que as células endoteliais possuam um sistema de reparação da membrana plasmática eficiente para lidar com este ambiente indutor de stress, os mecanismos e vias envolvidas foram, até à data, pouco estudadas. Com base em resultados preliminares sugerindo que a conexina43 (Cx43), uma proteína canonicamente associada à comunicação intercelular mediada por gap junctions, tem um papel na RMP, pretendemos explorar em maior detalhe se a Cx43 participa na resposta de RMP de células endoteliais após dano na membrana plasmática, recorrendo a uma linha celular de células endoteliais cardíacas de ratinho (MCEC) e a diversas técnicas de indução de lesão e abordagens de biologia celular e molecular, para avaliação do dano causado. Neste trabalho, mostrámos que as MCEC ativam uma resposta de reparação da membrana plasmática dependente de cálcio extracelular após lesão da membrana causada por diferentes agentes, incluindo pequenos orifícios induzidos pela toxina bacteriana formadora de poros, a estreptolisina O (EO). Com base nos nossos dados, é mais provável que a Cx43 participe na RMP mediada por endocitose de células endoteliais cardíacas após dano induzido pela EO, em vez de estar envolvida em processos de reparação da membrana que envolvem a deformação da membrana plasmática para o espaço extracelular. De modo geral, este estudo estabelece um novo papel não canónico para a Cx43 na RMP de células endoteliais e desvenda alguns dos mecanismos de RMP associados a Cx43 desencadeados por células endoteliais com lesão na membrana plasmática, ligando componentes importantes envolvidos na endocitose e autofagia neste processo. É importante ressaltar que um conhecimento mais profundo dos elementos moleculares e mecanismos subjacentes à resposta de RMP das células endoteliais é de extrema importância para desenvolver estratégias que combatam os distúrbios vasculares associados ao comprometimento da reparação da membrana.A comunicação intercelular direta pode ser mediada por gap junctions, mas também pode ocorrer através de estruturas tubulares denominadas tunnelling nanotubes (TNTs), que conectam o citoplasma de células vizinhas e facilitam o transporte de diversos elementos celulares. Embora a formação de TNTs entre cardiomiócitos tenha sido já descrita, o efeito da isquemia neste processo permanece desconhecido. Neste trabalho avaliámos o impacto da isquemia e do stress oxidativo na comunicação mediada por TNTs entre células cardíacas. Os nossos resultados mostraram que em linhas celulares cardíacas e em culturas primárias de cardiomiócitos que foram sujeitos a isquemia in vitro são observados mais TNTs do que em células cardíacas mantidas em condições controlo. Além disso, antioxidantes preveniram a formação de TNTs induzida por isquemia, sugerindo que o stress oxidativo regula este processo. Este trabalho identificou um novo marcador específico de TNTs derivados de cardiomiócitos, a troponina T, o que permite a identificação de TNTs heterocelulares entre cardiomiócitos e outras células residentes no coração, como fibroblastos. Os nossos resultados também revelaram a presença de estruturas semelhantes a TNTs em corações de ratos e humanos. Corações de ratos submetidos a isquemia global usando o sistema ex vivo de Langendorff mostraram aumento da formação de TNTs. Este estudo demonstra que a isquemia afeta a formação de TNTs no coração, constituindo mais um passo para ajudar a esclarecer alguns mecanismos envolvidos na desregulação da comunicação entre as células cardíacas, em condições patológicas.FC
Salinization and litter quality effects on leaf litter decomposition
No full textTese de Doutoramento em Biociências apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaAnthropogenic salinization is currently a major global threat to the biota and functional processes of freshwater streams, but little is known about its effects on leaf decomposition, key ecosystem process in forested streams. In particular, it is still unclear how the quality of organic matter of terrestrial origin can affect leaf processing by microbial decomposers and detritivores in salinized streams. The main objective of this study was to evaluate the effects of salt (NaCl) on the leaf decomposition process mediated by aquatic hyphomycetes (AH) and shredders and the relative importance of leaf quality ( per se or via fungal colonization) in the process. This thesis is composed of six chapters. After a general introduction (Chapter I), (Chapter II) evaluated the importance of chestnut (C; Castanea sativa Mill.) and oak (O; Quercus robur L.) leaf litter quality on microbial decomposition and fungal variables in microcosms containing salt-contaminated media (0, 1, 3 and 6 g L-1 NaCl). Leaf species were incubated individually, and as a mixture (1:1), for 28 days in each saline concentration. Salinization decreased leaf mass loss, fungal biomass, respiration and sporulation rates, particularly at the highest salt concentration. Results suggest a similar intensity of response for all the parameters evaluated (except sporulation) for the two species tested, per se and in mixture, indicating a response to salt contamination independent of leaf quality. In Chapter III, the concomitant effects of NaCl salinization and leaf quality — intrinsic or determined by conditioning — on the feeding behavior and performance of shredders were evaluated. Both leaf species were conditioned in reference (0 g L-1 NaCl) or salinized (3 g L-1 NaCl) medium and offered to the shredder Schizopelex festiva (Sericostomatidae; Trichoptera) kept in reference or salinized medium. Exposure to the salinized medium reduced growth, led to lower survival and eliminated the ability of S. festiva to discriminate between oak leaves conditioned in either medium. Results suggest that direct exposure to salinized medium is the main route of toxicity (sublethal and lethal effects) despite predictable consequences on the feeding ecology of these larvae. In Chapter IV, the importance of fungal richness (2 vs. 5 species of AH) in leaf decomposition and associated fungal variables was assessed. Oak and chestnut leaves were colonized in microcosms in media enriched with 3 or 6 g L-1 NaCl. Salinization, especially at 6 g L-1 NaCl, depressed leaf decomposition, fungal biomass and oxygen consumption, regardless of leaf quality and fungal richness. Chapter V corresponds to a stream manipulation test evaluating the effects of salt pulses on the decomposition of unconditioned and 10 days-conditioned chestnut leaves. Mass loss, fungal biomass and microbial respiration rate during exposure to salt pulses (salinization period, SP; 7 days) and after the pulses stopped (recovery period, RP; 4 days) were assessed. After the SP, none of the parameters were affected by salinization, regardless of the degree of leaf conditioning. After the RP, there was a reduction in leaf degradation, microbial metabolism and fungal biomass in the conditioned leaves on the salinized side; in the unconditioned leaves, only the biomass was lower in the leaves previously subjected to salinization. In general, salinization (chronic and pulsed) of the water negatively affected the leaf decomposition. Chronic salt contamination mainly affected leaf decomposition through waterborne effects on invertebrates’ performance and fungal colonization, regardless of leaf species and associated fungal richness. Salt pulse scenarios seem to be more deleterious on leaves with extended fungal conditioning through legacy effects after cessation of contamination. Although the influence of the intrinsic quality of the leaves was not always clear, the results suggest that the inherent physicochemical characteristics of the leaves may be relevant to the response of the microbial and invertebrate communities to salinization, depending on the pattern of contamination.A salinização antropogénica é atualmente uma das principais ameaças globais à biota e aos processos funcionais dos cursos de água doce, mas pouco se sabe sobre os seus efeitos na decomposição das folhas, um processo chave do ecossistema em cursos de água florestados. Em particular, ainda não está claro como a qualidade da matéria orgânica de origem terrestre pode afetar o processamento das folhas por decompositores microbianos e detritívoros em ribeiros salinizados. O principal objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do sal (NaCl) no processo de decomposição foliar mediado por hifomicetes aquáticos (AH) e macroinvertebrados trituradores e a importância relativa da qualidade da folha (per se ou via colonização fúngica) no processo. Esta tese é composta por seis capítulos. Após uma introdução geral (Capítulo I), o (Capítulo II) avaliou a importância da qualidade da folhada de castanheiro (C; Castanea sativa Mill.) e de carvalho (O; Quercus robur L.) na decomposição microbiana e nas variáveis fúngicas em microcosmos contendo meios contaminados com sal (0, 1, 3 e 6 g L-1 NaCl). As espécies de folhas foram incubadas individualmente, e em mistura (1:1), durante 28 dias em cada concentração salina. A salinização diminuiu a perda de massa foliar, a biomassa fúngica, a respiração e as taxas de esporulação, particularmente na concentração salina mais elevada. Os resultados sugerem uma intensidade de resposta semelhante para todos os parâmetros avaliados (exceto a esporulação) para as duas espécies testadas, per se e em mistura, indicando uma resposta à contaminação por sal independente da qualidade da folha. No Capítulo III, foram avaliados os efeitos concomitantes da salinização com NaCl e da qualidade das folhas — intrínseca ou determinada pelo condicionamento — sobre o comportamento alimentar e na performance de larvas de trituradores. Ambas as espécies de folhas foram condicionadas em meio de referência (0 g L-1 NaCl) ou salinizado (3 g L-1 NaCl) e oferecidas ao triturador Schizopelex festiva (Sericostomatidae; Trichoptera) mantido em meio referência ou salinizado. A exposição ao meio salinizado reduziu o crescimento, levou a uma menor sobrevivência e eliminou a capacidade de S. festiva de discriminar entre folhas de carvalho condicionadas em ambos os meios. Os resultados sugerem que a exposição direta ao meio salinizado é a principal via de toxicidade (efeitos subletais e letais), apesar das consequências previsíveis na ecologia alimentar destas larvas. No Capítulo IV, foi avaliada a importância da riqueza fúngica (2 vs. 5 espécies de AH) na decomposição foliar e variáveis fúngicas associadas. Folhas de carvalho e castanheiro foram colonizadas em microcosmos em meios enriquecidos com 3 ou 6 gL-1 NaCl. A salinização, especialmente a 6 g L-1 NaCl, deprimiu a decomposição foliar, a biomassa fúngica e o consumo de oxigénio, independentemente da qualidade da folha e da riqueza fúngica. O capítulo V corresponde a um ensaio de manipulação de ribeiro que avalia os efeitos de inputs de sal na decomposição de folhas de castanheiro não condicionadas e condicionadas durante 10 dias. Foram avaliadas a perda de massa, a biomassa fúngica e a taxa de respiração microbiana durante a exposição aos pulsos salinos (período de salinização, PS; 7 dias) e após a paragem dos pulsos (período de recuperação, PR; 4 dias). Após o SP, nenhum dos parâmetros foi afectado pela salinização, independentemente do grau de condicionamento das folhas. Após a RP, houve redução da degradação foliar, do metabolismo microbiano e da biomassa fúngica nas folhas condicionadas do lado salinizado; nas folhas não condicionadas, apenas a biomassa foi menor nas folhas previamente submetidas à salinização. Em geral, a salinização (crónica e pulsada) da água afectou negativamente a decomposição das folhas. A contaminação crónica com sal afectou principalmente a decomposição das folhas através dos efeitos da água no desempenho dos invertebrados e na colonização fúngica, independentemente da espécie de folha e da riqueza fúngica associada. Os cenários de pulso de sal parecem ser mais deletérios em folhas com condicionamento fúngico prolongado através de efeitos herdados após a cessação da contaminação. Embora a influência da qualidade intrínseca das folhas nem sempre tenha sido clara, os resultados sugerem que as características físico-químicas inerentes às folhas podem ser relevantes para a resposta das comunidades microbianas e de invertebrados à salinização, dependendo do padrão de contaminação
Implementation of SAP ERP - The case of Dan Cake
No full textRelatório de Estágio do Mestrado Em Gestão apresentado à Faculdade de EconomiaO presente relatório tem como objetivo enquadrar e descrever as tarefas realizadas durante o estágio curricular desenvolvido na Dan Cake, com o fim de concluir o grau de mestrado em Gestão, pela Faculdade de Economia da Universidade de Coimbra (FEUC), referente ao ano letivo 2022/2023.Durante o estágio, que se enquadra na área de logística, fui integrada no departamento de armazém de matérias-primas onde desempenhei tarefas habituais que competem ao departamento e tarefas relativas à implementação do novo software de gestão SAP. O primeiro conjunto de tarefas consistiu no lançamento das receções, devoluções e transferências entre armazéns no antigo sistema de gestão Sage X3. O segundo conjunto, e o mais importante, consistiu no comparecimento às formações de SAP, elaboração do manual/ guia de utilização do SAP, execução dos User Acceptance Testing (UAT) e dos testes integrados e na consequente formação dos restantes membros da equipa.Durante vários anos o software SAGE X3 foi utilizado pela Dan Cake como principal ferramenta de gestão. No entanto, proveniente da aquisição da Dan Cake pela empresa francesa Biscuit International, surgiu a necessidade de uniformizar o sistema de gestão do grupo de forma a permitir que a informação flua de forma transparente dentro do grupo e para um melhor acompanhamento e controlo. Para atender a essa nova realidade, começou a ser implementado o software de gestão SAP em todos os departamentos. A base de dados SAP é partilhada entre as diferentes unidades organizacionais que participam no mesmo processo de negócio. Para além disso, o SAP oferece a possibilidade de melhorar a colaboração e organizar melhor os esforços entre o pessoal de diferentes departamentos num mesmo processo.This report aims to frame and describe the tasks carried out during the curricular internship developed at Dan Cake, in order to complete the Master's degree in Management, by the Faculty of Economics of the University of Coimbra (FEUC), referring to the year 2022/2023.During the internship, which falls within the logistics area, I was integrated into the raw materials warehouse department where I performed regular tasks that are incumbent on the department and tasks related to the implementation of the new SAP management software. The first set of tasks consisted of launching receipts, returns and transfers between warehouses in the old Sage X3 management system. The second set, and the most important, consisted of comparing the SAP training courses, preparing the SAP user manual/guide, carrying out the User Acceptance Testing (UAT) and the integrated tests and the consequent training of the remaining team members.For several years, the SAGE X3 software was used by Dan Cake as the main management tool. However, arising from the acquisition of Dan Cake by the French company Biscuit International, the need arose to standardize the group's management system to allow information to flow transparently within the group and for better monitoring and control. To meet this new reality, SAP management software began to be implemented in all departments.The SAP database is shared between different organizational units participating in the same business process. In addition, SAP offers the possibility to improve collaboration and better organize efforts between staff from different departments in the same process