68199 research outputs found
Sort by
A novel nanoparticle formulation for combined gene therapy and chemotherapy application in hepatocellular carcinoma
No full textTese de Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina apresentada ao Instituto de Investigação InterdisciplinarO cancro do fígado é a sexta causa mais comum de cancro e a terceira principal causa de morte por cancro em todo o mundo, sendo que o carcinoma hepatocelular (CHC) corresponde a cerca de 90% dos tumores primários de fígado. Atualmente, o transplante hepático e a ressecção cirúrgica são as abordagens terapêuticas mais eficazes para doentes com CHC em estádios iniciais. No entanto, na grande maioria dos doentes com CHC o diagnóstico é feito num estádio avançado da doença. Nestes casos, a administração de fármacos quimioterapêuticos corresponde ao tratamento mais comum, embora apenas prolongue ligeiramente a sobrevivência dos doentes. Deste modo, os doentes com estádios avançados de CHC têm um prognóstico reservado, o que faz com que a taxa de incidência do CHC seja praticamente igual à taxa de mortalidade. O CHC é uma doença extremamente complexa e, de facto, o estudo do genoma e epigenoma dos tumores têm demonstrado que a hepatocarcinogénese está associada a várias alterações genéticas e epigenéticas com desregulação de múltiplas vias de sinalização celular que controlam processos celulares importantes, como a proliferação, o ciclo celular, a diferenciação e a sobrevivência celular. Neste contexto, o desenvolvimento de novas estratégias antitumorais focadas nestas vias de sinalização pode contribuir de forma substancial para o melhoramento do prognóstico do CHC. A combinação de diferentes fármacos que inibam vias de sinalização cruciais à hepatocarcinogenese ou a combinação da expressão de transgenes supressores de tumores com fármacos inibidores das referidas vias de sinalização pode resultar num elevado efeito antitumoral. No entanto, tanto os fármacos como os ácidos nucleicos carecem de nanoestruturas funcionais que permitam, entre outras propriedades, melhorar a estabilidade destes agentes terapêuticos, aumentar a sua especificidade e eficiência de entrega às células alvo, e minimizar os seus efeitos secundários. Neste sentido, o principal objetivo deste trabalho consistiu em desenvolver nanossistemas híbridos (HNP) com capacidade para entregar diferentes agentes terapêuticos, de forma eficiente e específica, a células de CHC. Foram desenvolvidas duas formulações, uma com capacidade para transportar de forma eficiente dois fármacos quimioterapêuticos, e a outra com capacidade para transportar de forma eficiente um plasmídeo de DNA e dois fármacos. A primeira formulação dos HNP consiste num núcleo de poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) revestido por uma bicamada lipídica contendo o ligando GalNac para permitir uma interação especifica com o recetor das asialoglicoproteinas, sobreexpresso nas células de CHC. No núcleo de PLGA foi encapsulado o selumetinib, um inibidor alostérico potente e seletivo da MEK1/2, cuja ativação é essencial para a proliferação celular. Na bicamada lipídica foi encapsulado o sorafenib, um inibidor de múltiplas proteínas quinases, utilizado no tratamento sistémico de primeira linha no CHC. Os nossos resultados demonstraram que este nanossistema apresenta propriedades físico-químicas adequadas, nomeadamente tamanho reduzido, elevada estabilidade e grande capacidade de carga para ambos os fármacos. Além disso, este HNP demonstrou ter capacidade para contornar a resistência aos fármacos e apresentou elevada especificidade, promovendo grandes níveis de morte em células de CHC, mas não em células não tumorais. Adicionalmente, esta formulação permitiu potenciar o efeito antitumoral dos fármacos co-encapsulados, através do aumento da morte celular programada, que ocorreu não só em culturas celulares 2D como em culturas celulares 3D. Por sua vez, o segundo HNP desenvolvido consistiu num núcleo de PLGA, no qual foi encapsulado o selumetinib, revestido com um plasmídeo de ADN contendo o transgene PTEN e uma bicamada lipídica sensível ao pH contendo o fármaco perifosina e o ligando GalNAc, para permitir a interação com o recetor das asialoglicoproteínas. O transgene PTEN codifica a proteína supressora tumoral PTEN e a perifosina é um inibir da AKT cuja ativação é essencial para a sobrevivência celular. Os nossos resultados mostraram que esta formulação apresenta não só uma elevada capacidade de transporte dos dois fármacos como também do material genético, permitindo uma expressão eficiente do transgene PTEN nas células alvo. Além disso, este nanossistema possui elevada estabilidade, propriedades físico-químicas adequadas, e elevada especificidade para as células de HCC. Esta formulação resultou num elevado efeito antitumoral, combinando a quimioterapia com a terapia génica, observando-se não só um aumento da morte celular programada como uma diminuição da proliferação celular, quer em culturas celulares 2D quer nas 3D. Globalmente, os nanossistemas híbridos desenvolvidos neste trabalho, juntamente com as estratégias terapêuticas por eles mediadas, constituem plataformas promissoras para a geração de novas abordagens terapêuticas para o CHC.Liver cancer is the sixth most common cause of cancer and the third leading cause of cancer death worldwide, with hepatocellular carcinoma (HCC) accounting for about 90% of primary liver tumors. Presently, liver transplantation and surgical resection are the most effective therapeutic approaches for patients with early stage HCC. However, in the vast majority of patients with HCC the diagnosis is made in advanced stages of the disease. In these cases, the administration of chemotherapeutic drugs corresponds to the most common treatment, although it only slightly improve the survival of these patients. Therefore, patients with advanced stages of HCC have a poor prognosis, which makes the HCC incidence rate practically equal to the mortality rate. HCC is a very complex disease and, in fact, genome and epigenome studies of tumors have demonstrated that hepatocarcinogenesis is associated with several genetic and epigenetic alterations with dysregulation of multiple cell signaling pathways that control important cellular processes, such as proliferation, cell cycle, differentiation and cell survival. In this context, the development of new antitumor strategies focused on these signaling pathways could substantially contribute to improve the prognosis of HCC. The combination of different chemotherapeutic drugs that inhibit crucial signaling pathways of hepatocarcinogenesis or the combination of tumor suppressor transgenes expression with different drugs that inhibit the referred signaling pathways may result in high antitumor effect. However, both drugs and nucleic acids lack of functional nanostructures that allow, among other properties, to improve the stability of these therapeutic agents, to increase their delivery specificity and efficiency to target cells, and to minimize their side effects. In this regard, the main objective of this work was to develop hybrid nanosystems (HNP) capable of efficiently and specifically delivering different therapeutic agents to HCC cells. Two formulations were developed, one with the ability to efficiently transport two chemotherapeutic drugs; and the other one with the capacity to efficiently transport a DNA plasmid and two drugs. The first HNP formulation consists of a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) core coated with a lipid bilayer containing the GalNac ligand to allow a specific interaction with the asialoglycoprotein receptor, which is overexpressed in HCC cells. The drug selumetinib, a potent and selective allosteric inhibitor of MEK1/2, whose activation is essential for cell proliferation, was encapsulated in the PLGA core. On the other hand, the drug sorafenib, an inhibitor of multiple protein kinases that is used in the first line systemic treatment of HCC, was encapsulated in the HNP lipid bilayer. Our results demonstrated that the developed nanosystem has adequate physicochemical properties for drug delivery, namely small mean diameters, high stability, and high loading capacity for both drugs. Furthermore, this HNP exhibited the ability to circumvent drug resistance and presented high specificity, promoting high levels of death in HCC cells, but not in non-tumor cells. Moreover, this formulation allowed to potentiate the antitumor effect of co-encapsulated drugs, by increasing programmed cell death, which occurred not only in 2D cell cultures but also in 3D cell cultures. In turn, the second developed HNP consisted of a PLGA core, in which selumetinib was encapsulated, coated with a DNA plasmid containing the PTEN transgene and a pH-sensitive lipid bilayer containing the drug perifosine and the GalNAc ligand, to allow interaction with the asialoglycoprotein receptor. The PTEN transgene encodes the PTEN tumor suppressor protein, and perifosine is an AKT inhibitor whose activation is essential for cell survival. Our results showed that this HNP formulation has not only a high capacity to transport both drugs but also the genetic material, allowing the efficient expression of the PTEN transgene in target cells. In addition, this nanosystem has high stability, suitable physicochemical properties, and high specificity for HCC cells. This formulation resulted in a high antitumor effect, by combining chemotherapy with gene therapy, being observed not only an increase in programmed cell death but also a decrease in cell proliferation, both in 2D and 3D cell cultures. Overall, the hybrid nanosystems developed in this work, together with the therapeutic strategies mediated by them, constitute promising platforms for the generation of novel therapeutic approaches to HCC.FCTFC
Secularismo no controverso "Water" de "Hindutva": um estudo de caso sobre o conflito entre liberdade de expressão e religião na Índia
No full textTese de Programa de Doutoramento em Direitos Humanos nas Sociedades Contemporâneas apresentada ao Instituto de Investigação InterdisciplinarA erosão dos direitos humanos provocada pela ascensão dos nacionalismos radicais é um dos mais sérios desafios globais que as sociedades contemporâneas enfrentam. Este trabalho trata de um estudo de caso indiano. Examina como os Hindus nacionalistas contestam o discurso consolidado dos direitos humanos e da secularidade, ao mesmo tempo que suprimem a liberdade de expressão e dissidência. Focando na obra fílmica ‘Water’ (2005) e na controvérsia por ele gerada em Varanasi, no norte da Índia, dissecam- se as tensões existentes entre os Hindus nacionalistas e os que se opõem à hegemonia do nacionalismo Hindu (Hindutva). Teoricamente, este fenómeno reflete conflitos entre discursos sobre direitos humanos, secularidade e religião. Empiricamente, mostra como grupos religiosos de nacionalistas Hindus como o Rastriya Swayamsevak Sangh (RSS) e o Bhartiya Janta Party (BJP) restringem a liberdade de expressão ao ameaçarem, legal e fisicamente, quem critica as tradições hinduístas opressivas e quem apoiem a secularidade, o pluralismo religioso e os direitos humanos. Esta investigação ajudará a compreender o comportamento específico de membros de partidos religiosos nacionalistas cujas ações políticas levaram a limitações na liberdade de expressão e a situações de violência e censura. Ao interrogar as narrativas de grupos nacionalistas Hindus (tais como o RSS/BJP) e de membros de grupos de resistência (que se lhes opõem) no contexto da controvérsia do filme ‘Water’ em Varanasi, no ano de 2000, este estudo analisa esta processo conflitante secular-religioso dentro do quadro do ‘secularismo contextual’. O estudo foca-se, em particular, no mais importante aspeto desta dimensão relacional: a tensão entre, por um lado, liberdade de expressão e, por outro, intolerância religiosa e violência. Dentro de um desenho de pesquisa de ‘estudo de caso', a estratégia de investigação adota uma abordagem qualitativa que foca o conflito entre nacionalismo Hindu, secularidade e direitos humanos, particularmente o direito à liberdade de expressão. Com efeito, aplicam-se métodos qualitativos, nomeadamente entrevistas semiestruturadas, análise documental, pesquisa de fontes secundárias e análise narrativa. A investigação conclui que o secularismo indiano (secularismo contextual, como lhe chama Rajiv Bhargava) tolera o fanatismo religioso face à liberdade de expressão e à dissidência; e que o nacionalismo Hindu é incompatível com a democracia secular e, em certa medida, com os direitos humanos. Contudo, é possível resistir ao hegemonismo Hindutva.The rise of aggressive nationalism is one of the serious global challenges facing contemporary societies, which manifests itself in the erosion of human rights. In this context, this study presents an Indian case study that examines how Hindu nationalists challenge the established discourse of human rights and secularism while suppressing freedom of expression and dissent. Focusing on the film ‘Water’ (2005) and its associated controversy in Varanasi in northern India, this case study examines the tensions between Hindu nationalists and those who oppose hegemonic Hindu nationalism (Hindutva). Theoretically, this phenomenon reflects the conflict between discourses of human rights, secularism, and religion. Empirically, it shows how Hindu religious nationalist groups such as the Rastriya Swayamsevak Sangh (RSS) and the Bhartiya Janta Party (BJP) restrict freedom of expression by physically and legally threatening those who criticise oppressive Hindu traditions and support secularism, religious pluralism, and human rights. Research in this area could improve our understanding of the specific behaviour of members of religious nationalist parties whose political actions have led to restrictions on freedom of expression, violence, and censorship. This study examines the narratives of Hindu nationalist groups (such as RSS/BJP) and members of resistance groups (who oppose Hindu nationalist groups) in the context of the Varanasi ‘Water' film controversy in 2000 and analyses this secular-religious conflict within the framework of 'contextual secularism'. In particular, the study focuses on the most important interrelated aspect of this situation, the tension between freedom of expression and religious intolerance and violence. My research strategy is a qualitative approach with a case study research design that focuses on the conflict between Hindu nationalism, secularism, and human rights, particularly the right to freedom of expression. This study applies qualitative research methods, specifically semi-structured interviews, document analysis, secondary research, and narrative analysis. The study concludes that Indian secularism (contextual secularism, as Rajiv Bhargava calls it) tolerates Hindu religious bigotry toward freedom of expression and dissent and that Hindu nationalism is incompatible with secular democracy and, to some extent, human rights. However, there is the possibility of resistance to hegemonic Hindutva
Otimização de novos inibidores da RIPK1 com atividade anti-necroptótica
No full textTese de Doutoramento em Química apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA morte celular é um mecanismo evolutivo que tem um papel crítico no desenvolvimento, na homeostase e na progressão de diversas doenças em organismos. A primeira classificação de morte celular baseava-se em aspetos morfológicos e estruturais, tendo dividido a morte celular em três tipos: apoptose (tipo I), morte celular dependente de autofagia (tipo II) e necrose (tipo III).Ao longo das últimas quatro décadas, a descoberta e caracterização de proteínas e vias de sinalização associadas a diferentes tipos de morte celular, revelaram que a classificação inicial era insuficiente para retratar a complexidade dos diferentes tipos de morte celular existentes. O que culminou com a criação dos atuais doze tipos de morte celular regulada (RCD).A necroptose é um tipo de RCD que apresenta as características morfológicas clássicas da necrose. Na maioria das vias de sinalização da necroptose, as proteínas serina/treonina cinase de interação com receptores 1 (RIPK1) e 3 (RIPK3) são ativadas, levando à fosforilação da pseudocinase com domínio cinase semelhante à de linhagem mista (MLKL). Uma vez ativa, a MLKL vai causar a rutura da membrana e a libertação do conteúdo celular. Esta libertação para o meio extracelular gera respostas inflamatórias e contribui para a geração de doenças inflamatórias crónicas.Devido ao papel da necroptose em diversas doenças, é esperado com sua regulação tenha um elevado impacto terapêutico. A inibição da necroptose pode ser aplicada como tratamento num largo espectro de doenças, cuja base é a inflamação associada à morte de um certo tipo de células.Um estudo em modelos celulares foi utilizado para selecionar compostos com atividade anti-necroptótitca. Neste foram identificados dois novos compostos com uma potência elevada contra a RIPK1 e com estruturas diferentes das presentes em inibidores conhecidos.Neste trabalho, a estrutura de cada um destes compostos foi explorada em campanhas de otimização. Antes de iniciar o processo de otimização, a novidade estrutural dos compostos foi analisada através de uma comparação com estruturas de inibidores da RIPK1 conhecidos. Ambos os compostos apresentaram vantagens estruturais comparativamente aos inibidores conhecidos.A partir da estrutura central de um dos compostos foi desenvolvida a família dos benzimidazóis, onde todos os compostos foram constituídos por um grupo benzimidazol substituído na posição 2 por um anel heterocíclico de 5 membros. O grupo de 25 novos compostos desta família, gerados por uma metodologia de síntese convergente, foi testado em ensaios enzimáticos com a RIPK1 e em ensaios celulares de inibição da necroptose. O composto que apresentou a maior efeito protetor nas avaliações biológicas foi selecionado para estudos adicionais. A sua atividade inibitória para a RIPK1, durante a necroptose em células, foi confirmada com estudos de immunoblot. Adicionalmente, o modo de inibição deste composto foi estudado através de estudos de competição com ATP, onde foi caracterizado como inibidor competitivo. Por fim, num estudo de seletividade contra um grupo de cinases foi observada uma elevada seletividade para a RIPK1.Foi também desenvolvida uma família de benzoxazepinas com base na estrutura do segundo novo composto identificado. Nesta todos os compostos partilhavam uma estrutura central com um anel 2,3,4,5-tetrahidrobenzo[f][1,4]oxazepina ligado por um grupo amida a um anel heterocíclico de 5 membros. Durante o desenvolvimento de alguns dos compostos desta família, foi observada uma duplicação de sinais nos espectros de RMN de 1H e 13C sugerindo a existência de isómeros de rotação. A presença de isómeros de rotação foi confirmada através de estudos de RMN de temperatura variável (VT). A existência de impedimento na rotação da ligação simples entre o anel heterocíclico de 5 membros e o grupo carbonilo da amida (Ar-CO) e na ligação amida (N-CO) foi estudada através da medição das cargas dos átomos do anel heterocíclico de 5 membros e de estudos de mecânica quântica.Os 17 novos compostos da família das benzoxazepinas foram analisados em estudos enzimáticos com a RIPK1 e em modelos celulares de inibição da necroptose. O composto que apresentou a maior efeito de proteção da necroptose nestes estudos foi selecionado para ensaios adicionais. Em estudos de immunoblot foi confirmada a sua atividade inibitória da RIPK1 durante o processo de necroptose. Por outro lado, estudos de competição com ATP permitiram a caracterização deste composto como inibidor competitivo.Adicionalmente, um projeto colaborativo resultou no estudo de dois compostos pertencentes à família das 7-fenilquinolinas. Ambos foram caracterizados como inibidores da RIPK1. O composto mais potente foi ainda classificado como inibidor competitivo da RIPK1.Este trabalho permitiu o desenvolvimento e estudo de três novas classes de inibidores da RIPK1, culminando com a identificação de promissores inibidores competitivos da necroptose com atividades na região do nanomolar.Cell death is an evolutionarily conserved mechanism that plays a critical role in the development, homeostasis, and disease of an organism. The first classification of cell death was based on morphological and structural details and divided cell death modalities into three types: apoptosis (type I), autophagy-dependent cell death (type II), and necrosis (type III).Throughout the last four decades, key molecular players and signaling pathways of cell death were discovered and characterized, revealing that the early classification was largely insufficient to depict the complexity of the different cell death modalities. These findings culminated in the emergence of twelve subroutines of regulated cell death (RCD).Necroptosis is a type of RCD that displays the classic necrotic cell death morphological features. Most necroptosis pathways activate receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 (RIPK1) and 3 (RIPK3), causing the phosphorylation of mixed lineage kinase domain like pseudokinase (MLKL). The activation of MLKL leads to plasma membrane permeabilization and a subsequent release of cellular content. The release of cellular components into the extracellular microenvironment causes inflammatory responses and contributes to the pathogenesis of chronic inflammatory diseases.Necroptosis is present in an array of human diseases, and its regulation is expected to have a broad therapeutic impact. Necroptosis inhibition could be applied as a treatment for a wide range of human diseases, where inflammation would be restrained and the death of a certain type of cell at the core of the medical condition would be prevented.A necroptosis inhibition high-throughput cell-based screening was carried out to identify new compounds with antinecroptotic activity. Two novel hit compounds with high potency against RIPK1 and a dissimilar scaffold from the known necroptosis inhibitors were identified.In this work, the scaffold of each of these discovered hit compounds was explored in hit-to-lead optimization campaigns. Before starting the campaigns, the structural novelty of the discovered hit compounds was assessed by performing a comparison with literature RIPK1 inhibitor structures. Both compounds exhibited structural advantages compared to the known inhibitors.A benzimidazole series was developed based on one of the hit scaffolds. In this family, all final compounds exhibited a core structure formed by a benzimidazole moiety substituted in position 2 by a 5-membered heterocyclic ring. A group of 25 novel final benzimidazole series compounds were synthesised by a convergent synthetical approach and tested in enzymatic assays against RIPK1 as well as in necroptosis inhibition cell-based assays.The benzimidazole series compound that exhibited the best overall results in the biological assessment was selected for additional studies. Its RIPK1 inhibitory activity during necroptosis in a cell model was confirmed with immunoblot studies. Additionally, its mode of inhibition was studied in ATP competitive assays, where it was characterized as a competitive inhibitor. Finally, a kinase profiling experiment was carried out to study its selectivity, revealing a good selectivity for RIPK1.A benzoxazepine series was also developed , resulting in compounds with a structural core of a 2,3,4,5-tetrahydrobenzo[f][1,4]oxazepine ring connected to a 5-membered heterocyclic ring by an amide moiety. Throughout the development of these compounds, a signal duplication phenomenon was observed in the 1H and 13C NMR spectra of several developed compounds suggesting the existence of rotational isomers. This type of conformational isomerism was confirmed by variable temperature (VT) NMR studies. The existence of hindered rotation at the single bond connecting the 5-membered heterocyclic ring to the amide carbonyl group (Ar-CO bond) and at the amide bond (N-CO bond) was assessed by studying the charges of the 5-membered heterocyclic ring atoms and performing quantum mechanics studies.The 17 novel final benzoxazepine series compounds were studied in enzymatic assays against RIPK1 and necroptosis inhibition cell-based assays. The benzoxazepine series compound that exhibited the best results in the biological assessment was selected for additional studies. Immunoblot studies with this compound confirmed its RIPK1 inhibitory activity during necroptosis in a cell model. Furthermore, ATP competitive assays allowed its characterization as a competitive inhibitor.Additionally, a collaborative project led to the development and study of two compounds belonging to a 7-phenylquinoline family. Both compounds were characterized as RIPK1 inhibitors. The compound with the highest potency was also classified as competitive inhibitor of RIPK1 on ATP competitive studies.This work allowed the development and study of three novel classes of RIPK1 inhibitors, culminating in the identification of promising competitive nanomolar necroptosis inhibitors.FCTFCTFCTFCTFC
Relatórios de Estágio e Monografia Intitulada "Hidrogéis injetáveis à base de nanocompostos para intervenções direcionadas e locais no cancro, cicatrização de feridas e engenharia de tecidos"
No full textRelatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de FarmáciaHydrogels that mimic the extracellular matrix (ECM) have applications in a variety of biomedical fields. Injectable hydrogels (IHs), which are generated by polymer crosslinking, allow for less invasive administration and homogeneous integration of therapeutic substances. The combination of IHs with nanosystems has resulted in remarkable advances in biomedical research. By addressing IHs limitations (fragility, poor mechanical strength, limited degradation control, and potential inflammatory response) through the incorporation of nanoparticles (NPs), injectable nanocomposite (NC) hydrogels have emerged as versatile platforms, offering improved biocompatibility, enhanced mechanical strength, and precise controlled drug release. Injectable NC hydrogels have revolutionized cancer therapy, wound management, and tissue engineering by providing targeted and localized interventions. In the field of cancer therapy, these systems allow for more specific treatment with minimal systemic exposure. Other biomedical applications include wound healing, particularly the management of diabetic wounds (DWs) and skin-tumor induced wounds. Furthermore, injectable NC hydrogels provide innovative solutions for bone tissue engineering (BTE), and cardiac tissue engineering. This review offers a thorough examination of current developments and biomedical applications of injectable NC hydrogels, highlighting their critical significance as a key strategy for providing localized interventions and promoting significant advances in a range of biomedical fields.Os hidrogéis que mimetizam a matriz extracelular (ECM) têm aplicações em vários campos biomédicos. Os hidrogéis injetáveis (IHs), obtidos através da ligação entre polímeros, permitem uma administração menos invasiva e uma integração homogénea de substâncias terapêuticas. A combinação de IHs com nanossistemas resultou em avanços notáveis na pesquisa biomédica. Os hidrogéis injetáveis à base de nanocompostos (NCs) (IHs onde são incorporadas nanopartículas (NPs)) apresentam um desempenho superior em termos de biocompatibilidade, resistência mecânica, e libertação precisa e controlada de medicamentos, superando as limitações dos IHs convencionais (fragilidade, baixa resistência mecânica, controlo limitado da degradação, e potencial resposta inflamatória). Neste contexto, os hidrogéis injetáveis à base de NCs revolucionaram a terapia do cancro, o tratamento de feridas, e a engenharia de tecidos, permitindo intervenções localizadas e vetorizadas. No caso da terapia do cancro, estes sistemas permitem um tratamento mais específico, e com a mínima exposição sistémica. Outras aplicações biomédicas dos hidrogéis injetáveis à base de NCs incluem a cicatrização de feridas, particularmente o tratamento de feridas diabéticas (DWs),e de feridas induzidas por tumores na pele. Além disso, os hidrogéis injetáveis à base de NCs oferecem soluções inovadoras no âmbito da engenharia de tecido ósseo (BTE), e na engenharia de tecido do miocárdio. Esta revisão oferece uma análise minuciosa dos desenvolvimentos atuais e das aplicações biomédicas dos hidrogéis injetáveis à base de NCs, destacando a sua relevância como uma estratégia inovadora fundamental para fornecer intervenções localizadas, e promover avanços significativos numa grande variedade de campos biomédicos
Relatórios de Estágio e Monografia intitulada "Reaproveitamento de Fármacos e Nanossistemas para o Tratamento do Melanoma Cutâneo: desenvolvimento de uma nanoemulsão óleo em água de miconazol"
No full textRelatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de FarmáciaCutaneous melanoma is one of the most lethal skin cancers, with a high mortality rate and incidence. This has led to a huge demand for new more effective forms of treatment. Miconazole is a hydrophobic drug that has been shown to reduce both the proliferation of melanoma cells and the potential of these cells to metastasize into distant organs. On the other hand, nanoemulsions are widely used for topical drug delivery as a promising alternative to increase the solubility, skin permeation, and retention of hydrophobic drugs. Hence, the purpose of this work was to incorporate miconazole in an oil-in-water nanoemulsion for topical administration for the treatment of cutaneous melanoma. Seventeen O/W nanoemulsions were prepared by spontaneous emulsification, made of Plurol® Diisostearique (oil and hydrophobic surfactant), Transcutol® (cosolvent), Kolliphor® RH 40 (hydrophilic surfactant), and Milli-Q® water. Droplet size and polydispersity index (PDI) were analyzed using dynamic light scattering (Zetasizer Nano ZS apparatus). Nanoemulsions with a PDI below 0.3 and droplet size between 100 – 200nm were selected for drug incorporation. The chosen formulation was also characterized for zeta potential, pH and osmolality. Accelerated stability studies, real-time stability studies and the in vitro release profile were also conducted. After miconazole incorporation (9mg/mL) only one of the seventeen nanoemulsions maintained characteristics within the intended parameters. This formulation was selected and characterized: the zeta potential was -4.71mV (neutral, expected due to used components), and the pH was 6.97 (well tolerated for topical application). The instability index of the drug-free nanoemulsion was 0.522 and 0.542 for the drug-loaded formulation, demonstrating that drug incorporation did not affect the formulation’s stability. Moreover, real-time stability studies confirmed that the developed preparation was stable up to 6 months. In vitro drug release studies showed that the nanoemulsion exhibited controlled drug release. Therefore, the incorporation of miconazole into nanoemulsions allowed to greatly increase its solubility (up to 11795 times, compared to its water solubility), while also producing stable formulations for future studies (viscosity, in vitro drug permeation, cytotoxicity in melanoma cells).O melanoma cutâneo é um dos cancros de pele mais letais, o que resulta em uma elevada incidência e taxa de mortalidade. Esta realidade levou a uma enorme procura por novas e eficazes formas de tratamento. O miconazol é um fármaco hidrofóbico que revelou reduzir a proliferação e o potencial metastático de células de melanoma. Por outro lado, as nanoemulsões são largamente utilizadas como veículos para a entrega de fármacos a nível tópico. Estas permitem aumentar a solubilidade e a penetração e retenção na pele de fármacos hidrofóbicos. Assim, o objetivo deste trabalho foi a incorporação do miconazol numa nanoemulsão óleo-em-água, para ser administrada topicamente para o tratamento do melanoma cutâneo. Foram preparadas 17 nanoemulsões O/A por emulsificação espontânea, constituídas por Plurol® Diisostearique (óleo e tensioativo hidrofóbico), Transcutol® (co-solvente), Kolliphor® RH 40 (tensioativo hidrofílico) e água Milli-Q®. O tamanho de gotícula e o índice de polidispersão (IPD) foram analisados utilizando a dispersão dinâmica de luz (com o aparelho Zetasizer Nano ZS). As nanoemulsões com um IPD inferior a 0,3 e um tamanho de gotícula entre 100 e 200nm foram selecionadas para incorporação do fármaco. A formulação escolhida foi também caracterizada relativamente ao potencial zeta, pH e osmolalidade. Foram também realizados estudos de estabilidade acelerada, estudos de estabilidade em tempo real e foi avaliado o perfil de libertação in vitro do fármaco. Após incorporação do miconazol (9mg/mL), apenas uma das 17 nanoemulsões manteve as características dentro dos parâmetros pretendidos. Esta formulação foi selecionada e caracterizada: o potencial zeta foi de -4,71mV (neutro, esperado devido aos componentes utilizados) e o pH foi de 6,97 (bem tolerado para aplicação tópica). O índice de instabilidade da nanoemulsão, sem fármaco, foi de 0,522 e de 0,542 para a formulação com fármaco, demonstrando que a incorporação do mesmo não afetou a estabilidade da formulação. Além disso, os estudos de estabilidade em tempo real confirmaram que, a preparação desenvolvida é estável até 6 meses. Os estudos de libertação in vitro do fármaco mostraram que, a nanoemulsão apresentava uma libertação controlada do fármaco. Desta forma, a incorporação de miconazol em nanoemulsões permitiu aumentar consideravelmente a sua solubilidade (até 11 795 vezes, em comparação com a sua solubilidade em água), sendo possível, simultaneamente, produzir formulações estáveis para estudos futuros (viscosidade, permeação do fármaco in vitro, citotoxicidade em células de melanoma)
DESENVOLVIMENTO DE UMA ESTRATÉGIA PARA ENTREGA DIRECIONADA DE VESÍCULAS EXTRACELULARES PARA CORAÇÃO PÓS-ENFARTE
No full textDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaMyocardial infarction (MI) results from an imbalance in the oxygen supply-demand ratio after a blockage of the coronary artery. Prolonged ischemia induces massive cardiac tissue necrosis followed by the replacement of dead cardiomyocytes by fibrotic tissue. One of the advanced therapies being tested for the treatment of MI is small extracellular vesicles (sEVs). These vesicles are naturally released by cells, and they have been shown to regulate cardiac regeneration. One of the main limitations of sEV-based therapies for cardiovascular diseases stands on their limited retention in the heart. Membrane modification of sEVs may be an interesting strategy to control their biodistribution while assuring the delivery to the cardiac tissue. Surface modification of sEVs with ligands that allow biorthogonal chemistry interactions with the desired target is particularly promising because these reactions can occur in vivo without raising cytotoxicity issues and because they are fast and highly selective. The main goal of this work was to develop an innovative strategy to induce targeted delivery and accumulation of sEVs in the ischemic region of an infarcted heart. To fulfil this goal, sEVs’ surface was modified so that vesicles could interact through click chemistry with entities shown to be upregulated upon MI: specific cell surface glycans or urokinase plasminogen activator receptor (uPAR). In the context of this work, two targeting strategies were tested. The first one was based on metabolic labelling of cell surface glycans with azido sugars, while the second one was based on a reagent modified antibody (uPAR antibody conjugated with DBCO-NHS) with affinity for uPAR. In both cases, membrane modified-sEVs could establish a click reaction with those targeting modalities (azido sugars and modified uPAR antibody, respectively). Nevertheless, only the uPAR-based strategy was shown to be suitable for a MI context, as it was not possible to demonstrate upregulation of azido sugars in pathological conditions. Overall, the results obtained indicate that novel cardiac targeting strategies can be developed by modifying sEVs surface, where click chemistry reactions can be exploited as intermediates to assure sEVs interaction with the respective overexpressed biomarker in the desired target. Moreover, the foundation of this work can be easily applied in other pathologies where specific markers upregulation is well established.O enfarte do miocárdio (EM) resulta de um desequilíbrio entre o fornecimento e a necessidade de oxigénio após a obstrução de uma artéria coronária. Isquemia prolongada resulta em necrose do tecido cardíaco e, consequente, cicatrização por fibrose miocárdica. Uma das terapias avançadas que está a ser testada para o tratamento do EM são pequenas vesículas extracelulares (sEVs). Estas vesículas são naturalmente exocitadas pelas células e têm a capacidade de regular a regeneração cardíaca. Uma das principais limitações de terapias cardiovasculares baseadas em sEVs reside na sua retenção limitada no coração. A modificação da membrana plasmática das sEVs pode ser uma estratégia interessante tanto para controlar a sua biodistribuição como para assegurar a entrega no tecido cardíaco. A modificação da superfície das sEVs com entidades que permitem interações biortogonais com o alvo desejado é particularmente promissora, uma vez que essas reações podem ocorrer in vivo de forma rápida, seletiva e sem citotoxicidade associada. O principal objetivo deste trabalho era desenvolver uma estratégia inovadora para garantir a entrega dirigida e acumulação de sEVs na região isquémica de um coração pós-infarte. Para atingir este objetivo, a superfície das sEVs foi modificada de forma que as vesículas pudessem interagir através de química de clique com componentes cuja expressão está aumentada após um EM. Glicanos específicos expressos na superfície das células ou o receptor de superfície do ativador do plasminogénio da uroquinase (uPAR) têm vindo a ser considerados biomarcados do EM. Durante este estudo, foram testadas duas estratégias de entrega dirigida, sendo que a primeira se foca na marcação metabólica de glicanos com açúcares com grupos azida, enquanto a segunda tem como base um anticorpo modificado (anticorpo uPAR conjugado com DBCO-NHS) com afinidade para o uPAR. Em ambos os casos, as sEVs cuja membrana foi modificada estabeleceram uma reação de clique com essas entidades (açúcares com grupos azida e anticorpo uPAR modificado). No entanto, apenas a estratégia baseada no uPAR demonstrou ser adequada para um contexto de EM, uma vez que não foi possível demonstrar a expressão aumentada dos açúcares em condições patológicas. No geral, os resultados obtidos indicam que podem ser desenvolvidas novas estratégias de entrega dirigida ao coração através da modificação da superfície das sEVs, explorando as reações de química de clique como intermediários para assegurar a interação das sEVs com o biomarcador sobre-expresso no alvo desejado. Além disso, as bases deste trabalho podem ser facilmente aplicadas a outras patologias em que a expressão aumentada de marcadores específicos esteja bem estabelecida.FCTOutro - Projeto “LABEL” (ref. POCI-01-0247-FEDER-049268) financiado pelo Portugal 202
Optimization of the Photosensitized Oxidation Process for the Reuse of Winery Wastewaters
No full textDissertação de Mestrado em Engenharia Química apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaThe main aim of this thesis is to develop and optimise a new technology for the recovery of water from wine industry wastewaters. Humanity is currently facing many social, economic, and environmental challenges, and water scarcity is one of the major issues demanding answers and solutions. Hence, the priority has been the transition from a linear economic model to acircular economy one, where instead of using water and then disposing it into water sources, this resource is managed in an integrated manner, helping to close the water cycle in industries.Consequently, it is possible not only to reduce the amount of effluent discharge into the environment, but also reduce the amount of water required, thus helping to fulfil the Sustainable Development Goals regarding this resource. Nevertheless, for water reusage to become a reality, it is imperative to ensure this water fulfils the legal standards.The photosensitised oxidation process is a promising option for the degradation of bio refractory substances which persist in wine industry effluents after biological treatment. This is an advanced oxidation process which mandatorily requires the presence of three components: oxygen or air, a source of radiation and a photosensitiser. The technology presented here was developed in a heterogeneous environment, by immobilising the photosensitiser, tetra sulphonated zinc phthalocyanine (ZnPcS4), on chitosan supports, to overcome the challenges of removing this component from the effluent after treatment.In order to optimise the process, the influence of the concentration of photocatalyst and the concentration of the photosensitizer solution were studied, monitoring the evolution of two parameters, the Chemical Oxygen Demand (COD) and the Phenolic Content (TPh). The leaching and physical degradation of the photocatalysts, as well as the variation in the solids content of the effluent, were also considered. The best results, corresponding to reduction of 47% in COD and 86% in TPh, were obtained for a concentration of 100 g/L of photocatalysts, immobilised with a solution of ZnPcS4 at 90 ppm, aerated with an air flow rate of 2.8 L/min and with the pH of the effluent set at 4. Additionally, it was also possible to see that, contrary to what might have been expected, smaller particles do not lead to better process efficiency.O principal objetivo da presente dissertação é o desenvolvimento e otimização de uma nova tecnologia que tem como finalidade a recuperação de água de efluentes da indústria vinícola. Atualmente, a humanidade enfrenta inúmeros desafios sociais, económicos e ambientais, constando a escassez da água de entre as principais problemáticas que necessitam de respostas e soluções. Assim, a aposta tem sido feita na transição de um modelo económico linear para uma economia circular, onde em vez de se usar e seguidamente descartar a água para os recursos hídricos, se passa a fazer uma gestão cuidada e integrada deste recurso, contribuindo, deste modo, para fechar o ciclo da água nas indústrias. Posto isto, é possível diminuir não somente a quantidade de efluentes descarregados no meio ambiente, como também diminuir a quantidade de água requerida, contribuindo assim para cumprir com os Objetivos de Desenvolvimento Sustentável relativos a este recurso. Não obstante, para que a sua reutilização seja uma realidade, é imprescindível garantir que estas águas apresentam um nível de depuração dentro das normas legais.O processo de oxidação fotossensitizada surge então como uma hipótese promissora no que diz respeito à degradação das substâncias biorefratárias que persistem nos efluentes da indústria vinícola após o tratamento biológico, de forma que se atinja a qualidade necessária para a sua reutilização. Este é um processo de oxidação avançada que necessita obrigatoriamente da existência conjunta de três componentes, oxigénio ou ar, uma fonte de radiação e um fotossensitizador. A tecnologia aqui apresentada foi desenvolvida em meio heterogéneo, imobilizando o fotossensitizador, ftalocianina tetrasulfonada de zinco (ZnPcS4),em suportes de quitosano, para assim se contornar as dificuldades de remoção deste componente do efluente após o tratamento.Para a otimização do processo em causa estudou-se a influência da concentração de fotocatalisador e da concentração da solução de fotossensitizador, acompanhando-se a evolução de dois parâmetros, a Carência Química de Oxigénio (CQO) e o Conteúdo Fenólico (TPh). A lixiviação e a degradação física dos fotocatalisadores, bem como a variação do conteúdo de sólidos presentes no efluente, foram aspetos igualmente considerados. Os melhores resultados, correspondentes a reduções de 47% no CQO e de 86% no TPh, foram obtidos para uma concentração de 100 g/L de fotocatalisadores, imobilizados com uma solução de ZnPcS4 a 90 ppm, arejados com um caudal de ar a 2,8 L/min e estando o pH do efluente acertado para 4. Para além disso, foi também possível verificar que contrariamente ao que seria de esperar, as partículas de menores dimensões não são as que conduzem a melhores eficiências do processoOutro - Agência Nacional para a Inovaçã
Team innovation: The role of psychological capital and team learning
No full textDissertação de Mestrado Integrado em Psicologia apresentada à Faculdade de Psicologia e de Ciências da EducaçãoThe current organizational world, constantly changing, requires a rapid development and adaptation from organizations, in order to maintain their efficiency and competitive advantage. In this context, their capacity for innovation and rapid learning is important, as well as the development of positive capacities of employees, in order to promote their optimal functioning. Likewise, given that teams are key units in organizational performance and development, it is important to increase these capabilities at a group level. Thus, this dissertation aimed to analyze the relationship between teams’ psychological capital and innovation, assuming group learning as a mediating variable. To this end, an empirical cross-sectional study was carried out, which included 124 portuguese work teams, belonging to different sectors of activity, adopting the questionnaire survey as the method of data collection. The data were analyzed at group level and submitted to a simple mediation model, using PROCESS. The results demonstrated a partial mediation of team learning in the relationship between psychological capital and innovation. In addition to the contribution to literature, the data obtained reinforce the understanding of the teams’ psychological capital and how it could contribute to their innovation, either directly or through team learning.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------O mundo organizacional atual, em constante mudança, exige um rápido desenvolvimento e adaptação por parte das organizações, de modo a manterem a sua eficiência e vantagem competitiva. Neste contexto, torna-se importante a sua capacidade de inovação e de rápida aprendizagem, bem como o desenvolvimento das capacidades positivas dos colaboradores, por forma a promover o funcionamento otimal destes. De igual modo, dado que as equipas são peças-chave no desempenho e desenvolvimento organizacional, é importante desenvolver estas capacidades a um nível grupal. Assim, a presente dissertação pretendeu analisar a relação entre o capital psicológico e a inovação das equipas, assumindo a aprendizagem grupal como variável mediadora. Para tal, realizou-se um estudo empírico de natureza transversal, que incluiu 124 equipas de trabalho portuguesas, pertencentes a diversos setores de atividade, adotando o inquérito por questionário como método de recolha de dados. Os dados foram examinados a nível grupal e submetidos a uma análise de regressão, através do PROCESS. Os resultados demonstraram uma mediação parcial da aprendizagem grupal na relação entre o capital psicológico e a inovação. Além de consistir num contributo para a literatura, os dados obtidos reforçam a compreensão do capital psicológico das equipas e como este pode contribuir para a inovação das mesmas, quer de forma direta, quer por via da aprendizagem grupal.----------------------------------------------------------------------
Branaplam como um promissor modulador de splicing: da atrofia muscular espinhal à doença de Huntington
No full textTrabalho Final do Mestrado Integrado em Medicina apresentado à Faculdade de MedicinaRNA-targeting splicing modulators have revolutionized modern medicine by allowing reversible regulations of gene expression. Branaplam, the first molecule found to specifically modulate a splicing behaviour at a particular splice site, has demonstrated the potential to alter the course of two neurogenetic diseases: Spinal Muscular Atrophy (SMA) and Huntington’s Disease (HD). While originally developed as a promising disease modifying therapy (DMT) for SMA, the second most common autosomal recessive disease and the leading cause of genetic infant mortality, its research has recently been redirected to HD, a fatal autosomal dominant disease. Currently, there are three DMTs approved for SMA, both by the Food and Drug Administration (FDA) and the European Medicines Agency (EMA): two splicing modulators, the antisense oligonucleotide (ASO) nusinersen and the small molecule risdiplam, and a gene replacement therapy onasemnogene abeparvovec. At the moment, there are no DMTs approved for HD, with approved treatments only providing limited symptomatic management. This work explores branaplam’s mechanisms of action while providing a comprehensive analysis on how this splicing modulator could be a potential DMT for SMA and HD. At the same time, it provides an overview of branaplam’s place amongst the existing and potential DMTs of these two devastating diseases. Ultimately, it glimpses into the world of RNA splicing and splicing modulators through the journey of one of its most memorable members, branaplam.Os moduladores de splicing, que têm como alvo o RNA, revolucionaram a medicina moderna ao permitirem a regulação de expressão genética de forma reversível. Branaplam, a primeira molécula encontrada com a capacidade de alterar um processo de splicing particular num local de específico, demonstrou o potencial de alterar o curso de duas doenças neurogénicas: a atrofia muscular espinhal (AME) e doença de Huntington (DH). Embora originalmente desenvolvida como uma promissora terapêutica modificadora da doença (TMD) para a AME, a segunda doença autossómica recessiva mais comum e a principal causa de mortalidade genética infantil, recentemente a sua investigação foi redirecionada para a DH, uma doença autossómica dominante fatal. Atualmente existem três TMDs aprovadas para a EMA, tanto pela Food and Drug Administration (FDA) como pela Agência Europeia de Medicamentos (EMA): dois moduladores de splicing, o oligonucleotídeos antisense (ASO) nusinersen e a pequena molécula risdiplam, e a terapia genética onasemnogene abeparvovec. Neste momento, não existem TMDs aprovados para a HD e os tratamentos aprovados apenas proporcionam uma limitada gestão dos sintomas. Este trabalho explora os mecanismos de ação do branaplam, fornecendo ao mesmo tempo uma análise abrangente sobre como este modulador de splicing poderá ser desenvolvido como uma TMD para a SMA e a HD. Ao mesmo tempo, fornece uma visão geral do lugar do branaplam entre as existentes e potenciais TMDs destas duas doenças devastadoras. Em última análise, oferece um olhar sobre o mundo dos modeladores splicing através da história de um dos seus membros mais memoráveis, o branaplam
Desvendando uma Nova Sialidase do Fungo Alergénico Alternaria alternata
No full textTrabalho Final do Mestrado Integrado em Medicina apresentado à Faculdade de MedicinaAlternaria alternata is a fungus involved in respiratory pathologies, both infection and allergy.Its spores are a very common potent aeroallergen source that is found mainly outdoors but can colonize indoor environments. Human exposure to these aeroallergens leads to sensitization and is associated with increased asthma severity.Sialidases are highly expressed in A. alternata spores. Sialidases are glycoside hydrolases responsible for removal of sialic acids from glycans on the cell surface. They have been implicated in the release of Influenza virus progeny from infected cells, bacterial pathogenesis by promoting adhesion, biofilm formation and bacterial growth stimulation. In fungi, it has been shown that these enzymes play a role in hyphal cell wall stability, mediate interaction between conidia and human epithelial cells and increase adherence to mucosal surfaces.Sialic acids are derived from neuraminic acid and primarily found in animals, some prokaryotes and virus, and do not occur in plants, indicating that most probably, A. alternata requires this protein for interaction with animals. They are involved in several biological processes, but we highlight their role in immune system regulation and host-pathogen interactions.A. alternata has 4 genes attributed to sialidases, but preliminary proteomic analysis showed that only one is expressed. Since little is known about A. alternata sialidases, this study aimed for the in silico characterization of this 346 aminoacids sialidase. This sialidase is largely different from other putative sialidases and from experimentally modeled sialidases. Unlike experimentally modeled sialidases which share a similar β-propeller architecture composed of antiparallel β-sheets in a six-fold symmetry, this sialidase presents a seven-fold symmetry. This might be the first description of the first member of a novel glycoside hydrolase family in the advent of AlphaFold2.Alternaria alternata é um fungo envolvido em patologias respiratórias, tanto infeciosas como alérgicas. Os seus esporos são uma fonte muito comum e potente de aeroalergénios, que são encontrados principalmente em ambientes exteriores, mas podem também colonizar ambientes interiores. A exposição humana a estes aeroalergénios leva à sensibilização e está associada a um aumento na gravidade da asma. As sialidases são altamente expressas nos esporos de A. alternata. As sialidases são glicosídeo hidrolases responsáveis pela remoção de ácidos siálicos de glicanos na superfície celular. Estão implicadas na libertação do vírus da gripe de células infetadas e na patogénese bacteriana ao promover a adesão, a formação de biofilmes e o estímulo do crescimento bacteriano. Em fungos, demonstrou-se que estas enzimas desempenham um papel na estabilidade da parede celular das hifas, medeiam a interação entre conídios e células epiteliais humanas e aumentam a aderência às superfícies mucosas. Os ácidos siálicos derivam do ácido neuramínico e são principalmente encontrados em animais, alguns procariotas e vírus, não ocorrendo em plantas, o que indica que muito provavelmente, A. alternata necessita desta proteína para interagir com animais. Estão envolvidos em vários processos biológicos, mas destacamos o seu papel na regulação do sistema imunitário e na interação hospedeiro-patogénio. A. alternata tem 4 genes atribuídos às sialidases, mas uma análise proteómica preliminar mostrou que apenas um é expresso. Uma vez que pouco se sabe sobre as sialidases de A. alternata, este estudo teve como objetivo a caracterização in silico desta sialidase de 346 aminoácidos. Esta sialidase é bastante diferente de outras sialidases putativas e de sialidases modeladas experimentalmente. Ao contrário das sialidases modeladas experimentalmente, que apresentam uma arquitetura semelhante de β-propeller composta por folhas β antiparalelas com simetria hexagonal, esta sialidase apresenta uma simetria heptagonal. Esta pode ser a primeira descrição do primeiro membro de uma nova família de glicosídeo hidrolases no advento do AlphaFold2.FC