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Elevação assintomática/paucissintomática de CK em idade pediátrica
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023A elevação assintomática de CK surge tipicamente associada à exposição a medicamentos, exercício físico intenso, trauma e a determinadas doenças sistémicas. No entanto, inúmeras doenças neuromusculares também se podem manifestar com hiperCKemia assintomática. Muitas destas doenças neuromusculares apresentam complicações graves e permanentes, as quais podem ser atenuadas, caso o diagnóstico e consequente tratamento (quando disponível) sejam realizados o mais precocemente possível. Muitos destes casos são pauci ou assintomáticos em idade pediátrica, surgindo os primeiros sintomas numa fase mais tardia da história natural da doença. Contudo, são passíveis de diagnóstico precoce por identificação de hiperCKemia. Na literatura existem alguns algoritmos propostos para o diagnóstico de hiperCKemia assintomática/paucissintomática. Contudo, estes não contemplam a população pediátrica, na qual um diagnóstico precoce poderá alterar o curso natural da doença. Esta Tese propõe o desenvolvimento de um algoritmo de diagnóstico de hiperCKemia assintomática/paucissintomática direcionado para a população pediátrica. Para alcançar este objetivo realizou-se uma revisão retrospetiva dos doentes com hiperCKemia assintomática/paucissintomática na unidade de Neuropediatria do Hospital de Santa Maria entre 2006 e 2020. Analisaram-se os dados demográficos, antecedentes pessoais e familiares, sintomas acompanhantes, valor máximo de CK, exame objetivo na primeira consulta, resultados de EMG, biópsia muscular e testes genéticos, diagnóstico final e follow-up. Os resultados obtidos permitiram estratificar a marcha diagnóstica, com reforço da necessidade de realização de uma anamnese cuidada, com particular atenção à história familiar. Do mesmo modo, a ordem de grandeza da elevação de CK pode ser um auxiliar na definição de hipóteses de diagnóstico. Devem ser realizados exames complementares de diagnóstico, como o EMG e, em casos específicos, a biópsia muscular. Para o estabelecimento de um diagnóstico etiológico, torna-se cada vez mais relevante a realização de testes genéticos.Asymptomatic CK elevation is typically associated with drug exposure, intense physical exercise, trauma, and certain systemic diseases. However, numerous neuromuscular diseases can also manifest with asymptomatic hyperCKemia. Many of these neuromuscular diseases have serious and permanent complications, which can be mitigated if the diagnosis and subsequent treatment (when available) are carried out as early as possible. Many of these cases are pauci or asymptomatic in pediatric age, with the first symptoms appearing later in the natural history of the disease. However, they can be early diagnosed by identifying hyperCKemia. In the literature, there are some proposed algorithms for the diagnosis of asymptomatic/paucisymptomatic hyperCKemia. However, these do not include the pediatric population, in which an early diagnosis may change the natural course of the disease. This Thesis proposes the development of a diagnostic algorithm for asymptomatic/paucisymptomatic hyperCKemia directed to the pediatric population. To achieve this objective, a retrospective study of patients with asymptomatic/paucisymptomatic hyperCKemia in the Neuropediatrics unit of the Hospital de Santa Maria between 2006 and 2020 was carried out. The study includes demographic data, personal and family history, accompanying symptoms, maximum value of CK, objective examination at the first visit, EMG results, muscle biopsy and genetic testing, final diagnosis and follow-up. The obtained results made the stratification of the diagnostic process possible, while reinforcing the need to carry out a careful anamnesis, with particular attention to family history. Likewise, the CK elevation order of magnitude can be an aid in defining diagnostic hypotheses. Complementary diagnostic exams should be performed, such as the EMG and, in specific cases, muscle biopsy. For the establishment of a diagnosis, it becomes increasingly relevant to carry out genetic tests
The role of adapter protein SHC-1 in epithelial chloride transport and cell proliferation
No full textTese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO gene CFTR (cystic transmenbrane conductance regulator) codifica um canal de cloreto e
bicarbonato, presente na membrana apical de células epiteliais. A abundância e função desta
glicoproteína é fisiologicamente determinante. Além de promover o equilíbrio iónico nas secreções
epiteliais, é essencial para a eliminação de agentes patogénicos, proteção epitelial contra xenobióticos e
produtos tóxicos libertados por agentes patogénicos, regulação do pH luminal e pela manutenção da
hidratação da superfície epitelial. Deficiências na sua função, causadas por mutações no gene CFTR,
estão na base do desenvolvimento da doença autossómica recessiva fibrose quística (CF). Contudo, o
défice funcional de CFTR também pode ser adquirido num contexto genético selvagem, pela ação de
fatores externos, como a exposição ao fumo do tabaco, álcool, metais pesados, hipoxia e acidose locais,
toxinas bacterianas, stress oxidativo e inflamação capazes de comprometer a função ou abundância do
canal na superfície celular e promover o desenvolvimento de doenças como a doença pulmonar
obstrutiva crónica (COPD), asma, pancreatite aguda e a cólera.
Esta glicoproteína é constituída por dois domínios transmembranares (TMD1 e TMD2), dois domínios
citoplasmáticos de ligação a nucleótidos (NBD1 e NBD2) e um domínio regulatório central (domínio
R). A sua atividade é regulada pela fosforilação do domínio R, que induz a ligação de ATP aos domínios
NBD, promovendo a abertura do canal iónico. A síntese da proteína CFTR envolve a translocação da
cadeia polipeptídica, proveniente do ribossoma, através da membrana do retículo endoplasmático (ER).
Quando esta se encontra no lúmen do ER sofre uma N-glicosilação, que distingue a sua forma imatura
com ~150 kDa, designada banda B, em ensaios de Western blot (WB). A CFTR segue o caminho da via
secretora desde o ER até ao complexo de Golgi, onde é processada por várias glicosiltransferases (GTFs)
de forma a atingir a sua forma madura, com 170-180 kDa, identificada como banda C. Ao atingir a
forma madura é armazenada em vesiculas trans-Golgi que promovem a inserção do canal na membrana
plasmática (PM). A deslocação destas vesiculas até à PM ocorre através das fibras do citoesqueleto de
actina e é facilitada pela miosina Vb (Myo5b), que é recrutada pela GTPase, Rab11. Este transporte até
à PM requer a ligação do domínio C-terminal da CFTR com o domínio PDZ da proteína adaptadora
NHERF-1 formando um complexo. Quando este complexo é inserido na PM, a adaptadora NHERF-1
interage com a proteína de ancoragem ao citoesqueleto, ezrina, que permite a retenção da CFTR na
superfície celular, impedindo a sua endocitose. A endocitose e consequente remoção da CFTR da PM é
mediada pela proteína clatrina, e é desencadeada após dissociação do complexo CFTR/NHERF1/ezrina. Sabia-se que a sinalização a jusante da via de proteínas cinase mitogénicas (MAPK) estava
envolvida no processo de internalização da CFTR, no entanto, os mecanismos regulatórios que
promovem a remoção desta proteína da PM não estavam claros.
Em estudos anteriores, o laboratório de acolhimento descreveu um mecanismo em que a quantidade e
prevalência de CFTR na PM de células epiteliais brônquicas é regulada através da via de sinalização
SYK/SHC-1. Este mecanismo é desencadeado pela fosforilação da CFTR, ancorada na PM, no resíduo
de tirosina 512 (Y512), pela tirosina cinase citoplasmática SYK. A fosforilação da CFTR permite o
recrutamento e ligação da proteína adaptadora citosólica SHC-1, através do domínio PTB desta última.
A proteína SHC-1 possui também um domínio SH2 que a direciona a interagir com recetores
fosforilados na PM. Ao interagir com os recetores na PM, a SHC-1 recruta outras proteínas adaptadoras
citoplasmáticas, como proteínas da família GRB, e fatores de troca de nucleótidos de guanina (GEFs)
da família SOS, por exemplo. Estes GEFs ativam GTPases da família RAS na PM que, por sua vez,
ativam cascatas de sinalização, como a via MAPK. Assim, a proteína SHC-1 funciona como um ponto
de ligação entre o sinal para a internalização, fornecido pela fosforilação da CFTR pela SYK, e a
maquinaria a jusante da via MAPK que promove a remoção do canal da PM, via endocitose mediada
pela clatrina. Recentemente, um grupo de investigação da Universidade de Davis (Califórnia, EUA),
com o qual o laboratório de acolhimento tem uma colaboração, determinou que o fármaco idebenone (IDE), bem como alguns compostos seus derivados, conseguiam bloquear a interação da SHC-1 com o
recetor da insulina (IR) em hepatócitos, interação esta também mediada pelo domínio PTB da SHC-1.
Com base nestes dados, postulámos que talvez fosse possível utilizar estes compostos para interferir
com a interação da SHC-1 (via domínio PTB) com a CFTR fosforilada pela SYK no resíduo Y512,
impedindo assim a sua internalização em células epiteliais brônquicas. Nos estudos em hepatócitos, o
tratamento com IDE inibia também a sinalização da via MAPK a jusante do IR, o que a verificar-se nas
células epiteliais brônquicas poderia também contribuir para reduzir a internalização da CFTR
fosforilada. No entanto, é sabido que esta via de sinalização desempenha um papel fundamental no
processo de renovação celular necessário à manutenção da integridade e função do epitélio respiratório.
Assim, quisemos também avaliar o grau de compromisso da viabilidade celular que o tratamento com
estes fármacos acarretaria.
Deste modo, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia dos inibidores recentemente
desenvolvidos para a proteína adaptadora SHC-1 na modulação da prevalência de CFTR na PM. Além
disso, procurámos compreender o impacto destes inibidores na via de sinalização das MAPK e na
viabilidade das células epiteliais. A hipótese central deste estudo postula que os inibidores da SHC-1,
nomeadamente o IDE e seus derivados, poderiam modular seletivamente a interação SHC-1/pY512-
CFTR e consequentemente reduzir a internalização da CFTR na PM sem comprometer a viabilidade
celular. Começámos por avaliar a capacidade dos inibidores, IDE e composto C#3, em elevar os níveis
de CFTR na PM através da técnica de biotinilação, que permitiu a marcação seletiva da proteína CFTR
presente na superfície celular com uma molécula de biotina após o tratamento com os inibidores, e
posteriormente, a sua extração com streptavidin e análise através de WB. Os níveis de fosforilação da
proteína ERK (p-ERK) também foram analisados por WB após tratamento com os inibidores, uma vez
que são um indicador chave da ativação da via de sinalização MAPK. Seguidamente, realizámos ensaios
de MTT para analisar a viabilidade celular nas três linhas celulares em estudo.
Ao avaliar a presença de CFTR na membrana verificámos que nas três linhas celulares que utilizámos
como modelos experimentais, CFBE-CFTR, 16HBE e Caco-2, nenhum dos inibidores, IDE e composto
C#3, conseguiram bloquear de forma seletiva e significativa a internalização do canal. Este resultado
sugere que o efeito do IDE pode ser somente específico para a interação entre a SHC-1 e o domínio
NPEY fosforilado do IR, não afetando a interação da SHC-1 com outras proteínas fosforiladas, como a
CFTR. Um outro resultado que apoia a especificidade dos inibidores para a interação SHC-1/IR e a
incapacidade de modular a via de sinalização das MAPK, é a ausência de efeito significativo de ambos
os inibidores nos níveis de p-ERK. A incapacidade de ambos os inibidores em modular eficazmente a
via de sinalização das MAPK é ainda destacada pelo impacto reduzido na viabilidade das três linhas
celulares em estudo, revelado pelo MTT. Notavelmente, o tratamento com IDE à concentração de 10
µM induziu uma redução significativa na viabilidade às 24 h especificamente nas células CFBE-CFTR,
o que não foi replicado pelo composto C#3 em nenhuma concentração ou tempo. A comparação deste
efeito com o do selumetinib e com os níveis de p-ERK1/2, sugere uma especificidade desta linha celular
e da dose, possivelmente resultante do processo clonal de seleção, para o efeito do IDE. Além disso, nas
células 16HBE, o composto C#3 pareceu aumentar ligeiramente os níveis de p-ERK nas concentrações
mais baixas do fármaco. Esta observação está de acordo com a literatura, que sugere que as respostas ao
tratamento com IDE e os seus derivados podem variar em diferentes contextos celulares.
Em suma, o conjunto dos nossos resultados não apoiam a nossa hipótese inicial, levantando questões
sobre a adequação do IDE e do composto C#3 como inibidores da SHC-1 fora do contexto da interação
SHC-1/IR nos hepatócitos. Uma perspetiva futura seria desenvolver uma metodologia de triagem
semelhante à utilizada por Tomilov et al. (2018), utilizando péptidos específicos para CFTR para revelar
compostos capazes de interferir seletivamente com a interação SHC-1/pY512-CFTR, e
consequentemente promover o aumento da prevalência do canal na PM. Esta abordagem permitiria ainda
compreender os possíveis efeitos destes compostos no tratamento de doenças, em que tanto a função da CFTR como a via de sinalização MAPK estão desreguladas, e minimizá-los, permitindo o
desenvolvimento de terapias mais específicas e eficazes.The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene encodes a chloride and
bicarbonate channel crucial for maintaining ionic balance in the plasma membrane (PM) of epithelial
cells. CFTR deficiency hinders the ion balance and, consequently the properties of epithelial secretions
in the lung, pancreas, and colon. Its deficiency can result from genetic mutations, causing the hereditary
disease cystic fibrosis (CF), or be induced, in a wild type CFTR background, by external factors such as
tobacco smoke, oxidative stress and inflammation, contributing to the etiology of diseases such as
asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD).
Previously, the host lab characterized a mechanism by which CFTR phosphorylation on Y512 by
spleen tyrosine kinase (SYK) triggers its internalization from the PM. The group identified SHC-1, an
intracellular adaptor protein regulating mitogenic protein kinase (MAPK) signaling cascades, as a key
mediator of pY512-CFTR internalization. Recently, idebenone (IDE) and its derivative compound C#3,
were described to block MAPK signaling by interfering with SHC-1 interaction with phosphorylated
insulin receptor (IR) in hepatocytes.
In this thesis, we investigated if these compounds could be used to block SHC-1/pY512-CFTR
interaction and prevent the channel’s internalization. We found that in contrast to RNAi-mediated SHC1 depletion, treatment with these inhibitors did not selectively nor significantly block CFTR
internalization in three different epithelial cell lines, CFBE-CFTR, 16HBE and Caco-2. Furthermore,
both inhibitors failed to significantly reduce MAPK pathway activity or consistently affect the viability
of any of the three cell lines studied. This indicates that the inhibitors’ effects are specific for the SHC1/IR interaction and cannot be used to block other SHC-1 interactions, namely the SHC-1/pY512-CFTR
or SHC-1/MAPK in cells other than hepatocytes. Further studies will be required to identify molecules
specifically interfering with the SHC-1/pY512-CFTR interaction, allowing the development of new
therapeutic options for diseases like COPD and asthma
The gut microbiome in health and disease: exploring the gut-brain connection in depression and anxiety
No full textTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O microbioma intestinal é uma comunidade complexa e diversificada de microrganismos constituída por cerca de 100 triliões de células. A composição do microbioma varia de forma única entre indivíduos e é determinada por uma mistura de fatores genéticos e ambientais, tais como padrões alimentares, exposição a medicamentos e níveis de stress. A microbiota intestinal tem um papel fundamental no hospedeiro, nomeadamente no metabolismo de nutrientes, na modulação do sistema imunitário, na proteção contra agentes patogénicos e na manutenção da integridade do epitélio intestinal.
Várias doenças estão associadas ao bem-estar do sistema gastrointestinal, incluindo perturbações na saúde mental, que se tornaram um problema mundial de saúde pública. Em 2019, estimou-se que 970 milhões de pessoas em todo o mundo sofressem de doenças mentais, no entanto, devido à pandemia COVID-19 estes números têm aumentado. A ansiedade e a depressão estão entre as doenças psiquiátricas mais prevalentes, afetando significativamente o dia-a-dia dos doentes. Além disso, pessoas que sofrem com doenças do foro psicológico normalmente têm comorbidades de saúde intestinal associadas, como por exemplo, obesidade, diabetes tipo 2 e síndrome do intestino irritável.
A relação entre o intestino e o cérebro pode ser atribuída ao eixo intestino-cérebro. Este trata-se de um sistema de comunicação bidirecional, que liga os centros emocionais e cognitivos do cérebro às funções intestinais periféricas. A comunicação entre o trato gastrointestinal e o sistema nervoso central faz-se sobretudo através das vias de sinalização imunitárias, neuronais, endócrinas e metabólicas.
O desequilíbrio da flora intestinal, denominado de disbiose intestinal, está associado ao desenvolvimento e progressão de doenças mentais, por influenciar o eixo intestino-cérebro. Dada a associação entre o eixo intestino-cérebro e o desequilíbrio observado na microbiota intestinal em pessoas com depressão e ansiedade, a manipulação do microbioma intestinal pode ser uma valiosa estratégia de tratamento. A microbiota intestinal pode ser modificada através da utilização de psicobióticos, intervenções dietéticas ou transplante microbiano fecal. Ainda assim, os dados disponíveis que apoiam a utilização de terapias baseadas no microbioma para as doenças mentais são atualmente insuficientes, sendo necessários estudos adicionais para determinar a sua eficácia e os mecanismos subjacentes.The gut microbiome is a complex and diverse community of microorganisms consisting of around 100 trillion cells. The microbiome composition varies uniquely across individuals and is determined by a mix of genetic and environmental factors, such as dietary patterns, drug exposure, and stress levels. The gut microbiota has a distinct role in the host's nutrient metabolism, immunomodulation, protection against pathogens, and maintenance of the structural integrity of the intestinal epithelium.
Several diseases have been linked to the gastrointestinal system's well-being, including mental health disorders, which have become a major problem in global public health. In 2019, it was expected that 970 million people around the world would be living with mental illnesses, although a rise in these conditions has been linked to the COVID-19 pandemic. Anxiety and depression are among the most prevalent psychiatric conditions, significantly affecting patients’ daily lives. Furthermore, people suffering from these conditions may encounter comorbidities associated with the gut’s health, including obesity, type 2 diabetes, and irritable bowel syndrome.
The relation between the gut’s health and the brain’s health can be traced to the gut-brain axis. It is two-way communication system, linking the emotional and cognitive centers of the brain with peripheral intestinal functions. Communication between the gastrointestinal tract and the central nervous system mostly takes place via the immune-related, neuronal, endocrine, and metabolic signaling pathways.
Gut dysbiosis, which refers to alterations in gut microbiota, is linked to the development and progression of mental diseases by influencing the gut-brain axis. Given the association between the gut-brain axis and the observed imbalance of gut microbiota in people with depression and anxiety, the manipulation of the gut microbiome might be a valuable treatment strategy. Gut microbiota can be modified by using psychobiotics, dietary interventions, or fecal microbial transplantation. Even so, the available data supporting the use of microbiome-based therapies for mental illnesses is currently insufficient. Additional research is required to determine their efficacy and underlying mechanisms
Contribution of CCBE1 to the mouse coronary vasculature development
No full textTese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento , 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasThe collagen- and calcium-binding EGF domains 1 (CCBE1) is an extracellular matrix protein
first known for its essential role in lymphatic vasculature and recently described as an important protein
in cardiovascular development. Accordingly, experiments in our lab using the Ccbe1tm1Lex mouse line
showed that Ccbe1 loss-of-function led to poor development of subepicardial and intramyocardial
vessels, delayed coronary artery (CA) stem formation and thinner ventricular myocardium as well. In
addition, Ccbe1 mutants died at E14.5 with lymphedema, which confirms the CCBE1 role in
lymphangiogenesis. Hence, whether CCBE1 affects all kind of vessels and the extent of that effect in
later stages of heart development remains unknown.
To overcome the premature death produced by the systemic KO (Ccbe1tm1Lex), a Ccbe1flE1/flE1
line (which has the exon 1 of the Ccbe1 gene flanked by two LoxP sites) was generated in our lab. As a
first approach to study the role of CCBE1 solely in heart development, here, we crossed the Ccbe1flE1/flE1
line with a Nkx2-5
cre line as a driver to selectively have the Ccbe1 loss-of-function in the heart, as this
crossing enables the recombination of the floxed Ccbe1 (exon 1) allele in Nkx2-5-derived tissue.
Ccbe1 conditional-KO mice (Nkx2-5
cre;Ccbe1flE1/−) recapitulated the systemic KO phenotype
described above, until E13.5. In the present thesis we show evidence that the sinus venosus-derived
coronary vessels program remains disrupted at later stages of heart development (E14.5 and E16.5),
along with delayed and mispatterned CA stems formation. Moreover, preliminary results for the
endocardium-derived coronary vessels suggest that the intramyocardial subset is being affected in the
absence of CCBE1 as well. Overall, these results propose a broader role for the CCBE1 protein in the
coronary vasculature development, independently of the coronary endothelial cells (ECs) origin
Maintenance therapy after an episode of steroid-responsive acute severe ulcerative colitis : what is the best strategy?
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023Introdução A Colite Ulcerosa é uma doença inflamatória intestinal crónica, que se caracteriza por períodos de agudização alternados com remissão. Em até 20% dos casos, podese desenvolver um quadro de colite ulcerosa (CU) grave. A melhor terapêutica de manutenção após um episódio de CU grave com resposta aos corticoides permanece por esclarecer. O nosso objetivo foi comparar a evolução clínica dos doentes tratados com diferentes regimes terapêuticos, após um internamento por CU grave. Métodos Estudo de coorte unicêntrico retrospetivo que incluiu todos os doentes internados por colite ulcerosa aguda grave, entre 2014-2022, e que responderam a corticoides, segundo os Critérios de Oxford. Os eventos a curto (1ano) prazo após internamento foram analisados. Para análise, foi considerado um ‘outcome’ composto definido por extensão proximal da doença, necessidade de escalar terapêutica, novo internamento ou colectomia. Resultados e Discussão Foram incluídos 32 doentes. No total, 28% dos doentes tiveram alta com 5- ASA/imunomodulador (IMM) e 72% com um agente biológico (infliximab, vedolizumab, golimumab). Durante o seguimento, 28% dos doentes precisaram de um novo curso de corticóides e 22% de escalar terapêutica, 4% apresentaram extensão proximal da doença, 13% um novo internamento e 3% de colectomia. Relativamente ao outcome composto, 47% desenvolveram pelo menos um evento a curto prazo e 31% a longo prazo. Não se verificaram diferenças nas taxas de eventos durante o primeiro ano de seguimento (48% vs 44%, p=0,863). Contudo, os doentes tratados com biológicos apresentaram uma tendência para um menor número de eventos a longo prazo (56% vs 22%, p=0,064). Conclusão Nesta coorte, os doentes tratados com biológico apresentaram uma tendência para um menor número de eventos a longo prazo, quando comparados com os doentes que foram tratados com 5-ASA ou IMM, sugerindo que uma terapêutica mais agressiva possa ser mais adequada neste contexto.Introduction Ulcerative Colitis (UC) is a chronic inflammatory bowel disease, characterized by periods of acute flares alternating with periods of remission. Up to 20% of UC patients can develop an acute severe ulcerative colitis (ASUC) episode. The best maintenance therapy after steroid-responsive acute severe ulcerative colitis (ASUC) is still controversial. Our goal was to compare the outcomes of starting different treatment regimens in patients with steroid-responsive ASUC. Methods Retrospective unicentric cohort study including all patients hospitalized with ASUC, between 2014-2022, who responded to steroids according to Oxford Criteria. Short (1year) outcomes after ASUC hospitalization were assessed. The primary composite outcome was defined by proximal disease extension, therapy escalation, new hospitalization or colectomy. Results and Discussion 32 steroid-responsive patients were included. Overall, 28% of patients were discharged with 5-ASA/immunomodulator (IMM) and 72% with biologics (infliximab, vedolizumab, golimumab). During long-term follow-up, 28% of patients needed a new course of steroids and 22% therapy escalation, 4% presented proximal disease extension, 13% required a new hospitalization and 3% underwent colectomy. Regarding the composite outcomes, 47% had at least one adverse event in shortterm and 31% in long-term follow-up. No differences were found between the two groups in short-term outcomes (48 vs 44%, p=0,863). In long-term-outcomes, patients treated with biologics had a lower rate of events (56% vs 22%, p=0,064). Conclusion In our cohort, patients treated with biologics presented a trend towards a lower rate of events in the long-term, when compared to the patients treated with 5-ASA or IMM, suggesting that a more aggressive therapy could be more appropriate in this setting
Lobectomy and isthmectomy vs total thyroidectomy : an analysis of a high-volume portuguese oncologic centre
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023Introdução: O cancro da tiróide é uma neoplasia relativamente comum, com diagnóstico através do exame objetivo, achados laboratoriais, ecográficos, e por citologia aspirativa por agulha fina. O seu tratamento é maioritariamente cirúrgico, inerente ao qual existem complicações, que variam com a experiência do cirurgião e o tipo de cirurgia.
Objetivo: Comparar os resultados cirúrgicos de doentes submetidos a tiroidectomia total com doentes submetidos a lobectomia mais istmectomia, de forma a obter melhores indicações operatórias.
Metodologia: Foi feito um estudo observacional retrospetivo através da consulta de processos clínicos de doentes com doença tiroideia maligna ou suspeita de malignidade e que tiveram indicação cirúrgica para tiroidectomia total ou lobectomia mais istmectomia, entre Janeiro de 2017 e Dezembro de 2022. Foram colhidos dados relativos ao diagnóstico, ecografia, citologia aspirativa por agulha fina, complicações cirúrgicas e seguimento. Estes dados foram posteriormente analisados estatisticamente.
Resultados: Este estudo incluiu 274 doentes, de um total de 502, posteriormente divididos em dois grupos, um grupo de tiroidectomia total (Grupo I, n=182) e um grupo de lobectomia mais istmectomia (Grupo II, n=92). No grupo I tivemos uma taxa de complicações pós-operatórias de 69,2%, mas apenas 3 (1,6%) doentes foram reintervencionados, enquanto no grupo II tivemos uma taxa de complicações pós-operatórias de apenas 14,1%, mas um total de 14 (15,2%) doentes foram reintervencionados.
Conclusão: A tiroidectomia total, embora apresente uma taxa de recidiva menor, tem uma morbilidade maior que a lobectomia mais istmectomia. No entanto, a esta última devem ser acrescentadas as complicações da reintervenção, de forma a estas serem interpretadas de forma integral. Graças a alguns marcadores identificados, os cirurgiões podem agora ter uma orientação adicional quando propuserem os seus doentes a uma destas cirurgias.Introduction: Thyroid cancer is a somewhat common type of neoplasm, diagnosed via physical exam, laboratory findings, ultrasound imaging, and with fine needle aspiration cytology. It has a mostly surgical treatment, inherent to which there are complications, that vary according to surgeons’ experience and type of surgery.
Aim: To compare surgical outcomes of patients submitted to total thyroidectomy with patients submitted to lobectomy plus isthmectomy, in order to achieve better operative indications.
Methods: A retrospective observational study was done by reviewing the clinical processes of patients with malignant thyroid disease or suspicion of malignancy that had a surgical indication of total thyroidectomy or lobectomy plus isthmectomy, between January of 2017 and December of 2022. Data regarding diagnosis, ultrasound, fine needle aspiration cytology, surgical complications and follow-up was collected and then statistically analysed.
Results: A population of 274 patients, from a total of 502, was gathered and then split into two groups, a total thyroidectomy group (Group I, n=182), and a lobectomy plus isthmectomy group (Group II, n=92). On group I we had a post-operative complication rate of 69,2%, but only 3 (1,6%) reintervened patients, whilst on group II we had a post-operative complication rate of just 14,1%, but a total of 14 (15,2%) reintervened patients.
Conclusion: Total thyroidectomy, while having a lower recurrence rate, has a higher morbidity than lobectomy plus isthmectomy. To the latter, however, reintervention complications must be added in order to fully understand the differences. Thanks to some identified markers, surgeons might now have an additional guidance when proposing their patients to one of these surgeries
Dissecting the role of peripheral glia in neuronal development, plasticity and after injury in Drosophila
No full textTese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO sistema nervoso periférico humano (SNP) é composto por nervos cranianos e espinhais que contêm os
axónios dos neurónios sensoriais e motores, e são responsáveis pela inervação da musculatura e dos órgãos
de todo o corpo, assim como pelo processamento de estímulos sensoriais da periferia para o cérebro. Para tal,
o SNP depende da relação interdependente entre neurónios e células da glia, embora os mecanismos celulares
e moleculares subjacentes a essas interações dinâmicas na periferia ainda não tenham sido totalmente
desvendados.
Este trabalho tem como objetivo a obtenção de conhecimento básico sobre a influência da glia periférica na
plasticidade e regeneração de neurónios motores e sensoriais. Como a complexidade do sistema nervoso de
mamíferos apresenta diversos desafios para o estudo do SNP, desenvolvemos este trabalho na mosca-da-fruta
Drosophila melanogaster, um modelo invertebrado mais simples. Ao longo das últimas décadas, este
organismo tem sido fundamental para o estudo de diversos processos moleculares e celulares, uma vez que
65% dos genes que causam doenças em humanos têm um homólogo funcional na Drosophila.
As células da glia periférica da Drosophila têm origem em progenitores do sistema nervoso central (SNC) e
migram ao longo de projeções axonais de neurónios motores e sensoriais para as suas posições na periferia.
À semelhança dos vertebrados, em Drosophila, as células da glia são cruciais para o estabelecimento da
barreira hematoencefálica, isolamento neuronal e para a orientação do cone de crescimento de neurónios
sensoriais e motores durante o desenvolvimento do SNP. Presentemente, existem três tipos de glia definidos
morfologicamente no SNP da Drosophila – wrapping glia (exclusivas da periferia), subperineurial glia e
perineurial glia (ambas comuns ao CNS e ao SNP). A identificação de vários elementos promotores e
marcadores moleculares possibilita a identificação e manipulação dos vários tipos de glia em Drosophila,
permitindo dissecar funções da glia no contexto do desenvolvimento, plasticidade e regeneração neuronal no
SNP.
Durante o desenvolvimento, a morfologia e função dos neurónios são geneticamente programadas, contudo
podem ser remodeladas em resposta a alterações nos níveis de atividade, um processo denominado
plasticidade. Contudo, os mecanismos de plasticidade, nomeadamente em relação à contribuição da glia,
ainda não são totalmente conhecidos. Um dos modelos usados para estudar a plasticidade sináptica e neuronal
é a junção neuromuscular da Drosophila, uma sinapse química formada entre um neurónio motor e as fibras
musculares. Semelhante às sinapses centrais de vertebrados, a junção neuromuscular da Drosophila é
composta por dois compartimentos, um pré-sináptico e um pós-sináptico. Os terminais pré-sinápticos dos
neurónios são constituídos por varicosidades redondas chamadas botões sinápticos, onde a transmissão
nervosa ocorre. Estas estruturas são altamente dinâmicas e estruturalmente plásticas, alterando o seu tamanho
e número em resposta a modificações na atividade. Os botões sinápticos recém-formados não possuem
maquinaria de transmissão pós-sináptica e designam-se por ghost boutons, podendo a rápida adição de botões
pré-sinápticos ser induzida em resposta a determinados padrões de atividade utilizando uma variedade de
estímulos (solução com K+ elevado, atividade elétrica e optogenética).
Este trabalho tem como um de seus propósitos conhecer a influência dos vários subtipos de glia na
plasticidade de neurónios motores. Para tal, expressámos especificamente um gene regulador de apoptose
especificamente nos diferentes subtipos de glia e induzimos plasticidade estrutural aguda na junção
neuromuscular no terceiro estádio larvar da Drosophila, utilizando um protocolo de despolarização espaçada
usando uma solução com K+ elevado. A observação de novos botões foi efetuada através de microscopia
confocal em amostras fixadas de forma a extrair informação quantitativa.
Os resultados sugerem que não existem diferenças estatísticas significativas no número de ghost boutons na
junção neuromuscular dos músculos 6/7 da larva quando a wrapping glia é geneticamente removida desde a
embriogénese do organismo em comparação com larvas selvagens/wild type. Isto sugere que a ausência da
wrapping glia desde as fases mais precoces de desenvolvimento não impacta o normal desenvolvimento e plasticidade estrutural dos neurónios motores. Por outro lado, ao replicarmos o mesmo protocolo de apoptose
geneticamente induzida da subperineurial glia, descobrimos que as larvas não sobrevivem quando
removemos este subtipo de glia durante o desenvolvimento inicial. Estas observações demonstram o papel
fulcral da subperineurial glia no desenvolvimento. Ao induzirmos a morte celular mais tarde no
desenvolvimento, no início do terceiro estádio larvar, as larvas sobrevivem, permitindo a análise da
plasticidade estrutural. Verificámos que a ausência de subperineurial glia também não leva a uma alteração
significativa no número de ghost boutons na junção neuromuscular. Assim, os nossos resultados sugerem
que tanto as wrapping glia como as subperineurial glia não influenciam a plasticidade dos neurónios
motores.
Outro dos objetivos principais deste trabalho consiste na elucidação da influência da glia na regeneração
neuronal. Na pele, os neurónios sensoriais estão em contacto com a epiderme para assegurar a transmissão
de sensações mecânicas, térmicas e de dor. Estes neurónios encontram-se cobertos por células da glia,
responsáveis por lhes fornecer suporte nutricional e estrutural. Quando acontece uma lesão na epiderme, as
células epiteliais, os neurónios sensoriais e a glia têm de trabalhar colaborativamente para restabelecer a
inervação do tecido. Contudo, os mecanismos usados pela glia para regular a reparação de tecidos
permanecem, na sua maioria, desconhecidos. Adicionalmente, não é claro se as células da glia são capazes
de regenerar após uma lesão. Os Class IV dendritic arborisation neurons (c4da) são neurónios sensoriais do
SNP da Drosophila que cobrem a totalidade da superfície da larva, contactando diretamente a epiderme e
constituindo os nociceptores primários da larva. Vários grupos já reportaram que os neurónios c4da têm uma
capacidade robusta de regeneração dendrítica após uma lesão, assim como de recuperação da capacidade de
resposta a estímulos mecânicos do meio exterior. Os somas destes neurónios são cobertos por células da glia
e as suas dendrites contactam diretamente a epiderme da larva.
O trabalho previamente realizado no nosso laboratório estabeleceu um ponto de partida para o uso da
epiderme larvar da Drosophila como um modelo para explorar a dinâmica entre a epiderme e o sistema
nervoso sensorial, assim como as funções desempenhadas por cada intermediário in vivo. Deste modo, aqui,
pretendemos explorar a dinâmica da regeneração neuronal e da glia, induzindo lesões que afetam
simultaneamente a epiderme, neurónio e glia da larva. Deste modo procurámos determinar se uma lesão na
glia poderá afetar a capacidade regenerativa do neurónio sensorial adjacente, assim como se a glia recupera
após esta lesão.
Os resultados preliminares sugerem que quando a lesão atinge a glia, as dendrites lesionadas não regeneraram
tão robustamente em comparação com as larvas nas quais a lesão atinge apenas as dendrites e a epiderme,
mas deixando a glia intacta. Observámos ainda que as ramificações da glia não regeneram após uma lesão
direta na pele da larva, pelo menos até 48 h após a indução da ferida.
Em trabalhos futuros seria crucial confirmar os resultados aqui apresentados aumentando o tamanho da
amostra, assim como delinear metodologias experimentais que permitam adicionalmente a exploração dos
mecanismos moleculares e vias de sinalização que participam na comunicação glia-neurónio durante os
processos de plasticidade e regeneração neuronal. Seria também pertinente investigar especificamente as
funções da perineurial glia, não contemplada neste trabalho, provavelmente o subtipo de glia da Drosophila
de que menos se sabe.
A investigação de processos celulares em modelos como a Drosophila é fundamental para aprofundar o
conhecimento da biologia da glia e as suas interações com os neurónios, que por sua vez contribuirá para
aprimorar o conhecimento relativo ao desenvolvimento e funções desempenhadas pelo sistema nervoso
humano.Glial cells are crucial for the development and homeostasis of the nervous system, and although we
know increasingly more about their roles, several questions remain unanswered. There is still a lot of
uncharted territory regarding the functions of different glial types, the molecular and cellular
mechanisms underlying glia-neuron interactions, as well as in glial cell plasticity and its impact on
neuronal function and regeneration.
Here, our goal is to unravel the functional significance of peripheral glia in neuronal repair and structural
plasticity. We studied the interactions between neurons and glia in two different contexts of Drosophila
melanogaster’s peripheral nervous system – the neuromuscular junction and the sensory nervous system
of the larval skin. Through this genetically tractable model, we monitored and manipulated cellular
behaviour during development and after injury in vivo.
First, to study the role of glia in structural plasticity, we developed a genetically encoded system that
allows ablation of specific glial subtypes at different timepoints of Drosophila development. We show
that subperineurial glia are required for larval development and survival. Only when we ablated
subperineurial glia from early third larval stage, some animals survived. Moreover, through ablation of
wrapping glia, we demonstrated that this glia subtype does not appear to cause significant defects in
structural plasticity.
Regarding sensory nerves, our preliminary findings suggest that sensory neurons do not seem to
regenerate as efficiently when glia are wounded, in comparison to when glia are not affected by the
wound. This points to a relevant role of glia in sensory neuron dendrite regeneration. Furthermore, glia
did not recover their morphology after simultaneous injury of the epithelium, proximal sensory neuron’s
dendrites, and glia branches, suggesting that peripheral glial cells are not able regenerate, or regenerate
slower.
Our findings hint that glia can influence the regeneration of sensory neurons. In contrast, neither
subperineurial nor wrapping glia seem to abolish structural plasticity at the NMJ, although
subperineurial glia seems to be essential for larval development. This works highlights the complex and
diverse roles of peripheral glia during neuronal development and repair, providing an additional
steppingstone to uncover conserved processes in vertebrates
Vigilância do neurodesenvolvimento nos cuidados de saúde primários
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023Introdução: O neurodesenvolvimento da criança é um processo contínuo de diferenciação de diversas competências, permitindo à mesma a realização de tarefas progressivamente mais complexas e a interação cada vez mais hábil com o meio. Assim, apesar de ser condicionado por inúmeros fatores e de depender da individualidade de cada criança, trata-se de um processo que é transversal a todas as culturas. Dada a relevância deste tema e tendo em conta que, em Portugal, as crianças são preferencialmente acompanhadas pela Medicina Geral e Familiar, é fundamental que os médicos especialistas desta área tenham noções claras acerca dos aspetos que caracterizam o neurodesenvolvimento normal e estejam atentos a sinais de alarme que indiquem que este não se está a processar de modo adequado, a fim de que a deteção precoce destas situações possa possibilitar uma intervenção atempada e eficaz.
Objetivos: Assim, pretende-se caracterizar os fatores de risco para que uma criança apresente alterações no seu neurodesenvolvimento; analisar a forma como é efetuada a sua vigilância e acompanhamento nos Cuidados de Saúde Primários; sumarizar as principais aquisições de cada etapa deste processo; descrever os sinais indicativos de que este decorre de modo anormal, considerando também a existência de variantes da normalidade; indicar ferramentas úteis nesta avaliação e assinalar alguns pontos chave que o médico deverá ter em conta no diagnóstico e orientação destes casos.
Métodos: Esta revisão narrativa basear-se-á na pesquisa de publicações submetidas entre 2009 e 2023, em inglês e português, em várias plataformas digitais, tais como PubMed, ResearchGate, UpToDate, Ata Médica Portuguesa e Revista Portuguesa de Medicina Geral e Familiar, e na consulta de Guidelines e Normas de Orientação Clínica. Conclusões: O médico de família tem um papel crucial na vigilância do neurodesenvolvimento, devendo possuir uma formação sólida nesta área e manter-se a par das orientações e recomendações que vão sendo divulgadas neste âmbito.Introduction: The child's neurodevelopment is a continuous process of differentiating multiple skills, allowing the child to carry out progressively more complex tasks and to interact more and more skilfully with the environment. Thus, despite being conditioned by numerous factors and depending on the individuality of each child, it is a process that is transversal to all cultures. Given the relevance of this issue and taking into account that, in Portugal, children are preferably followed in Primary Health Care, it is essential that those doctors have clear notions about the aspects that characterize normal neurodevelopment and are watchful to possible alarm signs that indicate that this is not being processed properly, so that the early detection of these situations can enable a timely and effective intervention.
Objectives: This work aims to characterize the risk factors for a child to present changes in their development; describe the way in which its surveillance and follow-up is carried out in Primary Health Care; summarize the main acquisitions of each stage of this process and list some of the alarm signs, also considering the existence of variants of normality; indicate useful tools in the evaluation of neurodevelopment and point out some key points that a doctor should take into account in the diagnosis and guidance of these cases.
Methods: This narrative review will be based on research of publications submitted between 2009 and 2023, in English and Portuguese, on digital platforms, such as PubMed, ResearchGate, UpToDate, Ata Médica Portuguesa and Revista Portuguesa de Medicina Geral e Familiar, and in the reading of Guidelines and Clinical Guidance Norms.
Conclusions: The family doctor plays a crucial role in monitoring neurodevelopment, and must have solid training in this area and keep abreast of the guidelines and recommendations that are disseminated in this area
Limites subjetivos da cláusula compromissória estatutária : um estudo de direito português
No full textA dissertação tem o objetivo de demonstrar a tese da vinculação dos sócios e dos titulares dos órgãos sociais à cláusula compromissória presente nos estatutos das sociedades comerciais. O desafio parte da tensão entre dois regimes jurídicos em convívio: de um lado, aquele que regula a eficácia da cláusula estatutária, segundo o qual a esfera jurídica dos sócios e titulares dos órgãos sociais fica exposta à normação produzida a propósito da constituição da sociedade e das deliberações sociais posteriores; do outro, o que aponta para o deslocamento da competência dos tribunais estaduais aos tribunais arbitrais, diante da celebração de convenção de arbitragem. Ele conduz a uma pergunta indispensável, a ser respondida ao longo da dissertação: existirá espaço, para além do modelo voluntário de arbitragem cujo suporte advém do instituto da convenção, a um regime de arbitragem voluntária não convencional na ordem jurídica portuguesa? A resposta a essa pergunta demanda segmentar o discurso em duas partes. A primeira toma por foco a demonstração da tese da vinculação dos sócios e da sociedade à cláusula compromissória estatutária originária e incorporada por deliberação, o que demanda fixar premissas assentadas nos elementos configuradores do consentimento necessário à aquisição da participação social no processo de constituição da sociedade; do consentimento necessário à validade e à eficácia da convenção de arbitragem; da eficácia dos estatutos sobre o sócio fundador e sobre a sociedade; no regime da eficácia das deliberações dos sócios; no direito de exoneração do sócio. A segunda destaca a vinculação do adquirente da participação social, dos usufrutuários, credores pignoratícios e titulares de órgãos sociais à cláusula compromissória estatutária, o que, por sua vez, exige percorrer o regime da aquisição da participação social, de um lado, e o regime da vinculação de não-signatários à convenção de arbitragem, de outro; o regime da oneração da participação social; o regime da eficácia dos estatutos sobre os titulares dos órgãos sociais.This thesis seeks to demonstrate that partners and officers of corporate bodies are bound to arbitration clause integrated to the company´s charters. This challenge is given by a clash between two coexistant regulations: on one side, the one that determines charters clauses´ effects, in reason of which partners and officers of corporate bodies are bound to original charters rules and charters rules inserted by further deliberations; on the other side, the one that indicates that the arbitration agreement withdraws jurisdiction from state courts in favor of arbitral tribunals. An indispensable question arises from this very challenge, answered throughout this dissertation: is there room, set aside the voluntary arbitration model based on contractual consent, for a voluntary arbitration model based on non-contractual consent in Portuguese law? The answer requires two segmented approaches. The first one focuses on demonstrating the thesis that partners and corporation are bound to the arbitration clause originally present in the charters as well as to the arbitration clause inserted in the charters by deliberation. This approach demands to extract elements from consent to acquire a partner share during the constitution of a corporation process; consent to formation of a valid and effective arbitration agreement; charter rules effects on founder partners and on company itself; regulation on effects set off by partners deliberations; regulation on partner resignation. The second approach outlines binding of partner shares acquirers, usufructuaries of partner shares; secured creditors of partners by partner shares and officers of corporate bodies to arbitration clause already inserted in the company´s charters. This approach demands studying rules related to partner share acquisition, on one hand, and regulation on binding of non-signatories to arbitration agreement, on the other; also, regulation on usufructuaries and secured creditors of partner share; regulation on charters effects on officers of corporate bodies
Development of drugs to treat tuberculosis targeting DprE1
No full textFaculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa.A tuberculose (TB) é uma das doenças mais antigas e com maior taxa de mortalidade da história da Humanidade. É uma doença do tipo infecioso, causada por bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), que embora seja frequentemente associada ao aparecimento de tubérculos nos pulmões (tuberculose pulmonar), pode também afetar outras regiões do corpo, nomeadamente o fígado, os ossos e os olhos (tuberculose extrapulmonar). Apesar de se tratar de uma doença curável e evitável, a Tuberculose (TB), continua a ser uma das principais causas de morte em todo o mundo. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), todos os anos surgem cerca de 10 milhões de novos casos de TB no mundo, dos quais 1.5 milhões acabam mesmo por ser fatais. Atualmente estima-se que um quarto da população mundial esteja infetada, ainda que só uma pequena percentagem venha a desenvolver a doença ativa.
A falta de adesão por parte dos doentes com TB à terapia já desenvolvida, bem como a falta de um acompanhamento adequado são dois dos fatores que contribuem para o aparecimento de novas variantes (variantes resistentes aos fármacos utilizados), que necessitam de terapias específicas para serem combatidas, terapias essas que acabam por apresentar uma duração mais longa e por envolver fármacos com efeitos adversos mais severos, quando comparados com os fármacos utilizados na terapia convencional. Posto isto, é urgente desenvolver novas terapias que sejam eficazes não só contra as estirpes suscetíveis aos fármacos, mas também contra as estirpes que apresentam resistência aos mesmos. Apesar dos vários alvos já identificados para o desenho de novos fármacos, nomeadamente a MmpL3, a QcrB e a Pks13, tem-se verificado um interesse crescente num novo alvo que tem demonstrado ser bastante promissor no combate a esta doença, a decaprenilfosforil-β-D-ribose-oxidase (DprE1), enzima essencial para a sobrevivência da Mtb, uma vez que catalisa um passo de epimerização crucial à síntese da parede celular das micobactérias. É a DprE1 que é responsável pela oxidação do DPR a DPX, que é posteriormente reduzido a DPA, um dos percursores essenciais para a síntese de 2 polissacáridos que constituem a parede celular da Mtb, garantido assim a sua sobrevivência. Posto isto, o facto de não existir nenhuma outra proteína capaz de exercer uma função semelhante à da DprE1, a sua inibição leva à morte das micobactérias. Das várias famílias de compostos já identificadas, as benzotiazinonas e derivados são até à data as mais relevantes, uma vez que delas fazem parte compostos que são capazes de inibir a DprE1 por meio de um mecanismo de inibição suicida. A presença de pelo menos um grupo nitro na estrutura destes compostos, demonstrou ser um fator essencial para sua a atividade, uma vez que o mecanismo de ação destes inibidores envolve uma primeira etapa que consiste na ativação do grupo nitro pelo cofator FAD na sua forma reduzida (FADH2) da DprE1 que é transformado em grupo nitroso, de modo a
conseguir interagir com o resíduo de cisteína 387 (cys387) presente no sítio ativo da DprE1, através de uma ligação covalente que impede o substrato natural de se ligar. Para além dos inibidores covalentes já descobertos, também inibidores não covalentes têm vindo a ser estudados. Em trabalhos de investigação anteriores do nosso grupo, foi descoberta uma nova série de nitrobenzamidas com atividades bastante promissoras. Apesar da sua estrutura simples, verificou-se que a atividade destes compostos era semelhante à atividade das nitrobenzamidas mais ativas existentes na literatura. Enquanto a literatura explora estruturas cada vez mais rígidas, com grupos cíclicos, estes compostos demonstraram que as cadeias alquílicas podem originar compostos de atividade semelhante. Assim, fazendo uso de linkers alquílicos, pretendemos estudar a importância de diferentes grupos terminais, resultando no desenvolvimento de uma nova série de nitrobenzamidas, através da síntese de duas famílias de compostos derivados das nitrobenzamidas: a família dos compostos fenólicos e a família dos compostos piperidínicos. Ambas as famílias utilizam como linker uma cadeia alquílica linear de 2 carbonos a ligar a nitrobenzamida a um grupo terminal que pode ser um fenol substituído, no caso dos compostos fenólicos, ou um derivado de piperidina no caso dos compostos piperidínicos. Para além da síntese destes compostos e da determinação da sua atividade biológica utilizando a estirpe H37Rv da Mtb, foram também realizados ensaios de estabilidade em diferentes meios, nomeadamente em PBS, em plasma humano e em homogenato de Mycobacterium smegmatis, para 3 dos compostos mais ativos.Tuberculosis (TB) is one of the oldest diseases with the highest mortality rate in human history. It is an infectious disease caused by bacteria of the Mycobacterium tuberculosis (Mtb) complex, which, although it is often associated with the appearance of tubercles in the lungs (pulmonary TB), can also affect other regions of the body, namely the liver, bones and eyes (extrapulmonary TB). Despite being a curable and preventable disease, Tuberculosis (TB) remains one of the main causes of death worldwide. According to the World Health Organization (WHO), every year there are about 10 million new cases of TB in the world, of which 1.5 million are fatal. Currently it is estimated that a quarter of the world's population is infected, although only a small percentage will develop active disease. The lack of adherence by TB patients to the therapy already developed, as well as the lack of adequate monitoring, are two of the factors that contribute to the emergence of new variants (drug-resistant variants), which require specific therapies to be fought, and those end up lasting longer and involving drugs with more severe adverse effects, when compared to the drugs used in conventional therapy. Therefore, there is an urgent need to develop new therapies that are effective not only against drug susceptible strains, but also against drug resistant strains. Despite the several targets already identified for the design of new drugs, namely MmpL3, QcrB and Pks13, there has been a growing interest in a new target that has shown great promise in fighting this disease, the decaprenylphosphoryl-β-D-ribose oxidase (DprE1), an enzyme essential for Mtb survival, since it catalyzes an epimerization step crucial to the synthesis of the mycobacterial cell wall. It is DprE1 that is responsible for the oxidation of DPR to DPX, which is subsequently reduced to DPA, one of the
essential precursors for the synthesis of the 2 polysaccharides that constitute the Mtb cell wall, thus ensuring their survival. That said, since there is no other protein capable of performing a similar function to DprE1, its inhibition leads to the death of the mycobacteria. Of the various families of compounds already identified, the benzothiazinones and derivatives are the most relevant to date, since they include compounds that are able to inhibit DprE1 by means of a suicide inhibition mechanism. The presence of at least one nitro group in the structure of these compounds has proven to be an essential factor for their activity, since the mechanism of action of these inhibitors involves a first step that consists in the activation of the nitro group by the FAD cofactor in its reduced form (FADH2) of DprE1, which, once activated, is transformed into a nitroso group in order to interact with the cysteine residue 387 (cys387) present in the active site of DprE1, through a covalent bond that prevents the natural substrate from binding. In addition to the covalent inhibitors already discovered, non-covalent inhibitors have also been studied. In previous research work by our group, a new series of nitrobenzamides with very promising activities was discovered. Despite their simple structure, the activity of these compounds was found to be similar to the activity of the most active nitrobenzamides in the literature. While the literature explores increasingly rigid structures with cyclic groups, these compounds demonstrated that alkyl chains can give rise to compounds of similar activity. Thus, making use of alkyl linkers, we intend to study the importance of different terminal groups, resulting in the development of a new series of nitrobenzamides through the synthesis of two families of compounds derived from nitrobenzamides: the phenolic
compound family and the piperidinic compound family. Both families use as linker a linear 2-carbon alkyl chain linking the nitrobenzamide to a terminal group that can be a substituted phenol in the case of phenolic compounds or a piperidine derivative in the case of non-phenolic compounds. In addition to the synthesis of these compounds and
the determination of their biological activity using the Mtb strain H37Rv, stability assays in different media were also performed for 3 of the most active compounds, namely in PBS, in human plasma and in Mycobacterium smegmatis homogenate