Repository of the University of Rijeka
Not a member yet
40085 research outputs found
Sort by
Standardizacija i optimizacija neuralnih staničnih modela i biomarker eseja za rijetke genetičke bolesti
No full textNiemann-Pick Disease Type C (NPCD) is a rare neurodegenerative disorder affecting 1 in 120,000 live births, characterized by complex alterations in sphingolipid metabolism. While cholesterol accumulation is a prominent feature, the situation is more intricate in the brain, where primary accumulating lipids are sphingolipids such as GM2 and GM3 gangliosides. So far, the only approved therapy to date, Miglustat, targets sphingolipid pathways and is used to prevent disease progression. The objective of this study is to improve an existing ganglioside assay for its utilization in cellular models. The optimization process encompasses the careful selection of the most effective extraction buffers, optimizing the protocol steps to enhance efficiency, and selecting appropriate sample sizes for cellular pellets. This study aims to develop a universally applicable assay that can be used across a wide range of cell lines. The assay validation involves the utilization of differentiated astrocytes and neural progenitor cells derived from fibroblast lines harboring NPC1-heterozygous and NPC1-homozygous variants. Quantification of gangliosides is performed using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).The findings of this investigation demonstrated a notable disparity in the buildup of GD3 ganglioside in fibroblast cell lines that were homozygous for the NPC1 gene mutation. Conversely, neural progenitor cells and astrocytes exhibited a reduction in GD3 ganglioside levels. Furthermore, it was observed that NPC1-homozygous fibroblasts exhibited increased concentrations of complex GD1a and GT1b gangliosides. Additional investigation is required to effectively address the inquiries that have been prompted by these results. This assay holds significant potential, hence redefining the application of cellular models in in vitro experiments related to lysosomal storage diseases. Upon optimization, the ganglioside assay will function as a valuable instrument for capturing the accumulation pattern of gangliosides that are linked to rare diseases.Niemann-Pickova bolest tipa C (NPCD) rijedak je neurodegenerativni poremećaj koji pogađa 1 od 120 000 živorođene djece, a karakteriziraju ga složene promjene u metabolizmu sfingolipida. Dok je nakupljanje kolesterola glavno obilježje ove bolesti, situacija je složenija u mozgu gdje se primarno nakupljaju sfingolipidi kao što su GM2 i GM3 gangliozidi. Do sada jedina odobrena terapija, Miglustat, inhibira sintezu sfingolipida i koristi se za sprječavanje progresije bolesti. Cilj rada je prenamijeniti postojeći esej gangliozida za njegovu upotrebu u staničnim modelima. Proces optimizacije obuhvaća pažljiv odabir otopine za ekstrakciju, optimiziranje koraka protokola za povećanje učinkovitosti i odabir odgovarajuće veličine uzorka za stanične pelete. Cilj ove studije je razviti univerzalno primjenjivi test koji se može koristiti u širokom rasponu staničnih linija. Validacija testa uključuje korištenje diferenciranih astrocita i neuralnih progenitorskih stanica diferenciranih iz linija fibroblasta koje sadrže NPC1-heterozigotne i NPC1-homozigotne varijante. Kvantifikacija gangliozida provodi se pomoću tekućinske kromatografije-tandem masene spektrometrije (LC-MS/MS). Rezultati ovog istraživanja pokazali su primjetnu razliku u nakupljanju GD3 gangliozida u linijama fibroblasta koje su bile homozigotne za mutaciju gena NPC1. Suprotno tome, neuralne progenitorske stanice i astrociti pokazali su smanjenje razine GD3 gangliozida. Nadalje, primijećeno je da NPC1-homozigotni fibroblasti pokazuju povećane koncentracije kompleksnih GD1a i GT1b gangliozida. Dodatna istraživanja su potrebna kako bi se učinkovito odgovorilo na upite koje su potaknute ovim rezultatima. Ovaj test ima značajan potencijal, stoga redefinira primjenu staničnih modela u in vitro eksperimentima koji se odnose na lizosomske bolesti nakupljanja. Nakon optimizacije, analiza gangliozida funkcionirat će kao vrijedan instrument za mjerenje gangliozida koji su povezani s rijetkim bolestima
Role of interferon gamma in the control of mouse cytomegalovirus infection in neurons
No full textCytomegalovirus (CMV) is a highly prevalent β-herpesvirus that infects the majority of the population worldwide. CMV infections are usually asymptomatic, however, in immunocompromised individuals and newborns they can lead to severe sequelae and life-threatening conditions. Congenital CMV infection is the most common congenital infection that can affect brain development and cause severe neurological disabilities. CMV can infect a broad range of cells including neurons, which employ pro-survival strategies to avoid destruction from the immune system. Generally, CD4+ and CD8+ T cells play a crucial role in the control of CMV infection in the brain. Since these cells secrete IFNγ, the objective of this thesis is to determine the role of IFNγ in the control of MCMV infection in neurons, using a mouse model of congenital infection. For this purpose, newborn mice lacking IFNγR in neurons were infected with MCMV and organs were harvested at three timepoints of infection. Viral titers in brain were determined by plaque assay and the percentage of infected neurons was quantified by dual immunohistochemical analysis. Analysis of viral titers was also performed for congenitally infected mice lacking IFNγR in astrocytes. The results of these experiments show that IFNγ does not directly control MCMV infection in neurons and astrocytes, both during, and after resolution of productive infection. These findings add to the understanding of immune responses to CMV infection which is pivotal for development of effective therapies and vaccines and raise new questions on which molecules and cells are involved in the control of CMV infection in neurons.Citomegalovirus (CMV) je široko rasprostranjen β-herpesvirus koji inficira većinu populacije širom svijeta. CMV infekcije su obično asimptomatske, međutim u imunokompromitiranih pojedinaca i novorođenčadi mogu dovesti do ozbiljnih posljedica te stanja opasnih po život. Kongenitalna CMV infekcija je najčešća kongenitalna infekcija koja može utjecati na razvoj mozga i uzrokovati ozbiljne neurološke poremećaje. CMV može inficirati širok raspon stanica, uključujući neurone koji koriste strategije preživljavanja kako bi izbjegli uništenje od strane imunološkog sustava. Općenito, CD4+ i CD8+ T stanice imaju presudnu ulogu u kontroli CMV infekcije u mozgu. Budući da te stanice izlučuju IFNγ, cilj ovog rada je utvrditi ulogu IFNγ u kontroli MCMV infekcije u neuronima, koristeći mišji model kongenitalne infekcije. U tu svrhu, novorođeni miševi kojima nedostaje IFNγR u neuronima inficirani su MCMV-om te su im organi prikupljeni u tri vremenske točke infekcije. Virusni titar u mozgu je određen analizom plakova te je kvantificiran postotak inficiranih neurona analizom dvojne imunohistokemije. Analiza virusnih titrova provedena je i za kongenitalno-inficirane miševe kojima nedostaje IFNγR u astrocitima. Rezultati ovih eksperimenata pokazuju da IFNγ nema direktnu kontrolu nad MCMV infekcijom u neuronima i astrocitima tijekom te nakon rezolucije produktivne infekcije. Ovi pronalasci pridodaju razumijevanju imunoloških odgovora na CMV infekciju, što je ključno za razvoj učinkovitih terapija i cjepiva te postavljaju nova pitanja o tome koje molekule i stanice su uključene u kontrolu CMV infekcije u neuronima
The effect of PI4KIIa and PI4KIIIb on platelet cytoskeleton
No full textTrombociti su krvne stanice koje nastaju oslobađanjem dijelova citoplazme zrelih megakariocita. U cirkulaciji se nalaze u stanju mirovanja, međutim pronalaskom oštećenja krvne žile, oni se aktiviraju što vodi promjeni oblika te stvaranju ugruška. Uslijed stimulacije trombocita dolazi do polimerizacije aktina, a adhezija trombocita ostvaruje se stvaranjem adhezivnih produžetaka: filopodija i lamelipodija. Procesi remodeliranja membrane i vezikularni promet potrebni su za aktivaciju trombocita te su posredovani i fosfoinozitidima (PI), fosforiliranim membranskim lipidima. Najobliniji PI u stanici su fosfatidilinozitol-4,5-bifosfat (PI(4,5)P2) i fosfatidilinozitol-4-monofosfat (PI4P), te se smatra da je PI4P glavni izvor PI(4,5)P2. PI4P mogu proizvoditi fosfatidilinozitol 4- kinaze tipa II (PI4KIIα i PI4KIIβ) i kinaze tipa III (PI4KIIIα i PI4KIIIβ). U ovom radu, pokazujemo kako specifična farmakološka inhibicija PI4KIIIβ, IN-9 inhibitorom, smanjuje širenje trombocita na kolagenu. Inhibirani trombociti su okruglastiji i nerašireni, pokazuju nemogućnost polimerizacije F-aktina uočeno po povećanom broju filopodija u odnosu na lamelipodije te izostanak aktinomiozinskih stresnih vlakana koja pomažu u održavanju širenja trombocita. Nadalje, imunofluorescencijom smo pokazali lokalizaciju PI4KIIα u mirujućim i aktiviranim trombocitima i njenu kolokalizaciju s α-tubulinom. Također, pokazujemo kako inhibicija PI4KIIα inhibitorom PI-273, tek u najvećoj koncentraciji djelomično smanjuje širenje trombocita na kolagenu ukazujući na slabiju ulogu ove kinaze u ovom aspektu funkcije trombocita.Platelets (PLT) are blood cells that are formed by the release of parts of the cytoplasm of mature megakaryocytes. In the circulation, they are in their resting state, but upon vessel wall injury, they activate, which leads to PLT shape change and the formation of a thrombus. Actin polymerization occurs as a result of PLT activation, and PLT adhesion is achieved by the formation of adhesive extensions: filopodia and lamellipodia. Membrane remodeling and vesicular trafficking are needed for PLT activation, and these processes are mediated also by phosphoinositides (PIs), phosphorylated membrane lipids. Two most abundant PIs in the cells are phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) and phosphatidylinositol-4-monophosphate (PI4P), the later being a major source for PI(4,5)P2. PI4P can be produced by type II phosphatidylinositol 4-kinases (PI4KIIα and PI4KIIβ) and type III kinases (PI4KIIIα and PI4KIIIβ). In this study, we show that specific pharmacological inhibition of PI4KIIIβ, with inhibitor IN-9, reduces PLT spreading on collagen. Inhibited platelets are more rounded and unexpanded, exhibit an inability to polymerize F-actin as evidenced by an increased number of filopodia compared to lamellipodia, and the absence of actinomyosin stress fibers that help maintain spreaded platelet. Furthermore, we showed the localization of PI4KIIα in resting and activated platelets and its colocalization with α-tubulin using immunofluorescence. We also show that inhibition of PI4KIIα with PI-273 mildly only at higher concentrations reduces platelet spreading on collagen. indicating a weaker role of PI4KIIα in this aspect of platelet function
In vitro regeneracija primarnih staničnih kultura korteksa postnatalnih oposuma Monodelphis domestica
No full textMammalian central nervous system (CNS) begins to develop in early embryonal period. CNS has then the ability to regenerate itself, while soon after birth, regeneration stops. Opossum Monodelphis domestica is a unique model for investigating CNS regeneration because it is born at a very immature stage of CNS development. Opossum has a unique possibility to successfully regenerate spinal cord after injury in the first two weeks of their postnatal development. Regenerative capacity abruptly declines after that period and is completely lost in mature organism. Two significantly different ages of opossum at postnatal days (P)3-5 and P16-18 have different cell environment and gene profile which determine the capability of spinal cord regeneration after injury. Apart from spinal cord, opossum cortex and capability of its regeneration remain unexplored. Aim of this thesis is to establish and characterize primary cell cultures of opossum cortex, in order to explore the CNS cell composition, maturation and regeneration at a molecular basis in vitro. Immunofluorescence was used to characterize the cell composition and expression of markers linked to CNS maturation and regeneration. Scratch assay was used to study the response of cells and of their environment to injury. Calcium imaging method was used to study the maturation of cells and cell networks formed in cultures, as well as activity recovery after injury. Primary cortical cell cultures of neonatal opossum can be maintained up to a month in vitro. P3-5 cultures consist of 93% of neurons and almost 50% of cells positive for progenitor marker SOX2, while P16-18 cultures consist of 80% of neurons and 30% of SOX2+ cells. An interesting discovery is the co-expression of neuronal marker with SOX2, which was not investigated in opossum before. In vitro cortical cell culture temporal maturation correlates with the maturation of opossum cortex in vivo. Spontaneous activity of neurons and neuronal networks is observed in 7th day in vitro (DIV7) of both age groups (P3-5 and P16-18). After the injury, neurons regenerate axons which after 48 hours connect the opposite sides of the injury. A reduction in injury width, as well as glial-scar-like formation is visible in DIV10 cultures of both ages. By calcium activity, it has been shown that 48 hours after the injury, neuronal networks of the opposite sides of the injury are reconstituted and synchronized. These results contribute to understanding of opossum cortex maturation, as well as cell microenvironment on the cortex regeneration upon injury. Integration of results may contribute to better understanding of cell adaptation on pathophysiological conditions of mammalian cortex.Središnji živčani sustav (SŽS) sisavaca počinje s razvojem u ranom embrionalnom periodu. Tada SŽS posjeduje sposobnost regeneracije, dok se ubrzo nakon rođenja sposobnost regeneracije gubi. Oposum Monodelphis domestica jedinstven je model za istraživanje regeneracije SŽS-a jer se rađa u vrlo nezrelom stadiju razvoja SŽS-a. Oposum posjeduje sposobnost regeneracije leđne moždine nakon ozljede tijekom prva dva tjedna postnatalnog razvoja. Sposobnost regeneracije naglo pada nakon tog perioda te se u potpunosti gubi u zrelom organizmu. Dvije značajno različite dobi oposuma, postnatalni dan (P)3-5 i P16-18 sadrže različiti stanični okoliš i genski profil koji uvjetuju sposobnost regeneracije leđne moždine nakon ozljede. Za razliku od leđne moždine, korteks mozga i sposobnost njegove regeneracije u oposumu ostaju neistraženi. Cilj ovog rada je uspostava i karakterizacija primarnih staničnih kultura korteksa oposuma, kako bi se omogućilo istraživanje staničnog sastava, maturacije i regeneracije SŽS-a na molekularnoj bazi in vitro. Metodom imunofluorescencije, karakterizirao se stanični sastav i ekspresija markera povezanih s razvojem SŽS-a i regeneracijom. Izazivanjem ozlijede in vitro, istražio se odgovor stanica i staničnog okoliša na ozljedu. Funkcionalnim ispitivanjem oslikavanja kalcija, proučila se zrelost stanica i staničnih mreža formiranih u staničnim kulturama, kao i ponovno uspostavljene aktivnosti nakon ozlijede. Primarne stanične kulture korteksa neonatalnog oposuma mogu se održavati do mjesec dana u in vitro uvjetima. Stanične kulture P3-5 oposuma sadrže 93% neurona i gotovo 50% stanica pozitivnih na marker progenitora (SOX2), dok stanične kulture P16-18 oposuma sadrže 80% neurona i 30% SOX2+ stanica. Zanimljivo otkriće predstavlja koekspresija markera neurona i progenitora (SOX2), koja nije do sada istražena u oposumima. In vitro maturacija staničnih kultura korteksa vremenski korelira sa maturacijom korteksa oposuma in vivo. Spontana aktivnost neurona i mreža neurona uočena je već u 7. danu u kulturi (DIV7) za obje dobi (P3-5 i P16-18). Nakon ozljede, neuroni regeneriraju aksone koji već 48 sati nakon ozljede povezuju suprotne strane ozljede. Smanjenje promjera ozljede, kao i formiranje staničnih struktura sličnim glijalnom ožiljku je uočeno već u DIV10 kulturama obiju dobi. Oslikavanjem aktivnosti kalcija, potvrđeno je da su 48 sati nakon ozljede neuronalne mreže između suprotnih strana ozljede ponovno uspostavljene i sinkronizirane. Ovi rezultati doprinose razumijevanju maturacije korteksa oposuma, kao i utjecaju staničnog mikorookoliša na regeneraciju korteksa nakon ozljede. Integracija dobivenih rezultata mogla bi doprinijeti boljem razumijevanju prilagodbe stanica na patofiziološka stanja u korteksu sisavaca
Isolation, characterization and evaluation of biological activities of extracts and natural compounds isolated from the Adriatic sea coral, Eunicella cavolini
No full textMorski sjedilački organizmi poput spužvi i koralja prilagodili su se ekstremnim uvjetima morskog okoliša sintezom sekundarnih metabolita s jedinstvenim strukturnim karakteristikama koji su pokazali široki spektar bioloških aktivnosti in vitro i in vivo. U prijašnjim studijama iz oktokoralja roda Eunicella, izolirani su spojevi iz klase steroida, terpenoida i alkaloida s prvenstveno citotoksičnim učincima. Unatoč tome što su Eunicella koralji iz Sredozemnog mora bili predmet nekolicine istraživanja unazad nekoliko desetljeća, oni iz Jadranskog mora do sada nisu istraživani u cilju izolacije prirodnih spojeva i biološke evaluacije istih. Stoga, je ovim doktorskim istraživanjem po prvi puta provedena kemijska karakterizacija metabolita i biološka evaluacija ekstrakta te polu-pročišćenih frakcija dobivenih iz koralja Eunicella cavolini (Koch, 1887.), s ciljem utvrđivanja potencijala antiproliferativnih, antioksidativnih, antimikrobnih i protuupalnih učinaka. Preliminarni podaci su pokazali kako ekstrakti i frakcije koralja pokazuju umjereni antiproliferativni učinak na panelu tumorskih stanica i djelovanje prema Gram-pozitivnim bakterijama, kao i toksične učinke u razvoju embrija zebrica Danio rerio. Stoga, je iz frakcije F1 izoliran i okarakteriziran steroid pregnanskog tipa kojemu su po prvi puta ispitane biološke aktivnosti te je dodatno pripremljen derivat modifikacijom supstituenta. Ti su spojevi pokazali potencijalno protuupalno djelovanje inhibicijom lipooksidaze iz soje te denaturacije albumina uz umjerenu inhibiciju rasta tumorskih stanica i selektivnost prema stanicama adenokarcinoma debelog crijeva. Također je prirodni pregnanski produkt imao zapaženo antibakterijsko djelovanje (MIC = 62,5 µM na B. subtilis) dok su i pregnan i njegov deriviat pokazali toksični efekt na razvoj zebrica pri niskim koncentracijama. S druge strane, doktorski rad je uključivao pripravu jednog od metabolita koji se prirodno pojavljuje u koralju roda Eunicella, granulatamida B te je priređeno desetak njegovih strukturnih analoga modulirajući pobočni masnokiselinski lanac (duljinu lanca, zasićenost, konjugaciju dvostrukih veza). Pokazalo se da granulatamid B i analozi s nezasićenim i/ili konjugiranim dvostrukim vezama uzrokuju umjerenu inhibiciju rasta tumorskih stanica, pri čemu je analog sa lancem retinoične kiseline pokazao antioksidativno djelovanje usporedivo s pozitivnom kontrolom. Dodatno, samo je granulatamid B imao antibakterijsko djelovanje i to prema Gram-pozitivnom B. subtilis. Obzirom na to da strukturni analog granulatamida B sa α-linolenskim lancem nije uzrokovao abnormalan razvoj zebrica, te je imao selektivnije djelovanje prema tumorskim stanicama, mogao bi predstavljati molekulu od interesa za daljnju promjenu strukture i postizanje boljih bioloških učinaka. U konačnici, ovim se istraživanjem otvara put daljnjim ispitivanjima biološkog potencijala ekstrakta, odnosno spojeva jadranskog koralja, E. cavolini s naglaskom na kemijsku modifikaciju struktura s ciljem smanjenja toksičnosti uzoraka.Sedentary marine organisms such as sponges and corals have adapted to the extreme conditions of the marine environment by synthesizing secondary metabolites with unique structural characteristics that have shown a wide range of biological activities in vitro and in vivo. Furthermore, compounds from the class of steroids, terpenoids and alkaloids with primarily cytotoxic effects were isolated via bioprospecting programmes from octocorals of the genus Eunicella. Even though Eunicella corals from the Mediterranean Sea have been the subject of several studies over the past few decades, those from the Adriatic Sea have not been investigated so far with the aim of isolating natural compounds and their biological evaluation. Therefore, within this doctoral research, chemical characterization of metabolites and biological evaluation of extracts and semi-purified fractions obtained from the coral Eunicella cavolini (Koch, 1887) were carried out for the first time, with the aim of determining the potential of antiproliferative, antioxidant, antimicrobial and anti-inflammatory effects. Preliminary data showed that coral extracts and fractions show a moderate antiproliferative effect on a panel of tumour cells and activity against Gram-positive bacteria. Also, toxic effects were observed in the development of zebrafish (Danio rerio) embryos. Consequently, a pregnane-type steroid was isolated and characterized from fraction F1, whose biological activities were tested for the first time, and a derivative was additionally prepared by modifying the substituent. These compounds showed potential anti-inflammatory activity by inhibiting soy lipoxygenase and albumin denaturation with moderate inhibition of cancer cells growth and selectivity towards colon adenocarcinoma cells. Natural pregnane had a noticeable antibacterial effect (MIC = 62.5 µM on B. subtilis) while both pregnane and its derivative exerted toxic effects on zebrafish development were also observed at low concentrations. On the other hand, the doctoral thesis included the preparation of one of the metabolites that occurs naturally in the coral genus Eunicella, granulatamide B, and a dozen of its structural analogues were prepared by modulating the fatty acid side chain (chain length, saturation, conjugation of double bonds). Granulatamide B and analogues with unsaturated and/or conjugated double bonds were shown to cause moderate inhibition of cancer cells growth, with the analogue with a retinoic acid chain showing antioxidant activity comparable to the control. Additionally, only granulatamide B had antibacterial activity against Gram-positive B. subtilis. Given that the structural analogue of granulatamide B with an α-linolenic chain did not cause abnormal development of zebrafish and had a more selective effect on cancer cell lines, it could represent a molecule of interest for further structural change in order to achieve better biological effects. Finally, this research paves the way for further investigation of the biological potential of the extract, or compounds of the Adriatic coral, E. cavolini with an emphasis on the chemical modification of the structures with the aim of reducing the toxicity of the samples
Razvoj novih protokola za izolaciju polietilen tereftalata i polistirena iz morskih uzoraka te njihova identifikacija pomoću ATR-FTIR-a i MALDI-MS-a
No full textPolymers are macromolecules with repeated structural units. Synthetic polymers have first been introduced in the middle of the 19th century, and since then their production has exponentially increased on yearly basis. As of 2015, more than 6300 Mt of plastic waste has been generated throughout the world, with more than 76% of that waste ending in landfills and oceans. To fully estimate the effect of this pollution on our planet, simple standardized protocols should be set in place for microplastic analysis. This study presents a novel approach for isolating polyethylene terephthalate (PET) and polystyrene (PS) particles and their quantification and identification using Fourier transformation infrared spectroscopy (FTIR) and matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry. Additionally, seawater samples were analyzed to determine and optimize the microplastic isolation protocol using chemical digestion of the organic matter coupled with density separation of microplastic from sodium metatungstate (SPT) saline solution. Chemical digestion of the organic matter from seawater samples was tested with both hydrogen chloride (HCl) and hydrogen peroxide (H2O2) solutions. FTIR was later used to determine minimal concentration of PET and PS in seawater needed for their identification. Acquired minimal concentration was further tested with reagents used in chemical digestion to assess the effect of various solutions on PET and PS particles identification. The MALDI method for PET and PS identification was used to study the effect of different polymer suspension concentrations and two different cationization agents, sodium iodide (NaI) and silver trifluoroacetate (AgTFA). Identification of both PS and PET with FTIR in different solutions as well as the development of the MALDI method for PET identification were successful.Polimeri su makromolekule koje sadrže ponavljajuće strukturne jedinice. Sintetički polimeri su se prvi puta pojavili sredinom 19. stoljeća te od tada njihova proizvodnja eksponencijalno raste na godišnjoj razini. Od 2015. godine, više od 6300 Mt plastičnog otpada je nastalo diljem svijeta, s više od 76% od toga otpada odbačenog na odlagališta smeća i u mora. Kako bi u potpunosti mogli procijeniti učinak ovog zagađenja na naš okoliš i nas same, jednostavni standardizirani protokoli bi trebali biti razvijeni za analiziranje čestica mikroplastike. Ovaj rad prikazuje novi postupak u izoliranju čestica polietilen tereftalata (PET) i polistirena (PS) i njihovu identifikaciju pomoću Fourierove transformirane infracrvene spektroskopije (FTIR) i matricom asistirane laserske desorpcije/ionizacije (MALDI) masene spektrometrije. Također, morski uzorci su analizirani kako bi odredili i optimizirali izolacijski protokol koji koristi kemijsku digestiju organskih tvari i razdvajanje mikroplastike temelju gustoće iz slane otopine natrijevog polivolframata (SPT). Kemijska digestija organskih tvari iz uzoraka morske vode je testirana sa klorovodičnom kiselinom (HCl) i vodikovim peroksidom (H2O2). FTIR je potom korišten da bi se odredila minimalna koncentracija PET-a i PS-a u morskoj vodi potrebna za njihovu identifikaciju. Dobivena minimalna koncentracija je potom testirana sa reagensima korištenima u kemijskoj digestiji da bi se provjerio učinak različitih otopina na identifikaciju čestica PET-a i PS-a. Korištena MALDI metoda za identifikacija PET-s i PS-a usporedila je utjecaj različitih koncentracija polimera u otopini i dvaju različitih kationizacijskih agensa, natrijevog jodida (NaI) i srebrovog trifluoroacetata (AgTFA), na rezultate analize. Identifikacija PS-a i PET-a sa FTIR-om u različitim otopinama i razvoj MALDI metode za identifikaciju PET-a su bili uspješni
Preparation of meso-(N, N-diethylaminophenyl)porphyrins and their N-oxidation
No full textFotodinamička terapija (PDT) je inovativni tretman koji selektivno cilja maligne stanice uz minimalnu štetu zdravom tkivu, čineći je učinkovitom za tumore i određene kožne bolesti. Postupak uključuje akumulaciju fotosenzibilizatora (PS) u tumorskom tkivu, osvjetljavanje zahvaćenog područja određenom valnom duljinom što rezultira stvaranjem reaktivnih kisikovih spojeva (ROS). Iako općenito neučinkovita protiv metastaza, PDT se može kombinirati s drugim terapijama kao što su kemoterapija ili radioterapija kako bi se poboljšala njezina učinkovitost i prevladali njeni nedostaci. Za učinkovitu terapiju ključno je odabrati optimalan fotosenzibilizator koji je dobro topiv u vodenim otopinama, netoksičan u mraku, učinkovito apsorbira u vidljivom dijelu spektra te učinkovito proizvodi singletni kisik i drugih ROS. Vrlo je bitan optimalan omjer lipofilnih i hidrofilnih dijelova u strukturi fotosenzibilizatora kako bi se olakšala akumulacija u tumorskim stanicama, što se postiže modifikacijama početnih struktura fotosenzibilizatora.
Simetrični meso-tetra-(4-dietilaminofenil)porfirin i njegovi asimetrični derivati u kombinaciji s 4-acetamidofenilnim supstituentima uspješno su izolirani za upotrebu kao fotosenzibilizatori u PDT-u. Sve nove strukture i njihova čistoća potvrđeni su 1H i 13C NMR spektroskopijom. Spojevi su pokazali apsorpciju u crvenom dijelu spektra, izuzetnu fotostabilnost i učinkovitu proizvodnju singletnog kisika, osobito 5-[4-(N-acetamido)fenil]-10,15,20-tri(4-(N,N-dietilamino)fenil)porfirin(A3B). Fototoksičnost sintetiziranih PS-ova ispitivana je MTT testom uz osvjetljavanje crvenim svjetlom (λ = 643 nm, 2 mW/cm2) na dvije tumorske stanične linije, MDA-MB 231 i HeLa, te na HFF kao normalnoj staničnoj liniji. Simetrični 5,10,15,20-tetra(N,N-dietil-4-aminofenil)porfirin (A4) zbog slabe topljivosti nije pokazao citotoksičan učinak, dok A3B, unatoč najefikasnijoj generaciji singletnog kisika, pokazao je smanjenu citotoksičnost u usporedbi sa 5,15-di[4-(N-acetamido)fenil]-10,20-di(4-(N,N-dietilamino)fenil)porfirin (trans-A2B2) i 5,10-di[4-(N-acetamido) fenil]-15,20-di(4-(N,N-dietilamino)fenil)porfirin (cis-A2B2) koji su pokazali najjaču citotoksičnost, ali ne i selektivnost prema tumorskim stanicama. Potrebne su daljnje modifikacije struktura dobivenih porfirina kako bi se poboljšala svojstva i postigli učinkovitiji fotosenzibilizatori.Summary
Photodynamic therapy (PDT) is an innovative treatment that selectively targets malignant cells while causing as little damage as possible to healthy tissue and it is, therefore, effective for tumors and certain skin diseases. The process involves the accumulation of photosensitizer (PS) in the tumor tissue, the illumination of the affected area with a specific wavelength and the generation of reactive oxygen species (ROS). Although PDT is generally ineffective against metastases, it can be combined with other therapies such as chemotherapy or radiotherapy to increase its effectiveness and overcome its limitations. For effective therapy, it is crucial to select an optimal PS that is highly soluble in aqueous solutions, non-toxic in the dark, has effective absorption in the visible spectrum, and efficiently generates singlet oxygen and ROS. The optimal ratio of lipophilic and hydrophilic parts in the structure of the PS is crucial for accumulation in tumor cells, which is achieved by various modifications of the original PS structure.
Symmetric meso-tetra-(4-diethylaminophenyl)porphyrin and its asymmetric derivatives with 4-acetamidophenyl substituents were successfully isolated for use as PSs in PDT. All new structures and their purity were confirmed by 1H and 13C NMR spectroscopy. They showed absorption in the red region of the spectrum, exceptional photostability and effective singlet oxygen production, especially the 5-[4-(N-acetamido)phenyl]-10,15,20-tri(4-(N,N-diethylamino) phenyl)porphyrin (A3B). The phototoxicity of the PSs was investigated using red light and MTT assay (λ = 643 nm, 2 mW/cm2) on two tumor cell lines, MDA-MB 231 and HeLa, and HFF as a normal cell line. Symmetric 5,10,15,20-tetra(N,N-diethyl-4-aminophenyl)porphyrin (A4) showed no cytotoxic effect due to its poor solubility, while A3B showed no cytotoxic effect despite its highly efficient production of singlet oxygen, in contrast to 5,15-di[4-(N-acetamido)phenyl]-10,20-di(4-(N,N-diethylamino)phenyl)porphyrin (trans-A2B2) and 5,10-di[4-(N-acetamido)phenyl]-15,20-di(4-(N,N-diethylamino) phenyl)porphyrin (cis-A2B2)which showed cytotoxic effects but no selectivity towards tumor cells. Further modifications of the obtained porphyrin structures are required to improve their properties and to develop more effective photosensitizers
Proces učenja nogometne igre kod djece predškolske dobi
No full textDijete u ranom djetinjstvu kroz pokret istražuje svijet oko sebe, stoga je potrebno već u toj dobi razvijati morfološke, motoričke i funkcionalne sposobnosti. U ranom djetinjstvu počinje interes djeteta za sport. Među djecom predškolske dobi najpopularniji sport je nogomet, te se sve više djece uključuje u škole nogometa već s 5 godina. Cilj ovog rada bio je ponuditi program škole nogometa s djeci primjerenim sadržajima i istražiti utjecaj tog programa na motorička dostignuća djece predškolske dobi. Uzorak ispitanika činilo je 33 djece u dobi od 4 do 6 godina, (23 djece u kontrolnoj skupini i 10 djece u eksperimentalnoj skupini). Od toga je bilo 26 dječaka i 7 djevojčica. Uzorak varijabli činila su tri testa za procjenu antropometrijskih (morfoloških) karakteristika, šest testova za procjenu motoričkih sposobnosti, jedan test za procjenu funkcionalnih sposobnosti, a nogometnim poligonom procjenjivala su se motorička dostignuća djece. Rezultati su pokazali statistički značajnu razliku u 2 motoričke varijable (varijabli poligon 3 i varijabli zgib) između djece eksperimentalne i kontrolne skupine u korist djece iz eksperimentalne skupine. Ovaj rezultat djelomično potvrđuje hipotezu kako će se utvrditi statistički značajne razlike u motoričkim postignućima i antropološkim obilježjima između eksperimentalne i kontrolne skupine.In early childhood a child is exploring the world around him. Because of that, it is necessary to develop morphological, motor and functional skills during that period. Interests in sports begins in early childhood. In preschool age football is the most popular sport, and most children are choosing football at age of 5. Goal of this study was to offer an educational program for football school with an appropriate agenda, monitor and explore that program on motor abilities of preschool children. In this program participate 33 children aged 4 to 6, 23 were in the control group and 10 in the experimental group. Pattern of variables consisted of three tests to assess Anthropometric (morphological) characteristics, six tests to assess motor skills, one test to asses functional skills, and a football polygon was used to asses the motor achievements of children. The results shows statistically significant differences in 2 motorical variables (polygon 3 and joint) between the children of the experimental group and control groups in favor of the children from the experimental groups. This result partially confirms the hypothesis that it will be shown statistically significant differences in motorical skills performance and anthropological characteristic between the experimental and control groups
In vitro uspostavljanje i optimizacija kultura kortikalnih stanica izvedenih iz Monodelphis domestica
No full textNeurodegenerative diseases and central nervous system (CNS) injuries pose significant challenges due to the limited regenerative capacity of CNS tissues. Understanding and optimizing culture conditions for neural and supporting cells is crucial for advancing regenerative medicine. This thesis aimed to optimize culture conditions for fibroblasts and neural stem cells (NSCs) derived from the cortex of postnatal day (P) 4 opossums. Cortical cells from P4 opossums were thawed and cultured in growth medium (GM) supplemented with fetal bovine serum (FBS) to support fibroblast proliferation. Transition to neuron culture medium (NCM) aimed to promote NSC proliferation and differentiation. Various substrates and coatings were explored to assess their impact on cell morphology and adhesion. Plastic and polymer substrates were found to promote fibroblast adhesion and spreading, with gelatin coating proving superior for fibroblast proliferation compared to PO and laminin. Notably, we successfully established a culture of P4 opossum cortical fibroblasts. Immunofluorescence analysis revealed distinct vimentin distribution patterns between fibroblasts and NSCs, with unexpected SOX2 positivity in both cell types. A subset of larger, round fibroblasts exhibited features indicative of senescence. These cells displayed distinct morphological characteristics such as increased cell and nuclear sizes, which are hallmark features of senescent cells. This thesis enhances our understanding of the optimal conditions for cultivating fibroblasts and NSCs from P4 opossum cortex, providing valuable insights into improving cell proliferation and viability. By systematically addressing substrate, coating, and medium composition, our research contributes to refining cell culture methodologies.Neurodegenerativne bolesti i ozljede središnjeg živčanog sustava (SŽS) predstavljaju značajne izazove zbog ograničenih regenerativnih kapaciteta tkiva SŽS-a. Razumijevanje i optimizacija uvjeta za kulturu neuralnih i potpornih stanica ključno je za napredak regenerativne medicine. Ova teza imala je za cilj optimizirati uvjete za kulturu fibroblasta i neuralnih matičnih stanica (NMS) dobivenih iz korteksa oposuma postnatalnog dana (P) 4. Kortikalne stanice iz P4 oposuma odmrznute su i kultivirane u mediju za rast s dodatkom fetalnog goveđeg seruma kako bi se podržala proliferacija fibroblasta. Prijelaz na medij za kulturu neurona imao je za cilj poticanje proliferacije i diferencijacije NMS-a. Istraživani su različiti supstrati i premazi kako bi se procijenio njihov utjecaj na morfologiju i adheziju stanica. Utvrđeno je da plastični i polimerni supstrati potiču adheziju i širenje fibroblasta, pri čemu se želatinski premaz pokazao superiornim za proliferaciju fibroblasta u usporedbi s PO i lamininom. Značajno je da smo uspješno uspostavili kulturu kortikalnih fibroblasta P4 oposuma. Analiza imunofluorescencije otkrila je različite obrasce distribucije vimentina između fibroblasta i NMS-a, s neočekivanom pozitivnošću SOX2 u oba tipa stanica. Podskup većih, okruglih fibroblasta pokazao je obilježja senescencije. Ove stanice su imale morfološke osobine poput povećane veličine stanica i jezgri, što su karakteristična obilježja senescentnih stanica. Ova teza poboljšava naše razumijevanje optimalnih uvjeta za uzgoj fibroblasta i NMS-a iz korteksa P4 oposuma, pružajući vrijedne uvide u poboljšanje proliferacije i održivosti stanica. Sistematskim pristupom supstratu, premazu i sastavu medija, naše istraživanje doprinosi usavršavanju metodologija za kulturu stanica
Optimizacija metode precipitacije proteina inducirane otapalom u određivanju specifičnosti erlotiniba prema njegovoj biološkoj meti EGFR
No full textIn recent years, label-free methods have become important in drug discovery for studying drug-protein interactions by observing conformational changes in target proteins after drug binding. These methods overcome the limitations of conventional techniques that rely on chemical modifications, which can affect a drugs’ specificity or affinity and lead to misidentification of targets. Identifying all protein interactions, whether the drug is designed for a specific target or discovered by phenotypic screening, is crucial for understanding both intended and off-target effects. This thesis uses solvent-induced protein precipitation (SIP) to assess erlotinibs’ specificity for its biological target, the epidermal growth factor receptor (EGFR). Additionally, it aims to identify any additional proteins, known as off-targets, that erlotinib may interact with. SIP is based on the principle that drug binding stabilizes proteins, making them more resistant to precipitation and denaturation by organic solvents. By comparing erlotinib-treated samples to untreated controls, we aimed to verify whether erlotinib specifically binds to EGFR, which would be indicated by increased stabilization compared to untreated samples. In experiments with A431 and HeLa cell lysates, Western blotting confirmed EGFR as erlotinibs’ biological target with differences in band intensity between erlotinib-treated and control samples validating its specificity. Additionally, certain experimental conditions required optimization. The initial use of DMSO and the lack of a loading control led to inconsistent results. Replacing DMSO and precipitating the lysates with acetone improved the results. Furthermore, β-actin may be sensitive to higher concentrations of organic solvents, suggesting the need for alternative controls, such as GAPDH. As this thesis focused on the Western blotting component of the SIP method, further studies should incorporate mass spectrometry to gain better insight into these interactions, and potentially confirm the off-target of erlotinib.Metode bez kemijskog označavanja molekula (engl. label-free methods) postale su važne u proučavanju interakcija između lijekova i ciljnih proteina, promatrajući konformacijske promjene koje nastaju nakon vezanja lijeka. Ove metode prevladavaju ograničenja prethodnih tehnika koje kemijskim modifikacijama mogu promijeniti specifičnost ili afinitet lijeka što može dovesti do pogrešne identifikacije njegovih meta. Identifikacija svih proteina je ključna za razumijevanje učinka nekog lijeka te njegovih potencijalnih nuspojava, bez obzira na to je li lijek dizajniran za specifičan ciljni protein ili otkriven fenotipskim skeniranjem (engl. phenotypic screening). Ovaj rad usmjeren je na korištenje metode precipitacije proteina inducirane otapalom (engl. solvent-induced protein precipitation; SIP) u određivanju specifičnosti erlotiniba prema njegovoj biološkoj meti, receptoru epidermalnog faktora rasta (engl. epidermal growth factor receptor; EGFR). Također, još jedan cilj ovog rada je identifikacija dodatnih proteina (engl. off-targets) s kojima erlotinib može biti u interakciji. SIP metoda temelji se na načelu da vezanje lijeka za ciljni protein povećava njegovu stabilnost, čineći ga otpornijim na precipitaciju i denaturaciju organskim otapalima. Uspoređujući uzorke tretirane erlotinibom s netretiranim kontrolama, htjeli smo potvrditi specifično vezanje erlotiniba za EGFR, vidljivo povećanom stabilnošću EGFR-a nakon vezanja erlotiniba. U eksperimentima sa lizatima stanica A431 i HeLa, Western blotting tehnika potvrdila je EGFR kao biološku metu erlotiniba. Razlike u intenzitetu linija između uzoraka tretiranih erlotinibom i netretiranih kontrola su potvrdile njegovu specifičnost. U radu je bilo potrebno i optimizirati eksperimentalne uvjete. Početna upotreba DMSO-a i nedostatak kontrole doveli su do nepouzdanih rezultata. Zamjena DMSO-a i precipitacija lizata acetonom poboljšala je pouzdanost rezultata. Također, β-aktin se pokazao osjetljivim na visoke koncentracije organskih otapala, što sugerira potrebu za alternativnim kontrolama, poput GAPDH. Budući da je rad fokusiran na Western blot dio SIP metode, buduća istraživanja trebala bi uključivati masenu spektrometriju kako bi se dobio širi uvid u interakcije između erlotiniba i EGFR-a i identifikaciju potencijalnog off-target proteina