Repositório Científico de Acesso Aberto da ULisboa
Not a member yet
95032 research outputs found
Sort by
Eficácia da oxigenoterapia hiperbárica no tratamento de lesões uretrais induzidas por radiação : um estudo retrospetivo
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023A Oxigenoterapia Hiperbárica é utilizada no tratamento de lesões tardias da radiação, como a Proctite Rádica, Cistite Rádica e Osteorradionecrose da Mandíbula. No sistema urinário, as estruturas mais afetadas pela radiação são os ureteres, a bexiga e a uretra. As Lesões Uretrais Induzidas por Radiação, podem-se caracterizar por Uretrite Rádica, Estenose Uretral e Fístula Uretral. A radiação, ao atingir os tecidos, causa fibrose e dano vascular, com consequente hipóxia. O oxigénio hiperbárico possui características que contrariam estes fenómenos, permitindo que ocorra cicatrização do tecido irradiado.
Este estudo pretende avaliar a eficácia terapêutica da Oxigenoterapia Hiperbárica nas Lesões Uretrais Induzidas por Radiação, através da avaliação retrospetiva dos sintomas antes e depois este tratamento.
Foram analisados retrospetivamente os processos clínicos dos doentes com Lesões Uretrais Induzidas por Radiação tratados no Centro de Medicina Subaquática e Hiperbárica que, num período de sete anos, cumpriram os critérios de inclusão.
O estudo incluiu nove doentes, todos com adenocarcinoma da próstata, tratados com radioterapia. Cinco doentes obtiveram resolução total de sintomas e quatro doentes obtiveram resolução parcial. Doentes que realizaram tratamentos prévios para as suas lesões mostraram uma resposta inferior ao oxigénio hiperbárico.
Como limitações, além do facto de ser retrospetivo e ter uma amostra de pequena dimensão, informações relativas à duração e dose da radioterapia, seguimento e recidiva sintomática não constavam nos processos clínicos.
Não obstante, neste estudo, a oxigenoterapia hiperbárica mostrou uma relação positiva com a resolução sintomática destas lesões, não havendo nenhum doente a relatar manutenção ou agravamento dos sintomas.
Futuramente, é necessário realizar estudos prospetivos para comprovar a eficácia deste tratamento neste tipo de lesões, com uma análise padronizada dos sintomas e tipo de radioterapia.Hyperbaric Oxygen Therapy is used in the treatment of late radiation-induced lesions such as Radiation Proctitis, Radiation Cystitis and Osteoradionecrosis of the Jaw. In the urological system, the structures most affected by radiation are the ureters, bladder, and urethra. Radiation-Induced Urethral Lesions can manifest as Radiation Urethritis, Urethral Stricture and Urethral Fistula. When the radiation reaches the tissues, causes fibrosis and vascular damage, leading to hypoxia. Hyperbaric oxygen, with its unique properties, counteracts these phenomena, allowing for healing of the irradiated tissue.
This study aims to evaluate the therapeutic efficacy of Hyperbaric Oxygen Therapy in Radiation-Induced Urethral Lesions by retrospectively assessing symptoms before and after treatment.
The clinical records of patients with Radiation-Induced Urethral Lesions treated at Centro de Medicina Subaquática e Hiperbárica were retrospectively analysed, during a seven-year period, who met the inclusion criteria.
The study included nine patients, all diagnosed with prostate adenocarcinoma and treated with radiotherapy. Five patients achieved complete resolution of symptoms, while four patients achieved partial resolution. Patients who had undergone previous treatments for their injuries showed a lower response to hyperbaric oxygen therapy.
However, this study has limitations, such as its retrospective nature and a small sample size. Clinical records did not provide information regarding the duration and dosage of radiotherapy, follow-up, and symptomatic relapse.
Nevertheless, this study demonstrated a positive relationship between Hyperbaric Oxygen Therapy and symptomatic resolution of these injuries, with no patients reporting symptom persistence or aggravation of symptoms.
Future prospective studies are needed to further establish the efficacy of this treatment for Radiation-Induced Urethral Lesions, employing standardized analysis of symptoms and radiotherapy type
Avaliação do microbioma oral de coelhos (Oryctolagus cuniculus) com e sem doença dentária
No full textDissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, área científica de ClínicaAs doenças dentárias são frequentes em coelhos domésticos, podendo afetar cerca de 15% dos animais e comprometendo gravemente o seu bem-estar. Embora a microbiota bacteriana oral desta espécie já tenha sido descrita, as alterações do microbioma associadas à doença dentária permanecem pouco esclarecidas. Este estudo teve como objetivo caracterizar e comparar o microbioma oral do coelho doméstico através da sequenciação de terceira geração (Oxford Nanopore ®) do gene 16S rDNA. Foram analisadas amostras da mucosa oral de 27 animais, divididos equitativamente por três grupos: coelhos saudáveis (n=9), com doença dentária (n=9) e com abcesso dentário (n=9). Foi avaliada a diversidade microbiana (alfa e beta) e a composição taxonómica em cada grupo, identificando diferenças significativas associadas à presença de doença oral. Apesar das amostras de cada coelho doente apresentarem uma redução estatisticamente significativa da diversidade microbiana oral, a diversidade total de espécies bacterianas encontradas em todos os coelhos doentes combinados foi maior do que nos coelhos saudáveis. Esta aparente contradição foi explicada pela diversidade beta, que demonstrou que a composição da comunidade microbiana variou mais entre coelhos doentes do que entre coelhos saudáveis. Nos coelhos saudáveis predominaram os géneros Bibersteinia e Rodentibacter (20,25% e 13,05%, respetivamente), enquanto os coelhos com doença dentária apresentaram um microbioma dominado por bactérias oportunistas. Em particular, registou se um aumento marcado de Streptococcus (16,21%) e de anaeróbios estritos nos grupos com doença avançada, nomeadamente Porphyromonas (de 0,6% nos saudáveis para >7% nos doentes). Contudo, a presença de Streptococcus diminuiu acentuadamente nos casos de abcesso (2,51%). A análise de diversidade beta mostrou a ocorrência de perfis microbianos distintos entre grupos: os coelhos saudáveis exibiram microbiomas mais homogéneos entre si, ao passo que os animais com algum tipo de alteração dentária apresentaram maior heterogeneidade, evidenciando alterações na estrutura da comunidade microbiana associadas à progressão da doença. Estes resultados demonstram que a doença dentária em coelhos está associada a alterações significativas no microbioma oral e sugerem potenciais biomarcadores microbianos para o diagnóstico e intervenção terapêutica nas doenças dentárias em coelhosABSTRACT - ASSESSEMENT OF THE ORAL MICROBIOME IN RABBITS (ORYCTOLAGUS CUNICULUS) WITH AND WITHOUT DENTAL DISEASE - Dental disease is a very common and significant condition in pet rabbits, affecting approximately 15% of individuals and severely impacting their well-being. Although the oral bacterial microbiota of this species has been described, the microbial changes associated with dental disease remain poorly understood. This study aimed to characterize and compare the oral microbiome of pet rabbits using long-read 16S rDNA sequencing (Oxford Nanopore ®). Analysis focused on oral mucosal samples from 27 animals, divided equally into three groups: healthy rabbits (n=9), rabbits with dental disease (n=9), and rabbits with odontogenic abscesses (n=9). Microbial diversity (alpha and beta) and taxonomic composition were assessed in each group, revealing significant differences associated with oral disease. Despite each diseased rabbit sample exhibiting a statistically significant reduction in oral microbial diversity, the overall diversity of bacterial species identified across all diseased rabbits combined was greater than that observed in healthy rabbits. This apparent contradiction was elucidated by beta diversity, which demonstrated greater heterogeneity in microbial community composition among diseased rabbits compared to healthy controls. The predominant genera in healthy rabbits were Bibersteinia and Rodentibacter (20,25% e 13,05%, respectively), whereas rabbits with dental disease exhibited a microbiome dominated by opportunistic bacteria. Specifically, a sharp increase in Streptococcus was detected in the group of animals with dental disease (16,21%), and an overgrowth of strict anaerobes was evident in animals with advanced disease, notably Porphyromonas (rising from 0.6% in healthy to over 7% in diseased groups). Conversely, Streptococcus abundance dropped drastically in abscess cases (2,51%). Beta-diversity analysis revealed distinct microbial profiles between groups: healthy rabbits showed a cohesive microbiome cluster, while rabbits with some kind of dental disease displayed greater intra-group variability. These patterns indicate a restructuring of the oral microbial community with disease progression. These findings demonstrate that dental disease in pet rabbits is associated with significant changes in the oral microbiome and suggest potential microbial biomarkers for diagnosis and therapeutic intervention in rabbit dental diseasesN/
Teresa Veiga: luz e mistério na ficção portuguesa contemporânea
No full textMais de 40 anos depois da sua estreia, homenagem a uma figura da literatura portuguesa que nos mostra como o mistério é um lugar de subversão. Teresa Veiga é a única escritora portuguesa que recebeu três vezes o Grande Prémio do Conto: em 1992, com História da Bela Fria, em 2008, com Uma Aventura Secreta do Marquês de Bradomín, e em 2015, com Gente Melancolicamente Louca. A presença pública de Teresa Veiga é rara. É uma autora misteriosa e fomenta a curiosidade dos leitores, interessados em saber mais sobre quem escreve obras que admiram. Também os seus textos constituem, usando uma expressão de Jorge de Sena, «um grande mistério artístico», proveniente da sua originalidade e ancorado na forma como mistura o realismo, o estranho e o fantástico ou como cria as suas personagens, muitas femininas. Há jogos de aparências entre o que se conhece e o que se desconhece, entre a verdade e a ilusão. Com este livro de ensaios, pretende-se alargar o conhecimento sobre tantos mistérios, que fazem de Teresa Veiga uma escritora canónica da narrativa breve — e com grande sentido de humor.Esta actividade é financiada por Fundos Nacionais através da FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., no âmbito do projecto UIDB/00077/2020.info:eu-repo/semantics/publishedVersio
Efeitos adversos endocrinológicos da terapêutica com inibidores de checkpoint imunológico
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024Os checkpoints imunológicos, como, por exemplo, PD-1, PD-L1 e CTLA-4, são proteínas com um papel importante na regulação da atividade dos linfócitos T, assegurando um equilíbrio entre a proteção do organismo e a manutenção da tolerância imunitária. A inibição destas moléculas através de anticorpos monoclonais anti-PD-1/L1 e anti-CTLA-4, apresenta-se como uma abordagem inovadora no tratamento da doença oncológica, dado o efeito anti-tumoral resultante do aumento da atividade das células T. Apesar do bom perfil de segurança atribuído aos inibidores de checkpoint imunológicos, cerca de 10% dos doentes tratados com estes fármacos apresentam efeitos adversos endocrinológicos, sendo as principais glândulas afetadas a tiroide e a hipófise. Neste trabalho, foram analisados 38 artigos, com o objetivo de rever os mecanismos fisiopatológicos subjacentes a esta resposta endócrina à imunoterapia, identificar as principais formas de apresentação clínica e avaliar a sua abordagem mais adequada. Além disso, procurou-se também identificar os principais fatores de risco para a ocorrência destas endocrinopatias, cujo reconhecimento precoce permite uma correta gestão destes casos, prevenindo situações graves e que comprometam a vida humana. Regra geral, a idade avançada, a utilização de doses elevadas destes fármacos e a preferência por esquemas de terapêutica combinada aumentam o risco de ocorrência destes eventos. Por fim, analisou-se a possível relação entre a presença de efeitos endocrinológicos secundários à imunoterapia e o prognóstico da doença oncológica, constatando-se que a maioria dos trabalhos sugere que os doentes que manifestam efeitos adversos autoimunes apresentam melhores outcomes de doença, nomeadamente maiores taxas de sobrevida geral. Contudo, são ainda necessários mais estudos nesta área para que se possa estabelecer com segurança esta associação.Immune checkpoints, such as PD-1, PD-L1, and CTLA-4, are proteins with an important role in regulating the activity of T lymphocytes, ensuring a balance between organism protection and maintenance of immune tolerance. Inhibiting these molecules through monoclonal antibodies targeting PD-1/L1 and CTLA-4 presents an innovative approach in cancer treatment, given the anti-tumoral effect resulting from increased T cell activity. Despite the favorable safety profile attributed to immune checkpoint inhibitors, approximately 10% of patients treated with these drugs experience endocrinological adverse effects, affecting primarily the thyroid and the pituitary glands. In this study, 38 articles were analyzed to review the underlying pathophysiological mechanisms of this endocrine response to immunotherapy, identifying the main clinical presentation forms and evaluating their best approach. Additionally, efforts were made to identify the main risk factors for the occurrence of these endocrinopathies, since early recognition is crucial to prevent severe situations that could compromise human life. In this regard, it was concluded that, in general, advanced age, high doses of these drugs, and preference for combined therapeutic regimens increase the risk of experiencing these events. Lastly, the possible relationship between the presence of an endocrine response to immunotherapy and the prognosis of oncological disease was analyzed, with most studies suggesting that patients who manifest autoimmune endocrinological adverse effects during immunotherapy show better disease outcomes, particularly higher rates of overall survival. However, further studies in this area are needed to safely establish this association
Digital Technology for the Production of Removable Partial Denture Metal Frameworks
No full textObjectives: To review the fit accuracy results of removable partial dentures (RPDs) metal frameworks produced by different digital protocols. To evaluate methods for the fit accuracy assessment of RPD metal frameworks to the supporting structures. To clinically evaluate RPD metal frameworks produced by digital technology.
Materials and methods: A systematic review was elaborated to identify the digital protocols of framework production and the corresponding fit accuracy assessment previously described. In vitro study of direct (digital superimposition and inspection) and indirect (mold thickness measure by micro-computed tomography) assessment of the gap between the occlusal rests (n= 34) and their respective rest seats. For twenty-six dental arches (n= 26) two RPD Co-Cr frameworks production protocol (experimental digital vs conventional lost-wax) were compared for production repetition, components adjusted until correct insertion, clinical acceptability, components maladjustment and thickness and volume of occlusal rest silicone molds determined by micro-computed tomography. Data were analyzed using adequate parametric or non-parametric tests (α= 0.05).
Results: The most described protocol was the direct additive manufacturing using conventional impression, which showed better outcomes. A strong positive correlation (ρ= 0.612) between quantitative methods was verified and no difference (p = 0.595) was found between the qualitative data. Digital production protocol presented similar results than control, with the exception of lower production repetitions (p= 0.046), higher components adjusted (p= 0.011) and lower reciprocal arms maladjustment (p= 0.044).
Conclusions: The results of this thesis suggest that the direct additive manufacturing using conventional impression is a feasible method to produce RPD metal frameworks, considering the applyed assessment methods.Sineldent®VOCO Gmb
Peano’s Geometry: From Empirical Foundations to Abstract Development
No full textIn Principii di Geometria (1889b) and ‘Sui fondamenti della Geometria’ (1894) Peano offers axiomatic presentations of projective geometry. There seems to be a tension in Peano's construction of geometry in these two works: on the one hand, Peano insists that the basic components of geometry must be founded on intuition, and, on the other, he advocates the axiomatic method and an abstract understanding of the axioms. By studying Peano’s empiricist remarks and his conception of the notion of mathematical proof, and by discussing his critique of Segre’s foundation of hyperspace geometry, I will argue that the tension can be dissolved if these two seemingly contradictory positions are understood as compatible stages of a single process of construction rather than conflicting options.info:eu-repo/semantics/acceptedVersio
Genome-wide understanding of biofilm formation by Staphylococcus aureus isolates
No full textTese de Mestrado, Microbiologia Aplicada, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasStaphylococcus aureus é um patobionte que coloniza a mucosa nasal e a pele de vários mamíferos,
incluindo o Homem. As estirpes comensais de S. aureus podem, em situações específicas, quebrar
barreiras naturais, ganhando acesso a tecidos mais profundos, e causando infeções com gravidade muito
variável.
Esta espécie possui uma notável diversidade metabólica, adaptabilidade ecológica, e resistência a
xenobióticos. Esta resiliência tem por base a formação de biofilmes. Grande parte das infeções
provocadas por S. aureus estão associadas a biofilmes, nos quais se desenvolvem subpopulações
persistentes que exibem tolerância a múltiplas drogas e se evadem da ação do sistema imunitário.
O processo de formação de biofilmes em S. aureus engloba vários determinantes genéticos
envolvidos na adesão e colonização de superfícies; o operão ica envolvido na produção de PIA,
importante para a matriz extracelular; outras adesinas que medeiam interações intercelulares
consolidando o biofilme; o operão agr associado à deteção de quórum; entre outros determinantes.
Embora, nos últimos anos, se tenha expandido o conhecimento sobre o processo de formação de
biofilmes em S. aureus, muitos aspetos permanecem por esclarecer, nomeadamente a base molecular
subjacente à heterogeneidade fenotípica observada neste domínio em isolados de diferentes origens.
Também pouco se conhece sobre os loci genéticos que estão sob pressão seletiva para a expressão do
fenótipo de biofilme. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi o de contribuir para o aumento do
conhecimento sobre as bases fenotípicas e genéticas da formação de biofilmes em Staphylococcus
aureus, através de uma abordagem integrada, combinando análise fenotípica, genómica comparativa e
evolução adaptativa experimental. Para o efeito, foram caracterizados 115 isolados de S. aureus obtidos
de animais selvagens, javali (n = 68), veado-vermelho (n = 36) e gamo (n = 11), em seis locais de
amostragem. Os isolados foram comparados na sua capacidade de formação de biofilme in vitro após
crescimento, durante 48 horas a 37 ºC, em microplacas de 24 poços contendo meio de cultura MuellerHinton (MH), sem agitação. Os 115 isolados foram classificados em três categorias: fracos produtores
de biofilme (WBP, 9.57% dos isolados), produtores moderados de biofilme (MBP, 76.52%) e produtores
fortes de biofilme (SBP, 13.91%).
Registou-se que, dos 115 isolados, os isolados multirresistentes apresentavam produção média de
biofilme significativamente maior quando comparada aos grupos suscetível e resistente. Após
sequenciação completa do genoma dos 115 isolados, classificou-se in silico cada isolado no seu genótipo
spa-type e no perfil alélico gerado por Multilocus sequence typing (MLST), com o objetivo de explorar
eventuais correlações entre o genótipo e o fenótipo (i.e. formação de biofilme).
Nas condições estudadas, verificou-se que os isolados com spa-type t034 produzem
significativamente maior quantidade de biofilme em comparação com a maioria dos isolados doutros
spa-types. Os isolados com spa-type t3583 e t701 foram associados a reduzida formação de biofilme.
Em contraste, os isolados com perfil alélico (sequence-type) ST6133, associados ao spa-type t034 e
complexo clonal CC398, destacam-se dos restantes, devido à sua forte capacidade de produção de
biofilme.
Apesar da literatura descrever que os operões agr e ica desempenham papéis essenciais no
processo de formação de biofilmes, neste trabalho não se registaram correlações significativas entre a
quantidade de biofilme formado e os quatro grupos de agr existentes. Apenas os isolados do agr-type I
apresentaram menor produção de biofilme (diferenças estatisticamente não significativas). Quando se
comparou o posicionamento filogenético dos isolados pertencentes às duas categorias extremas de produção de biofilme (fracos e fortes produtores de biofilme), não se registaram grupos monofiléticos,
quando se examinou as sequências concatenadas do operão ica, ou do operão agr.
Para aferir a base genética subjacente a diferentes fenótipos de formação de biofilmes, explorouse abordagens de genómica comparativa dos 115 isolados, focando especificamente as sequências de 15
genes anteriormente associados na literatura ao processo de desenvolvimento do biofilme. A análise
filogenética dos isolados resultante do alinhamento das sequências concatenadas dos 15 genes não
segregou os isolados SBP dos isolados WBP, apenas evidenciou que o posicionamento filogenético dos
isolados é determinado pelo seu perfil alélico MLST (grupos monofiléticos). Os perfis alélicos ST5,
ST3224 e ST6133 apresentavam exclusivamente isolados SBP, enquanto o ST72 estava associado
apenas a isolados WBP. Os polimorfismos encontrados nestes 15 loci foram analisados com maior
detalhe para identificar variantes exclusivas (ou mais frequentes) de SBP. Comparando-se os
polimorfismos encontrados em, pelo menos, 40% dos isolados WBP e dos isolados SBP, foram
encontradas 50 variantes potencialmente relevantes para descrever o fenótipo de formação de biofilme.
Estas mutações estavam presentes em 9 dos 15 genes selecionados. As mutações foram mais frequentes
nos genes fnbA, ebpS e clfA, que codificam adesinas, associadas às primeiras etapas de formação de
biofilme (adesão). Os genes icaB e icaC mutados em isolados de SBP podem afetar positivamente a
produção de PIA.
Paralelamente, foi aplicada uma metodologia de evolução adaptativa experimental (ALE) para
selecionar artificialmente isolados com maior produção de biofilme, seguida de sequenciação do
genoma dos isolados evoluídos, visando explorar as variantes genómicas emergentes. Os isolados de S.
aureus ST0563 e ST0719 (WBP) e ST0645 (SBP) foram selecionados para este estudo. O ensaio
estabelecido promoveu ciclos de recolonização e dispersão do biofilme. Nas duas linhagens dos isolados
WBP, registou-se um aumento consistente da capacidade de formação de biofilme dos isolados
amostrados semanalmente, independente da presença da esfera. Nas linhagens do isolado ST0645 não
foi observado o mesmo aumento. A análise assente em genómica comparativa evidenciou que a maioria
dos polimorfismos acumulados nos isolados evoluidos são SNPs, dos quais mais de 50% correspondem
a alterações missense com elevado impacto. Nos isolados evoluídos das linhagens ST0563 foram
encontradas variantes nos genes mraY, purR, ebh, nrnA, agrA, esaA e apt. Nos isolados evoluídos de
ST0645 foram encontradas mutações nos genes apt, saeR, saeS e arlS. Por último, nos isolados
evoluídos das linhagens de ST0719 foram encontrados polimorfismos nos genes purR, copA, pbuG,
clpC, purA, pepF1_1, fadR, tarS, bem como nos genes cujos produtos são uma proteína PhoH-like e
uma farnesil difosfato sintetase. A biogénese da membrana/envelope e transcrição foram as categorias
funcionais COG das variantes associadas a um maior impacto (cerca de 600% de aumento) na formação
de biofilme deste estudo. Por outro lado, detetaram-se variantes em loci associados a transdução de
sinal e ao transporte e metabolismo de nucleótidos nos isolados evoluídos nos quais se registou um
aumento de biofilme de 300% e 400%, respetivamente.
Foram também conduzidos ensaios de ALE para selecionar artificialmente isolados com maior
tolerância ao linezolide (antibiótico de importância crítica). Este ensaio teve por objetivo explorar as
variantes genómicas de isolados evoluídos com foco no aumento da concentração mínima inibitória
(MIC) e o impacto subjacente à formação de biofilmes. A estirpe S. aureus ATCC 25923 foi sujeita a
ciclos de exposição a elevadas concentrações de linezolide (20x a MIC) durante 7 ou 14 dias de
tratamento. Durante este período, registou-se uma ligeira diminuição da viabilidade celular nas três
linhagens evoluídas. Ao longo do ensaio, diminuiu o número de bactérias com a MIC original (MIC =
4 mg/L). Na Linhagem 1, obteve-se três isolados nos quais se registou o aumento em quatro vezes da
MIC (MIC = 16 mg/L); na Linhagem 2, apenas um isolado; e, na Linhagem 3, também três isolados.
Para quantificação do biofilme produzido, foram selecionados todos os isolados de todas as linhagens com MIC = 16 mg/L, e todos os isolados obtidos nos dias 7 e 14 que apresentavam MIC = 8 mg/L. Não
se registaram variações significativas na quantidade de biofilme formado pelos isolados evoluídos, por
comparação com o isolado parental. Em contraste, dois isolados da Linhagem 1 apresentaram redução
significativa da formação de biofilme. Sequenciou-se o genoma completo de alguns dos isolados
resistentes de cada linhagem que apresentavam maior produção de biofilme. Foram identificados sete
polimorfismos nos isolados selecionados das Linhagens 1 e da 2, enquanto na Linhagem 3, sujeita a
menos ciclos de exposição a linezolide (sete dias) registou-se apenas um polimorfismo com efeito
sinónimo numa proteína hipotética. A maioria dos outros polimorfismos encontrados são SNPs, a
maioria com efeito missense. Foram encontradas mutações nos genes nanE, fadR, atl_2, mdrP_1, apt e
ogt. Variantes genómicas nas categorias funcionais COG transporte e metabolismo de carbohidratos
foram associadas a maior impacto na quantidade de formação de biofilmes dos isolados evoluídos,
tendo-se registado uma diminuição drástica da quantidade de biofilme (superior a 60%), quando
comparada com o biofilme original. Por outro lado, e em linha com o ensaio ALE anterior, variantes
categorizadas na função transcrição, foram detetadas em isolados evoluídos nos quais se registou um
aumento (25%) na quantidade de biofilme produzido.
Em suma, neste trabalho, verificou-se que a especialização para o crescimento em biofilme ocorre
rapidamente, com alterações genómicas várias e complexas, em associação com a remodelação de
determinantes da adesão e da matriz extracelular, bem como a acumulação de polimorfismos em efetores
de diferentes níveis de regulação. Foram identificados vários genes com um papel putativo na formação
de biofilmes que poderão ser explorados no futuro como biomarcadores deste fenótipo e potenciais alvos
terapêuticos.Staphylococcus aureus is a commensal pathobiont of humans and other mammals, driving
nosocomial and community‑acquired infections that exert a high burden upon healthcare systems. S.
aureus ubiquity and ecological adaptability have been associated to a sessile lifestyle, involving a
complex set of genes and regulatory networks.
The main aim of this work was to expand knowledge of the genetic bases of biofilm formation in
S. aureus by means of an integrated approach pairing comparative genomics and adaptive laboratory
evolution (ALE). To achieve this goal, 115 S. aureus isolates were subjected to whole genome
sequencing and comparative genomics, highlighting polymorphisms on selected genes, previously
associated to the biofilm development process, that were then related with the biofilm phenotype
exhibited in vitro by the isolates. In addition, ALE assays towards the selection of biofilm traits or
tolerance to linezolid were performed, enabling biofilm phenotype-genotype relations after whole
genome resequencing of evolved isolates.
Sequence-type ST6133 isolates, associated with the clonal complex 398, exhibited significantly
stronger biofilm phenotypes. The strong biofilm producers could be distinguished from weak biofilm
producers by missense variants in eno, clfA, fib, ebpS, fnbB, fnbA, clfB, icaB and icaC genes. ALE assays
towards biofilm formation led different parental strains to convergent evolution in specific genes related
with nucleotide transport and metabolism, transcription, and signal transduction COG functional
categories. ALE towards linezolid resistance led to convergent evolution in specific genes related with
carbohydrate transport and metabolism and, also, transcription.
In this work, we show that S. aureus specialization towards the sessile mode of growth is
accompanied by adhesin and extracellular matrix remodelling, along with mutations in effectors of
different regulatory levels. Several new genes with a putative role in biofilm formation were identified
that may be further explored in the future as biofilm biomarkers or as therapeutic targets
Functional heterogeneity between T follicular regulatory cells from different human compartments
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023Após interagirem com linfócitos T foliculares helper (TFH), os linfócitos B do centro germinal (CG) produzem anticorpos de alta afinidade. A reação CG é regulada por linfócitos TFR. O estudo dos linfócitos TFR humanos do tecido linfoide está condicionado pela inexistência de uma forma eficaz de isolar estas células, visto que o fator de transcrição Foxp3 não pode ser marcado para manter a viabilidade celular. Os linfócitos TFR circulantes e do tecido linfoide correspondem a diferentes populações, não se conhecendo a sua capacidade supressora relativa.
Avaliámos a eficácia de uma nova estratégia que seleciona linfócitos TFR do tecido linfoide CXCR5lo/int CD25+ em vez de CXCR5hi CD25+ (normalmente utilizada), simulando ambas as estratégias e medindo o número de linfócitos TFR Foxp3+ hipoteticamente isolados. Também comparámos a capacidade supressora dos linfócitos TFR circulantes e do tecido linfoide, ao fazer co-culturas com linfócitos B naïve, TFH e TFR, que foram estimuladas com antigénio, para avaliar os níveis de ativação dos linfócitos B e de proliferação dos linfócitos TFH. Finalmente, estudámos a expressão de 361 proteínas em linfócitos TFR para identificar futuros marcadores que possam substituir o CD25 para isolar linfócitos TFR CXCR5hi.
Observámos que, ao selecionar linfócitos TFR de amígdalas humanas CXCR5lo/int ao invés de CXCR5hi, obtemos maiores frequências relativas de linfócitos TFR CD25+. Quando comparámos a supressão dos linfócitos TFR circulantes e do tecido linfoide, detetámos que os últimos reduzem mais eficazmente o número de linfócitos TFH que proliferam, quando comparados com os linfócitos TFR circulantes. Identificámos também o GARP, LILRA-2, SSEA-3 e TRA-1-81 como marcadores promissores para isolar linfócitos TFR do tecido linfoide viáveis.
Apesar de ser necessário validar estes achados, acreditamos que os mesmos evidenciam a heterogeneidade funcional dos linfócitos TFR circulantes e do tecido linfoide.Após interagirem com linfócitos T foliculares helper (TFH), os linfócitos B do centro germinal (CG) produzem anticorpos de alta afinidade. A reação CG é regulada por linfócitos TFR. O estudo dos linfócitos TFR humanos do tecido linfoide está condicionado pela inexistência de uma forma eficaz de isolar estas células, visto que o fator de transcrição Foxp3 não pode ser marcado para manter a viabilidade celular. Os linfócitos TFR circulantes e do tecido linfoide correspondem a diferentes populações, não se conhecendo a sua capacidade supressora relativa.
Avaliámos a eficácia de uma nova estratégia que seleciona linfócitos TFR do tecido linfoide CXCR5lo/int CD25+ em vez de CXCR5hi CD25+ (normalmente utilizada), simulando ambas as estratégias e medindo o número de linfócitos TFR Foxp3+ hipoteticamente isolados. Também comparámos a capacidade supressora dos linfócitos TFR circulantes e do tecido linfoide, ao fazer co-culturas com linfócitos B naïve, TFH e TFR, que foram estimuladas com antigénio, para avaliar os níveis de ativação dos linfócitos B e de proliferação dos linfócitos TFH. Finalmente, estudámos a expressão de 361 proteínas em linfócitos TFR para identificar futuros marcadores que possam substituir o CD25 para isolar linfócitos TFR CXCR5hi.
Observámos que, ao selecionar linfócitos TFR de amígdalas humanas CXCR5lo/int ao invés de CXCR5hi, obtemos maiores frequências relativas de linfócitos TFR CD25+. Quando comparámos a supressão dos linfócitos TFR circulantes e do tecido linfoide, detetámos que os últimos reduzem mais eficazmente o número de linfócitos TFH que proliferam, quando comparados com os linfócitos TFR circulantes. Identificámos também o GARP, LILRA-2, SSEA-3 e TRA-1-81 como marcadores promissores para isolar linfócitos TFR do tecido linfoide viáveis.
Apesar de ser necessário validar estes achados, acreditamos que os mesmos evidenciam a heterogeneidade funcional dos linfócitos TFR circulantes e do tecido linfoide
The role of RIPK3 in the crosstalk between hepatocytes and macrophages in metabolic-dysfunction associated steatotic liver disease
No full textTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A doença hepática esteatótica associada a disfunção metabólica (DHEM), anteriormente conhecida como doença de fígado gordo não-alcoólico (FGNA), é a doença hepática crónica mais comum e é das principais causas de mortalidade e morbilidade hepática. Ainda assim, existe uma carência de terapias farmacológicas, o que suscita a necessidade de um melhor entendimento dos mecanismos da doença para identificar potenciais alvos terapêuticos. A proteína receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) é um executor-chave da necroptose, uma forma de morte celular regulada imunogénica que está ativada na DHEM e que tem sido implicada na patogénese da doença. No entanto, o potencial benefício terapêutico resultante da inibição da RIPK3 continua a ser um assunto de debate, em parte devido à falta de estudos centrados na função da RIPK3 em diferentes tipos de célula. Neste trabalho, tivemos como objetivo compreender o papel da RIPK3, específico do tipo celular, na interação entre hepatócitos e macrófagos no contexto da DHEM. Foram realizadas co-culturas em monocamada e transwell in vitro de macrófagos J774A.1 e hepatócitos AML12 wild-type (WT) e deficientes em Ripk3, expostas ao ácido palmítico (AP). A morte celular e expressão de marcadores inflamatórios foram avaliados através de ensaios de citotoxicidade, qRT-PCR e imunoblotting.
Os nossos resultados revelaram funções específicas da RIPK3 em cada tipo de célula. Em particular, em co-culturas de monocamada, hepatócitos WT pré-tratados com AP não ativaram os macrófagos, enquanto a deficiência de Ripk3 nos hepatócitos induziu uma resposta inflamatória nos macrófagos, evidenciada pelo aumento da expressão de marcadores pró-inflamatórios. Simultaneamente, a deficiência de Ripk3 nos hepatócitos aumentou de forma acentuada a expressão do marcador anti-inflamatório arginase-1 (Arg1), o que pode sugerir um papel da RIPK3 dos hepatócitos na mediação da polarização dos macrófagos para executar respostas de resolução de inflamação. Em concordância, a deficiência de Ripk3 nos hepatócitos protegeu-os da morte celular induzida por AP e as co-culturas com macrófagos contribuíram para a reparação de danos nos hepatócitos. Surpreendentemente, a redução de Ripk3 em macrófagos ativou-os para um fenótipo pró-inflamatório em condições basais, que foi exacerbado em macrófagos pré-estimulados com lipopolissacarídeo (LPS) e interferão-gama (IFN-γ). No entanto, a redução de Ripk3 em macrófagos também exacerbou a expressão de Arg1 em macrófagos co-cultivados com hepatócitos Ripk3-/- pré-tratados com AP. Além disso, os nossos resultados revelaram um papel específico da RIPK3 nos macrófagos na modulação do metabolismo dos hepatócitos, nomeadamente através do aumento de enzimas implicadas na produção de triglicerídeos e diminuição de enzimas da β-oxidação peroxissomal.
Em suma, estes resultados fornecem novas informações sobre as funções da RIPK3 que podem influenciar a interação entre macrófagos e hepatócitos na DHEM. As diferentes funções da RIPK3 nos vários tipos de células devem ser consideradas no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para a DHEM.Metabolic-dysfunction associated steatotic liver disease (MASLD), formerly known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the leading chronic liver disease worldwide and is the fastest-growing cause of liver mortality and morbidity. Still, there is a lack of pharmacological therapies, which calls for a better understanding of the underlying mechanisms to identify potential therapeutic targets. Receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) is a key executor of necroptosis, an immunogenic form of regulated cell death activated in MASLD that has been implicated in disease pathogenesis. However, the potential therapeutic benefit resulting from RIPK3 inhibition remains a subject of debate, fueled, in part, by a lack of studies focusing on the cell-dependent contribution of RIPK3. Here, we aimed to understand the cell-specific role of RIPK3 and the crosstalk between hepatocytes and macrophages in the context of MASLD. In vitro monolayer and transwell co-cultures were performed using of wild-type (WT) and Ripk3-deficient AML12 hepatocytes and J774A.1 macrophages exposed to palmitic acid (PA). Cell death and inflammatory markers were evaluated through cytotoxicity assays, qRT-PCR, and immunoblotting.
Our data showed RIPK3 cell-specific functions. Notably, in monolayer co-cultures, PA-pretreated WT hepatocytes failed to activate macrophages, while Ripk3 ablation in hepatocytes induced an inflammatory response, evidenced by an increase in pro-inflammatory markers in macrophages. Simultaneously, Ripk3 ablation in hepatocytes markedly increased anti-inflammatory arginase-1 (Arg1) expression, which may suggest a role of RIPK3 in hepatocytes in mediating macrophage polarization towards healing responses. In agreement, Ripk3 deletion in hepatocytes protected from PA-induced cell death and co-cultures with macrophages contributed to hepatocyte damage repair. Intriguingly, Ripk3 knockdown in macrophages promoted a pro-inflammatory phenotype in basal conditions, which was exacerbated in macrophages primed with lipopolysaccharide (LPS) plus interferon-gamma (IFN-γ). However, the knockdown of Ripk3 in macrophages also markedly upregulated Arg1 in macrophages co-cultured with PA-pretreated Ripk3-/- hepatocytes. Moreover, our results uncovered a macrophage-specific role of RIPK3 in modulating hepatocyte metabolism, namely through the upregulation and downregulation of enzymes implicated in triglyceride production and peroxisomal β-oxidation, respectively.
Altogether, these findings provide novel information about unexpected roles of RIPK3 that could modulate the interplay between macrophages and hepatocytes in MASLD. These intricacies should be considered when evaluating RIPK3 as a therapeutic target for MASLD.Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa)
Sea Urchin Inspired Adhesive Proteins – Expression and Purification of Nectin Structural Domains
No full textTese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasAtualmente, há uma grande procura por adesivos biológicos que sejam eficazes em ambientes aquosos,
para aplicações nas áreas da biotecnologia e da biomedicina (por exemplo, para a produção de adesivos
cirúrgicos ou como promotores de adesão celular para culturas de células e tecidos in vitro).
Na natureza, este tipo de adesivos está muito presente em animais marinhos que usam a adesão para a
sua locomoção e alimentação, tais como as estrelas-do-mar e os ouriços-do-mar. Estes animais possuem
órgãos especializados para a adesão, os pés ambulacrários, que são constituídos por um caule cilíndrico,
responsável pela mobilidade e flexibilidade do pé, e um disco adesivo, que interage com o substrato e é
responsável pela produção de secreções adesivas. Os pés ambulacrários possuem uma epiderme duoglandular com células adesivas e de-adesivas, que produzem secreções adesivas e de-adesivas,
respetivamente. Estas secreções permitem que os ouriços-do-mar se liguem reversivelmente ao
substrato, deixando fixo ao mesmo um círculo de material adesivo. No caso dos ouriços-do-mar,
encontra-se descrito que as secreções adesivas são constituídas por uma grande fração inorgânica,
glícidos, lípidos e proteínas.
Estudos prévios sobre o ouriço-do-mar Paracentrotus lividus identificaram a Nectina-2 como sendo
uma proteína importante no processo de adesão destes organismos, uma vez que está sobre-expressa
tanto nos pés ambulacrários como nas secreções adesivas. A Nectina-2 é uma proteína de elevado peso
molecular (tem mais de 100 kDa) composta por seis domínios discoidina (DS), que lhe permitem ligarse a moléculas com resíduos de galactose e N-acetilglucosamina. Considera-se que estes domínios sejam
os principais responsáveis pelas propriedades adesivas da Nectina. Para além disso, esta proteína possui
um péptido sinal (com 24 resíduos de aminoácidos), uma sequência LDT, que se pensa ser responsável
por manter a interface entre o pé ambulacrário e a secreção adesiva (através de interações com recetores
de integrina do tipo α4/β7 nas células da epiderme do disco), e um possível local de sulfatação na Tyr77
(importante local para modificações pós-traducionais para proteínas que passam pela via secretora). A
Nectina-2 é ainda passível de sofrer modificações pós-traducionais, tais como fosforilação e
glicosilação.
Considerando que a produção da proteína Nectina-2, em larga escala, será um processo moroso e
provavelmente pouco rentável a nível industrial devido ao seu elevado tamanho e à sua complexa
estrutura, o principal objetivo deste trabalho é encontrar uma combinação mais simples de domínios DS
que tenha propriedades adesivas comparáveis à proteína completa e com estabilidade adequada à sua
produção em larga escala.
Deste modo, este trabalho consistiu na otimização dos processos de expressão e purificação de diferentes
construtos de Nectina-2, e posterior caracterização bioquímica e estrutural. Para alcançar estes objetivos,
foram desenhados seis constructos que foram inseridos em dois vetores diferentes [pHTP1 e pET28b(+)]
(obtido como serviço) para expressão de proteínas recombinantes em E. coli. Dos seis constructos,
quatro foram expressos com sucesso (constructos C1, C2, C5 e C6). Os constructos inseridos no vetor
pHTP1 (constructos C1 e C2) tiveram um nível de expressão de proteína mais elevado que os restantes.
Seguidamente testaram-se protocolos de purificação para os diferentes constructos, usando diferentes
técnicas cromatográficas. Para os constructos C1 e C6 não foi possível estabelecer protocolos de
purificação, pois os protocolos testados falharam na obtenção de proteína pura. Neste sentido no futuro
será necessário realizar mais testes. O constructo C2 foi purificado com sucesso através do uso de
cromatografia de afinidade (His-trap), tendo-se obtido uma proteína com um grau de pureza de 90-95%.
Através de estudos de dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência, percebemos que o constructo
purificado tem um fold do tipo α/β (o que vai de encontro às previsões obtidas com o software
AlphaFold) e os seus resíduos de triptofano estão parcialmente expostos ao solvente.
Para estudar a estabilidade conformacional do constructo C2 em diferentes ambientes, semelhantes aos
que a Nectina-2 está exposta quando expressa nos ouriços-do-mar, recorremos a estudos da desnaturação térmica. Deste modo, as condições estudadas foram água do mar artificial (ASW1 - 223 mM NaCl, 30
mM MgCl2, 5 mM KCl, 5 mM CaCl2, 12 mM NaHCO3, 5 mM Hepes pH 8) ou elevada concentração
de NaCl (25 mM Tris pH 8, 5% glicerol, 600 mM NaCl) para simular o ambiente marinho, e pH baixo
(78 mM tampão Na+
/K+
de fosfato, pH 5.5) para simular o interior dos grânulos secretores, onde
proteínas adesivas, como a Nectina-2, são armazenadas antes da sua secreção.
Os espectros de emissão de fluorescência dos triptofanos obtidos para o constructo C2, no estado nativo,
nos diversos ambientes foram muito semelhantes ao obtido na presença de tampão Tris. Não obstante,
após desnaturação térmica na presença de água do mar, no estado desnaturado, observou-se um red shift
no máximo de emissão comparativamente ao tampão Tris. Globalmente estes dados sugerem que
embora a água do mar artificial possa não causar alterações conformacionais instantâneas na proteína,
parece influenciar a sua conformação quando exposta a condições desnaturantes.
A fluorescência dos triptofanos foi também usada para seguir a estabilidade térmica da proteína. Os
resultados obtidos mostraram que, na maioria das condições estudadas, este processo é cooperativo, e
que a temperatura de desnaturação aparente (Tm
app) é muito semelhante entre condições (entre 55 e 56
°C). A única exceção foi para o tampão com pH 5.5, neste caso a transição apresentada correspondia a
um processo não cooperativo (e por isso não pode ser diretamente comparada com as restantes
condições) obtendo-se uma Tm
app ligeiramente superior às restantes (58 °C).
Outra técnica utilizada para estudar a estabilidade térmica do constructo purificado foi a fluorescência
de varrimento diferencial (DSF), recorrendo ao fluoróforo SYPRO Orange, cuja fluorescência aumenta
na presença de ambientes apolares, tais como as regiões hidrófobas de uma proteína desnaturada.
Novamente, obteve-se um processo de desnaturação cooperativo nas condições estudadas. O facto de os
valores de Tm
app obtidos na presença de água do mar artificial e de tampão Tris terem sido diferentes (53
e 56 °C, respetivamente), corrobora a influência da água do mar no processo de desnaturação do
constructo. Para além disso, o facto de o valor de Tm
app ser inferior na presença da água do mar artificial
significa que esta condição tem um efeito desestabilizador no constructo, pelo menos quando se
considera a exposição de resíduos hidrófobos.
Curiosamente, os valores de Tm
app obtidos por fluorescência e por DSF na presença de água do mar
foram diferentes (56 e 53 °C, respetivamente). Isto pode indicar que, durante o processo de desnaturação
térmica, a exposição de resíduos hidrófobos acontece a temperaturas mais baixas do que as alterações
ao ambiente circundante dos triptofanos.
Seguidamente ainda avaliámos a propensão para este constructo agregar em diferentes condições, uma
vez que, em estudos anteriores, foi demonstrado que o adesivo secretado por P. lividus comporta-se
como um amiloide funcional. Estes ensaios foram realizados seguindo a dispersão de luz ao longo do
tempo, à temperatura ambiente, de uma solução do constructo C2 em tampão Tris versus água do mar
artificial (ASW2 - 445 mM NaCl, 60 mM MgCl2, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 24 mM NaHCO3, 10 mM
Hepes pH 8). Interessantemente, em água do mar houve formação de precipitados. Embora estes dados
sejam muito preliminares, mais uma vez indicam que a água do mar provoca alterações conformacionais
na proteína alvo.
No geral, os resultados obtidos neste trabalho poderão vir a contribuir para uma melhor compreensão
dos mecanismos de adesão de P. lividus e para o desenvolvimento de novos bioadesivos inspirados em
ouriços-do-mar com potencial para aplicações nas áreas da biomedicina ou biotecnologia.Marine invertebrates produce secretions with outstanding adhesive properties, which can be used as
inspiration for the development of new biomimetic adhesives for biomedicine and biotechnological
applications.
Studies on the sea urchin Paracentrotus lividus identified Nectin-2 as an important adhesive protein,
that is present in its adhesive organs and secretions, and could have biomimetic potential. Nectin is a
large protein (over 100 kDa) composed of six discoidin-like (DS) domains, making it a laborious model
for future use at an industrial scale.
The main goal of this project is to discover a simplified version of the Nectin-2 protein with one or more
combinations of DS domains (putative adhesive domains) that would simultaneously present suitable
adhesive properties and adequate protein stability when compared to the full-length protein.
Specifically, for the designed constructs, we will establish and optimize protocols for protein expression
and purification.
Six different Nectin-2 constructs were designed for bacterial recombinant protein expression, and an
extensive protein expression assessment was performed. Four of the constructs were successfully
expressed in E. coli. For the latter, a first approach to protein purification was performed using a
combination of chromatographic techniques. Construct C2 was successfully purified (90-95% purity).
This construct was structurally characterized, and our results showed that it presents a folded
conformation with a typical α/β fold. Differential scanning fluorimetry (DSF) and tryptophan emission
were used to study protein thermal stability in different conditions. Overall, the thermal denaturation
curves indicated a fairly stable protein, although preliminary data suggest that artificial seawater (ASW)
can influence protein conformation. Finally, aggregation propensity was also evaluated, and the
presence of ASW induces protein aggregation.
We believe that our results contribute to the current knowledge on the adhesion mechanisms of P. lividus
and open new avenues for the development of sea urchin inspired bioadhesives for
biomedical/biotechnological applications