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Expresión heteróloga y caracterización de una superóxido dismutasa proveniente del arqueón Thermoplasma acidophilum
Get PDFTesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular)"Las superóxido dismutasas (SODs) de arqueas termoacidófilas tienen relevancia industrial debido a sus propiedades bioquímicas únicas en comparación a sus homólogas bacterianas. El objetivo de este trabajo fue clonar y expresar el ORF de la SOD (Ta0013) del arqueón termoacidófilo Thermoplasma acidophilum y caracterizar su producto estructural y funcionalmente. La producción de la enzima recombinante fue de 43.51 mg/L y se le identificó como una Fe-SOD con un contenido de 2.18 moles de metal/mol de proteína. El análisis electroforético desnaturalizante mostró una banda de 25 kDa que corresponde al peso monomérico calculado. Por otro lado, el análisis de electroforesis nativa evidenció que su estado conformacional es homotetramérico. La proteína fue activa en un amplio intervalo de temperatura (15-60°C) y pH (2-10, valor óptimo 6), su actividad específica fue de 118.5 U/mg a 23°C, fue termorresistente a temperaturas ≤60°C, tuvo un t1/2 ~35 min a 70°C y su actividad se vio afectada únicamente por FeCl2 10 mM y SDS 10 mM. Este trabajo constituye la primera caracterización en detalle que se hace de una SOD recombinante expresada en E. coli proveniente de un organismo del orden Thermoplasmatales. Los resultados obtenidos podrían ser útiles para la producción de la enzima recombinante así como para el desarrollo de cosméticos para la reducción del daño fotooxidante, suplementos para la salud, preservación de alimentos, tratamiento de enfermedades humanas y animales, así como cualquier otra aplicación potencial asociada con la disminución del daño inducido por O2 dentro de los intervalos de temperatura y pH descritos.""Superoxide dismutases (SODs) from thermoacidophilic Archaea have industrial relevance due to their unique biochemical properties when compared against their bacterial homologs. The aim of this work was to clone and express the SOD ORF Ta0013 from the thermoacidophilic archaeon Thermoplasma acidophilum and to characterize its product structurally and functionally. The yield of the recombinant enzyme was 43.51 mg/L and it was identified as an iron-containing protein (Fe-SOD) with a metal content of 2.18 moles/mole of protein. SDS-PAGE analysis showed a band of 25 kDa which corresponds to the theoretic monomeric weight. In addition to this, the native form of the enzyme was determined as a homotetramer by native PAGE. The protein was active in a wide range of temperature (15-60°C) and pH (2-10, optimum 6), it had a specific activity of 118.5 U/mg at 23°C, showed thermal stability (≤60°C), had a t1/2 ~35 min at 70°C, and its activity was only affected by 10 mM FeCl2 and 10 mM SDS. This work represents the first detailed characterization of a recombinant SOD from a member of the order Thermoplasmatales expressed in E. coli. These results could be useful for the production of the recombinant enzyme and it could be applied for the development of cosmetics for the reduction of photo-oxidant damage, health promoting supplements, food preservation, treatment of human and animal diseases and any other potential application related with the reduction of superoxide-induced damage inside the described temperature and pH ranges.
Identificación de proteínas interactoras de una dehidrina ácida SK3 de Opuntia streptacantha
Get PDF"Las dehidrinas (DHNs) o el grupo 2 de las proteínas LEA (Late Embryogenesis Abundant), son proteínas intrínsecamente desordenadas y altamente hidrofílicas, que típicamente se acumulan durante los estadios tardíos del desarrollo de la semilla o se inducen en tejidos vegetativos durante condiciones de déficit hídrico. Se ha reportado que las DHNs se distribuyen en diversos compartimentos celulares como: el citosol, núcleo, cloroplastos, mitocondria, retículo endoplásmico y membrana plasmática. Diversos estudios apuntan a que sus funciones comunes son: la unión a fosfolípidos ácidos, iones, crioprotección y la estabilización de membranas o proteínas durante condiciones de estrés abiótico Sin embargo, su mecanismo de acción aún no está completamente entendido. Recientemente, nuestro grupo reportó que plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresan una dehidrina de Opuntia streptacantha (OpsDHN1) muestran un incremento en la tolerancia a estrés por congelamiento. Para identificar las proteínas que interactúan con OpsDHN1 a través de las cuales ejerce dicho efecto, llevamos a cabo un ensayo de doble híbrido basado en la técnica splitubiquitin, a través del cual identificamos posibles proteínas interactoras de la dehidrina de nopal (OpsDHN1). Dentro de estos interactores encontramos proteínas de membrana como: RPT2B, PIP2;2 y ARA-5 y proteínas de cloroplasto como: NPQ4. Además, identificamos mayoritariamente una proteína de función desconocida (At1g44920) que se localiza en el cloroplasto. Por otro lado, demostramos que la OpsDHN1 puede interactuar consigo misma, lo que sugiere la formación de dímeros de ésta. La identificación de estos posibles interactores, incluyendo a la propia OpsDHN1, nos proporciona una valiosa información respecto a la identidad de las proteínas con las cuales puede participar esta dehidrina; lo que nos podría llevar a entender mejor los mecanismos moleculares mediante los cuales llevan a cabo su función las dehidrinas.""Dehydrins (DHNs) or group 2 LEA (Late Embryogenesis Abundant) proteins are intrinsically unstructured and highly hydrophilic proteins, they typically accumulate during the last stages of seed development or are induced in vegetative tissues under water stress conditions. It has been reported that DHNs are distributed in diverse cell compartments such as cytosol, nucleus, chloroplasts, mitochondria, endoplasmic reticulum and plasma membrane. Based on diverse genetic and transgenic studies it has been suggested that the common roles for dehydrins are binding to acidic phospholipids, to ions, cryoprotection and to stabilize membrane structures or proteins during abiotic stress conditions. Previously, our research group reported that transgenic Arabidopsis plants overexpressing a dehydrin from Opuntia streptacantha (OpsDHN1) show enhanced tolerance to freezing stress. In order to identify the OpsDHN1 interacting proteins through which it exerts this effect, we performed a yeast two-hybrid assay based on the split-ubiquitin technique, by which we identified potential interacting proteins of the dehydrin from cactus (OpsDHN1). Within these interactors are membrane proteins such as: RPT2B, PIP2;2 and ARA-5, and the chloroplast protein NPQ4. In addition, we identified an abundantly protein of unknown function (At1g44920) located in the chloroplast. Furthermore, we demonstrated that OpsDHN1 can interact with itself, suggesting the formation of homo-dimers. The identification of these potential interactors, including OpsDHN1 provides us with valuable information regarding the identity of the proteins with which dehydrin can participate and this could lead us to a better understanding of the molecular mechanisms by which dehydrins could perform their function.
Integración de un modelo de flujo a un Sistema de Información Geográfica (SIG).
Get PDF"Para conocer el comportamiento de un sistema de flujo subterráneo, es necesario conocer las ecuaciones que lo describen, así como también las variables necesarias para resolverlas. Generalmente, los sistemas que describen el flujo subterráneo, no permiten una solución analítica, por lo que los métodos para resolver las ecuaciones que describen la dinámica de flujos subterráneos son de carácter numérico, esto hace necesario utilizar herramientas computacionales. En este trabajo se desarrollo un software libre que hace uso de dos herramientas que se encuentran disponibles en la web, por una parte el software Open Source Geographic Resources Analysis Support System (GRASS) GIS que, por medio de Sistemas de Información Geografíaca (GIS en inglés) permite crear, manipular y visualizar mapas de datos georeferenciados, teniendo como ventaja que los datos se encuentran en un plano o el espacio. Estos datos son representados por un mapa que cumple las características de una malla cuadriculada (grid). Por otra parte se tiene un código libre llamado MODFLOW, que resuelve las ecuaciones de flujo subterráneo por medio del método de diferencias finitas, método en el cual es necesario tener un mallado (grid). MODFLOW está escrito en Fortran y es de libre acceso. El módulo que se busca crear en este trabajo pretende integrar MODFLOW con GRASS GIS por medio de una interfaz gráfica, la cual permitirá que los datos guardados en GRASS sean los parámetros de entrada para el modelo de flujo utilizado por MODFLOW. Las ventajas que tiene el módulo es que será de código libre, para hacer el modelo de flujo no será necesario hacer la conversión de formatos necesarios para ambos softwares, por lo tanto, el proceso de modelación será más eficiente. Este desarrollo tecnológico puede ser muy útil en el manejo de información asociada a modelos numéricos.""To understand the behavior of a groundwater ow system it is necessary to know the equations that describe it, as well as the variables needed to solve it. Generally, systems that describe groundwater flow, do not allow analitical solution, so the methods used to solve these equations are of numeric nature, so it is necessary to use computational tools. This project seeks to develop an open source software that makes use of two tools that are available on the web, first the open source software Geographic Resources Analysis Support System (GRASS) GIS, that by means of Geographical Information Systems (GIS) is able to create, manipulate and display maps of georeferenced data, with the advantage that the data is in square gridded plane or space. Additionally we used the open source software MODFLOW, which solves the groundwater flow equations using a nite difference method, which makes use of a mesh (grid). MODFLOW is written in FORTRAN and is freely accessible. The module we seek to create intends to integrate MODFLOW with GRASS GIS through a graphic interface, which will allow data stored in GRASS to be input parameters for the flow models used by MODFLOW. The advantages of this module is that it will be open source, in order to make the flow model it will no longer be necessary to make format conversions required by both software, therefore making the modeling processes more efficient. This tecnologic development can be very useful in the management of information associated with numerical models.
Microstructure and magnetocaloric effect of melt-spun Ni52Mn26Ga22 ribbon
Get PDF"Microstructural features and magnetocaloric properties of Ni52Mn26Ga22 melt-spun ribbons were studied. Results show that there are four types of differently oriented variants of seven-layered modulated (7M) martensite at room temperature, being twin-related one another and clustered in colonies. Due to the coupled magnetic and structural transformations between parent austenite and 7M martensite, the melt-spun ribbons exhibit a significant magnetocaloric effect. At an applied magnetic field of 5 T, an absolute maximum value of the isothermal magnetic entropy change of 11.4 J kg(-1) K-1 is achieved with negligible hysteresis losses.
Assessing and comparing relationships between ecosystem functioning and species diversity across forest ecosystems
Get PDF"Ecosystems are the fundamental unit in ecology, it is at this level that fundamental processes for the ecosystem functions are made; in recent years it has been proved that this processes are positively related to the species diversity, nevertheless, there are no global studies that could actually define this relation. The principal goal for this research is to implement a new methodology to evaluate the relationships between ecosystem function and species diversity at a global scale. In order to use this methodology it was necessary to use the databases of A.H. Gentry from the SALVIAS project which contain information from more than 200 forests worldwide. With this information, Monte Carlo simulations were carried out (re-sampling proportional to the sample size) for each database, and the shape of the curve was observed as a result of the mean of the accumulated biomass groups as the species richness increased. Afterwards, regressions were applied (with the formula F = αSβ) in order to classify the curves according to the parameters of the curve α and β. These parameters were later compared with several biotic and abiotic factors (Holdridge life-zones, precipitation, elevation, latitude and species richness). We got 152 positive deceleration response curves, 39 positive quasilinear and 7 positive accelerative curves, a clear relationship was observed between α and β parameters and the Holdridge life-zones, in addition tendency curves were appreciated when comparing the parameters with elevation, latitude and species richness.""Los ecosistemas son la unidad fundamental de la ecología, y es a ese nivel que se realizan procesos fundamentales para el funcionamiento del mismo, en los últimos años se ha corroborado que dichos procesos se relacionan de manera positiva con la diversidad presente en dicho ecosistema, sin embargo, no existen estudios a escala global que puedan ayudar a determinar esta relación. El objetivo principal de este estudio radica en implementar una metodología para evaluar las relaciones entre funcionamiento ecosistémico y diversidad de especies a nivel global. Para poder implementar la metodología fue necesario utilizar las bases de datos de A.H. Gentry del proyecto SALVIAS las cuales contienen información de más de 200 bosques alrededor del mundo. Con esta información, se realizaron simulaciones Monte Carlo (re-muestreo proporcional al tamaño de la muestra) para cada base de datos y se observó la forma de la curva que resultaba del promedio de grupos de biomasa acumulada a medida que la riqueza de especies aumentaba. Posteriormente se realizaron regresiones (mediante la fórmula F = αSβ) para poder clasificar las curvas en base a los parámetros α y β. Dichos parámetros fueron después comparados con diversos factores tanto bióticos como abióticos (zonas de vida de Holdridge, precipitación, elevación, latitud y riqueza de especies). Se obtuvieron un total de 152 curvas positivas desacelerativas, 39 curvas positivas cuasi lineales y 7 curvas positivas acelerativas, se pudo apreciar una clara relación entre los parámetros α y β y las zonas de vida de Holdridge, además de apreciar líneas de tendencia al correlacionar con la elevación, latitud y riqueza de especies
Diagnóstico molecular de la tuberculosis bovina
Get PDF"CONTEXTO. El diagnóstico de la tuberculosis (TB) humana habitualmente no incluye la diferenciación de las especies del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB), aunque la enfermedad causada por Mycobacterium bovis es una enfermedad del ganado bovino con prevalencia variable en humanos. En México la TB bovina causa pérdidas por alrededor de 450 millones de dólares anuales y es una fuente significativa de infección para los humanos. En San Luis Potosí nuestro grupo encontró recientemente que al menos 2.1% de los casos de TB pulmonar humana se deben a M. bovis. El propósito de este trabajo fue desarrollar un método de PCR multiplex anidada rápido y ultrasensible —consistente en dos mezclas multiplex directas (PCRM-D1 y PCRM-D2) y las mezclas de reacción multiplex anidadas correspondientes (PCRM-A1 y PCRM-A2— para identificar M. tuberculosis, M. bovis y M. bovis BCG, basado en el método de Pinsky y Banaei (J Clin Microbiol 46:2241-6, 2008), que consta de dos mezclas de reacción sucesivas, denominadas respectivamente Rx1 y Rx2, equivalentes a las mezclas “directas” del nuevo método que nos propusimos desarrollar. MÉTODOS. Diseñamos siete oligonucleótidos adicionales a los del método original para generar dos amplicones directos, dos semianidados “largos” y un amplicón semianidado corto, los cuales fueron probados en mezclas de PCR multiplex con DNA de tres cepas de referencia: M. tuberculosis H37Rv, M. bovis AN5 o M. bovis BCG. Luego “preamplificamos” las mezclas PCRM-D1 y -D2 por 15 ciclos y usamos 1/25 de volumen como molde en las mezclas PCRM-A1 y -A2 que también amplificamos por 30 ciclos. Comparamos la sensibilidad de las mezclas PCRM-A1 “directa” (A1d) y anidada (A1a) empleando cantidades decrecientes de DNA de M. tuberculosis H37Rv en: 1) mezclas A1d que fueron amplificadas por 30 ciclos y 2) mezclas PCRM-D1 preamplificadas por 15 ciclos de la cuales aplicamos 1/25 de volumen a mezclas A1a que fueron amplificadas a su vez por 30 ciclos. RESULTADOS. En las mezclas PCRMD1 obtuvimos las bandas esperadas para M. tuberculosis H37Rv, M. bovis BCG y M. bovis AN5. Observamos las dos bandas esperadas para M. tuberculosis con todas las diluciones de oligonucleótidos probadas. En las mezclas PCRM-A1 y -A2 preamplificadas obtuvimos todos los productos esperados e identificamos los amplicones específicos de M. tuberculosis, M. bovis y M. bovis BCG.""BACKGROUND. The diagnosis of human tuberculosis (TB) usually does not differentiate the Mycobacterium tuberculosis complex species (MTC) although human TB caused by Mycobacterium bovis is a disease of cattle with varying prevalence in humans. In Mexico bovine TB is a significant source of infection for humans and causes losses of 450 million dollars annually. Our group recently found that in San Luis Potosí at least 2.1% of the human pulmonary TB cases are caused by M. bovis. The purpose of this work was to develop a fast and ultrasensitive nested multiplex PCR method —consisting of two direct multiplex reactions mixtures (PCRM-D1 and PCRM-D2) and the corresponding nested multiplex reaction mixtures (PCRM-A1 and PCRM-A2)— to identify M. tuberculosis, M. bovis and M. bovis BCG, based on the method Pinsky and Banaei (J Clin Microbiol 46:2241-6, 2008) comprising two successive reaction mixtures called Rx1 and Rx2, equivalent to the “direct” mixtures of the new method. METHODS. Seven oligonucleotides additional to those of the original method were designed to generate two direct, two seminested “long” amplicons and one seminested “short” amplicon which were tested in multiplex PCR mixtures with DNA from three reference strains: M. tuberculosis H37Rv, M. bovis AN5 or M. bovis BCG. PCRM-D1 and -D2 mixtures were then “preamplified” for 15 cycles and 1/25 volume was used as template in PCRM-A1 and -A2 mixtures that were also amplified for 30 cycles. The sensitivity of “direct” PCRM-A1 (A1d) and nested (A1a) was compared using decreasing amounts of M. tuberculosis H37Rv in DNA as templates in: 1) A1d mixtures amplified for 30 cycles, 2) PCRM-D1 mixes “preamplified” for 15 cycles from which 1/25 volume was applied to A1a mixtures that were in turn amplified for 30 cycles. RESULTS. PCRM-D1 mixtures generated all bands expected for M. tuberculosis H37Rv, M. bovis BCG and M. bovis AN5. The two bands expected for M. tuberculosis were generated with all the oligonucleotide dilutions tested. In “preamplified” PCRM-A1 and -A2 mixtures all the products expected were obtained and the M. tuberculosis, M. bovis and M. bovis BCG specific amplicons were identified. In PCRM-A1d mixtures the expected bands were obtained with 353 fg of M. tuberculosis H37Rv DNA (equivalent to 74 genome copies) and in PCRM-A1a with 7 fg (equivalent to 1 genome copy).
Efecto nodriza de Larrea tridentata y su impacto en la diversidad de especies vegetales perennes en la región del Altiplano Potosino, México.
Get PDFTesis (Maestría en Ciencias Ambientales)"La facilitación entre las plantas puede influir fuertemente en la diversidad de la vegetación en lugares con condiciones ambientales extremas, como ecosistemas áridos y semiáridos. Esto ocurre porque las estructuras físicas de algunas plantas (doseles, sistemas de raíces, etc.), normalmente conocidas como plantas nodriza, pueden mitigar condiciones extremas dentro de su área de influencia y crear microhábitats en los que las especies altamente susceptibles a condiciones ambientales extremas pueden establecerse. A lo largo del desierto Chihuahuense, Larrea tridentata es una especie arbustiva pionera que coloniza sitios que han sido fuertemente afectados por las actividades humanas en el pasado. Aunque algunos estudios han indicado que este arbusto puede facilitar el establecimiento de otras especies proporcionando sombra para sus plántulas, la relevancia de este proceso para la recuperación y el mantenimiento de la diversidad vegetal no ha sido aun evaluado. Este estudio se centra en este tema y evalúa (1) si L. tridentata actúa realmente como planta nodriza para otras especies y (2) la magnitud con la que estos procesos de facilitación impactan sobre la diversidad de las comunidades vegetales en sección sur del Desierto Chihuahuense. Para determinar si L. tridentata facilita otras plantas, se realizó un experimento de campo y se evaluó el desempeño ecofisiológico en plantas establecidas debajo y fuera de su dosel. Por otro lado, para evaluar los impactos de L. tridentata sobre la diversidad de comunidades vegetales, se realizaron relevamientos de campo en diez paisajes distribuidos por toda la región de estudio.""Facilitation between plants can strongly influence the diversity of vegetation in sites with extreme environmental conditions, such as arid and semiarid ecosystems. This occurs because the physical structures of some plants (canopies, root systems, etc.), usually referred to as nurse plant, can ameliorate these extreme conditions within their area of influence, hence creating microhabitats in which species highly susceptible to environmental extremes can establish. Across the Chihuahuan Desert, Larrea tridentata is a pioneer shrub species that colonizes sites that have been strongly affected by human activities in the past. Although some studies have indicated that this shrub can facilitate the establishment other species by providing shaded environments for seedlings, the relevance of this process for the recovering and maintenance of plant diversity has not been previously assessed. This study focuses on this issue and evaluates (1) whether L. tridentata actually acts as nurse plant for other species and (2) the magnitude with which these facilitative processes impacts on the diversity of plant communities across the Southern section of the Chihuahuan Desert. To determine whether L. tridentata facilitates other plants, we performed a field experiment and assessed the ecophysiological performance of plant species established beneath and outside the canopy of this shrub. On the other hand, to assess the impacts of L. tridentata on the diversity of plant communities, we performed field surveys at ten landscapes distributed across the study region.
Attractors generated from switching unstable dissipative systems
Get PDF"In this paper, we present a class of 3-D unstable dissipative systems, which are stable in two components but unstable in the other one. This class of systems is motivated by whirls, comprised of switching subsystems, which yield strange attractors from the combination of two unstable "one-spiral" trajectories by means of a switching rule. Each one of these trajectories moves around two hyperbolic saddle equilibrium points. Both theoretical and numerical results are provided for verification and demonstration.
Chaos evidence in catecholamine secretion at chromaffin cells
Get PDF"Chromaffin cells secrete catecholamine molecules via exocytosis process. Each exocytotic event is characterized by a current spike, which corresponds to the amount of released catecholamine from secretory vesicles after fusing to plasma membrane. The current spike might be measured by the oxidation of catecholamine molecules and can be experimentally detected through amperometry technique. In this contribution, the secretion of catecholamine, namely adrenaline, of a set of bovine chromaffin cells is measured individually at each single cell. The aim is to study quantitative results of chaotic behavior in catecholamine secretion. For analysis, time series were obtained from amperometric measurements of each single chromaffin cell. Three analysis techniques were exploited: (i) A low-order attractor was generated by means of phase space reconstruction, Average Mutual Information (AMI) and False Nearest Neighbors (FNN) were used to compute embedding lag and embedding dimension, respectively. (ii) The properties of power spectrum density of time series were studied by Fast Fourier Transform (FFT) looking for possible dominant frequencies in power spectrum. (iii) Maximun Lyapunov Exponent (MLE) analysis was done to study the divergence of trajectories of the time series. Nevertheless, in order to dismiss the possibility of positiveness of MLE are due to the inherent noise in experiments, seven surrogate data sets computed using the Amplitude Adjusted Fourier Transform (AAFT) algorithm was computed. The phase space reconstruction showed that, in all cases, the trajectories lie in an embedding subspace suggesting oscillatory nature. The FFT analysis showed high dispersion of the power spectrum without any predominant frequency range. MLE analysis showed that the MLE values are positive for a given orbit time and a defined range of maximum scale values. Moreover, the trajectory of the MLE evolution of all the surrogate data are asymptotic and hold positive along the maximum scale range. These findings are preliminary evidence on detecting chaotic behavior in catecholamine secretion and, in general, their provide a first step towards a deeply understanding of nonlinear behavior of protein releasing dynamics.
Robust synchronization of a class of uncertain complex networks via discontinuous control
Get PDF"We propose robust controller designs to synchronize networks with uncertainties in their node dynamics and their connections. We consider two situations: in the first, we assume that the effect of uncertainties vanishes as synchronization is achieved. In the second, disturbances are assume nonvanishing but bounded. To achieve robust synchronization on these situations, we design local feedback controllers, which are smooth in the first case, and discontinuous in the latter. These designs allow us to establish synchronization criteria for this class of uncertain dynamical networks. We use numerical experiments to illustrate our results.