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A importância do trabalho nas doenças mentais : uma revisão narrativa
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024Objetivos: A presente revisão narrativa tem como objetivo refletir sobre o papel do trabalho na vida de pessoas com doenças mentais, nomeadamente a importância e os benefícios das diferentes vertentes da reabilitação profissional neste grupo. Com base nisto, iremos expor alguns modelos atuais de apoio ao emprego destinados a estas populações. Metodologia: Usando os termos “benefits of work and mental disorder”, ”work and mental health”, “supported employment”, “protected employment” e “psychosocial rehabilitation”, foi realizada uma pesquisa, entre setembro e dezembro de 2023, nas seguintes bases de dados: PubMed, PsycInfo, EMBASE, Cochrane Database, Web of Science, APA PsycNet, Scopus e SciELO. De seguida, foram aplicados os critérios de inclusão. Resultados: Com base num total de 170 artigos, foram selecionados 33. Os estudos revistos realçam os benefícios da inclusão de pessoas com doença mental num ambiente laboral apoiado ou protegido, sendo tal vantajoso para diferentes domínios da sua vida e do seu bem-estar. Conclusão: Qualquer cidadão tem o direito a ter acesso a um emprego adequado à sua problemática e isto é particularmente fundamental para as pessoas com problemas mentais (especialmente moderados ou graves), pois contribui para a sua reabilitação e integração social. É imperioso combater os estigmas que dificultam e limitam as ofertas laborais a este grupo de pessoas, para que se construa uma sociedade cada vez mais inclusiva.Objectives: This narrative review aims to discuss the role of employment in the life of people with a mental disorder, including the importance and the benefits of several aspects of professional rehabilitation in this particular group. Based on this, we will discuss some actual models of employment support targeted to this population.Methods: Using the terms “benefits of work and mental disorder”, ”work and mental health”, “supported employment”, “protected employment” and “psychosocial rehabilitation”, a search was conducted between September and December of 2023, on the following database: PubMed, PsycInfo, EMBASE, Cochrane Database, Web of Science, APA PsycNet, Scopus, SciELO. After that, the eligibility criterias were applied. Results: Consequently, from a total of 170 articles, 33 were selected. Different studies found the benefits of including people with a mental disorder in a work environment (supported or protected), which proves to be beneficial for several aspects of their life and well-being. Conclusions: Any citizen, regardless of their disorder, has the right to access a competitive job, appropriate to their condition. This is particularly important with regard to people with mental problems (especially moderate or severe), because it promotes rehabilitation and social integration of these individuals. It is imperative to fight the stigma that hinders and limits job opportunities for this population, in order to promote a society increasingly inclusive
Exploring 3’ UTR Isoforms : decrypting miR-34c-5p’s gene regulation
No full textTese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO trabalho realizado nesta dissertação aborda a regulação génica mediada por microRNAs
(miRNAs), em particular o miR-34c-5p, e a sua influência na diferenciação e ativação das células T CD4+.
Os miRNAs são pequenos RNAs não codificantes que regulam a expressão génica através de interações
com regiões específicas do mRNA, geralmente presentes nas regiões não traduzidas 3' (UTRs). Apesar de
existirem várias ferramentas de previsão de alvos de miRNA, a identificação precisa dos alvos é um desafio,
uma vez que as UTRs 3' são altamente dinâmicas e influenciadas por fatores específicos de cada tipo celular,
como a poliadenilação alternativa e proteínas que se ligam ao RNA. Esta dissertação utiliza uma abordagem
multidisciplinar para investigar a rede regulatória do miR-34c-5p, combinando análises de expressão
diferencial de genes após o knockdown do miR-34c-5p, previsões computacionais de alvos, e análises de
isoformas de UTRs 3' através de dados de sequenciação de longa leitura, juntamente com validações
experimentais de interações putativas entre o miRNA e alguns alvos biologicamente relevantes.
A primeira parte do trabalho focou-se em realizar uma análise de expressão diferencial (DGE)
usando dados de sequenciação de mRNA (mRNA-seq) após o knockdown de miR-34c-5p em células T
CD4+. A análise revelou que apenas cerca de 2% dos genes previstos como alvos do miR-34c-5p mostraram
uma alteração significativa na expressão, com menos de metade desses genes apresentando a regulação
esperada (upregulation). Este resultado está em linha com a natureza do controle pós-transcricional
mediado por miRNAs, onde a regulação muitas vezes ocorre ao nível da tradução, sem uma alteração
perceptível nos níveis de mRNA. Por esta razão, a utilização exclusiva de dados de expressão de mRNA
tem limitações claras para estudar a regulação por miRNAs, o que motivou a implementação de uma análise
mais abrangente neste projeto.
Para aprofundar o estudo da regulação mediada pelo miR-34c-5p, desenvolveu-se uma pipeline que
integra dados de sequenciação de whole transcript, permitindo uma melhor análise da utilização de
isoformas das UTRs 3' e dos elementos de resposta ao miRNA (MREs). Esta abordagem foi aplicada num
conjunto piloto de amostras de células CD4+ T, de forma a identificar alterações na expressão dos MREs
devido à poliadenilação alternativa, um fenómeno que pode alterar a presença ou ausência de locais de
ligação para os miRNAs nas UTRs 3'. As amostras sequenciadas incluíram células T CD4+ estimuladas e
não estimuladas, células tratadas com um mímico de miR-34c-5p, e células sob condições de Treg skewing
para promover a diferenciação de células T reguladoras (Tregs). Também foi incluída uma amostra controle
tratada com um mímico "scrambled" como controle negativo. Esta diversidade de condições permitiu
investigar o impacto do miR-34c-5p em diferentes contextos de ativação e diferenciação celular. A
sequenciação long read oferece vantagens significativas em relação à sequenciação de short read, uma vez
que permite a captura completa dos transcritos e uma resolução mais precisa dos locais de poliadenilação
usados em cada um deles. As análises realizadas mostraram que algumas isoformas de genes são reguladas
de maneira dependente do contexto, isto é, a expressão de determinadas isoformas com ou sem MREs
relevantes pode variar consoante o contexto celular.
A validação experimental das interações entre miR-34c-5p e genes alvo foi realizada através de
ensaios de luciferase, uma técnica amplamente utilizada para confirmar a ligação funcional entre um
miRNA e o mRNA alvo. Neste estudo, quatro genes foram selecionados para validação: FOXP3, KLF10,
NFKBIA e JUN, devido à sua relevância biológica no contexto das células T CD4+ e da diferenciação de
Tregs. Destes, o FOXP3, que é um gene chave na diferenciação de Tregs, foi confirmado como um alvo
direto do miR-34c-5p, apresentando uma interação funcional significativa com o miRNA. Embora o gene
NFKBIA tenha mostrado uma tendência de interação com o miR-34c-5p, esta não foi estatisticamente significativa, sendo necessário realizar mais replicados para averiguar se a interação se dá ou não. Por outro
lado, os genes KLF10 e JUN não mostraram evidências de serem alvos do miR-34c-5p nas condições
testadas, reforçando a hipótese de que os algoritmos de previsão de alvos podem não ser muito
representativos das realidades específicas em cada contexto.
No que diz respeito à análise das isoformas das UTRs 3', foi observado que a utilização dos locais
de poliadenilação variou entre as diferentes amostras sequenciadas. Os resultados sugerem que há varios
aspetos que podem ter uma influência marcante na escolha de locais de poliadenilação, sendo estes, o tempo
pós estimulação, o tratamento com mímicos, a sobre-expressão de miR-34c-5p e o estado de estimulação
das células. Isto sugere que a ativação celular pode ser um evento importante para a regulação mediada por
miRNAs, influenciando não só os níveis de mRNA, mas também a configuração das UTRs 3', o que pode,
por sua vez, alterar o impacto dos miRNAs como reguladores.
Um aspeto metodológico inovador deste trabalho foi a aplicação da sequenciação long read (usando
a tecnologia Oxford Nanopore) para mapear isoformas das UTRs 3' e explorar o impacto da poliadenilação
alternativa na regulação por miRNAs. Apesar dos desafios técnicos associados a este tipo de sequenciação,
como a elevada taxa de erro no "basecalling" em regiões altamente repetitivas, os dados gerados permitiram
uma análise mais detalhada das isoformas expressas e dos locais de poliadenilação. Além disso, a pipeline
de análise desenvolvida pode ser facilmente adaptada para estudar outros miRNAs e contextos celulares, o
que representa uma contribuição metodológica importante para o campo da investigação de miRNAs. Ao
comparar os dados de sequenciação de short e long read, verificou-se que o número de genes detetados nas
amostras de long read foi consideravelmente inferior ao das amostras de short read, o que se deve à menor
profundidade de sequenciação alcançada com a sequenciação de long read.
A análise funcional subsequente à analise de expressão diferencial revelou que vários processos
biológicos importantes, incluindo a divisão celular, a diferenciação e vias de sinalização como a via JAKSTAT (que tem sido associada à diferenciação de Tregs), foram afetados pelo knockdown de miR-34c-5p.
Isto sugere que o miR-34c-5p desempenha um papel relevante na ativação e diferenciação das células T
CD4+, com particular ênfase na diferenciação de Tregs.
Um resultado importante deste trabalho foi a identificação de um número reduzido de alvos
previstos que foram de facto regulados pelo miR-34c-5p, o que destaca a limitação das ferramentas de
previsão de alvos de miRNAs. As previsões computacionais tendem a gerar muitos falsos positivos, uma
vez que não conseguem ter em conta o contexto celular específico e a complexidade da regulação póstranscricional. Estes resultados sublinham a necessidade de validação experimental rigorosa em estudos de miRNA para refinar a compreensão da especificidade dos alvos e da expressão dependente do contexto dos MREs nos transcritos.
Em conclusão, este trabalho contribuiu para a caracterização do papel do miR-34c-5p na regulação
de genes envolvidos em processos cruciais para o ciclo celular, crescimento celular e diferenciação de
células T, particularmente em vias associadas à diferenciação de Tregs. Além disso, foi desenvolvida uma
nova metodologia para a análise da expressão de MREs em resposta à poliadenilação alternativa, utilizando
dados de sequenciaçãpo de long read. Esta pipeline tem o potencial de ser utilizada em estudos futuros para
explorar a regulação mediada por diferentes miRNAs e em diversos contextos celulares. Finalmente, os
resultados preliminares indicam que a estimulação celular, a diferenciação de Tregs e a sobre-expressão de
miR-34c-5p influenciam a escolha dos locais de poliadenilação, revelando uma possível ligação entre estes
processos e a regulação mediada por miRNAs. Este estudo representa um avanço tanto em termos biológicos como metodológicos, fornecendo uma base sólida para investigações futuras sobre a função dos miRNAs e as suas implicações mais amplas na regulação génica e em vários processos celulares.MicroRNAs (miRNAs) play pivotal roles in cellular processes by modulating gene expression
through interactions with mRNA sequences, primarily within the 3’ untranslated regions (UTRs), and
understanding their regulatory networks is crucial for elucidating gene expression dynamics. Despite the
existence of numerous target-prediction algorithms, accurately identifying miRNA targets remains very
challenging due to the dynamic nature of the 3’ UTR, which is influenced by cell type-specific factors such
as alternative polyadenylation and regulatory RNA-binding proteins. Our research takes a multifaceted
approach to interpret the regulatory network of miR-34c-5p, which our lab recently showed to be expressed
in human naïve CD4+ T cells following TCR stimulation. We performed differential gene expression (DGE)
analysis of mRNA-seq data generated following miR-34c-5p knockdown in these cells and identified key
genes whose expression was altered, revealing insights into the biological processes affected by this
miRNA. Analysis of predicted target genes demonstrated that only around 2% showed significant
differential expression, of which less than half exhibited the expected upregulation, suggestive of direct
targeting by miR-34c-5p. To explore the impact of 3’UTR isoforms on these results, a novel pipeline was
developed, integrating long read sequencing data with polyadenylation site and miRNA response element
(MRE) annotations. This pipeline was used on a pilot ONT sequencing dataset to assess differential MRE
expression due to alternative polyadenylation, showing that some genes are only regulated by miR-34c-5p
in a context-dependent manner. Experimental validation through luciferase assays was used to confirm
interactions between miR-34c-5p and four target genes, with one target, FOXP3, showing significant
interactions, and another, NFKBIA, a suggestive albeit non-significant trend. This integrative study
provides new insights into the complexity of miR-34c-5p-mediated gene regulation, offering a robust
framework for future research on miRNA function and its broader biological implications
Functional genomics in familial dyslipidaemia
No full textDyslipidaemia is defined as an abnormal deviation of plasma lipid levels, being a significant risk factor for cardiovascular disease, which can be due to both genetic and environmental factors. There are several familial dyslipidaemias, and their occurrence is regulated by multiple genes. Familial hypercholesterolaemia (FH) is one of those dyslipidaemias, being the most common inherited life-threatening disorder of the lipid metabolism, affecting around 1:300 individuals. This disorder is characterised by increased levels of total and LDL plasma cholesterol, which is associated with premature atherosclerosis and coronary heart disease. The FH phenotype has a considerable genetic heterogeneity and phenotypic variability, depending on both the LDL receptor activity and lifestyle habits. So far, about 3,500 unique LDLR variants have been described, most of them lacking functional evidence proving their effect on the LDLR function. The high number of LDLR variants described as variants of uncertain significance (VUS) is the largest obstacle to achieve a definitive FH diagnosis, being early diagnosis and treatment the key to reduce the cumulative life-long cardiovascular burden of patients with FH.
Being a correct diagnosis one of the most important steps for FH patients’ identification this work concentrated in achieving a better diagnosis for FH patients by improving variants functional characterisation. Another aim was to unravel the genetic background of phenotype-positive genotype-negative patients in order to provide a more personalised medicine for these patients.
In the initial stage of this work, the combined efforts for the functional characterisation of 28 rare LDLR variants found in the Portuguese population (and other countries worldwide) allowed the classification reassignment of 15 variants, from VUS to likely benign (1), benign (3), likely pathogenic (10) or pathogenic (1). The variants were analysed by flow cytometry to assess their individual function and the results showed a large spectrum of functional levels, indicating that the impact of variants is not uniform across the LDLR gene. This methodology is deemed as the gold standard for functional characterisation and recommended by the FH Variant Curation Expert Panel from the Clinical Genome Resource. These results allowed 82 Portuguese patients to receive a definitive FH diagnosis, as well as many other FH patients with the same variants scattered across the 21 different countries where the same variants have been described.
Following the first stage of this work, the efforts were focused on the development of a high-throughput cell-based methodology to identify disruptive variants in the LDLR gene, with the objective of providing a fast and reliable method for variant characterisation. This assay showed to be a time- and cost-effective method of profiling rare variants, helping to differentiate between rare variants that are clinically significant and those that are benign. Two sets of variants were characterised: 1 – control set, consisting of 22 previously characterised variants as well as variants that achieve a pathogenic and benign classification without functional studies (n=5), where no variants were misclassified; 2 – test set, with 19 newly functionally characterised variants: 11 displaying abnormal function, five displaying normal function, and three remaining unclassified. This work generated a valuable resource for systematic functional characterisation of LDLR variants, helping to solve one of the major issues to achieve a definitive FH diagnosis. Large scale up of this method is now possible.
This project also assessed the impact of rare variants from an array of 112 genes on a FH-negative cohort gathered from the Portuguese FH study. From the targeted sequencing of 185 variant-negative individuals and subsequent cascade family screening, it was possible to determine a definitive or possible genetic aetiology of the dyslipidaemia for 14 patients. The obtained data uncovered a high prevalence of rare variants in genes associated with sitosterolaemia and hypertriglyceridaemia, namely ABCG5, ABCG8 and GPD1 genes. Heterozygous variants in these genes are linked to increases of LDL cholesterol levels of up to 71.38, 76.11 and 65.96 mg/dL, respectively, compared to normal controls. From the analysis of this cohort, it was described the second case of sitosterolaemia in Portugal. Finally, in three unrelated families it was identified a variant that largely co-segregates with the phenotype in each family, in a new potential FH gene. However, further studies and supportive evidence are still required to establish a direct association to the FH phenotype and pathogenesis.
Overall, this work makes a significant contribution to the field of dyslipidaemias and FH, by introducing new data and fresh perspectives to various domains within it. It contributed for the functional characterisation of over 40 rare LDLR variants, which can allow a more personalised choice of the lipid-lowering treatment and dyslipidaemia management, ultimately improving patients’ prognosis. Moreover, a new high-throughput cell-based methodology that generates a useful resource for systematic functional characterisation of rare LDLR variants has been developed. This method has the potential to quickly profile a significant number of variants of uncertain significance, addressing a major gap in the diagnosis of FH. Additionally, this research shed light on the genetic dynamics of FH-positive and FH-negative individuals, highlighting the importance of accurate identification of dyslipidaemia's aetiology and introduces a potential candidate FH gene, providing a new avenue for future investigation
Envelhecimento : dos mecanismos moleculares à prevenção primária
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024A Organização Mundial de Saúde estima, em Portugal, um total de 3,7 milhões de pessoas com mais de sessenta anos até 2050 perfazendo 40% da população. O envelhecimento é o denominador mais comum em qualquer doença não transmissível e um possível catalisador da multimorbilidade. Por esse motivo, surge a “gerociência” com o objetivo de estudar os mecanismos moleculares do envelhecimento e a sua aplicabilidade em medidas preventivas farmacológicas e não farmacológicas.
Esta revisão tem como propósito identificar os principais mecanismos moleculares do envelhecimento, bem como explorar o potencial terapêutico antienvelhecimento da nutrição, exercício físico e senoterapia em idosos. Assim, foi realizada uma pesquisa na base de dados Pubmed para artigos publicados de janeiro de 2010 a dezembro de 2023.
Os hallmarks do envelhecimento são essenciais para a investigação de novas terapêuticas anti-aging, somando um total de 12, atualmente. Em termos de nutrição, a restrição calórica parece beneficiar os marcadores de risco para doenças cardiovasculares (DCV), apesar da difícil adesão a longo prazo. O jejum intermitente inclui diferentes subtipos e os ensaios clínicos são com populações com distúrbios metabólicos logo sem claro efeito anti-aging. As dietas com um reduzido teor de lípidos, com suficiente aporte de proteínas e com os hidratos de carbono em maioria, trarão o maior número de benefícios em termos de DCV, cancro e mortalidade. No exercício, a OMS tem as suas recomendações para os idosos e vários estudos comprovam o efeito deste nos hallmarks do envelhecimento, com um forte contributo no fortalecimento muscular e na neurodegeneração. Nas terapêuticas farmacológicas temos os agentes senoterapêuticos com destaque para a combinação de dasatinib e quercetina, a fisetina e o UBX0101, todos em ensaios clínicos. Contudo, os estudos ainda são insuficientes para gerar uma conclusão e por consequência a sua aplicação na prática clínica.The WHO estimates a total of 3.7 million people over the age of sixty by 2050, making up 40% of the population residing in Portugal. Aging is the most common denominator in any non-communicable disease and a possible catalyst for multimorbidity. For this reason, “geroscience” emerges with the aim of studying the molecular mechanisms of aging, with possible applicability in pharmacological and non-pharmacological preventive measures.
This review aims to identify the main molecular mechanisms of aging, as well as explore the anti-aging therapeutic potential of nutrition, physical exercise and senotherapy in the elderly. Therefore, a search was carried out in the Pubmed database for articles published from January 2010 to December 2023.
Aging hallmarks are essential for the investigation of new anti-aging therapies, currently totaling 12. In terms of nutrition, different aspects were tested. Calorie restriction appears to benefit risk markers for cardiovascular disease, despite difficult long-term adherence. Intermittent fasting includes different subtypes and clinical trials are in populations with metabolic disorders without a clear anti-aging effect. Diets with a low lipid content, sufficient protein intake and carbohydrates accounting for the largest share will bring the greatest number of benefits in terms of cardiovascular diseases, cancer and mortality. Regarding exercise, the WHO has its recommendations for the elderly and several studies prove its effect on the hallmarks of aging, with a strong contribution to muscle strengthening and neurodegeneration. In pharmacological therapies we have senotherapeutic agents, with emphasis on the combination of dasatinib and quercetin, fisetin and UBX0101, all in clinical trials. However, studies are still insufficient to generate a conclusion and therefore its application in clinical practice
Efeito de uma alimentação rica em pescado numa abordagem nutricosmética
No full textTese de Mestrado, Química (Química Analítica), 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA nutricosmética está a ganhar um enorme reconhecimento na comunidade científica, sendo a
responsável pela promoção dos benefícios associados a alimentos que promovem a saúde e a
aparência da pele, unhas e cabelo. O consumo de uma alimentação rica em pescado, graças aos
seus compostos bioativos como os ácidos gordos polinsaturados n-3 (PUFA n-3), pode ter
benefícios numa aplicação nutricosmética. O ácido docosahexaenóico (DHA) apresenta diversos
benefícios ao nível da saúde cutânea e não só, podendo encontrar-se envolvido na prevenção de
doenças como a Doença de Alzheimer (DA). A DA pode apresentar impacte ao nível de condições
cutâneas, como propensão ao desenvolvimento de psoríase e processos inflamatórios.
Este estudo pretendeu explorar os benefícios nutricosméticos associados a uma alimentação
suplementada, analisando o impacte de rações específicas com o perfil lipídico e mineral no tecido
cutâneo e pelo de murganhos transgénicos suscetíveis a DA (5XFAD (B6SJL)/Tg6799). O
desenho experimental contou com 32 animais, divididos em quatro grupos diferenciados pelas
rações: Controlo (C), Cavala (CV), Quinoa (Q), Cavala + Quinoa (CVQ). O perfil lipídico foi
caracterizado em termos de determinação de classes de lípidos e perfil de ácidos gordos, e foi
quantificado o zinco, o ferro e o magnésio.
A classe de lípidos predominante foram os TAG e apenas os PL apresentaram diferenças
significativas entre os grupos em estudo. A cavala reduziu os ácidos gordos polinsaturados n-6
(PUFA n-6) e, subsequentemente, aumentou os PUFA n-3 e também os SFA. O aumento de PUFA
n-3 foi impulsionado especialmente pelo DHA, cujo teor se destacou no grupo CVQ. Nos
minerais, o grupo Q demonstrou influência no aumento da absorção de ferro e os restantes
minerais não apresentaram diferenças significativas entre grupos. Assim, os resultados sugerem
que a cavala favoreceu a incorporação de DHA no tecido cutâneo, enquanto a quinoa contribuiu
para o aumento de ferro.Nutricosmetics is gaining huge recognition in the scientific community. It promotes the
benefits associated with foods that improve skin, nails and hair health and appearance. A fish diet
can show benefits in a nutricosmetic application, due to its bioactive compounds such as n-3
polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFA). Docosahexaenoic acid (DHA) has multiple benefits for
skin health and may be involved in the prevention of other type of diseases, such as Alzheimer's
(AD). AD can influence skin conditions, including the tendency to develop psoriasis and
inflammatory processes.
This study aimed to explore the nutricosmetic benefits associated with a supplemented diet by
analysing the impact of specific diets on the lipid and mineral profile in the skin and fur of
transgenic mice susceptible to develop AD (5XFAD (B6SJL)/Tg6799). The experimental design
included 32 animals, divided into four groups differentiated by feed: Control (C), Mackerel (CV),
Quinoa (Q), Mackerel + Quinoa (CVQ). The lipid profile was characterised by the lipid classes
and fatty acid profile determination. Zinc, iron and magnesium were also quantified.
The predominant lipid class was TAG. Only PL showed significant differences between the
studied groups. Mackerel reduced n-6 polyunsaturated fatty acids (n-6 PUFA) and subsequently
increased PUFA n-3 and SFA. The increase in n-3 PUFA was mainly due to DHA, which stood
out in the CVQ group. In the case of minerals, the Q group showed an influence on increasing
iron absorption. The other minerals showed no significant differences between groups. The results
therefore suggest that mackerel favoured the incorporation of DHA into skin tissue, while quinoa
contributed to an increase in iron absorption
Unravelling hybridization dynamics of Iberian chubs through demographic modelling
No full textTese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA hibridação, isto é, o cruzamento entre espécies distintas ou linhagens geneticamente diferenciadas, tem sido demonstrada como um fenómeno mais frequente na natureza do que anteriormente se pensava, sendo comum na história evolutiva de muitas espécies. O avanço na compreensão deste fenómeno e da sua frequência tem sido possível graças ao aumento de dados de genómica populacional para um número crescente de espécies. Também o desenvolvimento de métodos sofisticados, como a modelação demográfica, tem contribuído para uma nova apreciação da importância deste fenómeno. No entanto, como e se a hibridação pode levar à especiação ainda permanece uma questão em debate. Entre os grupos animais, os peixes de água doce destacam-se por apresentar algumas das mais altas taxas de hibridação conhecidas. Como tal, são um grupo relevante para o estudo dos efeitos e consequências da hibridação sobre a especiação.
A hibridação pode resultar numa miríade de consequências evolutivas, desde introgressão genética até à formação de novas espécies. Em casos em que as espécies ou populações já se encontram
isoladas, a hibridação histórica que ocorreu entre elas denomina-se hibridação ancestral. O estudo de
eventos de hibridação ancestral fornece uma visão detalhada de como o fluxo genético entre diferentes
linhagens pode influenciar a diversificação e a adaptação das populações ao longo do tempo. Com o
desenvolvimento das tecnologias de sequenciação de nova geração, tornou-se viável analisar em profundidade o impacto da hibridação na variabilidade genética e os mecanismos de seleção natural.
Neste trabalho, investigámos um possível caso de hibridação ancestral em escalos ibéricos (género Squalius), num fenómeno previamente descrito por meio de dados de genotyping by sequencing (GBS). O nosso objetivo era compreender a origem da espécie Squalius pyrenaicus, hipoteticamente o resultado de um evento de hibridação entre duas espécies filogeneticamente próximas, S. carolitertii e S. tartessicus, com uma contribuição maioritária (~84%) de S. carolitertii. Atualmente, as três espécies estão isoladas, habitando bacias hidrográficas distintas sem qualquer contacto natural. Para investigar a hipótese de hibridação, gerámos dados de re-sequenciação de genoma completo de alta cobertura (>17x) para 37 indivíduos, abrangendo as espécies alvo S. pyrenaicus, S. carolitertii, S. tartessicus e duas espécies filogeneticamente relacionadas, mas mais distantes, S. torgalensis e S. aradensis (outgroups). De forma geral, todas as espécies de escalos apresentaram baixos níveis de diversidade genética. S. pyrenaicus e S. tartessicus apresentaram níveis semelhantes de diversidade genética, consideravelmente superiores à diversidade genética em S. carolitertii. Já em termos de diferenciação entre as populações, todas as espécies demonstraram uma diferenciação elevada com base em todas as métricas que calculámos. S. pyrenaicus apresentou uma diferenciação ligeiramente mais baixa com S. carolitertii do que com S. tartessicus, coincidente com a hipótese de uma maior contribuição de S. carolitertii relativamente a S. tartessicus. Propomos ainda que, devido à sua alta diferenciação, populações do norte e sul da distribuição de S. carolitertii sejam tidas em conta enquanto unidades de conservação distintas. Tal se deve aos níveis de diferenciação destas populações serem equiparáveis à diferenciação entre quaisquer duas populações de espécies distintas de escalos. Com base em estimativas de ancestralidade individual, observámos que os indivíduos de S. pyrenaicus formam grupos geneticamente distintos tanto de S. carolitertii como de S. tartessicus, sem ancestralidade mista, o que está de acordo com um evento de hibridação ancestral. Para testar formalmente a hipótese de hibridação, utilizamos estatísticas D, ou teste ABBA BABA, para examinar a relação evolutiva entre S. pyrenaicus, S. carolitertii e S. tartessicus. Este método permite diferenciar entre hibridação e incomplete lineage sorting, ao testar a proporção dos padrões ABBA e BABA entre estas três populações filogeneticamente próximas. O incomplete lineage sorting gera os padrões ABBA e BABA em proporções semelhantes ao longo do genoma, mas a hibridação causa desvios nestas proporções. Com base nos resultados obtidos, constatamos que a relação entre estas espécies não pode ser explicada por uma simples árvore bifurcada. Identificamos evidências de fluxo genético de S. pyrenaicus com S. carolitertii e S. tartessicus, corroborando resultados anteriores obtidos
por meio de GBS. Para além disso, observamos que a estatística D apresenta o mesmo valor para as
quatro populações amostradas de S. pyrenaicus. Estando atualmente isolado tanto de S. carolitertii como
de S. tartessicus, a hibridação de S. pyrenaicus com ambas as espécies terá de ter ocorrido antes do seu
isolamento. De igual modo, as várias populações de S. pyrenaicus amostradas neste trabalho situam-se
em bacias isoladas. Assim, sendo que todas as populações de S. pyrenaicus apresentam o mesmo valor
para esta estatística, a hibridação tem de ser anterior ao isolamento das populações, reforçando assim a
hipótese de uma hibridação ancestral. Observamos ainda que esta estatística aponta para uma maior
partilha de alelos entre S. carolitertii e S. pyrenaicus do que entre S. pyrenaicus e S. tartessicus. Tal
corrobora fortemente a maior contribuição de S. carolitertii para o genoma de S. pyrenaicus. Finalmente,
observamos uma diferença nesta estatística quando consideramos diferentes populações de S. carolitertii. A população amostrada no Mondego, mais próxima da distribuição de S. pyrenaicus, aparenta ter
algum efeito no valor desta estatística. Tal se pode dever a introgressão mais recente com S. pyrenaicus,
o que levaria a uma maior partilha de alelos entre S. pyrenaicus e S. carolitertii do Mondego.
Inferimos dois momentos de expansão e contração do efetivo populacional das três espécies
alvo, bem como efetivos populacionais baixos ao longo da história evolutiva destas espécies. Tais contrações podem explicar a baixa diversidade genética observada. Além disso, encontramos diferenças no
tempo em que estes eventos ocorreram entre as espécies. S. carolitertii foi afetado por uma contração
mais recentemente, explicando a sua menor variabilidade. S. pyrenaicus e S. tartessicus apresentam
histórias demográficas semelhantes, algo que se poderá dever à distribuição semelhante de posições
heterozigóticas no genoma.
As nossas tentativas de inferir a história demográfica com modelação foram infrutíferas. Tal se
poderá dever à violação dos pressupostos do modelo, nomeadamente o Infinite sites model, aliado a uma
taxa de mutação demasiado elevada e erros de polarização dos alelos, o que poderá ser melhorado futuramente.
Além disso, utilizámos ainda a técnica de chromosome painting para estudar a distribuição de
padrões de ancestralidade no genoma de S. pyrenaicus. Foi-nos possível estimar a contribuição parental,
com uma contribuição altamente desequilibrada, quase completamente dominada por S. carolitertii
(~95%). Padrões semelhantes de ancestralidade do parental menor (S. tartessicus) entre indivíduos de
S. pyrenaicus permitiram-nos identificar regiões possivelmente sob seleção nesta espécie. Encontrámos
regiões relacionadas à reprodução e à resposta imune, com partilha de ancestralidade de S. tartessicus
por todos os S. pyrenaicus amostrados. Tratando-se de regiões com partilha do estado de ancestralidade
do parental com menor contribuição, estas zonas representam possíveis regiões de introgressão adaptativa, com o favorecimento destes alelos em detrimento dos alelos correspondentes de S. carolitertii.
A deteção de fluxo genético em diferentes escalas temporais, bem como a identificação de regiões sob seleção são cruciais para compreender as suas consequências genómicas em diferentes momentos da história evolutiva de cada linhagem. A presença de genes candidatos a estarem sob seleção
em S. pyrenaicus sugere introgressão de genes que podem ter proporcionado vantagens adaptativas face
às pressões seletivas exercidas pelo meio. De modo semelhante, a introgressão de genes relacionados à
reprodução pode assegurar uma barreira ao fluxo genético insipiente com o parental de maior contribuição. Estes mecanismos podem permitir o isolamento dos híbridos e levar à especiação, bem como permitir-lhes vantagens adaptativas perante o seu meio.
Os nossos resultados fornecem suporte adicional para a hipótese de que a hibridação desempenhou um papel crucial na história evolutiva de S. pyrenaicus. Além disso, destacamos como o fluxo genético pode ser detetado de maneira distinta por diferentes métricas, especialmente em casos envolvendo hibridação ancestral e uma contribuição parental significativamente desequilibrada. Estes resultados fornecem suporte para a compreensão das consequências genómicas da hibridação e salientam a importância da análise integrada de múltiplas abordagens genómicas na investigação de eventos de hibridação ancestral.
A complexidade da especiação mediada por hibridação evidencia a necessidade de estudos adicionais que explorem diferentes sistemas biológicos e utilizem metodologias complementares. A combinação de análises genómicas de larga escala com o estudo da ecologia e comportamento das espécies
pode fornecer um panorama mais abrangente sobre o papel da hibridação na biodiversidade. Além disso,
compreender os impactos da hibridação sobre a resiliência das populações naturais pode ser crucial para
estratégias de conservação. Tal se deve ao facto de que este fenómeno pode ter consequências tanto
positivas como negativas a diferentes níveis, tanto genómicos como fenotípicos. Esta compreensão parece tornar-se cada vez mais fundamental, especialmente dado o atual cenário de mudanças ambientais
cada vez mais aceleradas e acentuadas, que promovem contactos entre espécies previamente isoladas,
promovendo a hibridação.Hybridization, i.e., the mating between distinct species or genetically distinct lineages, has been shown
to be widespread throughout the evolutionary tree. Our understanding of hybridization and its preva lence has been made possible due to the generation of population genomics data for increasingly higher
numbers of species, coupled with the development of sophisticated methods, such as demographic mod elling. Freshwater fish stand out amongst animal groups with some of the highest rates of hybridization.
Yet, if and how hybridization can lead to speciation remains an open debate. Here, we investigate a
potential case of ancient hybridization in Iberian chubs, previously described using genotyping-by-se quencing (GBS) data. With population genomic data, we aimed to uncover the origin of the Iberian chub
Squalius pyrenaicus. This species has been hypothesized to result from hybridization between its sibling
species S. carolitertii and S. tartessicus, with a major (~84%) contribution from S. carolitertii. We gen erated high-coverage (>17x) whole-genome resequencing data for 37 individuals comprising S. pyrena icus, S. carolitertii, S. tartessicus and two outgroups, S. torgalensis and S. aradensis. Based on estimates
of individual ancestry we found that S. pyrenaicus forms distinct clusters from its sister species, con sistent with an ancient hybridization. With D-statistics, we found that the relationship between S. pyre naicus, S. carolitertii and S. tartessicus cannot be explained by a simple bifurcating tree, with evidence
of gene flow with both sister species, like previous results using GBS data. Using chromosome painting,
we found regions possibly under selection favouring S. tartessicus-like alleles in S. pyrenaicus related
to reproduction and immune response. Our results provide further support for the hypothesis of hybrid ization in the evolutionary history of S. pyrenaicus. Furthermore, these results highlight how gene flow
is differently recognized by different metrics, especially in ancient hybridization cases and with a sig nificant imbalance between the contributions of each parental species
The Energetic metabolism of Mycobacterium tuberculosis as a target for the development of anti-tuberculosis drugs: new and promising approaches
No full textTese de mestrado, Química Medicinal e Biofarmacêutica, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A tuberculose é uma doença infeciosa causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis
(Mtb). Apesar dos avanços científicos significativos e da grande variedade de tratamentos já
disponíveis, esta doença continua a ser uma das principais causas de morte em todo o mundo
devido a apenas um agente infecioso. Em 2022, foram reportados 10,6 milhões de novos casos
e estima-se que cerca de um quarto da população mundial esteja atualmente infetada com
tuberculose.
O atual regime terapêutico utilizado para tratar a tuberculose consiste na administração de
quatro fármacos de primeira linha por um período mínimo de seis meses e destaca-se por
apresentar uma taxa de sucesso elevada de aproximadamente 88%. Por sua vez, este regime é
muito longo, pouco seletivo e está associado a vários efeitos secundários graves, pelo que a
maioria dos pacientes não consegue completar o tratamento, o que contribui para o
aparecimento de novas estirpes resistentes aos fármacos administrados.
Para além do desenvolvimento de resistência aos fármacos utilizados, um grande desafio
que dificulta o tratamento da tuberculose é a capacidade única que o agente patogénico tem de
conseguir sobreviver no hospedeiro, alternando entre o estado ativo e o estado latente da
doença. O estado latente caracteriza-se por ser metabolicamente e fisiologicamente diferente
do estado ativo, sendo que o agente patogénico consegue manter-se várias décadas sem ser
detetado pelo sistema imunitário. Contudo, verifica-se que a maioria dos novos casos
reportados resultam da reativação da infeção por tuberculose latente, pelo que também se torna
crucial tratar a tuberculose latente para prevenir a progressão da doença para o estado ativo.
De uma forma geral, todos os tratamentos disponíveis para tratar os diversos tipos de
tuberculose são longos e tóxicos e, por isso, torna-se essencial desenvolver regimes terapêuticos
alternativos que sejam mais curtos, mais eficazes, mais seletivos e mais seguros para o paciente.
Atualmente, já existem relatados diversos fármacos antituberculose, mas na sua maioria inibem
principalmente os processos importantes para o crescimento e replicação celular e são menos
eficazes em eliminar as subpopulações de bactérias não replicantes. Posto isto, torna-se
imperativo descobrir e desenvolver novos fármacos com novos alvos e diferentes mecanismos
de ação que atuem eficazmente no estado ativo e latente da tuberculose, mas também nas
estirpes resistentes.
O Mtb é um agente patogénico aeróbio obrigatório que precisa de oxigénio para sobreviver
e, por isso, ambas as bactérias replicantes e não replicantes estão dependentes do processo de
fosforilação oxidativa para produzir ATP e crescer. Neste sentido, o metabolismo energético
deste bacilo surgiu recentemente como um alvo bastante promissor para o desenvolvimento de
fármacos antituberculose que atuem no estado latente da doença. Mais concretamente, os
principais componentes da cadeia respiratória que interferem com a produção de ATP têm sido
bastante estudados, sendo que mais de 30% dos novos fármacos atualmente em ensaios clínicos
têm como alvo um elemento da cadeia transportadora de eletrões.
Neste âmbito, esta tese teve como principais objetivos a síntese, a caracterização, a
avaliação in vitro das propriedades físico-químicas e farmacocinéticas e a avaliação biológica
de compostos híbridos desenhados para impedirem a produção de ATP e o crescimento das
bactérias através da inibição de dois componentes fundamentais da cadeia transportadora de
eletrões do Mtb.
O presente trabalho descreve a síntese e a caracterização estrutural de uma pequena
biblioteca de compostos híbridos propostos para inibirem as duas oxidases terminais da cadeia
transportadora de eletrões do Mtb. Os compostos desenvolvidos apresentam uma estrutura base
comum (pirroloquinolona ou quinolonimina) que foi selecionada do screening da biblioteca de
compostos do iMed.ULisboa para inibir o citocromo bc1-aa3, e apresentam um componente
heteroaromático com um grupo nitro que, após ser metabolizado in vivo pelas nitroreductases,
liberta óxido nítrico que irá inibir a atividade do citocromo bd.
Procedeu-se à síntese de quatro compostos híbridos derivados da pirroloquinolona
(compostos 8,10,13 e 17). Para tal, sintetizou-se o esqueleto da pirroloquinolona que foi obtido
com rendimentos elevados. De seguida, acoplou-se a pirroloquinolona com um grupo nitro-
heteroaromático. Este processo, que envolve a formação de uma ligação peptídica, mostrou-se
particularmente difícil, pelo que o composto 8 e o composto 17 não foram obtidos. O composto
10 foi sintetizado com um rendimento muito baixo (3,8%). Apesar de terem sido testados
diferentes solventes, bases e agentes de acoplamento, não se conseguiram otimizar as condições
reacionais de forma a aumentar o rendimento da reação. O composto 13 foi igualmente obtido
com um rendimento baixo (6,3%). Porém, apesar das tentativas de purificação, não foi possível
isolar o produto puro e, por isso, o composto 13 não foi avaliado nos restantes ensaios.
Posteriormente, prosseguiu-se com a síntese dos compostos híbridos derivados da
quinolonimina e para isso começou por se preparar o esqueleto quinolina que foi sintetizado
com um rendimento elevado. De seguida, a quinolina foi acoplada a uma estrutura nitro-
heteroaromática, o que resultou na obtenção do composto 21. No entanto, não foi possível
purificar o composto inviabilizando os ensaios posteriores. Tendo em consideração estes
resultados, acoplou-se a quinolina a uma estrutura heteroaromática mais simples a fim de
compreender se a reação ocorreria nestas condições, mas o composto 22 também não foi
sintetizado. De seguida, com o propósito de averiguar se a adição de uma cadeia alifática a
conectar a estrutura quinolina e o anel heteroaromático poderia influenciar a reação de
substituição nucleofílica bimolecular, sintetizou-se o composto 23, que por sua vez foi obtido
com sucesso. Os resultados descritos são ainda preliminares, mas sugerem que a adição de uma
cadeia alifática a aumentar a distância entre as duas estruturas base pode favorecer este tipo de
reação.
As propriedades físico-químicas e farmacocinéticas devem ser determinadas no processo
de desenvolvimento de fármacos, pelo que se procedeu à sua avaliação por cromatografia
líquida de alta eficiência (HPLC) para o composto 10 sintetizado e para dois compostos da
biblioteca química do grupo de investigação, também com a estrutura pirroloquinolona
(compostos 24 e 25).
Inicialmente, determinou-se a solubilidade aquosa dos três compostos em estudo.
Constatou-se que o composto híbrido 10 destaca-se relativamente aos restantes compostos e
revela ser um promissor fármaco antituberculose, visto que não só apresentou uma excelente
solubilidade aquosa (>200 µM), mas também as suas propriedades físico-químicas indicam que
terá provavelmente uma boa biodisponibilidade oral. Por outro lado, apesar dos compostos 24
e 25 cumprirem todos os critérios de Lipinski e Veber, ambos os compostos demonstraram ser
muito pouco solúveis em meio aquoso (<10 µM), pelo que se espera que tenham uma
biodisponibilidade oral limitada.
A estabilidade dos compostos em tampão fosfato, em plasma humano e em microssomas
de fígado de ratinho foi avaliada. De uma forma geral, os três compostos revelaram ter um bom
perfil farmacocinético nas três condições avaliadas. O composto 10 demonstrou uma boa
estabilidade química (t1/2 = 92,4 horas), estabilidade enzimática (t1/2 = 67,9 horas) e estabilidade
metabólica (t1/2 = 6,8 horas). O composto 24 revelou ser estável em tampão fosfato e em plasma
humano e apresentou uma boa estabilidade em microssomas de fígado de ratinho (t1/2 = 2,4 horas). O composto 25 também demonstrou uma boa estabilidade química (t1/2 = 173,3 horas),
enzimática (t1/2 = 135,9 horas) e metabólica (t1/2 = 1,6 horas). Dos resultados obtidos, constata-
se que o composto híbrido 10 é o menos estável em tampão fosfato e em plasma humano, o que
pode ser explicado pela presença das duas funções amida que podem ser hidrolisadas nestas
condições.
Em conclusão, os resultados obtidos sugerem que a atividade biológica do composto
híbrido 10 deverá ser avaliada futuramente in vitro em estirpes resistentes e não resistentes do
Mtb. Para além disso, deverão ser realizados ensaios de citotoxicidade a fim de avaliar a
seletividade e especificidade deste composto. Por fim, as condições reacionais dos compostos
sintetizados devem ser otimizadas com o intuito de expandir a biblioteca de compostos híbridos
do grupo de investigação.Tuberculosis (TB) is an airborne infectious disease caused by the bacillus Mycobacterium
tuberculosis (Mtb) and remains a major threat to human life and health, ranking among the top
thirteen leading causes of death worldwide. Despite significant advances in science and the
variety of treatments available, there are still several factors that hamper the complete
eradication of TB, including the emergence of drug resistance and the failure to address the
latent state of the disease.
Currently, a diverse pipeline of drugs has been reported and is part of the available
therapeutic regimens. Nonetheless, conventional drugs primarily inhibit processes required for
cell growth and replication and are less effective against non-replicating mycobacteria, making
it critical to understand, prevent and specifically target the latent state.
Since Mtb is an obligate aerobe pathogen and both replicating and non-replicating bacteria
depend on the oxidative phosphorylation (OxPhos) pathway for ATP production and growth,
the energy metabolism of Mtb has recently emerged as an interesting target and has been the
focus of intensive studies for the discovery of new antitubercular (anti-TB) drugs.
This thesis presents the synthesis and structural characterization of a small library of hybrid
compounds designed to inhibit two key components of the energy metabolism of Mtb. The
compounds have a common pyrroloquinolone (PYQ) or quinolonimine structure proposed to
target cytochrome bc1-aa3 and a nitro-heteroaromatic structure that inhibits cytochrome bd
activity.
The physicochemical and pharmacokinetic properties of three PYQ-based compounds
were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Hybrid compound 10
demonstrated excellent aqueous solubility (>200 µM) and a good pharmacokinetic profile with
good stability in phosphate buffer (t1/2 = 92.4 hours), in human plasma (t1/2 = 67.9 hours) and
in mice liver microsomes (t1/2 = 6.8 hours), indicating that it could be a promising anti-TB drug.
Compound 24 showed no degradation in phosphate buffer and in human plasma during the
assay period and showed good stability in mice liver microsomes (t1/2 = 2.4 hours). Compound
25 also presented a good chemical (t1/2 = 173.3 hours), plasmatic (t1/2 = 135.9 hours), and
metabolic stability (t1/2 = 1.6 hours). However, since both compounds are poorly soluble in aqueous media (<10 µM), they are not expected to have good bioavailability and therefore
structural modifications should be made to improve the aqueous solubility of the compounds.
Altogether, these results suggest that in the future the biological activity and cytotoxicity
of compound 10 should be evaluated in vitro and the library of hybrid compounds should be
expanded to perform a structure-activity relationship study.Medicinal Chemistry, iMed.ULisboa
Phosphorus recovery through struvite precipitation from urine – Process optimization under alternative magnesium sources
No full textDoutoramento em Restauro e Gestão Fluviais / Faculdade de Arquitectura / Instituto Superior de Agronomia / Instituto Superior Técnico. Universidade de LisboaN/