Repository of the University of Rijeka, Department of Biotechnology
Not a member yet
715 research outputs found
Sort by
In vitro regeneracija primarnih staničnih kultura korteksa postnatalnih oposuma Monodelphis domestica
No full textMammalian central nervous system (CNS) begins to develop in early embryonal period. CNS has then the ability to regenerate itself, while soon after birth, regeneration stops. Opossum Monodelphis domestica is a unique model for investigating CNS regeneration because it is born at a very immature stage of CNS development. Opossum has a unique possibility to successfully regenerate spinal cord after injury in the first two weeks of their postnatal development. Regenerative capacity abruptly declines after that period and is completely lost in mature organism. Two significantly different ages of opossum at postnatal days (P)3-5 and P16-18 have different cell environment and gene profile which determine the capability of spinal cord regeneration after injury. Apart from spinal cord, opossum cortex and capability of its regeneration remain unexplored. Aim of this thesis is to establish and characterize primary cell cultures of opossum cortex, in order to explore the CNS cell composition, maturation and regeneration at a molecular basis in vitro. Immunofluorescence was used to characterize the cell composition and expression of markers linked to CNS maturation and regeneration. Scratch assay was used to study the response of cells and of their environment to injury. Calcium imaging method was used to study the maturation of cells and cell networks formed in cultures, as well as activity recovery after injury. Primary cortical cell cultures of neonatal opossum can be maintained up to a month in vitro. P3-5 cultures consist of 93% of neurons and almost 50% of cells positive for progenitor marker SOX2, while P16-18 cultures consist of 80% of neurons and 30% of SOX2+ cells. An interesting discovery is the co-expression of neuronal marker with SOX2, which was not investigated in opossum before. In vitro cortical cell culture temporal maturation correlates with the maturation of opossum cortex in vivo. Spontaneous activity of neurons and neuronal networks is observed in 7th day in vitro (DIV7) of both age groups (P3-5 and P16-18). After the injury, neurons regenerate axons which after 48 hours connect the opposite sides of the injury. A reduction in injury width, as well as glial-scar-like formation is visible in DIV10 cultures of both ages. By calcium activity, it has been shown that 48 hours after the injury, neuronal networks of the opposite sides of the injury are reconstituted and synchronized. These results contribute to understanding of opossum cortex maturation, as well as cell microenvironment on the cortex regeneration upon injury. Integration of results may contribute to better understanding of cell adaptation on pathophysiological conditions of mammalian cortex.Središnji živčani sustav (SŽS) sisavaca počinje s razvojem u ranom embrionalnom periodu. Tada SŽS posjeduje sposobnost regeneracije, dok se ubrzo nakon rođenja sposobnost regeneracije gubi. Oposum Monodelphis domestica jedinstven je model za istraživanje regeneracije SŽS-a jer se rađa u vrlo nezrelom stadiju razvoja SŽS-a. Oposum posjeduje sposobnost regeneracije leđne moždine nakon ozljede tijekom prva dva tjedna postnatalnog razvoja. Sposobnost regeneracije naglo pada nakon tog perioda te se u potpunosti gubi u zrelom organizmu. Dvije značajno različite dobi oposuma, postnatalni dan (P)3-5 i P16-18 sadrže različiti stanični okoliš i genski profil koji uvjetuju sposobnost regeneracije leđne moždine nakon ozljede. Za razliku od leđne moždine, korteks mozga i sposobnost njegove regeneracije u oposumu ostaju neistraženi. Cilj ovog rada je uspostava i karakterizacija primarnih staničnih kultura korteksa oposuma, kako bi se omogućilo istraživanje staničnog sastava, maturacije i regeneracije SŽS-a na molekularnoj bazi in vitro. Metodom imunofluorescencije, karakterizirao se stanični sastav i ekspresija markera povezanih s razvojem SŽS-a i regeneracijom. Izazivanjem ozlijede in vitro, istražio se odgovor stanica i staničnog okoliša na ozljedu. Funkcionalnim ispitivanjem oslikavanja kalcija, proučila se zrelost stanica i staničnih mreža formiranih u staničnim kulturama, kao i ponovno uspostavljene aktivnosti nakon ozlijede. Primarne stanične kulture korteksa neonatalnog oposuma mogu se održavati do mjesec dana u in vitro uvjetima. Stanične kulture P3-5 oposuma sadrže 93% neurona i gotovo 50% stanica pozitivnih na marker progenitora (SOX2), dok stanične kulture P16-18 oposuma sadrže 80% neurona i 30% SOX2+ stanica. Zanimljivo otkriće predstavlja koekspresija markera neurona i progenitora (SOX2), koja nije do sada istražena u oposumima. In vitro maturacija staničnih kultura korteksa vremenski korelira sa maturacijom korteksa oposuma in vivo. Spontana aktivnost neurona i mreža neurona uočena je već u 7. danu u kulturi (DIV7) za obje dobi (P3-5 i P16-18). Nakon ozljede, neuroni regeneriraju aksone koji već 48 sati nakon ozljede povezuju suprotne strane ozljede. Smanjenje promjera ozljede, kao i formiranje staničnih struktura sličnim glijalnom ožiljku je uočeno već u DIV10 kulturama obiju dobi. Oslikavanjem aktivnosti kalcija, potvrđeno je da su 48 sati nakon ozljede neuronalne mreže između suprotnih strana ozljede ponovno uspostavljene i sinkronizirane. Ovi rezultati doprinose razumijevanju maturacije korteksa oposuma, kao i utjecaju staničnog mikorookoliša na regeneraciju korteksa nakon ozljede. Integracija dobivenih rezultata mogla bi doprinijeti boljem razumijevanju prilagodbe stanica na patofiziološka stanja u korteksu sisavaca
Porphyrins in photodynamic inactivation of Legionella in wastewater
No full textBakterija Legionella pneumophila često se nalazi u okolišu, u prirodnim i umjetno stvorenim vodenim sustavima, a može se pronaći i u komunalnim i otpadnim vodama. Ova bakterija, koja može uzrokovati ozbiljne komplikacije, poput po život opasne pneumonije, predstavlja fakultativni unutarstanični patogen. L. pneumophila ima sposobnost stvaranja biofilma, što joj omogućava otpornost na različita sredstva i metode dezinfekcije. Iz tog razloga potrebne su alternativne metode eliminacije ovog patogena, kao i dezinfekcije voda, njenih čestih staništa. Ovo istraživanje proučavalo je fotofizikalna svojstva i primjenu porfirinskih spojeva, TMPyP3 i Zn(II)-TMPyP3, kao fotosenzibilizatora. Strukturalna razlika Zn(II)-TMPyP3 u usporedbi s TMPyP3 potvrđena je UV-Vis spektrofotometrijom i ukazuje na različite fotofizikalne karakteristike ova dva spoja. Zn(II)-TMPyP3 je odabran kao fotosenzibilizator zbog prethodnih istraživanja provedenih na metaloporfirinskim kompleksima i utvrđenih antimikrobnih svojstava cinkovih kompleksa. Stabilnost ovih spojeva u otpadnoj vodi implicira izazove uzrokovane zamućenošću i prisutnošću tvari, sugerirajući potrebu za dodatnim istraživanjima. Rezultati mjerenja generiranja singletnog kisika pokazuju prednost TMPyP3 nad Zn(II)-TMPyP3, s većom učinkovitošću TMPyP3 pri nižim koncentracijama. TMPyP3 pokazuje poboljšanu fotodinamičku učinkovitost pri dužem izlaganju svjetlosti, što ga čini povoljnim za različite terapije. Ispitivanja antiadhezijskih svojstava potvrđuju veću djelotvornost TMPyP3, posebno u vodi iz slavine, naglašavajući njegov potencijal za prevenciju bakterijske adhezije. Sveukupno, ovo istraživanje potvrđuje veću djelotvornost TMPyP3 nad Zn(II)-TMPyP3 kao fotosenzibilizatora u ispitanim uvjetima, ističući važnost optimizacije uvjeta osvjetljavanja i potrebu za daljnjim istraživanjima u širem spektru valnih duljina radi poboljšanja učinkovitosti fotodinamičke terapije i njene primjene u stvarnim uvjetima, poput upotrebe u pročišćavanju otpadnih voda, odnosno njene dezinfekcije.The bacterium Legionella pneumophila is often found in the environment, in natural and man-made water systems, and can also be found in municipal and wastewater. This bacterium, which can cause serious complications such as life-threatening pneumonia, is a facultative intracellular pathogen. L. pneumophila has the ability to form biofilms, which enables it to resist various disinfection agents and methods. Therefore, alternative methods for eliminating this pathogen, as well as for disinfecting water, its frequent habitat, are needed. This study examined the photophysical properties and application of porphyrin compounds, TMPyP3 and Zn(II)-TMPyP3, as photosensitizers. Structural change in Zn(II)-TMPyP3 compared to TMPyP3 was confirmed by UV-Vis spectrophotometry and indicated different photophysical characteristics. Zn(II)-TMPyP3 was chosen as photosensitizer due to previous research conducted on metalloporphyrin complexes, which identified antimicrobial properties of zinc(II) complexes. The stability of these compounds in wastewater implies challenges caused by turbidity and the presence of substances, suggesting the need for further research. Results of singlet oxygen generation studies show the advantage of TMPyP3 over Zn(II)-TMPyP3, with TMPyP3 being more efficient at lower concentrations. TMPyP3 shows improved efficiency with prolonged light exposure, making it favorable for various therapies. Tests on anti-adhesion properties confirm the greater effectiveness of TMPyP3, especially in tap water, highlighting its potential for preventing bacterial adhesion. Overall, this research confirms the higher efficency of TMPyP3 over Zn(II)-TMPyP3 as a photosensitizer in tested conditions, emphasizing the importance of optimizing irradiation conditions and the need for further research across a broader spectrum of wavelengths and other photosensitizers to improve the effectiveness of photodynamic therapy and its application in real-world conditions, such as wastewater purification and disinfection
Stanična parabioza
No full textSince the human lifespan has been extended in the past decades, age-related diseases have become a significant societal problem. Thus, life science research is increasingly attempting to develop approaches to delay or attenuate aging and age-related diseases. These attempts target mostly cell-autonomous factors. However, it has been shown that during aging cell populations become increasingly heterogenous, with some cells still young and functional and others damaged or dying. This has raised an interest in the role of non-cell-autonomous factors in aging, i.e. how cells with different phenotypes affect each other.
In this study I tested the hypothesis of cellular parabiosis, which states that the cellular damage may be phenotypically supressed by intercellular communication with the surrounding healthy cells. Cellular damage was induced in the immortalized hamster lung fibroblasts by staurosporine - an inducer of apoptosis. Sublethal dose of staurosporine that allows recovery of the cells after removal of the treatment was determined using a cell viability assay. Mammalian cells were then treated with such dose of staurosporine, and grown either in the monoculture or in the co-culture with healthy cells. Comparison of the numbers of surviving cells between the two conditions was performed by flow cytometry. The results showed that the recovery of the damaged cells was significantly higher in co-culture with the healthy cells compared to the monoculture conditions. Next, I tested the involvement of the tunneling nanotube-mediated intercellular communication in this recovery. The same experiment was performed in the presence or absence of the actin polymerization inhibitor latrunculin B, which also inhibits the formation of the tunneling nanotubes. The efficiency and lack of toxicity of latrunculin B was confirmed by imaging the actin cytoskeleton using fluorescent microscopy and by the cell viability assay, respectively. Comparing the results obtained in the presence or absence of latrunculin B showed that latrunculin B partially inhibited the recovery of the damaged cells in co-culture, suggesting the involvement of the tunneling nanotubes in the process. These results support the initial hypothesis of cellular parabiosis, as well as the importance of non-cell-autonomous factors in damaged phenotype supression.Budući da se ljudski vijek produžio u proteklim desetljećima, bolesti povezane sa starenjem postale su značajan društveni problem. Stoga istraživanje znanosti o životu sve više pokušava razviti pristupe za odgodu ili ublažavanje starenja i bolesti povezanih sa starenjem. Ti pokušaji uglavnom ciljaju čimbenike autonomnih staničnih procesa. Međutim, pokazalo se da tijekom starenja populacije stanica postaju sve heterogenije, pri čemu su neke stanice još uvijek mlade i funkcionalne, a druge su oštećene ili umiru. To je potaknulo interes za ulogu čimbenika neautonomnih staničnih procesa u starenju, tj. kako stanice s različitim fenotipovima utječu jedna na drugu.
U ovoj sam studiji testirala hipotezu stanične parabioze, koja predlaže da stanično oštećenje može biti fenotipski potisnuto međustaničnom komunikacijom s okolnim zdravim stanicama. Stanično oštećenje inducirano je u imortaliziranim fibroblastima pluća hrčka koristeći staurosporin - induktor apoptoze. Subletalna doza staurosporina koja omogućuje oporavak stanica nakon uklanjanja tretmana određena je ispitivanjem stanične viabilnosti. Stanice sisavaca zatim su tretirane takvom dozom staurosporina i uzgojene ili u monokulturi ili u kokulturi sa zdravim stanicama. Usporedba broja preživjelih stanica između dva stanja provedena je protočnom citometrijom. Rezultati su pokazali da je oporavak oštećenih stanica bio znatno veći u kokulturi sa zdravim stanicama u usporedbi s uvjetima monokulture. Zatim sam testirala uključenost međustanične komunikacije posredovane tunelirajućim nanocijevčicama u ovom oporavku. Isti je eksperiment izveden u prisutnosti ili odsutnosti inhibitora polimerizacije aktina latrunkulina B, koji također inhibira stvaranje tunelirajućih nanocijevčica. Učinkovitost i nedostatak toksičnosti latrunkulina B potvrđeni su vizualiziranjem aktinskog citoskeleta pomoću fluorescentne mikroskopije, odnosno ispitivanjem stanične viabilnosti. Usporedba rezultata dobivenih u prisutnosti ili odsutnosti latrunkulina B pokazala je da latrunkulin B djelomično inhibira oporavak oštećenih stanica u kokulturi, što ukazuje na uključenost tunelirajućih nanocjevčica u ovom procesu. Ovi rezultati podupiru početnu hipotezu stanične parabioze, kao i važnost čimbenika neautonomnih staničnih procesa u supresiji oštećenog fenotipa
Synthesis, cyclization and characterization of catalytic peptide CG11
No full textKatalitički peptidi su kratke sekvence aminokiselina koje mogu katalizirati
specifičnu kemijsku reakciju. Katalitički peptidi često su inspirirani aktivnim
mjestima enzima. Katalitička aktivnost enzima proizlazi iz specifičnog
rasporeda aminokiselinskih ostataka unutar njihove trodimenzionalne
strukture, što im omogućuje interakciju sa supstratima na precizan i
selektivan način. Katalitički peptidi mogu se koristiti kao katalizatori za
organske ili anorganske reakcije i za asimetrične transformacije/kiralne
katalitičke reakcije. Kratki katalitički peptidi karakterizirani su
konformacijskom fleksibilnošću i mogu se lako prilagoditi i funkcionalizirati
na različite načine. Njihova struktura koja se sastoji od monomera
aminokiselina dopušta nebrojene mogućnosti u dizajnu katalitičkih peptida.
Ipak, odnos između sekvence aminokiselina peptida i njegove katalitičke
aktivnosti nije u potpunosti shvaćen. Unatoč svom velikom potencijalu,
postoji nekoliko izazova, poput njihove niske stabilnosti i niske
selektivnosti.
Ovaj rad bavi se razotkrivanjem odnosa strukture i aktivnosti kratkog
katalitičkog peptida, CG11, i modifikacijom njegove strukture sa svrhom
poboljšanja katalitičke učinkovitosti. Ciklizacija linearnog CG11 peptida služi
kao jednostavna, ali potentna modifikacija koja nudi poboljšanu rigidnost i
stabilnost. Uz stalna istraživanja i razvoj novih peptida koji se mogu podesiti
za određene funkcije, katalitički peptidi mogu se koristiti kao visoko
učinkoviti biokatalizatori u kemijskoj i biotehnološkoj industriji.Catalytic peptides are short sequences of amino acids capable of catalyzing
a specific chemical reaction. Catalytic peptides are often inspired by enzyme
active sites. Enzyme catalytic activity arises from the specific arrangement
of amino acid residues within its three-dimensional structure, which allows
it to interact with substrates in a precise and selective manner. Catalytic
peptides can be utilized as catalysts in organic and inorganic reactions and
for asymmetric transformations/chiral catalytic reactions. Short catalytic
peptides are characterized by conformational flexibility and can be easily
tuned and functionalized numerous ways. Their structure consisting of
monomers of amino acids allows countless possibilities in the design of
catalytic peptides. Still, the relationship between the amino acid sequence
of a peptide and its catalytic activity is not entirely understood. Despite their
great potential, they face several challenges, such as low stability and low
selectivity.
This thesis deals with unraveling the structure–activity relationship of a
short catalytic peptide, CG11, and the modification of its structure with the
goal to achieve better catalytic efficiency. Cyclization of the linear CG11
peptide serves as a straightforward but powerful modification that offers
improved rigidity and stability. With continuing research and development
of novel peptides that can be finely tuned for specific functions, catalytic
peptides can be employed as highly efficient biocatalysts in chemical and
biotechnological industry
Optimizacija metode precipitacije proteina inducirane otapalom u određivanju specifičnosti erlotiniba prema njegovoj biološkoj meti EGFR
No full textIn recent years, label-free methods have become important in drug discovery for studying drug-protein interactions by observing conformational changes in target proteins after drug binding. These methods overcome the limitations of conventional techniques that rely on chemical modifications, which can affect a drugs’ specificity or affinity and lead to misidentification of targets. Identifying all protein interactions, whether the drug is designed for a specific target or discovered by phenotypic screening, is crucial for understanding both intended and off-target effects. This thesis uses solvent-induced protein precipitation (SIP) to assess erlotinibs’ specificity for its biological target, the epidermal growth factor receptor (EGFR). Additionally, it aims to identify any additional proteins, known as off-targets, that erlotinib may interact with. SIP is based on the principle that drug binding stabilizes proteins, making them more resistant to precipitation and denaturation by organic solvents. By comparing erlotinib-treated samples to untreated controls, we aimed to verify whether erlotinib specifically binds to EGFR, which would be indicated by increased stabilization compared to untreated samples. In experiments with A431 and HeLa cell lysates, Western blotting confirmed EGFR as erlotinibs’ biological target with differences in band intensity between erlotinib-treated and control samples validating its specificity. Additionally, certain experimental conditions required optimization. The initial use of DMSO and the lack of a loading control led to inconsistent results. Replacing DMSO and precipitating the lysates with acetone improved the results. Furthermore, β-actin may be sensitive to higher concentrations of organic solvents, suggesting the need for alternative controls, such as GAPDH. As this thesis focused on the Western blotting component of the SIP method, further studies should incorporate mass spectrometry to gain better insight into these interactions, and potentially confirm the off-target of erlotinib.Metode bez kemijskog označavanja molekula (engl. label-free methods) postale su važne u proučavanju interakcija između lijekova i ciljnih proteina, promatrajući konformacijske promjene koje nastaju nakon vezanja lijeka. Ove metode prevladavaju ograničenja prethodnih tehnika koje kemijskim modifikacijama mogu promijeniti specifičnost ili afinitet lijeka što može dovesti do pogrešne identifikacije njegovih meta. Identifikacija svih proteina je ključna za razumijevanje učinka nekog lijeka te njegovih potencijalnih nuspojava, bez obzira na to je li lijek dizajniran za specifičan ciljni protein ili otkriven fenotipskim skeniranjem (engl. phenotypic screening). Ovaj rad usmjeren je na korištenje metode precipitacije proteina inducirane otapalom (engl. solvent-induced protein precipitation; SIP) u određivanju specifičnosti erlotiniba prema njegovoj biološkoj meti, receptoru epidermalnog faktora rasta (engl. epidermal growth factor receptor; EGFR). Također, još jedan cilj ovog rada je identifikacija dodatnih proteina (engl. off-targets) s kojima erlotinib može biti u interakciji. SIP metoda temelji se na načelu da vezanje lijeka za ciljni protein povećava njegovu stabilnost, čineći ga otpornijim na precipitaciju i denaturaciju organskim otapalima. Uspoređujući uzorke tretirane erlotinibom s netretiranim kontrolama, htjeli smo potvrditi specifično vezanje erlotiniba za EGFR, vidljivo povećanom stabilnošću EGFR-a nakon vezanja erlotiniba. U eksperimentima sa lizatima stanica A431 i HeLa, Western blotting tehnika potvrdila je EGFR kao biološku metu erlotiniba. Razlike u intenzitetu linija između uzoraka tretiranih erlotinibom i netretiranih kontrola su potvrdile njegovu specifičnost. U radu je bilo potrebno i optimizirati eksperimentalne uvjete. Početna upotreba DMSO-a i nedostatak kontrole doveli su do nepouzdanih rezultata. Zamjena DMSO-a i precipitacija lizata acetonom poboljšala je pouzdanost rezultata. Također, β-aktin se pokazao osjetljivim na visoke koncentracije organskih otapala, što sugerira potrebu za alternativnim kontrolama, poput GAPDH. Budući da je rad fokusiran na Western blot dio SIP metode, buduća istraživanja trebala bi uključivati masenu spektrometriju kako bi se dobio širi uvid u interakcije između erlotiniba i EGFR-a i identifikaciju potencijalnog off-target proteina
Azabicikloheptan-tiourea derivati s jakim citotoksičnim učinkom na stanične linije nemalih stanica raka pluća
No full textCancer remains a leading cause of death worldwide, with lung cancer being the most prevalent and deadly. Key challenges in cancer therapy include molecular heterogeneity and drug resistance. Phenotypic drug discovery (PDD) approach was used to identify a subset of compounds from a small library of azabicycloheptane-thiourea derivatives, which exhibit significant antiproliferative effects in non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines.
The primary objective of this study was to elucidate the mode of action of selected compounds, with a focus on identifying the type of cell death they induce. To accomplish this, live-cell imaging and experiments assessing potential mitochondrial, cytoskeletal, and DNA damage were conducted. Live-cell imaging revealed the presence of vacuoles emerging shortly before cell death, suggesting a link between vacuole formation and the compounds' cytotoxic effects. These vacuoles were found to be non-acidic and ruled out as autophagosomes. No mitochondrial or cytoskeletal damage was observed, while DNA damage was only detected after prolonged exposure.
The findings suggest that these compounds induce a methuosis-like type of cell death in the SW1573 cell line. Methuosis is a non-apoptotic cell death pathway characterized by extreme vacuolization derived from macropinosomes. This research highlights the potential of non-apoptotic cell death pathways, like methuosis, as a novel approach to overcome drug resistance in cancer therapy.Rak ostaje vodeći uzrok smrti u svijetu, pri čemu je rak pluća najčešći i najsmrtonosniji. Ključni izazovi u terapiji raka uključuju molekularnu heterogenost i otpornost na lijekove. Fenotipski pristup otkrivanju lijekova (PDD) korišten je za identifikaciju podskupa spojeva iz male biblioteke derivata azabicikloheptan-tiouree, koji pokazuju značajne antiproliferativne učinke na stanične linije nemalih stanica raka pluća (NSCLC).
Primarni cilj ovog istraživanja bio je rasvijetliti mehanizam djelovanja odabranih spojeva, s posebnim naglaskom na identifikaciju vrste stanične smrti koju induciraju. Kako bi se to postiglo, provedeno je snimanje živih stanica te eksperimenti za procjenu potencijalnog oštećenja mitohondrija, citoskeleta i DNK. Snimanje živih stanica otkrilo je prisutnost vakuola koje se pojavljuju neposredno prije stanične smrti, što sugerira vezu između stvaranja vakuola i citotoksičnih učinaka spojeva. Ove vakuole su identificirane kao ne-kisele te su isključene kao autofagosomi. Oštećenje mitohondrija ili citoskeleta nije zabilježeno, dok je oštećenje DNK otkriveno tek nakon dugotrajne izloženosti.
Rezultati sugeriraju da ovi spojevi induciraju metuozi-sličnu vrstu stanične smrti u staničnoj liniji SW1573. Metuoza je ne-apoptotski put stanične smrti karakteriziran ekstremnom vakuolizacijom koja potječe iz makropinosoma. Ovo istraživanje naglašava potencijal ne-apoptotskih puteva stanične smrti, poput metuoze, kao novog pristupa za prevladavanje otpornosti na lijekove u terapiji raka
In vitro uspostavljanje i optimizacija kultura kortikalnih stanica izvedenih iz Monodelphis domestica
No full textNeurodegenerative diseases and central nervous system (CNS) injuries pose significant challenges due to the limited regenerative capacity of CNS tissues. Understanding and optimizing culture conditions for neural and supporting cells is crucial for advancing regenerative medicine. This thesis aimed to optimize culture conditions for fibroblasts and neural stem cells (NSCs) derived from the cortex of postnatal day (P) 4 opossums. Cortical cells from P4 opossums were thawed and cultured in growth medium (GM) supplemented with fetal bovine serum (FBS) to support fibroblast proliferation. Transition to neuron culture medium (NCM) aimed to promote NSC proliferation and differentiation. Various substrates and coatings were explored to assess their impact on cell morphology and adhesion. Plastic and polymer substrates were found to promote fibroblast adhesion and spreading, with gelatin coating proving superior for fibroblast proliferation compared to PO and laminin. Notably, we successfully established a culture of P4 opossum cortical fibroblasts. Immunofluorescence analysis revealed distinct vimentin distribution patterns between fibroblasts and NSCs, with unexpected SOX2 positivity in both cell types. A subset of larger, round fibroblasts exhibited features indicative of senescence. These cells displayed distinct morphological characteristics such as increased cell and nuclear sizes, which are hallmark features of senescent cells. This thesis enhances our understanding of the optimal conditions for cultivating fibroblasts and NSCs from P4 opossum cortex, providing valuable insights into improving cell proliferation and viability. By systematically addressing substrate, coating, and medium composition, our research contributes to refining cell culture methodologies.Neurodegenerativne bolesti i ozljede središnjeg živčanog sustava (SŽS) predstavljaju značajne izazove zbog ograničenih regenerativnih kapaciteta tkiva SŽS-a. Razumijevanje i optimizacija uvjeta za kulturu neuralnih i potpornih stanica ključno je za napredak regenerativne medicine. Ova teza imala je za cilj optimizirati uvjete za kulturu fibroblasta i neuralnih matičnih stanica (NMS) dobivenih iz korteksa oposuma postnatalnog dana (P) 4. Kortikalne stanice iz P4 oposuma odmrznute su i kultivirane u mediju za rast s dodatkom fetalnog goveđeg seruma kako bi se podržala proliferacija fibroblasta. Prijelaz na medij za kulturu neurona imao je za cilj poticanje proliferacije i diferencijacije NMS-a. Istraživani su različiti supstrati i premazi kako bi se procijenio njihov utjecaj na morfologiju i adheziju stanica. Utvrđeno je da plastični i polimerni supstrati potiču adheziju i širenje fibroblasta, pri čemu se želatinski premaz pokazao superiornim za proliferaciju fibroblasta u usporedbi s PO i lamininom. Značajno je da smo uspješno uspostavili kulturu kortikalnih fibroblasta P4 oposuma. Analiza imunofluorescencije otkrila je različite obrasce distribucije vimentina između fibroblasta i NMS-a, s neočekivanom pozitivnošću SOX2 u oba tipa stanica. Podskup većih, okruglih fibroblasta pokazao je obilježja senescencije. Ove stanice su imale morfološke osobine poput povećane veličine stanica i jezgri, što su karakteristična obilježja senescentnih stanica. Ova teza poboljšava naše razumijevanje optimalnih uvjeta za uzgoj fibroblasta i NMS-a iz korteksa P4 oposuma, pružajući vrijedne uvide u poboljšanje proliferacije i održivosti stanica. Sistematskim pristupom supstratu, premazu i sastavu medija, naše istraživanje doprinosi usavršavanju metodologija za kulturu stanica
The latest achievements in cellular immunotherapy
No full textZbog toga što rak predstavlja jedan od vodećih uzroka smrti u svijetu, intenzivno se radi na otkriću novih vrsta terapije. Upravo imunoterapija predstavlja nov i moderan pristup u liječenju raka, zaraznih bolesti i autoimunih bolesti. Obećavajuće rezultate pokazuje osobito u liječenju malignih formacija. Za razliku od tradicionalni terapija (kemoterapija i radioterapija), ona direktnim djelovanjem na imunosni sustav postiže efikasnu reakciju i odgovor na tumore, što je čini sigurnijom i manje štetnom za pacijente. Dijeli se na nekoliko značajnih područja, staničnu imunoterapiju, imunoterapiju antitijelima, checkpoint inhibitore, citokinsku terapiju, imunomodulatore i cjepiva. Zbog svojih iznimnih rezultata u kliničkim ispitivanjima pa i činjenice da je već nekoliko terapija odobreno od strane FDA, odlučio sam više pažnje posvetiti upravo staničnoj imunoterapiji, a posebice CAR-T stanicama. Stanična imunoterapija doživjela je veliki procvat te čini temelj za budućnost liječenja raka. Ona se bazira na poboljšanju funkcija imunosnih stanica njihovom modifikacijom, multiplikacijom i aktivacijom, a dijeli se prema vrsti stanice čije se funkcija poboljšava. Razlikujemo adoptivnu T staničnu (TILs, CAR-T, TCR-T), NK staničnu, CIK staničnu imunoterapiju i DC cjepiva. Najznačajnija vrsta terapije, upravo je adoptivna T stanična imunoterapija. Pokazuje iznimno dobre rezultate u liječenju raka, a zbog intenzivnog i predanog istraživanja u ovom području rada, već je odobren niz terapija ove vrste.Because cancer is one of the leading causes of death worldwide, intensive efforts are being made to discover new types of therapy. Immunotherapy represents a new and modern approach in the treatment of cancer, infectious diseases, and autoimmune diseases. It shows promising results especially in the treatment of malignant formations. Unlike traditional therapies (chemotherapy and radiotherapy), it achieves an effective reaction and response to tumors by directly acting on the immune system, making it safer and less harmful to patients. It is divided into several significant areas: cellular immunotherapy, antibody immunotherapy, checkpoint inhibitors, cytokine therapy, immunomodulators, and vaccines. Due to its remarkable results in clinical trials and the fact that several therapies have already been approved by the FDA, I have decided to focus more on cellular immunotherapy, especially on CAR-T cells. Cellular immunotherapy has experienced a significant breakthrough and forms the foundation for the future cancer treatments. It is based on enhancing the functions of immune cells through their modification, multiplication, and activation, and it is categorized based on the type of cell whose function is being improved. We distinguish between adoptive T cell (TILs, CAR-T, TCR-T), NK cell, CIK cell immunotherapy, and DC vaccines. The most significant type of therapy is adoptive T cell immunotherapy. It shows exceptionally good results in cancer treatment, and due to intensive and dedicated work, a series of therapies of this kind have already been approved
Neuropharmacology and pharmacotherapy of neurodegenerative disorders with a etiology of pathological changes in basal ganglia - Parkinson's disease
No full textParkinsonova bolest jedan je od najčešćih neurodegenerativnih poremećaja, a procjenjuje se da pogađa 1-2% ukupne svjetske populacije. Kronična je i progresivna bolest, a kao najveći rizični faktor ističe se dob. Temeljni neuropatološki nalaz PB-a je odumiranje dopaminergičkih neurona nigrostrijatalnoga puta, što dovodi do velikih pomanjkanja u opskrbi striatuma dopaminom. Takvi procesi rezultiraju nastankom prepoznatljivih motornih simptoma PB: tremora u mirovanju, rigidnosti, bradikinezije koja vodi u akineziju i nestabilnosti posture. Glavna meta farmakoloških pristupa liječenja PB je dopaminergički sustav, u cilju smanjenja intenziteta motornih simptoma direktnim utjecajem na razine dopamina u mozgu. Tijekom prvih godina bolesti, najčešći izbor terapije je levodopa, prekursor dopamina, u fiksnoj kombinaciji s karbidopom. Nakon češće incidencije komplikacija i negativnih perifernih učinaka levodope, a koji se pojavljuju s godinama korištenja, prelazi se na druge agense. Agonisti dopaminskih receptora, selektivni inhibitori monoamin-oksidaze B, inhibitori katehol-O-metiltransferaze i antagonisti muskarinskih receptora samo su neki od njih. Navedeni agensi koriste se samostalno ili u kombinaciji s levodopom i karbidopom. Poveznica svih je, međutim, da djeluju kao olakšanje motornih i nemotornih simptoma PB; nemaju nikakvog učinka na uzroke i progresiju same bolesti. Posljednjih se godina intenzivno radi na proučavanju i razvoju novih oblika terapija za PB. Genska terapija i terapija matičnim stanicama, izvrsni su primjeri novih pogleda na mogućnosti liječenja neurodegenerativnih bolesti u budućnosti. Jedan od ambicioznih ciljeva takvih novih pristupa je i usađivanje novih neurona, uzgojenih iz matičnih stanica, u područje bolešću zahvaćenog nigrostrijatalnog puta. Ovakvi su pothvati, iako iznimno važni za budućnost, još uvijek u ranim stadijima istraživanja i u široj slici neprimjenjivi. Upravo zato, farmakoterapija i individualizirani pristup pacijentu u vidu administracije terapeutika, ostaju najvažnijim stupom u životu i poboljšanju kvalitete života pacijenata s PB.Parkinson’s disease is one of the most common neurodegenerative disorders and it is estimated that it affects 1-2% of total world population. It is a chronic and a progressive disease, age being the primary risk factor. Basic neuropathologic finding in PD is the death of dopaminergic neurons in the nigrostriatal pathway, leading to great deficiencies in striatal dopamine supply. These processes result in the onset of notorious motor symptoms of PD: resting tremor, rigidity, bradykinesia leading to akinesia and postural instability. The main target of pharmacological approaches to treating PD is the dopaminergic system, with a main goal of reducing the intensity of motor symptoms, directly influencing the brain dopamine levels. The most common therapeutic choice during the first years of the disease is levodopa, a dopamine precursor, in a fixed combination with carbidopa. After the incidence of complications and negative effects of levodopa on the periphery increases, which happens with years of administration, the second line agents become a therapy of choice. Dopamine receptor agonists, selective monoamine oxidase-B inhibitors, catechol-O-methyltransferase inhibitors and muscarinic receptor antagonists are just some of many. Said agents are used as monotherapy or combined with levodopa and carbidopa. A link between all of them is, however, their effects are only observed in alleviation of motor and non-motor symptoms of PD; they have no effects on the causes and progression of the disease itself. In recent years, intense efforts are being invested into research and development of new therapeutic forms for PD. Genetic and stem-cell therapy are exquisite examples of new outlooks for future possibilities in treatment of neurodegenerative diseases. One of the ambitious goals of these novel approaches is implantation of new, stem-cell derived neurons into the affected area of the nigrostriatal pathway. This kind of ventures are, although very important for the future, still in the early stages of development and inapplicable in a broader perspective. Thus, pharmacotherapy and individualized patient approach in context of therapeutics administration, remain a most important pillar in life and improving life quality of patients with PD
Amfifilni konjugati masnih kiselina i piridilporfirina u fotodinamičkoj terapiji na staničnim linijama melanoma
No full textAmphiphilic porphyrins are widely used photosensitisers (PSs) in photodynamic therapy
(PDT), an antitumor treatment in which the PS is combined with light irradiation of
appropriate wavelength and oxygen in the vicinity within the treated lesions to induce the
cytotoxic effect and consequently tumour destruction. In addition to their beneficial
properties as antitumour agents, they are also used to treat viral, bacterial or fungal infections.
The hydrophobic parts of the molecule facilitate the passage through the membrane bilayer,
while the hydrophilic parts enable water solubility and thus the possibility of easier
administration of the PS. Although the amphiphilic porphyrins have shown great efficacy as
PSs, the hydrophilic-lipophilic balance, which utilises all the advantageous properties of this
type of PSs and avoids the disadvantages such as aggregation or low cellular uptake, is
somewhat less studied.
The main goal of this doctoral thesis was to study the hydrophilic-lipophilic balance on
different groups of asymmetric A3B pyridylporphyrins and its content is divided into four
parts. In the first part, N-methylated (pyridinium-3-yl) porphyrins and Zn(II) analogues with
alkyl chains of different lengths (7-17 C-atoms) were compared. The Zn(II)-porphyrin with
a 13 C-atom alkyl chain showed the highest cytotoxicity and selectivity towards the
melanoma cell line when irradiated with orange light. The second part involved the synthesis
of amphiphilic N-oxidised pyrid-3-ylporphyrins, where porphyrins with a 13 and 17 C-atom
chain showed to be promising against melanoma cell line, diminishing the melanin
obstruction. In the last part, amphiphilic (pyridinium-3-yl)porphyrins were chelated with
68Ga(III) and natGa(III) to obtain the PET/PDT agents, and their distribution was analysed in
PET-CT scan. It was found that the hydrophilic-lipophilic balance not only affects
cytotoxicity and selectivity in vitro, but also exhibits differential biodistribution in vivo.
These findings on A3B pyridylporphyrins will give us a deeper insight into the importance
of the amphiphilicity of the molecule and lead us to the further development of an “ideal PS”
for use in PDT.Amfifilni porfirini su široko korišteni fotosenzibilizatori (PS-ovi) u fotodinamičkoj terapiji
(PDT), antitumorskom tretmanu u kojem se PS kombinira sa svjetlošću odgovarajuće valne
duljine i kisikom u blizini liječenih lezija kako bi se izazvao citotoksični učinak i posljedično
uništenje tumora. Osim što se koriste kao antitumorski ljekovi, također je poznata njihova
upotreba protiv virusnih, bakterijskih i fungalnih infekcija. Hidrofobni dijelovi u molekuli
olakšavaju prolazak kroz membranski dvosloj, dok hidrofilni dijelovi omogućuju topljivost
u vodi, a time i mogućnost lakše administracije PS-a. Iako su amfifilni porfirini pokazali
veliku učinkovitost kao PS-ovi, ravnoteža hidrofilnih i lipofilnih dijelova, koja omogućava
sva povoljna svojstva i izbjegava nedostatke kao što su agregacija ili niska stanična
internalizacija, manje je izučavana.
Glavni cilj ovog doktorskog rada bio je proučavanje ravnoteže hidrofilnih i lipofilnih dijelova
različitih skupina asimetričnih A3B piridilporfirina, podijeljenih u četiri dijela. U prvom
dijelu uspoređeni su N-metilirani (piridin-3-ij)porfirini i njihovi Zn(II) analozi s alkilnim
lancima različitih duljina (7-17 ugljikovih atoma). Zn(II)-porfirin s alkilnim lancem od 13 Catoma pokazao je najveću citotoksičnost i selektivnost prema staničnoj liniji melanoma
nakon osvjetljavanja narančastom svjetlošću. Drugi dio uključivao je sintezu amfifilnih Noksidiranih pirid-3-ilporfirina, gdje su se porfirini s lancem od 13 i 17 C atoma pokazali
obećavajućima protiv stanične linije melanoma, smanjujući utjecaj pigmenta melanina. U
posljednjem dijelu amfifilni (piridinij-3-il)porfirini kelirani su s 68Ga(III) i natGa(III) kako bi
se dobili PET/PDT agensi, a njihova distribucija analizirana je PET-CT skeniranjem.
Utvrđeno je da ravnoteža hidrofilnih i lipofilnih dijelova ne samo da utječe na citotoksičnost
i selektivnost in vitro, već pokazuje i različitu biodistribuciju in vivo. Ovaj rad i saznanja
dobivena na temelju rezultata o A3B piridilporfirinima dat će nam dublji uvid o utjecaju
amfifilnosti molekule i dovesti nas do daljnjeg razvoja "idealnog fotosenzibilizatora" za
upotrebu u PDT-u