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Valorização dos derivados de açúcares obtidos por despolimerização catalítica da biomassa lignocelulósica
No full textCom o aumento da população mundial, o consumo de materiais e fontes de energia derivados dos combustíveis fósseis tem-se intensificado ao longo dos últimos anos. Este consumo acelerado tem gerado consequências a médio e longo prazo, que se não forem combatidas, podem causar impactos na qualidade de vida das populações atuais e futuras.
As alterações climáticas têm surgido como uma das principais consequências do consumo de recursos fósseis. A emissão de gases tóxicos para a atmosfera tornou-se cada vez mais elevada nas últimas décadas, causando degradação ambiental e gerando ainda mais poluição.
A mitigação desses efeitos através da implementação de medidas eficazes que visem incentivar o consumo de produtos de forma consciente e sustentável é de fundamental importância. Neste sentido, o uso de materiais sustentáveis e de origem renovável tem surgido como uma alternativa extraordinária ao uso dos combustíveis fósseis, promovendo a desaceleração da degradação ambiental, bem como impulsionando o desenvolvimento económico sustentável.
Considerada como um dos recursos renováveis mais abundantes na natureza, a biomassa lignocelulósica tem sido vista como uma alternativa importante para a produção de materiais sustentáveis, uma vez que possui origem de fonte renovável, podendo ser obtida a partir de resíduos florestais e agrícolas.
Neste contexto, os resíduos da madeira, nomeadamente do Eucalyptus globulus, uma das principais matérias-primas para a indústria portuguesa do papel, tem despertado enorme interesse no que diz respeito ao seu uso para produção de materiais sustentáveis e com elevado valor económico agregado. Portanto, a valorização desses resíduos constitui uma importante alternativa ao consumo dos recursos fósseis e também promove a economia circular através da minimização dos desperdícios, com o aproveitamento dos resíduos e, consequentemente, com a produção de materiais sustentáveis.
Os bio-óleos resultantes da liquefação termoquímica do serrim do Eucalyptus globulus apresentam elevados teores de açúcares, além de outros compostos. No entanto, a sua fração aquosa ainda não havia sido investigada no tocante ao seu teor de açúcares, bem como no que se refere à elucidação dos mecanismos que levam à formação desses açúcares durante o processo de liquefação termoquímica, contribuindo assim a sua investigação para a inovação nesta área.
Por forma a valorizar a biomassa lignocelulósica, nomeadamente o serrim do Eucalyptus globulus, e atendendo às necessidades atuais no que se refere ao desenvolvimento de novas investigações que visem à produção de materiais sustentáveis, desenvolveu-se na presente tese, um método recorrendo a HPLC-RID que permitiu, com sucesso, a identificação e quantificação dos açúcares contidos na fração aquosa proveniente do bio-óleo resultante da liquefação termoquímica do Eucalyptus globulus. Deste modo, identificou-se na fração aquosa os açúcares glucose, frutose, xilose, sacarose e a trealose, tendo sido sugerida a elucidação dos seus mecanismos de formação.
A partir dos açúcares identificados, podem-se obter outros materiais cujo uso como matéria-prima também se traduzem na valorização da biomassa lignocelulósica. Neste sentido, a α-angélica lactona (α-AL) pode ser obtida a partir do ácido levulínico que, por sua vez, pode ser derivado dos açúcares identificados.
Deste modo, como forma de valorizar a biomassa lignocelulósica, utilizou-se a α-AL como matéria-prima para a produção, bem-sucedida, de levulinatos de alquilo, nomeadamente o levulinato de metilo, levulinato de etilo, levulinato de propilo e levulinato de butilo, através de procedimentos sustentáveis e ambientalmente amigáveis, nomeadamente através de reações one pot, livres de solventes, com curtos tempos de reação e excelentes rendimentos.
Futuramente, esses levulinatos sintetizados podem ser utilizados como biocombustíveis e aditivos de combustíveis, como monómeros para a produção de polímeros e materiais plastificantes, como precursores na produção de resinas, bem como solventes na produção industrial de aromatizantes.
Os polímeros biodegradáveis surgiram como uma alternativa para minimizar os impactos ambientais causados pelo uso inadequado dos plásticos, cuja principal causa é a contaminação ambiental através dos seus resíduos, que são comumente descartados pelos consumidores e pelo setor industrial em locais inapropriados. No entanto, o desenvolvimento de novos métodos para a produção de polímeros biodegradáveis tem-se mostrado como um desafio acrescido, pois a síntese dos referidos polímeros requer o uso de complexas metodologias de polimerização de acordo com a natureza da matéria-prima. Neste sentido, a polimerização por abertura de anel (Ring-opening polymerization, ROP) tem sido utilizada para a produção de polímeros derivados de monómeros cíclicos de base biológica, nomeadamente as lactonas, permitindo assim, a produção de polímeros biodegradáveis.
Finalmente, visando também uma forma de valorização da biomassa lignocelulósica, realizaram-se várias tentativas de polimerização da α-AL via ROP, que tiveram como objetivo a produção de polímeros biodegradáveis e de origem sustentável. Neste sentido, foram testadas diferentes abordagens de polimerização, com a utilização de diferentes catalisadores e condições reacionais, sendo identificada a possível formação de oligómeros de baixo peso molecular. As inúmeras tentativas contribuíram para perceber o comportamento da α-AL nas condições investigadas, o que também constitui um conhecimento relevante para abrir novas vias de investigação no ramo da polimerização por abertura de anel da α-AL
Variantes no gene APOB associadas a hipobetalipoproteinemia e hipercolesterolemia familiar : estudos funcionais e relação genótipo/fenótipo
No full textTese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasAs dislipidemias são um grupo de patologias caracterizadas por alterações no perfil lipídico,
podendo incluir fenótipos de hiperlipidemia ou hipolipidemia. A apolipoproteína B (apoB), principal
componente proteico do colesterol LDL (c-LDL), desempenha um papel essencial na regulação dos
níveis de colesterol no sangue. Variantes no gene APOB estão associadas a condições distintas como a
hipercolesterolemia familiar (FH) e a hipobetalipoproteinemia familiar (FHBL).
A FH caracteriza-se por níveis elevados de c-LDL, que podem levar ao desenvolvimento de
aterosclerose e doença coronária prematura. Por outro lado, a FHBL apresenta níveis reduzidos de cLDL e está associada a complicações hepáticas, nutricionais e neurológicas. A compreensão dos efeitos
das variantes no gene APOB é fundamental, sendo os estudos funcionais uma ferramenta indispensável,
especialmente com o avanço da sequenciação de nova geração (NGS), que permite a análise completa
do gene.
O presente trabalho visou realizar estudos funcionais de variantes no gene APOB associadas a
estas duas patologias, com o objetivo de aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos moleculares
subjacentes. A análise de variantes descritas na base de dados ClinVar revelou um elevado número
associado tanto à FH como à FHBL, com muitas classificadas como variantes de significado clínico
incerto (VUS).
Foram realizados ensaios funcionais utilizando citometria de fluxo a partir de LDL de
indivíduos com variantes no gene APOB associadas à hipercolesterolemia. Os resultados não
identificaram nenhuma das variantes analisadas como causadora do fenótipo observado nos indivíduos.
Consequentemente, não foi possível alterar a classificação destas variantes, que permanecem de
significado incerto. Adicionalmente, foram analisados casos de FHBL e discutidas possíveis abordagens
para estudos funcionais futuros. Este trabalho reforça a relevância de estudos funcionais para esclarecer
o papel das variantes no gene APOB nas dislipidemias, contribuindo para um melhor diagnóstico e
caracterização destas condições.Dyslipidemias are a group of pathologies characterized by alterations in the lipid profile, which
may include phenotypes of hyperlipidemia or hypolipidemia. Apolipoprotein B (apoB), the main protein
component of LDL cholesterol (LDL-c), plays a crucial role in regulating blood cholesterol levels.
Genetic variants in the APOB gene are associated with distinct conditions such as familial
hypercholesterolemia (FH) and familial hypobetalipoproteinemia (FHBL).
FH is characterized by elevated LDL-c levels, which can lead to the development of
atherosclerosis and premature coronary artery disease. On the other hand, FHBL presents itself with
reduced LDL-c levels and is associated with hepatic, nutritional, and neurological complications.
Understanding the effects of variants in the APOB gene is essential, and functional studies are an
indispensable tool, especially with the growing use of next generation sequencing (NGS), which allows
the analysis of the full gene sequence.
The present work aimed to conduct functional analysis of variants in the APOB gene associated
with these two conditions, with the goal of deepening the knowledge of the underlying molecular
mechanisms. Analysis of variants described in the ClinVar database revealed a high number of variants
associated with both FH and FHBL, many of which were classified as variants of uncertain significance
(VUS).
Functional assays were performed using flow cytometry on LDL from individuals with APOB
variants associated with hypercholesterolemia. The results did not identify any of the analysed variants
as causative of the observed phenotype in these individuals. Consequently, it was not possible to change
the previous classification of these variants, which remains as VUS. Additionally, cases of FHBL were
analysed, and potential approaches for future functional studies were discussed. This work reinforces
the importance of functional studies to clarify the role of APOB gene variants in dyslipidemias,
contributing to a better diagnosis and characterization of these conditions
Evaluating insulin-degrading enzyme role in the onset and development of Parkinson’s disease
No full textTese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA Doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa que afeta milhões de pessoas em
todo o mundo, caracterizando-se pela perda progressiva de neurónios dopaminérgicos na
substantia nigra pars compacta, o que resulta no desenvolvimento de sintomas motores como
tremor, bradicinesia, rigidez e instabilidade postural. Além disso, os pacientes com DP apresentam
uma série de sintomas não motores, incluindo alterações cognitivas, distúrbios do humor,
disfunção autonómica e distúrbios do sono, que afetam significativamente a qualidade de vida. A
patogénese da DP está fortemente associada à desregulação e agregação da α-sinucleína (αSin),
uma proteína que se acumula nos neurónios, formando agregados tóxicos conhecidos como
corpos de Lewy. Estes corpos de Lewy são uma das marcas patológicas da DP e estão diretamente
implicados na disfunção neuronal.
Nos últimos anos, tem-se observado uma associação crescente entre a diabetes mellitus tipo 2
(DMT2) e a DP. A DMT2, caracterizada por resistência à insulina, hiperglicemia crónica e
disfunção metabólica, é um fator de risco reconhecido para várias doenças neurodegenerativas.
Estudos sugerem que a resistência à insulina pode afetar negativamente a função neuronal e
contribuir para a neurodegeneração observada na DP. Em particular, o enzima degradador de
insulina (EDI) tem sido identificado como um possível elo entre a DMT2 e a DP, dada a sua
capacidade de degradar a insulina e atuar como um chaperone para impedir a oligomerização da
αSin. A hipótese central deste estudo é que a deficiência de EDI, característica da DMT2, pode
contribuir para o desenvolvimento de fenótipos semelhantes aos da DP, promovendo tanto
alterações motoras quanto não motoras. O objetivo principal é investigar se a ausência de EDI
aumenta a patogénese da DP, particularmente em modelos de ratinho submetidos a uma dieta
padrão ou a uma dieta rica em gordura (HFD), esta última conhecida por induzir resistência à
insulina.
Para investigar a nossa hipótese, utilizámos dois modelos experimentais principais: ratinhos EDIKO, que têm uma deleção do gene codificante para o EDI, e os seus homólogos WT (wild-type),
que serviram como controlo. Foram formadas quatro coortes de ratinhos machos, alimentados
com uma dieta padrão (NCD) ou com HFD, sendo os grupos organizados em WT-NCD, WTHFD, EDI-KO NCD e EDI-KO HFD. O estudo incluiu a genotipagem dos animais e uma série
de avaliações metabólicas, comportamentais e bioquímicas ao longo de 22 semanas.
As avaliações metabólicas incluíram o teste de tolerância à glucose (GTT) e a medição da glucose
em jejum, realizados antes e depois da introdução das dietas diferenciadas. O desempenho motor
foi avaliado através de testes comportamentais como o Rotarod, o Pole test e o Rope test, enquanto
os sintomas não motores foram analisados com Open field e a avaliação da qualidade do pelo.
Além disso, realizámos análises bioquímicas para avaliar a presença de marcadores de
neuropatologia, incluindo os níveis de αSin, EDI, marcadores sinápticos e indicadores de
neuroinflamação em várias regiões do cérebro, nomeadamente o córtex, hipocampo, cerebelo e
mesencéfalo.
Às 8 semanas de idade, antes da introdução das dietas diferenciadas, os ratinhos EDI-KO
apresentavam um peso corporal inferior ao dos WT, mas exibiam níveis elevados de glucose em
jejum e uma maior Area Under the Curve (AUC) no GTT, sugerindo um estado de intolerância à
glucose típico de pré-diabetes. Estes resultados indicam que a deficiência de EDI está associada
a uma disfunção metabólica precoce, caracterizada por uma resposta inadequada à glucose. Às 22
semanas de idade, após 14 semanas de alimentação diferenciada, observou-se que os ratinhos alimentados com HFD apresentavam um aumento significativo de peso, um fenómeno típico de
um perfil obesogénico. No entanto, os ratinhos EDI-KO HFD, apesar de aumentarem o seu peso,
apresentam um peso inferior aos dos WT HFD. Ambos os grupos HFD (WT e EDI-KO)
mostraram níveis elevados de glucose em jejum e menor resposta à insulina, confirmando a
presença de resistência à insulina compatível com um estado pré-diabético.
Os testes comportamentais destinados a avaliar o desempenho motor revelaram défices
significativos tanto nos ratinhos WT HFD como nos EDI-KO HFD. Nos testes de coordenação e
equilíbrio motor, como o Rotarod, observou-se que os ratinhos alimentados com HFD
apresentavam um desempenho inferior ao dos ratinhos alimentados com dieta padrão,
particularmente no tempo que conseguiam permanecer na barra rotativa. Este défice foi mais
acentuado nos ratinhos EDI-KO HFD, sugerindo que a combinação da ausência de EDI e o
consumo de uma dieta rica em gordura exacerba a disfunção motora, possivelmente devido a uma
diminuição na função dopaminérgica e a alterações na plasticidade sináptica.
O Pole test também demonstrou diferenças significativas entre os grupos, com os ratinhos EDIKO a apresentarem um tempo de descida superior ao dos WT, indicando dificuldades na
coordenação motora e uma resposta motora mais lenta. Este fenómeno foi igualmente observado
nos ratinhos WT HFD, sugerindo que a resistência à insulina induzida pela dieta afeta a
capacidade de execução de tarefas motoras que requerem precisão e equilíbrio.
No que diz respeito aos sintomas não motores, os ratinhos EDI-KO demonstraram
comportamentos sugestivos de maior ansiedade. No teste de Open field, os EDI-KO evitaram as
áreas centrais do campo, preferindo permanecer nas zonas periféricas, o que é indicativo de um
comportamento de ansiedade elevado. Além disso, os ratinhos HFD, tanto WT como EDI-KO,
apresentaram uma qualidade do pelo inferior, caracterizada por uma aparência ungroomed (não
cuidada) e oleosa, sugerindo um comportamento depressivo. Estes resultados são consistentes
com a literatura que associa a resistência à insulina a sintomas de ansiedade e depressão, tanto em
modelos animais como em estudos clínicos.
A avaliação bioquímica focou-se na análise dos níveis de αSin, EDI e outros marcadores
neuropatológicos em diferentes regiões cerebrais. Observou-se que os ratinhos alimentados com
NCD apresentavam níveis mais elevados de EDI, enquanto nos grupos HFD houve uma tendência
para a diminuição dos níveis de EDI. Esta redução está associada à disfunção metabólica
observada nos testes comportamentais e metabólicos. No entanto, os níveis de αSin não
apresentaram alterações significativas entre os grupos, sugerindo que, apesar da disfunção
metabólica, resistência à insulina, e alterações motoras, não houve uma acumulação evidente de
αSin nas regiões cerebrais estudadas.
Em termos de neuroinflamação, os níveis de GFAP mostraram uma ligeira tendência para o
aumento nos ratinhos HFD, especialmente no hipocampo, enquanto no mesencéfalo dos EDI-KO
observou-se uma redução inesperada. Esta evidência pode indicar a existência de mecanismos
compensatórios que atenuam a inflamação neuronal na ausência de EDI, o que contraria a
expectativa de aumento da neuroinflamação associada à resistência à insulina.
Os resultados deste estudo sugerem que a ausência de EDI e o consumo de uma HFD conduzem
a um estado pré-diabético, com implicações tanto para o metabolismo da glucose quanto para a
função motora e aumento de ansiedade. No entanto, a ausência de marcadores claros de
neurodegeneração, como a acumulação de αSin e a perda de neurónios dopaminérgicos, sugere
que a deficiência de EDI pode não ser suficiente, por si só, para desencadear os processos degenerativos típicos da DP no período de tempo estudado. A existência de mecanismos
compensatórios, como a redução da inflamação no mesencéfalo dos EDI-KO, pode ser um fator
protetor que impede a progressão da neurodegeneração, pelo menos nas fases iniciais.
É possível que um período de exposição mais prolongado à HFD, ou a introdução de estímulos
adicionais que aumentem o stress metabólico, possam resultar em alterações mais pronunciadas
nos marcadores de neurodegeneração. Além disso, a utilização de técnicas mais sensíveis, como
a imunohistoquímica, permitirá uma avaliação mais detalhada e específica das alterações a nível
celular, particularmente no que respeita à distribuição da αSin e à resposta inflamatória em
diferentes tipos de células do sistema nervoso.
Em conclusão, o presente estudo reforça a ideia de que a deficiência de EDI e a resistência à
insulina têm um impacto significativo no metabolismo da glucose e na função motora, fatores que
podem estar na base da ligação entre a DMT2 e a DP. No entanto, os resultados sugerem que os
processos neurodegenerativos mais severos podem necessitar de um tempo de desenvolvimento
mais longo ou de condições experimentais mais extremas para se manifestarem de forma evidente.
Estes resultados sublinham a importância de continuar a investigar a relação entre disfunções
metabólicas e doenças neurodegenerativas, utilizando abordagens que integrem tanto modelos
animais como análises moleculares detalhadas.Parkinson's disease (PD) is characterized by the degeneration of dopaminergic neurons and the
development of motor and non-motor impairments. Although the cause of PD remains unclear,
dysregulation and aggregation of alpha-synuclein (αSyn) play a key role in its pathogenesis. Most
PD cases are sporadic, with a clear association between type-2 diabetes mellitus (T2DM) and PD.
We hypothesize that the dysregulation in T2DM may contribute to neurodegeneration in PD,
particularly through the impairment of insulin-degrading enzyme (IDE), which acts as a
chaperone to prevent αSyn oligomerization. Our main goal is to investigate whether IDE loss, a
feature of T2DM, promotes PD-like phenotypes in wild-type (WT) and IDE-KO mice under a
standard or high-fat diet (inducer model of diabetes). Our findings demonstrate that IDE-KO mice
exhibit early metabolic dysregulation, including elevated fasting glucose and insulin resistance
by 8 weeks of age, suggesting that IDE deficiency alone leads to prediabetes. This condition
worsens by 22 weeks with HFD, as both WT-HFD and IDE-KO HFD mice show increased fasting
glucose and impaired insulin sensitivity. Motor deficits were apparent in both IDE-KO and WTHFD mice, particularly in coordination, with IDE-KO HFD mice displaying more pronounced
impairments. Despite these changes, no significant reduction in brain insulin receptor levels
(except for a decrease in the cortex of IDE-KO mice), neuroinflammatory markers (GFAP), or
indicators of neurodegeneration (TH) were observed. Synaptic markers (PSD95 and SNAP25)
remained unaltered, and no changes in IDE or αSyn levels were detected in WT-HFD animals. In
conclusion, while our data supports that IDE deficiency contributes to prediabetes and motor
impairment, the anticipated neurodegenerative and neuroinflammatory markers linked to PD were
not evident at this stage. Longer HFD exposure or more sensitive analyses may be necessary to
clarify the role of systemic insulin resistance and IDE dysfunction in PD-like neurodegeneration
Efeitos biológicos de novas substâncias psicoativas
No full textTese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO consumo de Novas Substâncias Psicoativas (NSP) tem aumentado globalmente,
representando um desafio significativo à saúde pública. Até dezembro de 2023, a Agência da União
Europeia sobre Drogas (EUDA) identificou 950 NSP, incluindo catinonas sintéticas. Estas drogas estão
associadas a efeitos tóxicos graves e mortes, sublinhando a necessidade urgente de estudos aprofundados
sobre o seu perfil toxicológico e mecanismos de ação de modo a clarificar o seu impacto no organismo.
Este trabalho centrou-se no estudo de quatro catinonas sintéticas, 3-CIC, 4-CIC, 3-Cl-TBC
(bupropiona) e 4-Cl-TBC, quanto à sua biodisponibilidade gastrointestinal num modelo celular
intestinal, Caco-2, e mecanismos de citotoxicidade num modelo celular hepático, HepG2. Foram
analisados, em particular, a produção de espécies reativas ao oxigénio (ROS) e os efeitos na membrana
celular sobre a libertação da lactato desidrogenase (LDH), bem como as alterações no perfil proteico
induzidas pela exposição ao stress oxidativo.
Os ensaios de citotoxicidade demonstraram valores de IC50 entre 2,5 e 6,2 mM para Caco-2,
sendo a 4-Cl-TBC a catinona que mostrou maior toxicidade. Para 3-CIC e 4-CIC, os mecanismos de
toxicidade foram associados a danos na membrana celular e aumento de ROS, enquanto que 3-Cl-TBC
e 4-Cl-TBC apresentaram efeitos mais moderados. Quanto à permeabilidade gastrointestinal, os
coeficientes de permeabilidade aparente (Papp) variaram entre 0,19x10⁻⁶ cm/s e 3,84x10⁻⁶ cm/s, com 3-
CIC mostrando maior permeabilidade e 4-Cl-TBC a menor. Em HepG2, alterações na análise preliminar
de expressão proteica, sugeriram respostas adaptativas ao stress oxidativo, especialmente nas células
expostas à 3-CIC.
Este estudo revela os efeitos tóxicos das catinonas sintéticas, destacando diferenças na sua
citotoxicidade e permeabilidade. Enfatiza a importância de investigar alterações proteicas e propõe
direções para pesquisas futuras sobre os mecanismos de toxicidade, visando uma melhor compreensão
dos riscos e o desenvolvimento de estratégias de controlo mais eficazes.The consumption of New Psychoactive Substances (NPS) has been increasing globally, posing
a significant public health challenge. By December 2023, the European Union Drugs Agency (EUDA)
identified 950 NPS, including synthetic cathinones. These drugs are associated with severe toxic effects
and deaths, highlighting the urgent need for in-depth studies on their toxicological profiles and
mechanisms of action to clarify their impact on the body.
This study focused on the analysis of four synthetic cathinones – 3-CIC, 4-CIC, 3-Cl-TBC
(bupropion), and 4-Cl-TBC – regarding their gastrointestinal bioavailability in a Caco-2 intestinal cell
model and cytotoxicity mechanisms in a HepG2 hepatic cell model. Specifically, the production of
reactive oxygen species (ROS) and the effects on the cell membrane, such as lactate dehydrogenase
(LDH) release, as well as changes in the protein profile induced by oxidative stress exposure, were
analyzed.
Cytotoxicity assays showed IC50 values between 2,5 and 6,2 mM for Caco-2, with 4-Cl-TBC
exhibiting the highest toxicity. For 3-CIC and 4-CIC, toxicity mechanisms were associated with
membrane damage and increased ROS levels, while 3-Cl-TBC and 4-Cl-TBC exhibited more moderate
effects. Regarding gastrointestinal permeability, apparent permeability coefficients (Papp) ranged from
0,19x10⁻⁶ cm/s to 3,84x10⁻⁶ cm/s, with 3-CIC showing the highest permeability and 4-Cl-TBC the
lowest. In HepG2, preliminary analysis of protein expression suggested adaptive responses to oxidative
stress, particularly in cells exposed to 3-CIC.
This study reveals the toxic effects of synthetic cathinones, highlighting differences in their
cytotoxicity and permeability. It emphasizes the importance of investigating protein alterations and
proposes future research directions on toxicity mechanisms, aiming for a better understanding of the
risks and the development of more effective control strategies
Pesquisa de bactérias entéricas multirresistentes em perus produzidos para consumo humano – Existe risco para a Saúde Pública?
No full textTese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente , 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasAs doenças de origem alimentar constituem um grave problema de saúde pública, e os produtos
alimentares de origem animal são uma das principais fontes de contaminação. Igualmente preocupante
é o aumento de estirpes multirresistentes.
Este estudo teve como objetivo analisar o papel dos perus enquanto reservatórios e potenciais
fontes de transmissão de Escherichia coli (E. coli), Salmonella spp. e Shigella spp. ao Homem, através
do isolamento e caracterização fenotípica e genotípica destas bactérias de fezes (n = 108) e carnes cruas
de peru (n = 33), em Portugal.
Em nenhuma das matrizes foi isolada Shigella spp., enquanto Salmonella spp. foi apenas isolada
numa amostra de fezes (0,9%). Isolou-se E. coli em todas as amostras de fezes e em 90,9% das amostras
de carne. E. coli enteropatogénica foi identificada em 0,9% dos isolados de fezes. Os 138 isolados de E.
coli sequenciados apresentaram genes de virulência de E. coli patogénica extraintestinal e 31,2% foram
classificados como E. coli patogénica aviária. Foi observada uma grande diversidade de serotipos e
sequências tipo.
Salmonella Newport foi suscetível aos antibióticos testados. Em E. coli, foram observadas
resistências em 74,1% dos isolados de fezes e 90,0% dos de carne, e, respetivamente, 52,8% e 70,0%
foram multirresistentes. No geral, as resistências mais frequentes foram à ampicilina, tetraciclina e
ciprofloxacina, e foram identificados cinco isolados produtores de beta-lactamases de espetro alargado.
Oito isolados de E. coli apresentaram genes de resistência para a colistina (mcr-1.1). A análise
filogenética dos isolados de E. coli permitiu identificar 13 clusters. Foi identificado um cluster entre o
isolado de Salmonella Newport e outro isolado nacional.
Os resultados deste estudo realçam o papel dos perus como uma potencial fonte de doenças
zoonóticas para o Homem e a importância da abordagem One Health, de forma a garantir a segurança
alimentar e promover a saúde pública.Foodborne diseases represent a major public health concern, with food-producing animals
identified as a primary source of contamination. Furthermore, the emergence of multidrug-resistant
strains is a significant cause for worry.
This study aimed to understand the role of turkeys as reservoirs and potential sources of
transmission of Escherichia coli (E. coli), Salmonella spp., and Shigella spp. to humans, through the
isolation and the phenotypic and genotypic characterization of these bacteria from turkey faeces
(n = 108) and raw turkey meat (n = 33) in Portugal.
No Shigella spp. were isolated from the analysed samples, while Salmonella spp. were only
isolated from faecal samples (0.9%). E. coli was isolated from all faecal samples and from 90.9% of
meat samples. Enteropathogenic E. coli was identified in 0.9% of faecal isolates. All sequenced E. coli
isolates carried virulence genes characteristic of extraintestinal pathogenic E. coli, with 31.2% of the
isolates classified as avian pathogenic E. coli. A high diversity of serotypes and sequence types was
observed.
The Salmonella Newport isolate was susceptible to all tested antibiotics. Among the E. coli
isolates, resistance was observed in 74.0% of faecal isolates and 90.0% of the meat isolates and,
respectively, 52.8% and 70.0% of the isolates were multi-drug resistant. The most prevalent resistances
were observed to ampicillin, tetracycline, and ciprofloxacin. Five E. coli isolates were identified as
extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) producers, and eight carried colistin resistance genes
(mcr-1.1). Phylogenetic analysis of E. coli isolates identified 13 clusters. Additionally, a cluster was
observed between the Salmonella Newport isolate and a national isolate from the Enterobase Portuguese
collection.
These findings highlight the role of turkeys and their meat as a potential source of zoonotic
diseases to humans and emphasize the importance of a One Health approach to ensure food safety and
promote public health
Functional validation of novel candidate microRNA-like molecules encoded in HIV genomes
No full textTese de mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasMicroRNAs (miRNAs) are crucial regulators of gene expression, impacting translation and mRNA
stability across several biological processes, including viral infections. Our lab previously identified two
viral small non-coding RNAs (sncRNAs) encoded in HIV genomes — one from HIV-1 and one from HIV2 — that can follow the canonical microRNA biogenesis pathway. Prediction of miRNA-mRNA target
interactions suggested these sequences might aid viral infection by inhibiting host proteins detrimental to
the virus. The work developed in this dissertation aimed to assess the potential of these novel sequences
to function like bona fide miRNAs.
We conducted functional characterisation of the candidate HIV-derived miRNAs to assess their role
in regulating host gene expression and influencing HIV replication. To investigate seed sequence dependency, seed-disruptive mutant constructs of the sncRNAs were created and compared with wild-type
counterparts. Both wild-type and mutant miRNAs’ impact on predicted host mRNA targets was evaluated
with RT-qPCR and Western blot following transient expression of their precursor transcripts in HEK-293
cells. Additionally, flow cytometry and RT-qPCR on J-lat 6.3 cells assessed HIV reactivation and candidate v-miRNA production, following TNF-α stimulation. HEK-293 RT-qPCR results showed increased
mRNA levels of the selected target genes in cells transfected with the mutant constructs, indicating seed
dependency in miRNA-mediated repression. Western blot analysis confirmed that wild-type viral sncRNas reduced protein levels, while seed mutants showed partial activity. We demonstrated sncRNA 1_2
expression in latent infected J-lat cells, indicating its potential relevance in HIV infection. However,
the effects of the sncRNAs on HIV latency reversal were subtle, making it difficult to draw definitive
conclusions.
Overall, our findings support the hypothesis that HIV-1 and HIV-2 encode microRNA-like sequences
capable of regulating host-virus interactions and provide new insights into v-miRNA-dependent regulatory mechanisms involved in the pathobiology of HIV-1 and HIV-2, highlighting the need for further
in-depth studies
Cost-effectiveness Analysis of Selection Criteria for Liver Transplantation in Patients with Hepatocellular Carcinoma
No full textTrabalho de projeto de mestrado, Matemática Aplicada à Economia e Gestão, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasIntroduction:Liver transplantation is the most effective curative treatment for patients with hepatocellular carcinoma.Due to the scarcity of cadaveric donor livers, selection criteria have been established. However, thesecriteria are very restrictive.In this study, we analysed a new selection tool called HepatoPredict (ClassI and ClassII) and comparedit with standard criteria, including the Milan Criteria (MC), UCSF, Up-to-7, AFP Model, andMetroTicket 2.0. We conducted a cost-effectiveness analysis from the perspective of the U.S. healthcaresystem to determine which selection criterion provides the most significant benefit to the health system.Methodology:A Markov model was developed to simulate the health status of patients with hepatocellular carcinoma who underwent liver transplantation over a five-year period. Transition probabilities, costs, and QALYs were obtained from published articles. The probabilities of recurrence were computed by Kaplan-Meier estimators and were based on a cohort of 149 patients from Portugal and Spain.
We analysed the mean of recurrence-free survival, life years gained, quality of life, and the incremental
cost-effectiveness ratio (ICER) relative to the MC. Results: HepatoPredict offers the most benefits but has a higher total cost than the other criteria. The ICER of HepatoPredict-ClassI and HepatoPredict-ClassII relative to the MC was 40 960.19/QALY, respectively. These two values were below the cost-effectiveness threshold (U.S. GDP per capita, $81 632.25/QALY), which means that HepatoPredict is acceptable in the U.S. healthcare system. Conclusion: HepatoPredict stands out as the most cost-effective criterion and allocates organs most efficiently, considering their scarcity. This provides a significant advantage for hospitals
Impact of BCL-6 downregulation in the oncogenic properties of breast cancer cells
No full textTese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO cancro da mama é atualmente uma das principais preocupações de saúde pública a nível mundial, com
a sua incidência e impacto a aumentarem significativamente nas últimas duas décadas. Em 2022, o
cancro da mama tornou-se no segundo tumor maligno mais prevalente globalmente, com 2.3 milhões
de novos casos registados e aproximadamente 700 mil mortes atribuídas à doença, tornando-se a quarta
maior causa de morte entre todos os tipos de cancro. Projeções indicam que, até 2040, o número de
casos anuais poderá ultrapassar os 3 milhões, com mais de 1 milhão de mortes, sobretudo devido ao
aumento da população e da esperança média de vida. Apesar de avanços no diagnóstico precoce e na
terapia, desafios como a resistência adquirida aos tratamentos, a recorrência, e formação de metástases
continuam a limitar o sucesso clínico. Em resposta, a Organização Mundial da Saúde lançou a Iniciativa
Global do Cancro da Mama, visando reduzir a mortalidade pelo cancro da mama através de estratégias
de saúde pública coordenadas, diagnóstico oportuno e tratamentos acessíveis.
O cancro da mama é uma neoplasia heterogénea, causada por uma combinação de fatores de risco
ambientais e genéticos, com quatro subtipos moleculares definidos pelos diferentes perfis de recetores
hormonais e índices de proliferação celular. Estes incluem os tumores luminal A, caracterizados pela
expressão de recetores de estrogénio (ER) e progesterona (PR), ausência de recetores HER2 e baixos
níveis do marcador de proliferação Ki-67. Os tumores luminal B, diferem do subtipo anterior por
apresentarem elevados níveis de proliferação e poderem ser negativos para a expressão do recetor de
PR. O terceiro subtipo é caracterizado por ser HER2 positivo, não sendo dependente dos outros
recetores. Finalmente, os tumores triplo-negativos caracterizam-se por não apresentarem expressão de
nenhum recetor hormonal. Todos estes subtipos apresentam padrões clínicos diferentes, no entanto, de
uma forma geral, a cirurgia é atualmente a primeira opção de tratamento, sendo precedida de
quimioterapia de forma a impedir o crescimento do tumor e reduzir o seu tamanho, e seguida de
radioterapia para minimizar o risco de recorrência do tumor. Avanços recentes em biologia molecular e
imunologia têm vindo a introduzir novas opções de tratamento que englobam o conceito de medicina
personalizada.
Apesar destes progressos, a resistência adquirida aos tratamentos, formação de metástases, e recorrência
do tumor continuam a ser grandes desafios, pelo que descobrir os mecanismos responsáveis que estão
na base destes eventos e desenvolver novas estratégias terapêuticas que visem a utilização de alvos
moleculares específicos são cruciais para superar estes problemas. Entre potenciais alvos terapêuticos
para intervenção, o fator de transcrição BCL-6 surge como um oncogene promissor. Este atua como um
repressor, ligando-se à região promotora de genes alvo e bloqueando assim, a sua transcrição. Em
condições normais, BCL-6 é necessário para a formação de centros germinais durante a resposta
imunológica humoral no tecido mamário, controlando a expressão de genes envolvidos na diferenciação
terminal, controlo de danos no DNA, e checkpoints de proliferação, sendo estes processos fundamentais
na formação e progressão tumoral. Esta proteína foi encontrada altamente expressa em tecidos primários
de cancro da mama, estando associada à progressão da doença e a um pior prognóstico de pacientes com
cancro da mama. Curiosamente, em tumores recorrentes e metastáticos de cancro da mama observa-se
uma perda da expressão de BCL-6, que está associada a um decréscimo na sobrevivência dos pacientes.
Estes resultados contraditórios demonstram que os mecanismos pelos quais BCL-6 atua ainda não são
completamente compreendidos, destacando a necessidade de entender mais aprofundadamente a sua
contribuição para a progressão do cancro da mama.
Neste estudo utilizámos a tecnologia de RNA de interferência, de forma a explorar o impacto da
supressão de BCL-6 na progressão oncogénica das células MCF-7, uma linha celular de cancro da mama
caracterizada por ser positiva para o recetor alfa de estrogénio (ERα) e apresentar baixa tumorigenicidade. Apesar de ser conhecido o seu papel na regulação da proliferação e diferenciação das
células mamárias, a supressão de BCL-6 não afetou a proliferação ou viabilidade das células MCF-7,
contudo reduziu significativamente as suas propriedades migratórias ao nível coletivo e singular. Como
a migração celular é uma componente essencial da formação de metástases, a capacidade das células
cancerígenas compreenderem estímulos químicos e seguirem gradientes direcionados é crucial para a
disseminação do tumor primário. Estes resultados sugerem que BCL-6 pode estar implicado na migração
celular, independentemente da proliferação. Considerando que BCL-6 se encontra sub-expresso em
tumores de cancro da mama, especialmente em tumores de estádio avançado, e que a sua supressão
levou a uma perda das capacidades migratórias de células de cancro da mama, nós colocámos a hipótese
que um gene regulado por BCL-6 poderia ser essencial para recuperar o fenótipo migratório das células
MCF-7 de cancro da mama e promover a progressão da doença. Análises transcritómicas de RNA de
células MCF-7 identificaram um conjunto de genes sobre-expressos (CFB, S100A7, e S100A8) quando
BCL-6 se encontrava suprimido. Assim decidimos validar experimentalmente estes resultados in silico
nas células MCF-7. Infelizmente, não conseguimos otimizar as condições de PCR para o CFB, o gene
que demonstrava maior variação na análise computacional, nem para a supressão do S100A8, cujo RNA
de interferência não funcionou, pelo que não foi possível continuar o estudo destes genes. O gene
S100A7 está associado à progressão do cancro da mama, no entanto o seu papel exato permanece
incerto. Estudos anteriores revelaram que S100A7 se encontrava mais expresso em carcinomas ductais
in situ pré-invasivos quando comparado com tecido normal ou carcinomas invasivos da mama,
sugerindo um papel na progressão inicial do cancro da mama. Além disso, um estudo de análise
comparativa de dados microarray com o objetivo de definir assinaturas genéticas na progressão do
cancro da mama sugeriu que a supressão do S100A7 é crucial para iniciar a tumorigénese e invasão dos
tecidos adjacentes. Curiosamente, foi demonstrado que S100A7 desempenha um papel diferencial na
progressão do cancro da mama, baseado no estatuto do recetor ERα. Em células de cancro da mama que
expressam este recetor, a sobre-expressão de S100A7 apresenta atividade supressora de tumores,
reduzindo a capacidade de proliferação, migração e invasão. Já em células de cancro da mama que não
expressam ERα, a sobre-expressão de S100A7 atua como um oncogene, promovendo a migração e
invasão celular. No entanto, os nossos resultados demonstraram que a supressão de S100A7 não afeta a
migração das células MCF-7, tanto ao nível singular, como ao nível coletivo. Ademais, quando
suprimido em conjunto com BCL-6, S100A7 não conseguiu resgatar o fenótipo migratório das células
MCF-7.
Em conclusão, os nossos resultados sugerem que um aumento na expressão de BCL-6 está associado
com uma maior capacidade migratória das células de cancro da mama, mas que tal é independente da
expressão de S100A7. Estudos adicionais são necessários para esclarecer o papel de BCL-6 no cancro
da mama, particularmente na identificação de quais dos seus alvos transcricionais contribuem para a
rede regulatória que impulsiona a progressão da doença. Embora não tenha sido possível continuar o
estudo sobre os genes S100A8 e CFB, a sua expressão diferencial após a supressão de BCL-6 pode
desempenhar um papel na restauração do fenótipo migratório das células MCF-7. Para além disso,
testámos apenas um pequeno conjunto de genes, regulados positiva ou negativamente, da análise
transcritómica, de modo que validar outros genes diferencialmente expressos é um próximo passo
lógico. Ampliar o nosso estudo para incluir genes fora daqueles identificados na análise transcritómica,
tais como os principais genes envolvidos na regulação de BCL-6, incluindo membros da família STAT,
pode permitir uma melhor compreensão profunda do papel de BCL-6 na progressão do cancro da mama.
Por exemplo, STAT3 e STAT5, frequentemente ativados no cancro da mama, desempenham papéis
opostos na regulação de BCL-6, enquanto STAT3 promove a sua expressão, STAT5 suprime-a. Esta
interação regulatória poderá ser crucial para entender os mecanismos subjacentes no impacto de BCL6 na progressão tumoral. Explorar a função de BCL-6 em modelos de estudo in vitro de cancro da mama, para além das MCF-7, pode também possibilitar uma visão mais abrangente do seu papel. Como este
estudo se focou exclusivamente na supressão de BCL-6, estudos futuros utilizando linhas celulares com
níveis endógenos de BCL-6 mais elevados podem fornecer um conhecimento mais claro sobre o seu
potencial oncogénico. Assim, aprofundar o entendimento dos mecanismos moleculares pelos quais o
repressor BCL-6 contribui para a progressão do cancro da mama é essencial para o desenvolvimento de
novas abordagens terapêuticas que visem mitigar a metastização e melhorar o prognóstico dos pacientes.Breast cancer (BC) incidence has risen over the past two decades, now being the second most prevalent
cancer worldwide and the fourth leading cause of cancer-related deaths. Despite advancements in BC
treatment, challenges like acquired resistance, recurrence, and metastasis persist. BCL-6, a
transcriptional repressor, plays a controversial role in BC development. It is overexpressed in
approximately half of primary tumors across all subtypes, correlating with poorer patient prognosis.
Conversely, its downregulation is linked to disease progression and metastasis, highlighting the critical
need for a deeper understanding of BCL-6's dual role in BC pathogenesis. This study used RNA
interference to explore the impact of BCL-6 depletion on the oncogenic progression of MCF-7 cells, a
low-tumorigenic estrogen receptor-alpha-positive (ERα+) cell line. While BCL-6 is known to regulate
mammary cell proliferation and differentiation, its depletion did not affect MCF-7 cell proliferation or
viability but significantly reduced their individual and collective migratory properties. An RNA
microarray analysis identified a set of genes upregulated following BCL-6 depletion, including S100A7,
previously reported to inhibit MCF-7 cell migration and invasion in ERα+ BC cells. However, our
findings showed that S100A7 downregulation alone did not affect MCF-7 migration. Moreover,
simultaneous depletion of BCL-6 and S100A7 failed to restore MCF-7 cell migratory behavior. Our
results suggest that increased expression of BCL-6 is linked to increased cell migration but is
independent of S100A7 upregulation. Further studies are required to clarify the role of BCL-6 in BC,
including disease progression
Hq-bashy as a novel platform for photodynamic therapy
No full textTese de mestrado, Química Medicinal e Biofarmacêutica, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Nos dias de hoje, o cancro permanece como uma das doenças mais prevalentes e mortais a nível
global. Apesar dos diversos avanços significativos das terapias anticancerígenas, a heterogeneidade
desta doença continua a ser um desafio na clínica moderna. Fenómenos como resistência aos
fármacos anticancerígenos, recorrência do mesmo cancro, processos de metastização e
modificações intra e inter tumorais são os que mais contribuem para que esta patologia se mantenha
como uma das mais mortais globalmente. Uma das técnicas que tem ganho mais atenção ao longo
dos últimos anos consiste na terapia Fotodinâmica. Este método é utilizado sempre em
concomitância com outro tratamento anticancerígeno, mas pode ser utilizado em monoterapia para
outras patologias tais como o acne ou a psoríase. A terapia fotodinâmica tem evoluído com o
objetivo de se tornar num tratamento minimamente invasivo, mas com uma precisão elevada para
todas as patologias que por este método são tratadas. Este método baseia-se na interação de 3
componentes: um fotossensibilizador, um feixe de luz com um comprimento de onda específico e
oxigénio molecular. Apesar destes componentes serem não tóxicos isoladamente, quando se juntam
em terapia fotodinâmica, são capazes de desencadear reações que levam à formação de radicais de
oxigénio dentro da célula-alvo, o que leva à destruição do tecido pretendido, e à consequente
ativação do sistema imunitário. O fotossensibilizador. que é o componente essencial para o
mecanismo de terapia fotodinâmina, pois é este que permanece inativo em circulação após injeção
IV, é o composto que absorve o feixe de luz com um comprimento de onda específico, e após isto,
é o mesmo que, já ativado, inicia reações fotoquímicas com o oxigénio molecular, originando
espécies reativas de oxigénio, que irão acumular-se e consequentemente destruir as células-alvo. O
oxigénio molecular, é o catalisador deste processo, uma vez que este reage com o
fotossensibilizador, levando consequentemente à formação de radicais de oxigénio, que irão reagir
a nível intracelular e consequentemente desencadear processos de stress celular. Este stress pode
levar à degradação da célula tumoral por diversos tipos de morte celular (apoptose ou necrose), e
consequentemente à emissão de citoquinas que estimulam o sistema imunitário no microambiente
tumoral. Apesar de tudo, nem todos os fotossensibilizadores são apropriados para aplicações
clínicas.
Para aumentar a eficácia da terapia fotodinâmica, os cientistas têm procurado sintetizar um
fotossensibilizador ideal, que seja seletivo para as células-alvo, que seja estável em meio fisiológico
e no microambiente tumoral, e que não seja tóxico para as células saudáveis. Estudos recentes
indicam que o fluoróforo híbrido entre um BASHY (boronic acid salicilidenehydrazone) e a cianina
(cy-BASHY) demonstra potencial para ser utilizado como um fotossensibilizador. Este demonstrou
uma forte capacidade de gerar singuletos de oxigénio, atingir rendimentos quânticos elevados e
índices de fototoxicidade elevados. No entanto, o grande problema destes híbridos passa pela foto
vi
degradação, que é bastante característica nos fotossensibilizadores tipo cianina, solubilidade em
água baixa e comprimentos de onda de absorção baixos, ou seja, longe da radiação de infravermelho
próximo. Estas desvantagens restringem o potencial total desta molécula para terapia fotodinâmica.
Neste trabalho, foi utilizada a modularidade característica das plataformas fluorescentes dos
BASHYs para ultrapassar as limitações do híbrido BASHY-cianina. Para alcançar este objetivo,
foram realizadas três modificações à estrutura habitual dos BASHYs, para se obter este resultado:
aumento da estabilidade do core, modificação das propriedades push-pull do fluoróforo e
rigidificação/proteção da foto degradação da molécula pelo oxigénio. A descoberta e consequente
inserção de um grupo de hidroxiquinona na posição aceitadora da plataforma, poderá ser o que é
necessário para que se evite a foto degradação dos grupos polimeteno. Uma vez que este grupo
funcional possui um anel aromático extra, bem como um grupo carbonilo, é expectável que o
comprimento de onda de absorção desta molécula acabe por aumentar, não só pela inserção de um
grupo electro atractor, mas também pela rigidificação da molécula e prolongamento da conjugação
π. Para além disso. Para além disso, a existência de uma ligação dupla, ligação que acreditamos que
seja o grupo funcional que despolete a reação com o oxigénio e formação de radicais, encontra-se
com a carga deslocalizada e protegida pelo grupo fenilo. Desta forma, este grupo funcional poderá
estar menos disponível para ser degradado, e os fenómenos de photobleaching poderão ser
reduzidos. Neste trabalho também conseguimos modificar as propriedades push-pull do BASHY,
de modo a obter uma molécula com um comprimento de onda de absorção mais perto do
infravermelho próximo. Ao prevenir a rotação do nosso grupo eletrodador, dietilamina,
substituindo-o por um grupo funcional mais rígido como a julolidina, podemos prevenir a perda de
energia por processos de decaimento não radioativos, e aumentar o comprimento de onda de
absorção e de emissão. Isto é vantajoso, pois assim, o feixe de radiação incidente para ativar estes
fotossensibilizadores tem um maior comprimento de onda e, ao receber esta radiação, as células
saudáveis não são afetadas pela mesma. Também decidimos alterar a estabilidade da molécula, uma
vez que uma das principais desvantagens deste fotossensibilizador é a sua instabilidade em meio
fisiológico. Para corrigir esta situação, foram realizados estudos computacionais, de modo a
encontrar o grupo funcional que melhor estabiliza a molécula no carbono da imina, zona funcional
mais sensível ao ataque nucleofílico da água. Com estas otimizações, pretendemos aumentar o
potencial dos BASHY para terapia fotodinâmica.Cancer remains one of the leading causes of death globally. Even though anticancer therapies have
advanced significantly, challenges such as drug resistance, recurrence, and metastasis continue to
deter the achievement of complete remission. In recent years, photodynamic therapy (PDT) has
evolved to a minimally invasive treatment with precise control over cancer and other diseases. PDT
is based on the interaction of three non-toxic components: a PS, light of a specific wavelength, and
molecular oxygen. When these components come together, they trigger a therapeutic reaction that
can effectively target and destroy diseased tissue while also engaging the immune system.
Photosensitizers are essential to the mechanism of PDT, as their ability to absorb light at specific
wavelengths initiates photochemical reactions with molecular oxygen, generating reactive species
that target diseased cells. However, not all naturally occurring or synthetic photosensitizers are
appropriate for clinical applications. Consequently, researchers are focused on creating new
photoactive compounds that align closely with the attributes of an ideal photosensitizer, including
selectivity, stability, and minimal side effects. Cyanine-like boronic-acid salicylidenehydrazones
(Cy-BASHYs) have showcased their potential as PS. These photosensitizers demonstrate an
impressive ability to generate singlet oxygen, achieving high quantum yields and exceptional
phototoxicity indexes. However, their cyanine-like photobleaching, low water solubility and shorter
wavelengths of absorption, restraining their full potential in PDT.
In this work, we aim to develop the BASHY platform to overcome some of the cy-BASHYs
limitations. With the introduction of a hydroxyquinone moiety, we aim to avoid the characteristic
photodegradation of polymethine moieties. Furthermore, we also intend to optimize the platform’s
push-pull properties, so that the absortion spectra is shifted to the near infrared (NIR) allowing for
a less invasive triggered-light PS activation. With this we plan to enhance their photophysical
properties due to their more rigid framework and push pull properties, elevating their potential for
PDTFaculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa
Estudos funcionais de variantes no gene APOB em doentes com diagnóstico clínico de Hipercolesterolemia Familiar
No full textTese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA hipercolesterolemia familiar (FH) é uma doença caracterizada por níveis elevados de colesterol LDL,
que se acumulam nas artérias, promovendo o desenvolvimento precoce de eventos cardiovasculares.
Geneticamente, a FH é transmitida de forma autossómica semi-dominante, sendo causada por variantes
nos genes LDLR, APOB e PCSK9. As variantes no gene APOB afetam a ligação do colesterol LDL ao
seu recetor, representando 5 a 10% dos casos de FH.
No entanto, para a maioria das variantes identificadas, o efeito funcional na proteína ainda não está
determinado.
Esta dissertação teve como objetivo principal investigar a correlação entre fenótipo e genótipo, além de
caracterizar funcionalmente variantes identificadas no gene APOB em indivíduos com diagnóstico
clínico de FH na população portuguesa. Como objetivo secundário, foi desenvolvida uma base de dados
que reúne todas as variantes deste gene com estudos funcionais realizados até ao momento.
A identificação das variantes foi realizada por sequenciação de nova geração (NGS) e confirmada por
PCR e sequenciação de Sanger, seguida da pesquisa da variante nos familiares dos casos index. As
variantes em estudo foram identificadas no âmbito do projeto EPHF.
O LDL dos participantes foi isolado por ultracentrifugação a partir do soro de casos index e familiares
com variantes no gene APOB, bem como de indivíduos normolipidémicos. Este LDL foi marcado com
fluorescência e incubado em células CHO-ldlΔ7 para avaliar a capacidade de ligação e internalização
do LDL.
A caracterização funcional, realizada por citometria de fluxo com LDL fluorescente, revelou que as
variantes p.(Asp1456Asn), p.(Val4295Leu) e p.(Arg4519Thr) apresentavam ligação e internalização
normais do LDL, indicando que estas variantes não comprometem a função da proteína.
Este trabalho destaca a importância de caracterizar funcionalmente as variantes no gene APOB para
melhorar o diagnóstico dos indivíduos com FH, possibilitando tratamentos mais adequados a cada caso
e contribuindo para a redução do risco cardiovascular.Familial hypercholesterolemia (FH) is a disease characterized by elevated LDL cholesterol levels, which
accumulate in the arteries, leading to the early onset of cardiovascular events. Genetically, FH is caused
by variants in the LDLR, APOB, and PCSK9 genes, presenting a semi-dominant autosomal transmission
pattern. Variants in the APOB gene affects the binding of LDL cholesterol to its receptor, accounting
for 5 to 10% of FH cases.
However, for most identified variants, the functional effect on the protein remains undetermined.
The primary aim of this dissertation was to investigate the correlation between phenotype and genotype
and to functionally characterize variants identified in the APOB gene in individuals with a clinical
diagnosis of FH in the Portuguese population. A secondary objective was to develop a database that
compiles all known variants of this gene with functional studies conducted to date.
The identification of variants was performed using next-generation sequencing (NGS) and confirmed
by PCR and Sanger sequencing, followed by screening the variants in the relatives of the index cases.
The variants studied were identified as part of the EPHF project.
The LDL of the participants was isolated by ultracentrifugation from the serum of index cases and
relatives with variants in the APOB gene, as well as from normolipidemic individuals. This LDL was
fluorescently labeled and incubated in CHO-ldlΔ7 cells to assess LDL binding and internalization
capacity.
Functional characterization, performed using flow cytometry with fluorescently labeled LDL, revealed
that the variants p.(Asp1456Asn), p.(Val4295Leu), and p.(Arg4519Thr) exhibited normal LDL binding
and internalization, indicating that these variants do not impair protein function.
This study highlights the importance of functionally characterizing variants in the APOB gene to
improve the diagnosis of individuals with FH, enabling more appropriate treatments for each case and
contributing to the reduction of cardiovascular risk