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Impact of anti-CTLA4 and anti-PD1 on the cross talk between cancer and immune cells, underlying CAT-VTE
No full textTese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente , 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasCancer-associated thrombosis (CAT) and venous thromboembolism (VTE) are frequent cancerrelated complications associated with high mortality, thus the identification of predictive markers urges.
Immune checkpoints inhibitors (ICI) used in cancer immunotherapy allow T cell activation against
cancer cells. Recent retrospective studies showed increased VTE following ICI administration in some
patients. Non-small cell lung cancer (NSCLC) is at high risk of thrombosis and the adoption of
immunotherapy as a first line treatment seems to be associated with coagulation-fibrinolysis
derangement. In melanoma, a very high-risk of thrombosis disease, few studies have addressed
increased risk of coagulation alterations associated to ICI.
For this project, we hypothesized that the action of ICI (anti-CTLA4 and anti-PD1) on immune
and cancer cells as well as on their interaction, accounts for an increased risk of CAT-VTE. Our goal is
to analyze this molecular crosstalk to identify possible prothrombotic biomarkers.
We pharmacologically modulated NSCLC and melanoma cell lines in co-culture with CD8+ T
cells (T CD8+
) and Myeloid-Derived Suppressor Cells (MDSC), isolated from healthy blood donors.
Immunofluorescence and flow cytometry analyses showed that T CD8+
and ICI increase cancer cell
death. The in vitro clotting assay showed that T CD8+
and ICI induce platelet aggregation dependent on
the relative quantity of T CD8+
. The Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) proposed that T
CD8+
and ICI differently disrupt Tissue Factor and Podoplanin levels, which were not restored by
MDSC exposure. The metabolic remodeling assessment by Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
suggested differential concentrations of extracellular metabolites upon exposure to T CD8+
and ICI.
This study provides some insights about the interplay of immune cells, ICI and cancer cells,
influencing the coagulation status. The results obtained constitute a starting point on this theme, denoting
the need of further investigation underlying this dynamic, and opening important cues to follow towards
the definition of biomarkers
Redox regulation of mitochondrial dynamics and function in parkinson’s disease
No full textTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.As espécies reativas de oxigénio (ROS) desempenham papéis fisiológicos importantes, nomeadamente na sinalização celular. No entanto, a produção excessiva de ROS está associada ao stress oxidativo, uma caraterística patológica que, juntamente com a disfunção mitocondrial, é um fator central que contribui para a neurodegenerescência, nomeadamente nas doenças neurodegenerativas associadas ao envelhecimento como a Doença de Parkinson (PD).
Foi levantada a hipótese de as ROS poderem regular a dinâmica mitocondrial através da ação em proteínas como a Mitofusina 2 (MFN2). Os resíduos de cisteína (Cys) das proteínas são extremamente sensíveis a alterações nas condições redox, funcionando como sensores de stress. Resultados anteriores do nosso laboratório identificaram Cys na MFN2, que poderiam ser alteradas por modificações pós-traducionais baseadas no estado redox.
Neste trabalho, colocamos a hipótese de que as células que sobreexpressam MFN2, com mutações em Cys específicas, teriam uma resposta alterada ao stress oxidativo, devido a alterações na dinâmica mitocondrial.
Começámos por investigar os níveis de expressão de factores-chave envolvidos na dinâmica mitocondrial e na resposta antioxidante em amostras de tecido cerebral obtido post-mortem a partir de indivíduos controlo e de doentes com PD. Os genes de fusão e fissão mitocondrial foram analisados, tanto a nível de mRNA como da proteína, e os resultados sugerem um desequilíbrio na dinâmica mitocondrial e uma co-regulação entre os níveis de expressão de MFN1 e MFN2. Não se registaram alterações significativas nos níveis de mRNA dos genes antioxidantes, embora a tioredoxina-1 e a peroxirredoxina 1 tenham mostrado uma tendência para diminuir. Curiosamente, os níveis da proteína homóloga de ligação a CCAAT parecem aumentar nas amostras de PD, o que sugere uma potencial ativação da unfolded protein response. Concomitantemente, observámos uma tendência para a diminuição dos níveis de glutationo (GSH) nas amostras dos doentes. Além disso, gerámos vectores de expressão recombinantes, que codificam para formas mutadas de cisteína-para-alanina da MFN2, alteradas nas Cys390 e Cys700. Em estudos de ganho e perda de função, fibroblastos embrionários de murganho de tipo selvagem (WT) e knocked-out para MFN2, foram transfectados com vectores de expressão que codificam as formas WT ou mutadas de MFN2. Observámos que as células MFN2-KO apresentam alterações no potencial de membrana mitocondrial e na geração de ião superóxido, e respondem de forma diferente a fármacos que depletam os níveis de GSH total ou mitocondrial. Além disso, a expressão ectópica dos mutantes MFN2-C700A e MFN2-C390A afeta seletivamente a resposta celular a estes compostos.
Os nossos resultados, embora preliminares, sugerem uma potencial ligação entre a disfunção da dinâmica mitocondrial, o stress oxidativo e as modificações redox na patologia da PD.Reactive oxygen species (ROS) play important physiological roles. However, excessive ROS production is associated to oxidative stress, a pathological feature that, together with mitochondrial dysfunction, is a core-contributing factor to neurodegeneration. ROS have been hypothesized to regulate mitochondrial dynamics through acting on proteins such as Mitofusin 2 (MFN2). Protein cysteine (Cys) residues are extremely sensitive to changes in redox conditions, functioning as stress sensors.
Previous results from our lab have identify Cys in MFN2, that could be altered by redox-based post-translational modifications. Herein, we hypothesize that cells overexpressing MFN2, with mutations in these specific Cys, would have impaired response to oxidative stress due to deficient mitochondrial dynamics. We started by investigating the expression levels of key factors involved in mitochondrial dynamics and antioxidant response in postmortem brain tissue samples from controls and Parkison’s Disease (PD) patients. Mitochondrial fusion and fission genes were analyzed at both mRNA and protein levels and results suggest an imbalance in mitochondrial dynamics, and a co-regulation between MFN1 and MFN2 expression levels. There were no significant changes in mRNA levels of antioxidant genes, although thioredoxin-1 and peroxiredoxin 1 showed a tendency to decrease. Interestingly, C/EBP homologous protein levels appears to increase in PD samples suggesting a potential activation of the unfolded protein response in this disease. Concomitantly, we observed a trend towards decreased glutathione (GSH) levels in PD. Additionally, we have generated recombinant expression vectors, encoding for cysteine-to-alanine mutated forms of MFN2, at Cys390 or Cys700. In gain and loss of function studies, in wild-type (WT) and MFN2-KO cells, transfected with expression vectors encoding for WT or MFN2 mutated forms, we observed that MFN2-KO cells have alterations in mitochondrial membrane potential and superoxide generation, and respond differently to drugs that deplete total or mitochondrial GSH levels. Moreover, ectopic expression of MFN2-C700A and MFN2-C390A mutants selective affect the cellular response to these compounds.
Our results, although preliminary, suggest a potential link between mitochondrial dynamics dysfunction, oxidative stress, and redox modifications in PD pathology.iMed.Ulisboa
Unveiling the role of DIPK2B in zebrafish myeloid cell development
No full textTese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA hematopoiese é um processo que ocorre desde a embriogénese e até à vida adulta de todos os
animais vertebrados. Ao longo dos anos o peixe-zebra tem-se tornado um modelo muito utilizado
para estudar a hematopoiese, uma vez que apresenta vantagens que facilitam o estudo do seu
desenvolvimento, tais como a fertilização externa e a transparência dos embriões.
Adicionalmente, os genomas do peixe-zebra e dos mamíferos apresentam uma elevada
similaridade, a qual também se observa em numerosos genes associados a doenças. Para além
disso, há também uma grande homologia nos mecanismos genéticos e regulatórios que controlam
a hematopoiese no peixe-zebra e nos mamíferos, apesar deste processo ocorrer em tecidos e
órgãos distintos. Durante o desenvolvimento embrionário dos peixes, a primeira onda de
hematopoiese dá origem aos eritrócitos primitivos, que levam oxigénio aos tecidos embrionários,
e aos macrófagos primitivos, que migram para diferentes localizações no embrião onde se
diferenciam em macrófagos residentes de tecidos. No sistema nervoso central, estas células são
definidas como microglia. A segunda onda de hematopoiese ocorre numa fase mais tardia do
desenvolvimento, e é responsável pela formação de células hematopoiéticas estaminais
progenitoras, que migram para diferentes tecidos e estabelecem-se como células hematopoiéticas
estaminais na medula do rim do peixe-zebra, o tecido equivalente à medula óssea dos mamíferos.
É neste tecido que as células hematopoiéticas estaminais dão origem às várias linhagens celulares
do sangue durante toda a vida do organismo, tais como os eritrócitos, monócitos, granulócitos e
linfócitos. Na maioria dos órgãos, os macrófagos residentes de tecidos, de origem primitiva, são
gradualmente substituídos por macrófagos definitivos derivados de monócitos, com origem em
células hematopoiéticas estaminais. Devido às diferentes origens dos macrófagos residentes de
tecidos, defeitos genéticos em qualquer uma dessas populações podem ter consequências distintas
para o desenvolvimento hematopoiético do organismo. Distúrbios no normal desenvolvimento
dos macrófagos primitivos levam a defeitos nos macrófagos residentes de tecidos embrionários,
os quais podem afetar o desenvolvimento dos órgãos onde estes se localizam. Um destes órgãos
é o cérebro, cujo normal desenvolvimento depende em grande medida da atividade da microglia
primitiva. Por outro lado, se o defeito ocorrer nas células hematopoiéticas estaminais, os
macrófagos definitivos podem não se desenvolver normalmente, o que compromete a imunidade
inata do organismo adulto. Alterações no desenvolvimento hematopoiético podem levar a
distúrbios relacionados com o sistema imunitário, tais como as perturbações do espetro do
autismo (PEA) e as imunodeficiências primárias (IDP). Nomeadamente, mutações em genes que
regulam a função e/ou o desenvolvimento da microglia têm sido associadas a defeitos no
neurodesenvolvimento e a PEA. É de notar que a microglia desempenha funções essenciais para
o normal desenvolvimento do cérebro, tais como a regulação da neurogénese e da apoptose
neuronal, a fagocitose de células mortas, a poda sináptica e a remodelação de circuitos neuronais.
As PEA são doenças do neurodesenvolvimento caracterizadas por defeitos na interação social e a
presença de comportamentos ou interesses repetitivos e restritos. Dentro deste espetro, os cinco
principais tipos são: a Perturbação Autística, a Síndrome de Asperger, a Perturbação
Desintegrativa da Segunda Infância, a Síndrome de Rett e a Perturbação Global de
Desenvolvimento sem outra especificação. Por outro lado, mutações que afetam o
desenvolvimento das células hematopoiéticas estaminais podem comprometer o desenvolvimento
e/ou a função do sistema imunitário, como ocorre nas IDP. As IDP são um grupo heterogénio de
doenças crónicas causadas por mutações de novo ou hereditárias e com diversos fenótipos
provocados por defeitos imunes, tais como infeções recorrentes, autoimunidade, inflamação
aberrante e aumento do risco de doenças hematológicas malignas. Em particular, as IDP
associadas a deficiências nos macrófagos são as seguintes: a Doença Granulomatosa Crónica, a
Suscetibilidade Mendeliana a Infeções Micobacterianas e a Síndrome da Cinase de 3-
Fosfoinositol δ Ativada. Neste projeto, abordamos o papel de um gene implicado em PEA e IDP que é expresso nos progenitores das células hematopoiéticas, o gene DIPK2B (Divergent Protein
Kinase Domain 2B; também conhecido por DIA1R, Deleted in Autism 1 Related). A proteína
DIPK2B possui um péptido sinal na região N-terminal seguido de um possível local de clivagem,
indicando assim que esta proteína será translocada para o retículo endoplasmático e transportada
para o aparelho de Golgi. Adicionalmente, as proteínas DIPK2B têm um domínio de proteína
quinase PIP49_C altamente conservado, característico da família de proteínas quinases FAM69.
Contudo, não possuem um domínio catalítico conservado, sugerindo que DIPK2B pode ser uma
cinase atípica ou uma pseudocinase. Deleções e duplicações do gene DIPK2B foram encontradas
em pacientes que apresentam fenótipos associados a PEA, enquanto mutações pontuais neste gene
foram encontradas em pacientes com IDP. Estudos efetuados no passado por investigadores do
nosso laboratório mostraram que embriões de peixe-zebra com knockdown de dipk2b
apresentavam um nível de expressão superior de marcadores de células percursoras
hematopoiéticos e um nível de inferior de marcadores de células hematopoiéticas diferenciadas
relativamente aos seus controlos. Adicionalmente, estudos de quantificação da microglia no
cérebro de larvas homozigóticas mutantes para este gene apresentavam um menor número de
células da microglia do que os respetivos controlos. Estes resultados, bem como a implicação do
gene DIPK2B em patologias como as PEA e IDP, sugerem que este gene restringe o número de
células precursoras hematopoiéticas e promove a sua diferenciação em macrófagos e microglia.
Neste projeto, pretendemos investigar o papel do gene dipk2b no desenvolvimento
hematopoiético do peixe-zebra. Para isso, avaliamos o efeito do knockout deste gene na
viabilidade de embriões e adultos através de uma análise das razões Mendelianas dos
descendentes de cruzamentos de mutantes heterozigóticos. Esta análise revelou que dipk2b não
parece ser essencial para a viabilidade do peixe-zebra. Concomitantemente, o efeito do knockout
de dipk2b no desenvolvimento de diferentes populações hematopoiéticas foi avaliado através da
análise de imagens de microscopia confocal e citometria de fluxo de embriões transgénicos que
expressam proteínas fluorescentes especificamente nessas populações. Nomeadamente, a linha
Tg(gata1a:DsRed);dipk2b foi utilizada para avaliar o efeito do knockout deste gene na população
de progenitores eritromielóides, enquanto a linha Tg(mpeg:LRLG);dipk2b foi usada para estudar
o papel deste gene no desenvolvimento dos macrófagos. Neste estudo não foram encontradas
alterações na população de progenitores eritromielóides, apesar de estudos anteriores de
investigadores do nosso laboratório terem mostrado que o gene dipk2b possa restringir o tamanho
da população destas células. No entanto, o número de macrófagos é significativamente inferior
nos mutantes homozigóticos quando comparados com os respetivos controlos. Assim, na fase
embrionária, o papel deste gene parece consistir em promover o desenvolvimento dos
macrófagos. Adicionalmente, foi também avaliado o efeito do knockout de dipk2b nas principais
populações hematopoéticas de peixes adultos. Em particular, foram avaliadas as percentagens das
populações de eritrócitos, linfócitos, mielomonócitos e precursores hematopoiéticos localizadas
no sangue periférico, no baço e no rim de peixes adultos. Esta análise revelou que, no geral, as
populações hematopoiéticas do rim e do sangue não parecem estar alteradas em mutantes para
dipk2b, mas os baços de mutantes apresentam uma maior percentagem de mielomonócitos do que
os de animais controlo. Este fenótipo recapitula alguns dos defeitos observados num modelo de
peixe-zebra para leucemia mieloide aguda, uma neoplasia maligna hematopoiética
frequentemente encontrada em pacientes com IDP. De modo geral, os nossos resultados sugerem
que o dipk2b tem um papel importante no desenvolvimento hematopoiético da linhagem
mieloide, promovendo o desenvolvimento dos macrófagos. Esta investigação contribui assim para
esclarecer a função do gene DIPK2B na patogénese de subtipos de PEA e IDP relacionados com
a disfunção de macrófagos.Hematopoiesis is a process that starts during embryogenesis and continues throughout adult life.
In the embryo, a first wave of hematopoiesis gives rise to primitive erythrocytes, which oxygenate
the embryonic tissues, and to primitive macrophages, which migrate into the tissues and become
tissue-resident macrophages, such as the microglia in the brain. A second wave of hematopoiesis
occurs later in development and is responsible for generating hematopoietic stem and progenitor
cells (HSPCs) that persist throughout an organism's life, giving rise to all blood cell lineages.
Disruptions in hematopoietic development can lead to immune-related disorders, such as autism
spectrum disorders (ASD) and primary immunodeficiencies (PID). Namely, genetic mutations
that affect the development of microglia have been associated with defects in neurodevelopment
and ASD, whereas those affecting the development of HSPCs have been associated with immune
disorders and PID. In this project, we addressed the role of a gene implicated in ASD and PID
that is expressed in the progenitors of hematopoietic cells, the gene DIPK2B (Divergent Protein
Kinase Domain 2B). In particular, we investigated the effects of dipk2b loss of function in the
hematopoietic development of zebrafish. In transgenic embryos expressing fluorescent proteins
in different hematopoietic populations, we used confocal microscopy and flow cytometry to
assess the number of erythromyeloid progenitors and macrophages. Our results showed that
dipk2b mutant embryos have less macrophages then their respective controls. In adult zebrafish,
we used flow cytometry to quantify the percentages of different hematopoietic cell populations in
the peripheral blood, spleen and kidney marrow. In dipk2b mutant fish, the blood and kidney
hematopoietic cell populations appeared unchanged, but the spleen had a significantly higher
percentage of myelomonocytes than controls. Overall, our findings suggest that dipk2b plays a
crucial role in the development of myeloid cells, which may underly its implication in ASD and
PID
Strategies of miR-124-3p Enrichment in Neuronal Exosomes and Reparative Effects in Human Tricultures Modeling Aging, Neurodegeneration, and Inflammation in Alzheimer’s Disease
No full textTese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA doença de Alzheimer (DA) é uma doença caracterizada por uma severa neurodegeneração e
neuroinflamação cronica que conduz, em grande parte, à demência. Como resultado, a memória, a
função cognitiva, o comportamento e as competências sociais deterioram-se gradualmente. Caracterizase pela morte das células cerebrais resultando numa atrofia do cérebro. É causada por uma acumulação
anormal de proteínas dentro e à volta das células cerebrais,sendo o peptídeo amiloide-β (Aβ) e a proteína
Tau fosforilada e total, os seus marcadores moleculares mais utilizados. A DA é fortemente influenciada
pela desregulação de microRNAs (miRNAs) e pela inflamação e reatividade associada à microglia.
Além disso, alguns estudos identificaram o papel da reatividade dos astrócitos na neuroprotecção,
plausivelmente na fase prodrómica da DA, ao secretar moléculas anti-inflamatórias, que eliminam a Aβ
e limitam a neuro- inflamação no sistema nervoso central (SNC). Contudo, também secretam alarminas
e mediadores inflamatórios que concorrem para desregular a homeostase e agravar o quadro
inflamatório. Apesar da patogenicidade da DA ter vindo a ser estudada há já muitos anos, e haver
bastante informação, as causas não se encontram esclarecidas e, por isso, a doença não tem cura à data
de hoje. Uma das dificuldades reside na utilização de modelos animais, que não partilham a
fisiopatologia da doença humana.
Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes (~22 nucleótidos) que regulam
a expressão dos genes nas células ao se ligarem ao RNA mensageiro (mRNA), controlando desta forma
os níveis de expressão proteica durante a inflamação. Estes miRNAs têm sido recentemente estudados
como biomarcadores de diagnóstico e potenciais terapias para a DA. Os miRNAs participam ainda na
comunicação entre células, quer na forma livre, quer integrando o conteúdo dos exossomas, sendo
capazes de alterar a expressão de genes na célula recipiente e contribuir para a propagação da
neuroinflamação.
Os exossomas são pequenas vesículas com uma bicamada lipídica, contendo proteínas e material
genético, com diâmetro entre 30-150 nm, que são secretadas por todos os tipos celulares. De origem
endossómica, os exossomas são mediadores cruciais na comunicação entre células e entre tecidos. Uma
vez que podem atravessar a barreira hematoencefálica e entregar a sua carga às células alvo, nos últimos
anos tem havido um interesse crescente na sua utilização para o diagnóstico precoce de doenças
neurodegenerativas, devido ao seu conteúdo em proteínas mutantes e miRNAs associados à doença.
Além disso, os exossomas têm a capacidade de se manterem estáveis na circulação periférica,
características que os tornam sistemas atraentes como veículos de moléculas para tratamento de doenças
neurodegenerativas, como a DA.
Este estudo tem como um dos principais objetivos a produção de exossomas com conteúdo
elevado em miR-124, com o objetivo de ser utilizado como estratégia terapêutica, sempre que o doente
manifeste uma redução da sua expressão. Trabalhos antes realizados no nosso laboratório evidenciaram
que uma diminuição de miR-124 nos neurónios se encontra associado à perda de espinhas dendríticas e
comprometimento sináptico, bem como a uma elevação da proteína precursora do Aβ, pelo que a sua
regulação poderá ser crucial para impedir ou atrasar a progressão da DA. Para tal, o outro objetivo
pretende a otimização de um modelo humano de triculturas de células neuronais, capaz de reproduzir
alguns dos mecanismos de patogenicidade da DA, para servir de modelo no estudo da eficácia dos
exossomas potencialmente terapêuticos. De salientar que este modelo pode também ser aplicado ao
estudo dos subtipos da doença a partir dos fibroblastos dos doentes DA e produção de células induzidas
pluripotentes, capazes de se diferenciar em neurónios, microglia e astrócitos.
Com estes objetivos em mente, servimo-nos de dois processos de enriquecimento do miR-124 em
exossomas. Um, o de fazer uma transfeção do miRNA-124-3p exógeno, sintetizado (mimico), em
células de neuroblastoma humano SH-SY5Y e recolher os exossomas enriquecidos em miR-124
(CT124). O outro o de transfetar diretamente os exossomas isolados das células de neuroblastoma humano SH-SY5Y usando Exo-FectTM (ET124). A sua eficácia foi depois testada em microglia isolada
do córtex de ratinhos aos 2 dias de vida e cultivada por dois dias em cultura, condição na qual se observa
vários marcadores de ativação devido ao stresse produzido pelo método de isolamento. A avaliação
baseou-se na expressão microglial em miR-124, número de exossomas internalizados e marcadores de
ativação microglial. Ambos os estudos evidenciaram uma eficiente captação de exossomas pela
microglia, juntamente com uma entrega mais eficiente do miR-124-3p. No entanto, selecionámos os
ET124 como o melhor método para recuperar o fenótipo homeostático da microglia (mais arginase 1 e
TREM2 (receptor desencadeador expresso nas células mielóides tipo 2), menos IBA1 (molécula
adaptadora ligante de cálcio ionizado-1) e mais P2RY12 (recetor purinérgico P2Y12), provavelmente
por serem preferencialmente captados pela microglia quando comparados com os CT124. Com o fim de
reproduzir um modelo de cultura de células neurais in vitro capaz de reproduzir a patologia de AD para
avaliar o poder reparador dos ET124, fomos otimizar a realização de triculturas
(neurónios+astrócitos+microglia) em sistemas microfluídicos tri-compartimentados que nos foram
providenciados pelo Dr. Alessandro Polini da CNR NANOTEC de Lecce, Itália. Estes sistemas apenas
viabilizam a sinalização parácrina entre as células, incluindo a distribuição de exossomas entre os 3
compartimentos contendo aqueles tipos celulares. A experiência envolveu a realização de estudos
controlo com uma primeira chip (Peter S. Staats) contendo SH-SY5Y (células humanas de
neuroblastoma como neurónios) /IM-HA (astrócitos humanos imortalizados) /CHME3 (linha microglial
humana). Aqui verificámos que a proporção 5:3:2 de neurónios/astrócitos/microglia e o uso de poli-Dlisina + laminina era o mais adequado para manter a viabilidade dos 3 tipos celulares. Uma segunda chip
para mimetizar o AD e o envelhecimento celular (Peter S. Staats) usando a estimulação com H2O2 e as
células SH-SY5Y transfetadas com a mutação SWEdish APP695 em tricultura, SH-SY5Y APPSWE/IMHA/CHME3. Uma terceira chip (Peter S. Staats) igual à segunda, mas onde foram adicionados os ET124.
Seguidamente, e focando no modelo da chip 2, foi possível verificar uma redução das neurites,
um aumento do TNFα (fator de necrose tumoral) e uma diminuição da sinaptofisina (proteína présináptica) e da PSD95 (proteína pós-sináptica de 95 kDA) nas células SH-SY5Y APPSWE, concordando
com a presença de inflamação e alterações sinápticas que caracterizam a DA. Em conformidade,
encontrámos também modificações na morfologia da microglia com uma redução acentuada da TREM2
e elevação de MHCII (complexo principal de histocompatibilidade classe II), de Arginase 1 e de S100B
(proteína ligante de cálcio da família S100). Do mesmo modo encontrámos modificações características
da reatividade dos astrócitos em AD, com o aumento da circularidade e perímetro da célula, bem como
de S100B, RAGE (recetor para produtos finais de glicação avançada), GFAP (proteína ácida fibrilar
glial) e Cx-43 (conexina 43), bem como diminuição de miR-124, miR-146a e miR-125b. As alterações
encontradas nestes dois tipos de células gliais valida o modelo de triculturas em sistema microfluídico
para estudo dos mecanismos de patogenicidade em AD.
Desta forma e continuando o estudo com a adição de ET124 (chip 3), o nosso objetivo seguinte
foi de testar o seu papel reparador nas triculturas que evidenciaram neurodegeneração e inflamação.
Pudemos comprovar que impediu a atrofia das neurites no sistema AD (SWE+H2O2), diminuiu a nNOS
(óxido nítrico sintase neuronal) e aumentou o S100B e o miR-21, para além de reduzir ligeiramente o
défice em proteínas sinápticas e aumentar um pouco o miR-124. Para além destes benefícios nos
neurónios, também aumentou o perímetro e reduziu a circularidade microglial, contrariando o aumento
de S100B e a redução do P2RY12 e de TREM2, favorecendo a capacidade fagocítica, em paralelo com
um aumento do miR-124, que comprova a captação dos ET124 pela microglia e modificações para um
fenótipo mais homeostático. Finalmente, os resultados apontam que o tratamento é eficaz na prevenção
da reatividade do astrócito, contrariando o aumento de circularidade e reduzindo os níveis de marcadores
como o S100B, também um pouco o GFAP, Cx43 e RAGE. Também aqui encontrámos um efeito
notório no aumento, não só do miR-124 (o que era também pretendido) mas também de miR-146a e miR-125b, juntamente com a diminuição de miR-21 e miR-155, justificando o seu papel na regulação
do papel regulador dos astrócitos na neurodegeneração e inflamação.
Em suma, o nosso sistema microfluídico de tricultura baseado em células humanas SHSY5YSWE/IM-HA /CHME3 estimuladas com H2O2 mostrou ser muito dinâmico e reproduzir muitas
características da neurodegeneração e inflamação associadas à DA, sendo uma boa ferramenta para
identificar subtipos da doença e testar novas estratégias terapêuticas. Um exemplo disso é o facto dos
nossos ET124 revelarem ser uma terapêutica neuroprotetora promissora ao contrariar a disfunção
sináptica a ativação da microglia e a reatividade do astrócito, graças à sua capacidade única de modular
a resposta imunológica em contexto de DA, embora sejam necessários mais estudos antes da sua
aplicação na clínica.Alzheimer’s disease (AD) is a major public health threat, characterized by severe
neurodegeneration and chronic neuroinflammation, without effective treatment. Cellular and exosomal
microRNA (miRNA) abnormalities are key in the AD onset and progression and may serve as
therapeutic targets. Literature reports miRNA(miR)-124-3p as being both upregulated and
downregulated in AD. Our previous data using human SH-SY5Y-APP695 SWEdish neuroblastoma cells
(SWE) showed that miR-124-3p regulate dendritic spines, APP expression, toxic amyloid species, and
Tau phosphorylation. We additionally showed that exosomal miR-124 was able to modulate IFNγmicroglia activation.
Our goals in this thesis were to generate exosomes enriched in miR-124 and to test their
therapeutic potential in an optimized human triculture model of neurons/astrocytes/microglia cell lines
in a microfluidic device, for preventing AD-associated neurodegeneration and inflammation.
Exosomes from SH-SY5Y cells were characterized for size, number, and protein content. miR124-engineered exosomes were produced from SH-SY5Y cells transfected with miR-124 mimic
(CT124) or by direct transfection in exosomes using Exo-FectTM (ET124). ET124 was more efficient
than CT124 in delivering miR-124-3p to activated microglia and in recovering their homeostatic
phenotype.
The optimized human AD tricultures, used H2O2-stressed SH-SWE/astrocytes/microglia in a
microfluidic device. Reduction of neurites/synaptic proteins were observed in SH-SWE cells, together
with elevated inflammatory mediators/miRNAs, mainly in microglia and astrocytes showing
morphological alterations. Increase of MHCII/S100B and reduction of TREM2/P2RY12 in microglia,
plus the increase of S100B/RAGE and decrease of miR-124/miR-146a/miR-125b in astrocytes,
validated the AD model. Addition of ET124 prevented neurite atrophy, reverted cell dysmorphologies,
and mitigated S100B levels in glial cells. Transcriptionally, ET124 rectified nNOS/S100B deregulation
in SH-SY5Y cells, boosted microglial TREM2, and compensated the reactive inflammatory
gene/miRNA profile in astrocytes.
In sum, ET124 represents a versatile and effective therapeutic approach to modulate the neuronglia immune response in AD. The triculture model lays the foundation for further investigations toward
AD treatment
Antioxidant and anti-inflammatory potential of polyphenols and derived metabolites in parkinson’s disease
No full textTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurológica degenerativa caracterizada pela perda gradual da dopamina estriatal e pela subsequente diminuição do controlo motor. Os mecanismos moleculares subjacentes à morte neuronal dopaminérgica ainda não estão completamente esclarecidos, mas há fortes indícios de que a disfunção mitocondrial, o stress oxidativo e a neuroinflamação estão implicados na patogénese da DP. Por conseguinte, os (poli)fenóis têm sido amplamente estudados pelos seus potenciais efeitos benéficos na saúde do cérebro e a sua atividade pode ser exercida através das suas propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes.
Para investigar o potencial terapêutico dos (poli)fenóis dietéticos, realizámos um estudo de intervenção nutricional utilizando uma dieta enriquecida em bagas num modelo de ratinho de DP induzido por MPTP, às 24h e 7 dias após a administração de MPTP.
O nosso estudo revelou que a dieta rica em bagas levou a uma melhoria da função motora 7 dias após a exposição ao MPTP, através da melhoria do desempenho dos ratinhos rotarod, tight rope test e grid test. Além disso, o número de células da microglia e a sua morfologia, no cérebro, após 24 horas, sugerem que a exposição ao MPTP resultou na ativação da microglia, uma resposta que foi atenuada pelo consumo de uma dieta rica em bagas. A administração de MPTP também resultou num aumento dos níveis de GFAP no córtex após 24 horas. No entanto, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos de dieta.
Verificou-se que a resposta ao stress oxidativo, conforme avaliada pelos níveis de expressão, tanto da proteína como do mRNA, de diversos componentes da via do fator de transcrição nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2), estava alterada no modelo de PD e foi modulada pelo consumo de uma dieta enriquecida em bagas.
No geral, os nossos resultados apoiam a hipótese de que uma dieta enriquecida em bagas pode atenuar o stress oxidativo, a neuroinflamação e as alterações comportamentais num modelo de ratinho da DP induzido por MPTP.Parkinson's disease (PD) is a degenerative neurological disorder characterized by the gradual depletion of striatal dopamine and the subsequent impairment of motor control. The molecular mechanisms underlying dopaminergic neuronal death are still not completely understood, however strong evidence implicates mitochondrial dysfunction, oxidative stress and neuroinflammation in the pathogenesis of PD. Accordingly (poly)phenols have been extensively studied, for their potential beneficial effects on brain health and their activity might be exerted through their anti-inflammatory and antioxidant properties.
To investigate the therapeutic potential of dietary (poly)phenols, we conducted a nutritional intervention study utilizing a berries-enriched diet in an MPTP-induced mouse model of PD in two timepoints, 24h and 7days after MPTP administration.
Our study revealed that the berries-enriched diet led to improved motor function 7days after MPTP exposure by enhancing the performance of mice in the rotarod, tight rope test and grid test. Moreover, the observed number and morphology of microglial cells in the brain after 24h suggests that exposure to MPTP resulted in microglia activation, a response that was mitigated by berries consumption. MPTP administration also resulted in an increase in GFAP levels in the cortex after 24 hours. However, no significant differences were seen between the dietary groups. The oxidative stress response, as measured by protein and mRNA expression levels of several components of the nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2) pathway, was altered in the PD mouse model and modulated by a berries-enriched diet.
Overall, our results support the hypothesis that a berries-enriched diet can mitigate oxidative stress, neuroinflammation and behavior changes in an MPTP-induced mouse model of PD.Cellular Function and Therapeutic Targeting lab at the Research Institute for Medicines, Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa and at Molecular Nutrition and Health lab at NOVA Medical School
Multimorbilidade e gestão do doente complexo : um estudo de caso
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023A multimorbilidade (duas ou mais condições coexistentes num indivíduo) é um desafio global crescente com efeitos substanciais sobre os indivíduos, cuidadores e a sociedade. A maioria das normas de orientação clínica, formação e prestação de cuidados de saúde concentram-se em doenças individuais, levando a cuidados por vezes inadequados e potencialmente prejudiciais. A multimorbilidade requer cuidados centrados na pessoa, priorizando o que é mais importante para o indivíduo e para os seus cuidadores, garantindo que o atendimento é coordenado de forma eficaz e com o mínimo de interrupções, alinhando-se com os valores do paciente.
A necessidade de orientar doentes com multimorbilidade é um dos desafios da medicina geral e familiar. As limitações funcionais consequentes da diabetes mellitus tipo 2 e de outras doenças crónicas exigem uma boa articulação de cuidados. O médico de família, que melhor enquadra o contexto biopsicossocial do doente, deve assumir um papel primordial nesta integração.
Relata-se o caso de um homem de 45 anos, com antecedentes de talassémia minor, asma persistente leve, esteatose hepática não alcoólica, diabetes mellitus tipo 2 com complicações microvasculares nomeadamente neuropatia, nefropatia e retinopatia, hipertensão arterial e dislipidémia. Apresentam-se os contributos para um plano individual e integrado de cuidados.
Com o presente caso, salienta-se a importância da implementação de um modelo de cuidados centrado na pessoa, integrando toda a constelação da sua multimorbilidade.Multimorbidity (the presence of two or more coexisting conditions in an individual) is a growing global challenge with substantial effects on individuals, caregivers, and society. Most clinical guidelines, training, and healthcare delivery focus on individual diseases, leading to sometimes inadequate and potentially harmful care. Multimorbidity requires person-centered care, prioritizing what matters most to the individual and their caregivers, ensuring that care is effectively coordinated with minimal disruptions, and aligning with the patient's values.
The need to guide patients with multimorbidity is one of the challenges in general and family medicine. The functional limitations resulting from type 2 diabetes mellitus and other chronic diseases demand well-coordinated care. The family physician, who better understands the patient's biopsychosocial context, must play a primary role in this integration.
We report the case of a 45-year-old man with a history of minor thalassemia, mild persistent asthma, non-alcoholic fatty liver disease, type 2 diabetes mellitus with microvascular complications, including neuropathy, nephropathy, and retinopathy, hypertension, and dyslipidemia. The contributions to an individualized and integrated care plan are presented.
With this case, the importance of implementing a person-centered care model is emphasized, integrating the entire constellation of his multimorbidity
Glúten e autoimunidade
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023O glúten é o principal constituinte dos cereais mais consumidos no mundo (trigo, centeio e cevada), fazendo parte da base da alimentação humana. Nas últimas décadas tem sido associado ao desenvolvimento, agravamento e progressão de múltiplas doenças autoimunes, tais como a diabetes mellitus tipo 1 e a esclerose múltipla, levantando a hipótese de o glúten ser um fator etiopatogénico de processos imunomediados. A dieta sem glúten tem sido adotada de forma especulativa por pessoas com condições autoimunes não existindo, até à data, evidência científica que suporte a sua recomendação. Nesta revisão é discutida a evidência disponível na literatura acerca da associação entre o consumo de glúten e o desenvolvimento de autoimunidade, assim como da eficácia e segurança da dieta sem glúten nas várias doenças autoimunes.Gluten is the main component of the most consumed cereals in the world (like wheat, rye and barley) and it’s consumed on a daily basis. In the last decades it has been associated with the development, progression and worsening of multiple autoimmune diseases, such as type 1 diabetes and multiple sclerosis, which raises the hypothesis that gluten might be an etiopathogenic factor in the development of autoimmunity. People with this kind of condition have been using a gluten free diet in a purely speculative way with no scientific evidence supporting its recommendation. In this review it’s discussed the available evidence from the literature concerning the association between gluten consumption and the development of autoimmunity, as well as the efficiency and security of a gluten free diet in some autoimmune pathologies
Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) an important pathogen tick vector in Portugal: a metagenomic approach
No full textTese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasTicks are hematophagous arthropods represented by approximately 900 species, divided into
three families: Argasidae (soft-bodied ticks), Ixodidae (hard-bodied ticks) and Nuttalliellidae
(intermediate features).
Rhipicephalus sanguineus, belonging to the Ixodidae family, is the dominant species in
mainland Portugal. This species is the vector of several pathogens, many of them emerging in our
country. Most of them belong to Rickettsia (Rickettsia massiliae, Ri. conorii), Coxiella, Anaplasma,
Babesia and Ehrlichia. It is therefore necessary to know the true epidemiological situation in mainland
Portugal, which tick species are present and which potential pathogens they carry.
Thus, this work aims to identify which tick species are present in dogs and cats from mainland
Portugal and which pathogens are found in Rhipicephalus sanguineus ticks, in particular. Ticks were
morphological identified based on diagnostic characteristics, and when in doubt, we resorted to
molecular identification through Cytochrome C Oxidase subunit I (COI) and 16S gene. Next, the
presence of potential pathogens from Rickettsia, Anaplasma/Ehrlichia, and Babesia/Hepatozoon genera
was obtained using specific molecular markers by RT-PCR. A Shotgun metagenomic sequencing
analysis was also carried out with Kraken 2 and Krona, to obtain more detailed information on the set
of pathogens present in R. sanguineus samples, one for each studied region (North, Centre and South).
The results showed a more evident presence of Rickettsia genus, namely Rickettsia massiliae,
and, for the first time, the bacterium Rickettsia amblyommatis and the endosymbiont Candidatus
Coxiella mudrowiae were identified in mainland Portugal. The presence of Klebsiella pneumoniae and
Staphylococcus pseudointermedius was also detected in Rhipicephalus sanguineus.
To conclude, the data obtained from this study contributed to a better understanding of ticks’
distribution in Portugal, the bacterial communities hosted by Rhipicephalus sanguineus and allowed us
to see what other pathogens not frequently associated with this species are circulating in Portuguese
territory
Alterações imagiológicas dos traumatismos crânio-encefálicos na idade pediátrica
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023Introdução: Os traumatismos crânio-encefálicos (TCE) apresentam elevada prevalência na idade pediátrica, constituindo uma causa importante de morbilidade e mortalidade infantil. A tomografia computorizada crânio-encefálica (TC-CE) apresenta-se como o método diagnóstico de eleição dos TCE no serviço de urgência, pela sua ampla disponibilidade e rapidez na aquisição das imagens. O objetivo do presente estudo consistiu em caracterizar os dados clínicos e imagiológicos agudos de doentes pediátricos que tenham sofrido traumatismo crânio-encefálico e/ou vértebro-medular, bem como relacionar o mecanismo de lesão traumática e as manifestações clínicas à admissão com a existência de alterações neuro-imagiológicas.
Métodos: Foi concretizado um estudo retrospetivo de doentes em idade pediátrica, diagnosticados com traumatismo crânio-encefálico e/ou vértebro-medular, no Serviço de Urgência do Hospital Santa Maria, entre janeiro e outubro de 2022, que realizaram estudo de imagem. Foram recolhidos e analisados os dados clínicos e imagiológicos dos doentes. A análise estatística foi realizada através do SPSS (v24.0) e posteriormente analisada.
Resultados: Amostra constituída por 380 doentes, com predomínio do sexo masculino (58%) e de crianças com idade inferior a 4 anos (40,5%). A idade média foi de 7,7±5,9 anos. A queda foi o mecanismo de lesão mais frequentemente relatado nos grupos etários dos 0-4 anos e 5-9 anos e o acidente de viação o mais reportado nos outros dois grupos etários (10-14 anos e 15-17 anos). As manifestações clínicas mais comuns à admissão no serviço de urgência foram o hematoma epicraniano (30%), os vómitos (22%) e a sonolência (19%). As quedas de superfície e os acidentes de viação foram identificados como mecanismos de lesão traumática preditores de existência de lesão crânio-encefálica e/ou vértebro- medular nos exames de imagem, bem como a apresentação à admissão com hematoma epicraniano ou com alteração do estado de consciência. A TC-CE foi o método de imagem realizado em todos os doentes, sendo observado alterações em 16,6%. As lesões mais comumente identificadas foram a fratura do crânio (63,5%), o hematoma subdural (36,5%), a hemorragia subaracnoideia (20%), a contusão cerebral (19%) e o hematoma epidural (15,8%). Pela suspeita de lesão
vertebral, foram efetuados TC da coluna vertebral em 57 doentes, sendo encontradas alterações em 8 (14,03%) estudos, com destaque para a fratura vertebral e a lesão articular.
Conclusão: Os TCE apesar de muito frequentes na idade pediátrica, apresentam baixa prevalência de lesão crânio-encefálica. A TC-CE identifica e caracteriza precocemente as lesões decorrentes do traumatismo. No entanto, a sua utilização deve ter em conta fatores clínicos preditores de alterações imagiológicas, como o mecanismo de lesão traumática e as manifestações clínicas à admissão no Serviço de Urgência, para evitar a exposição desnecessária à radiação ionizante. O clínico deve ainda permanecer em alerta para lesões decorrentes do traumatismo vértebro-medular, frequentemente em concomitância com o TCE.Background and purpose: Traumatic brain injury (TBI) is highly prevalent in children and is an important cause of morbidity and mortality. Brain CT is the diagnostic method of choice in the acute setting, being widely available and quickly obtainable. The aim of this study was to characterize the clinical and imaging data of pediatric patients who suffered traumatic brain or spinal injury, as well as to associate the mechanism of traumatic injury and clinical manifestations at admission with the existence of neuroimaging findings.
Methods: Retrospective analysis of patients diagnosed with traumatic brain or spinal injury at the Emergency Department of Santa Maria Hospital between January and October 2022, who had an imaging study. Clinical and imaging data of the patients were collected and analyzed. Statistical analysis was performed and analyzed using SPSS.
Results: Three hundred and eighty patients were eligible, predominantly male (58%) and children under 4 years old. Mean age was 7.7 ± 5.9 years. Fall was the most frequently reported injury mechanism among the youngest and road traffic accident among the oldest. The most common clinical manifestations were epicranial hematoma (30%), vomiting (22%) and drowsiness (19%). Falls from height and road traffic accidents were identified as mechanisms of traumatic injury that were predictive of the existence of imaging findings, as well as the presentation on admission with epicranial hematoma or altered state of consciousness. Brain CT was performed in all patients, with imaging findings in 16.6%. The most commonly identified injuries were skull fracture (63,5%), subdural hematoma (36,5%), subarachnoid hemorrhage (20%), epidural hematoma (15,8%), and cerebral contusion (19%). Due to suspicion of concomitant spinal injury, CT of the spine was performed in 57 patients and changes were found in 8 (14,03%), with emphasis on vertebral fracture and joint injury.
Conclusion: TBI is very frequent in pediatrics and most of them are mild. Brain CT identifies early injuries resulting from trauma. However, to avoid unnecessary exposure to ionizing radiation, its use has to take into consideration clinical factors that predict the existence of imaging findings, such as the mechanism of traumatic injury and clinical manifestations at admission. The clinician should also remain alert for injuries resulting from spinal injury, often concomitant with TBI
Adenocarcinoma de células em anel de sinete na doença inflamatória intestinal : a propósito de três casos clínicos
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023A Doença Inflamatória Intestinal é uma condição inflamatória crónica que engloba duas entidades: a doença de Crohn e a colite ulcerosa. Derivado do estado pró-inflamatório crónico, estes doentes encontram-se sujeitos a um maior risco de desenvolvimento de neoplasias, com principal destaque no cancro colorretal. O tratamento passa pelo uso de imunomodulares e agentes biológicos. Apesar de reduzir a inflamação, a supressão do sistema imunitário pode promover a carcinogénese. Assim, com base numa avaliação endoscópica sistemática, juntamente com a história médica e familiar do doente, foram desenvolvidos programas de vigilância para reduzir a morbilidade e mortalidade associadas ao cancro colorretal. Após uma avaliação retrospetiva e multicêntrica dos últimos 20 anos, foram reunidos os únicos três casos clínicos descritos em Portugal de doentes com um diagnóstico de adenocarcinoma de células em anel de sinete no contexto da doença inflamatória intestinal. Este é um subtipo histológico raro constituído por células mal diferenciadas, com localização preferencial no estômago. O seu diagnóstico é normalmente feito em estadios mais avançados, apresentando uma maior taxa de invasão linfática e peritoneal em comparação com os restantes, conferindo assim um pior prognóstico. O risco de desenvolvimento de neoplasias está diretamente associado à atividade da doença, sendo importante controlar a mesma através de terapêuticas dirigidas e ajustadas, bem como a adesão aos esquemas de vigilância endoscópica. Adicionalmente, estratégias de follow-up direcionadas e técnicas de imagem avançadas, como ressonância magnética e tomografia por emissão de positrões com tomografia computorizada, poderão ser essenciais para o diagnóstico precoce e deteção de metástases.Inflammatory Bowel Disease is a chronic inflammatory condition that encompasses two entities: Crohn's disease and ulcerative colitis. Due to the chronic pro-inflammatory state, these patients are at a higher risk of developing neoplasms, especially colorectal cancer. The treatment involves the use of immunomodulatory and biologic agents. Despite reducing inflammation, suppression of the immune system can promote carcinogenesis. Therefore, based on a systematic endoscopic evaluation, together with the patient's medical and family history, surveillance programs have been developed to reduce the morbidity and mortality associated with colorectal cancer. After a retrospective and multicenter evaluation of the last 20 years, the only three clinical cases described in Portugal of patients diagnosed with signet ring cell adenocarcinoma in the context of inflammatory bowel disease have been assembled. This is a rare histological subtype consisting of poorly differentiated cells, with a preferential location in the stomach. It is usually diagnosed at more advanced stages and has a higher rate of lymphatic and peritoneal invasion compared to the others, thus conferring a worse prognosis. The risk of developing neoplasms is directly associated with disease activity, and it is important to control the disease through targeted and adjusted therapy, as well as adherence to endoscopic surveillance schemes. Additionally, targeted follow-up strategies and advanced imaging techniques, such as magnetic resonance imaging and positron emission tomography with computed tomography, may be essential for early diagnosis and detection of metastases