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Prevalência da tosse pós-COVID
No full textTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Após a pandemia da COVID-19, declarada em março de 2020, e com a contínua investigação que foi sendo desenvolvida durante estes anos, foi descoberta uma nova condição, a síndrome pós-COVID. Esta síndrome foi definida pela Organização Mundial de Saúde como a persistência ou o desenvolvimento de novos sintomas após a infeção causada pelo SARS-CoV-2. Os sintomas mais comuns nesta fase consistem em perturbações respiratórias, cardiovasculares, cognitivas, metabólicas e de saúde mental.
Neste trabalho, o principal objetivo foi estudar a prevalência da tosse pós-COVID. Neste sentido, elaborou-se um questionário que foi validado e disponibilizado aos utentes de quatro farmácias na zona metropolitana de Lisboa, entre abril e maio de 2024.
Dos 435 participantes incluídos no estudo, a maioria (65,98%) não teve quaisquer sintomas pós-COVID. Os restantes 34,02% da amostra estudada referiram como sintomas mais comuns a fadiga, tosse, disgeusia, anosmia e dispneia.
Quanto à prevalência da tosse pós-COVID, este sintoma foi referido por 50 participantes do estudo, correspondendo a 33,8% dos sintomas pós-COVID mencionados. Os indivíduos com tosse pós-COVID foram predominantemente aqueles que haviam apresentado um maior número de sintomas durante a fase aguda da doença e a pré-existência de doenças/comorbilidades. Para além disso, esta análise de dados concluiu que de uma forma geral a tosse pós-COVID tem alguma interferência no que toca às atividades do dia-a-dia, no trabalho e no sono.
Em relação às abordagens terapêuticas, a maioria dos participantes (72%) não fez uso de qualquer tipo de medicação e os restantes recorreram a medidas habitualmente utilizadas, como a administração de antitússicos e expetorantes, entre outros grupos de fármacos, sendo que praticamente metade dos participantes (46,2%) ficaram satisfeitos com os resultados obtidos.
Este estudo sugere a continuidade de investigação de forma a colmatar algumas lacunas que ainda existem em relação à compreensão do mecanismo fisiopatológico subjacente à tosse pós-COVID, com o objetivo de se encontrar um método de alívio deste sintoma que seja mais direcionado e eficaz.After the COVID-19 pandemic, declared in March 2020, and with the continuous research that has been developed during these years, a new condition was discovered, post-COVID syndrome. This syndrome has been defined by the World Health Organization as the persistence or development of new symptoms after the initial infection caused by SARS-CoV-2. The most common symptoms at this stage are respiratory, cardiovascular, cognitive, metabolic and mental health disorders.
In this study, the main goal was to study the prevalence of post-COVID cough. In order to do so, we developed a questionnaire that was implemented in four pharmacies in the Lisbon metropolitan area between April and May 2024.
Of the 435 participants included in the study, the majority (65,98%) did not experience any post-COVID symptoms. The remaining 34,02% of the population reported fatigue, cough, dysgeusia, anosmia and dyspnea as their most common symptoms.
Concerning the prevalence of post-COVID cough, this symptom was reported by 50 study participants, corresponding to 33,8% of the post-COVID symptoms mentioned. Individuals with a post-COVID cough were predominantly those who had presented a greater number of symptoms during the acute phase of the disease and pre-existing illnesses/comorbidities. In addition, it was possible to conclude that, in general, post-COVID cough interferes with day-to-day activities, work and sleep.
Regarding therapeutic approaches, the majority (72%) did not use any type of medication, and the rest made use of commonly used measures, such as taking antitussives and expectorants, among other groups of drugs. Almost half of the participants (46.2%) were satisfied with the results obtained.
As future work, it is important that further research is carried out to fill some of the gaps that still exist in understanding the pathophysiological mechanisms underlying post-COVID cough, with the aim of finding a more targeted and effective method of relieving this symptom
Effects of plastic pollution on skin barrier integrity: aspects of (trans)dermal drug delivery
No full textTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A presença de plásticos em quase todos os ecossistemas leva a uma exposição humana inevitável, levantando preocupações significativas sobre os seus potenciais impactos na saúde. À medida que o plástico se degrada, liberta partículas que se tornaram um problema ambiental e de saúde crescente. Apesar de algumas pesquisas indicarem que o poliestireno pode induzir alterações nas camadas lipídicas, a compreensão dos efeitos destas partículas, particularmente na pele humana, continua a ser limitada. O estrato córneo humano é um sistema biológico complexo que oferece impermeabilidade e proteção face ao meio envolvente e, por isso, pequenas variações nesta estrutura podem comprometer as suas funções. Este estudo tem como objetivo compreender o impacto dos oligómeros de estireno em membranas, que modelam o estrato córneo humano.
Foram preparadas membranas com lípidos do estrato córneo contendo concentrações variadas de oligómeros de estireno. As membranas foram analisadas por difração de raios-X para determinar alterações na estrutura lipídica. A permeabilidade foi avaliada através de testes de impedância elétrica, perda de água transepidérmica e permeabilidade à indometacina, realizada em células de Franz.
A análise de difração de raios X revelou que a adição de oligómeros de estireno, particularmente de trímeros de estireno, causou aumentos significativos na periodicidade lamelar. As medições de perda de água transepidérmica mostraram uma menor permeabilidade à água dependente da concentração, enquanto a permeabilidade à indometacina e a impedância elétrica não revelaram um comprometimento significativo da função da barreira cutânea.
Estes dados sugerem que os oligómeros de estireno têm um impacto na orientação lamelar dos lípidos do estrato córneo, realçando a necessidade de mais investigações sobre as implicações para a saúde dos poluentes derivados do plástico.Plastics in nearly every ecosystem has led to unavoidable human exposure, raising significant concerns about their potential health impacts. As plastic degrades, it releases particles which have become a growing environmental and health issue. Despite some research indicating that polystyrene can induce alterations in lipid layers, the understanding of the effects of these particles, particularly on human skin, remains limited. The human stratum corneum (SC) is a complex biological system that offers impermeability and protection from its surroundings, therefore, small variations on this structure can compromise its functions. This study focused on understanding how styrene oligomers affect human SC model lipid membranes.
SC model lipid membranes were prepared with varying styrene oligomers concentrations. Membranes were analysed using X-ray diffraction (X-RD) to determine changes in lipid structure. Permeability was conducted in Franz diffusion cells and accessed through electrical impedance (EI), transepidermal water loss (TEWL), and indomethacin (IND) permeability tests.
X-RD analysis revealed that the addition of styrene oligomers, particularly styrene trimers (ST), caused significant increases in lamellar periodicity. TEWL measurements showed a concentration dependent decrease in water permeability, while EI measurements and IND permeability do not reveal significant compromised skin barrier function.
These findings suggest that styrene oligomers have an impact in the lamellar orientation of the SC lipids, highlighting the need for further investigation into the health implications of plastic-derived pollutants.Farmaceutická fakulta, univerzity karlovy
Design de superfície enquanto identidade, valor e comunicação da marca
No full textO presente estudo tem por base um estágio académico, com a duração de quatro meses, numa marca de roupa feminina, Wheat & Rose, fundada por Maria Veloso.
Durante o estágio, tive a possibilidade de presenciar a dinâmica de uma marca em ascensão, tendo tido também a oportunidade de desenvolver um vasto leque de tarefas, tais como: ilustração; gerir as redes sociais; atendimento e assistência a clientes; gestão de encomendas e stock; assistência em feiras; visitas a fábricas e fornecedores; acompanhar e participar nas tarefas de fábrica; desenvolver peças para a marca.
Em simultâneo, com todas estas tarefas e para aprofundar o meu conhecimento sobre o tema que pretendi estudar, desenvolvi ainda, uma estampa em colaboração com a marca.
O contacto direto com uma marca em crescimento permitiu fortalecer os meus conhecimentos adquiridos, em contexto académico.
Estes, irão servir mais tarde para a minha integração numa equipa de uma marca existente ou, mesmo, dar início a um projeto profissional meu.
Nesta investigação foi utilizada uma metodologia mista de base qualitativa, que teve de suporte as fases exploratória, generativa e avaliativa.
A fase exploratória, teve como base a investigação e procura de informação sobre os temas trabalhados.
A fase generativa, subdivide-se em duas: Na primeira, realizei as tarefas sugeridas no estágio e na segunda, tenho contemplado todo o conhecimento adquirido no diário de estágio, com registos fotográficos.
Por fim, na fase avaliativa, está toda a compilação desta investigação.This study is based on a four-month academic internship at a women's clothing brand, Wheat & Rose, founded by Maria Veloso.
During the internship, I was able to witness the dynamics of a brand on the rise, and I also had the opportunity to develop a wide range of tasks, such as: illustration; managing sociais networks; customer service and assistance; managing orders and stock; assisting at trade fairs; visiting factories and suppliers; accompanying and participating in factory tasks; developing pieces for the brand.
At the same time as all these tasks and in order to deepen my knowledge of the subject I wanted to study, I also developed a print in collaboration with the brand.
The direct contact with a growing brand allowed me to strengthen my knowledge acquired in an academic context.
This knowledge will later be used to join a team at an existing brand or even to start a professional project of my own.
This research used a mixed methodology with a qualitative basis, supported by exploratory, generative and evaluative phases.
The exploratory phase was based on research and looking for information on the topics covered.
The generative phase is subdivided into two: in the first, I carried out the tasks suggested during the internship and in the second, I have recorded all the knowledge acquired in the internship diary, with photographic records.
Finally, in the evaluative phase, there is the entire compilation of this research.N/
Design de moda: um veículo entre memória e infância na construção de identidade
No full textA presente dissertação cogita repensar o papel
das memórias na relação entre Infância e
Identidade, utilizando como meio expressivo, o
design de moda. Recorremos às memórias como
um refúgio, uma jornada pessoal, que nos conecta
ao nosso passado, à nossa experiência e às
emoções por nós vividas. São uma fonte de
narrativas, cores, texturas e emoções, que
permeiam a nossa existência. Ao resgatá-las,
damos vida a histórias que, de outra forma,
permaneceriam
silenciosas. A nostalgia, muitas vezes associada à
relembrança de memórias, tem o poder de
inspirar, e de nos apercebermos de elementos que
nos definem. Essas reminiscências podem
desencadear em criatividade, influenciando
diversas áreas de expressão, incluindo o design de
moda.
Nesta investigação pretende-se valorizar o papel
do design de moda no setor infantil, espelhando o
seu papel enquanto agente que molda e preserva
as experiências e as memórias da infância.
Tendo por base a realização de um estágio na
marca infantil Knot, a dissertação afere de que
forma a essência e as necessidades da criança
são incluídas nos processos de criação da marca.
No decorrer da investigação foram combinadas
metodologias de investigação ativa e de
observação direta, integrando a equipa de design
e de comunicação da Knot, de modo a reunir
aspetos que estruturassem a pesquisa e as
respetivas conclusões.
O estágio referenciado permitiu criar uma
experiência tangível entre o universo académico
e o profissional, proporcionando novas
aprendizagens e partilhas de conhecimento, bem
como a descoberta de novos interesses
profissionais.This dissertation considers rethinking the role
of memories in the relationship between
Childhood and Identity, using fashion design
as an expressive medium.
We turn to memories as a refuge, a personal
journey, that connects us to our past, our
experiences, and the emotions we have lived.
They are a source of narratives, colors,
textures, and emotions that permeate our
existence. By rescuing them, we bring to life
stories that would otherwise remain silent.
Nostalgia, linked to the evocation of
memories, holds the inspiring ability to remind
us of moments, revealing elements that are
part of our identity.
These reminiscences can trigger creativity,
influencing various areas of expression,
including fashion design.
This research intend to value the role of
fashion design in the children’s sector,
mirroring its role as an agent that shapes and
preserves the experiences and memories of
childhood.
Based on the realization of an internship at the
children’s brand Knot, the dissertation
assesses how the essence and needs of the
child are included in the processes of creation
of the brand.
During the research, active research
methodologies and direct observation were
combined, integrating Knot’s design and
communication team, in order to bring
together aspects that structured the research
and its conclusions.
The referred internship allowed to create a
tangible experience between the academic
and professional universe, providing new
learning and knowledge sharing, as well as
the discovery of new professional interests.N/
História natural do melanoma : quem progride e como progridem os doentes?
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024Introdução e Obje/vos: Não existe nenhum consenso acerca dos !mings de follow-up dos doentes em estadios precoces após o tratamento do melanoma cutâneo primário, nem acerca dos melhores exames a serem efetuados. Assim, atendendo à relevância do tema, o obje@vo deste estudo é perceber se existem padrões de recidiva e em quanto tempo os doentes progridem. Métodos: Este estudo retrospe@vo incluiu doentes com um diagnós@co de Melanoma Cutâneo entre o período de Janeiro de 2014 e Novembro de 2020, sem evidência de metástases, referenciados ao IPOFG. Excluíram-se melanomas da cabeça e pescoço. Foram registadas e analisadas informações demográficas, clínicas, histopatológicas e informações acerca da evolução da doença. Um p-value <0,05 foi considerado esta@s@camente significa@vo. Foi realizada uma revisão de literatura acerca do tema. Resultados: De um total de 226 casos de Melanoma Cutâneo, 70,8% man@veram-se livres de doença e 29,2% recidivaram. Idades mais avançadas (p=0,011), o sub@po histológico nodular (p<0,001), os pT3b e pT4b (p=0,003 e p=0,008, respe@vamente) e casos com um maior número de mitoses (p<0,001), relacionaram-se com um maior número de recidivas. Os casos de recidiva ocorreram em mediana aos 26 meses [IQR 15,00-36,25], sendo que estadios pT mais avançados recidivaram em menor tempo compara@vamente com os outros estadios. Dos casos que recidivaram, 66,7% progrediram com metástases locorregionais, 22,7% com metástases à distância e 10,6% com metástases síncronas locorregionais e à distância. Independentemente do pT, a maioria dos casos progrediu com metástases locorregionais, com a exceção do pT4b que apresentou uma maior percentagem de progressão à distância. A recidiva relacionou-se com um maior número de mortes por melanoma cutâneo (p<0,001). Conclusões: A sobrevivência livre de doença é menor em estadios pT mais avançados. A recidiva é sobretudo locorregional. Quanto mais avançado é o estadio maior a probabilidade de metástases à distância. A definição de um padrão temporal e de localização da recidiva são importantes para a o@mização do follow-up dos doentes, de forma a diminuir o número de mortes por melanoma cutâneo.Introduc/on and Objec/ves: Aler the cutaneous melanoma treatment, there is no consensus regarding the best follow-up @mings and the best exams to perform in order to detect a recurrence. As a result, the aim of this study is to understand which pa@ents will have a recurrence, to understand if there are paoerns of recurrence and when the recurrence will happen. Methods: This retrospec@ve study includes pa@ents with a diagnosis of cutaneous melanoma between January 2014 and November 2020, without evidence of metastasis, referred to IPOFG. Head and neck melanomas were excluded. Were registered and analyzed demographic, clinical and histopathological informa@on and was also collected informa@on on disease progression. A p-value <0,005 was considered sta@s@cally significant. A revision of literature was performed. Results: Of a total of 226 cases of cutaneous melanoma, 70,8% remained disease-free and 29,2% had a recurrence. More advanced ages (p=0,011), the nodular histological subtype (p<0,001), pT3b and pT4b (p=0,003 e p=0,008, respec@vely) and a greater number of mitosis (p<0,001) related to a higher recurrence rate. Median recurrence @me was 26 months [IQR 15,00-36,25], however @me @ll recurrence was shorter in more advanced pT stages. From the cases that recurred, 66,7% had a locoregional recurrence, 22,7% had a distant recurrence and 10,6% had both locoregional and distant metastasis. Most cases recurred with locoregional metastasis, except for the pT4b, which had a greater percentage of recurrence with distant metastasis. Recurrence related with a higher number of deaths (p<0,001). Conclusions: Disease-free survival is lower in more advanced pT stages. Locoregional metastasis are more frequent in the majority of the recurrence cases. Higher pT stages relate to a higher likelihood of distant recurrence. The defini@on of a temporal recurrence paoern and a loca@on recurrence paoern are fundamental to op@mize pa@ent’s follow-up and to prevent pa@ents from dying from cutaneous melanoma
Trigger ferroptosis in breast cancer (BC) cells by targeting xCT and FATP1
No full textTese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO carcinoma da mama (BC) afeta milhões de pessoas no mundo e apesar das melhorias na terapêutica
e abordagem clínica, continua a constituir um grave problema clínico. Esta doença divide-se em três
subtipos moleculares, o BC do tipo luminal, que expressa o recetor de estrogénio e/ou progesterona, o
BC enriquecido com HER2, que apenas expressa o recetor do fator do crescimento epidermóide 2, e o
BC do tipo triplo negativo (TNBC), se não expressar nenhum destes recetores. Este último é o carcinoma
com o fenótipo mais agressivo e com uma maior taxa de mortalidade entre os subtipos de BC. Isto devese parcialmente ao facto de não existirem terapias alvo e ao desenvolvimento de resistência à terapêutica
convencional.
Um melhor conhecimento dos mecanismos subjacentes à biologia da doença pode ajudar a identificar
novos marcadores e alvos terapêuticos. Sabe-se que, apesar de ser uma doença multifatorial, todas as
células malignas partilham características comuns, as hallmarks do cancro. Neste contexto, o estudo do
metabolismo tumoral ocupa um lugar privilegiado. As células malignas sofrem remodelação metabólica,
de forma a sustentar a elevada capacidade proliferativa e de biossíntese. Esta remodelação promove a
adaptação ao microambiente tumoral e à biodisponibilidade de nutrientes. Assim, as células
cancerígenas expressam transportadores que medeiam a importação de compostos orgânicos do meio
extracelular.
Vários estudos mostram que o metabolismo da cisteína e dos ácidos gordos contribuem para a
progressão do BC. A cisteína é um aminoácido essencial, cuja importação é feita através do
transportador xCT, que o nosso grupo descreveu estar sobreexpresso em linhas celulares e amostras
humanas de TNBC. A cisteína no interior da célula é utilizada para sintetizar a glutationa, que é
biologicamente muito relevante, pois é um cofator de várias enzimas antioxidantes e destoxificantes,
nomeadamente, a glutationa peroxidase 4, que protege as células de danos por peroxidação lipídica. Os
ácidos gordos desempenham várias funções no interior da célula, sendo uma fonte de energia,
constituintes de membranas, e moléculas de sinalização. A sua importação é feita através de vários
transportadores, nomeadamente o FATP1 que também está associado à biossíntese de gotas lipídicas
(LD). Estas são organelos intracelulares de ácidos gordos, que capturam os lípidos não esterificados no
seu interior, na sua forma neutra, protegendo as células da formação de peróxidos lipídicos, e ainda os
libertam controladamente consoante as necessidades energéticas das células. Estudos prévios realizados
pelo nosso grupo demonstraram que linhas celulares e amostras humanas de TNBC apresentam
expressão aumentada de FATP1.
O xCT e a formação de LD são inibidores da ferroptose, que é uma morte celular provocada pela
acumulação de peróxidos lipídicos, devido à geração de radicais livres relacionados com iões ferro.
Assim, este projeto tem o objetivo de explorar se a inibição do xCT e do FATP1 poderá ser uma
abordagem terapêutica viável em BC, promovendo a ferroptose. A inibição do xCT e do FATP1 foi
realizada com selénio-crisina (SeChry) e arilpiperazina 5k, respetivamente. Para os modelos in vitro
utilizou-se quatro linhas celulares que representam diferentes subtipos moleculares de BC, as MCF7 e
BT474 do subtipo molecular luminal, e as HCC1806 e MDA-MB-231 do subtipo TNBC. Para a
observação dos efeitos do SeChry e do 5k in vivo, foi desenvolvido um modelo xenógrafo ortotópico
murino, usando as células MDA-MB-231. As linhas celulares foram expostas ao SeChry, ao 5k, e à
combinação dos dois, durante 24 h. Os ratinhos foram tratados com SeChry encapsulado num
dendrímero de poliureia funcionalizado com ácido fólico (SeChry@PUREG4-FA2), para reduzir a
toxicidade sistémica, sendo mais específico para as células tumorais, visto que estas sobreexpressam o
recetor do folato. O tratamento desenrolou-se ao longo de 2 semanas com 2 aplicações a cada 3 dias,
sendo o SeChry@PUREG4-FA2 administrado no tumor e o 5k no peritoneu.
In vitro, caracterizaram-se os efeitos do SeChry e do 5k com ensaios de morte com anexina-V e
iodeto de propídio (PI) por citometria de fluxo. Foi demonstrado, que as células quando expostas a concentrações crescentes de SeChry tinham um aumento significativo de morte celular. Com estes
resultados também se determinou as concentrações de EC50 para este composto, onde se obteve que as
células mais sensíveis são as MDA-MB-231, seguidas das MCF7, BT474 e HCC1806. Porém, o 5k não
apresentou um efeito citotóxico significativo. A expressão do xCT e FATP1 basal e na presença dos
inibidores foi avaliada por imunofluorescência indireta. Observou-se que todas as linhas celulares
expressavam ambos os inibidores, e que a expressão do FATP1 diminuiu quando as células eram postas
em cultura com os inibidores.
In vivo, o volume do tumor em ratinhos tratados com SeChry@PUREG4-FA2 foi significativamente
menor comparado com o grupo não tratado, contudo, o tratamento conjunto com SeChry@PUREG4-FA2
e 5k não teve qualquer efeito no volume tumoral. Estes resultados confirmam a validade do xCT como
alvo terapêutico e a eficácia do SeChry, e demonstram que o 5k protege as células do BC dos efeitos do
SeChry.
A ocorrência da ferroptose in vitro foi determinada por microscopia de fluorescência, para observar
as LD, usando o corante Nile Red, e por citometria de fluxo para analisar os níveis citoplasmáticos de
espécies reativas de oxigénio (ROS) e de peróxidos lipídicos, usando as sondas DCF-DA e Bodipy
581/591 C11, respetivamente. Nas linhas celulares de BC expostas a SeChry e 5k, observou-se um
decréscimo na formação de LD e nos níveis de ROS intracelulares, com um aumento concomitante dos
níveis de peróxidos lipídicos, sugerindo que está a ocorrer ferroptose. Visto que o 5k impediu os efeitos
do SeChry@PUREG4-FA2 nos tumores dos ratinhos, levantou-se a hipótese que a morte por ferroptose
ocorre proporcionalmente aos lípidos presentes no ambiente intracelular, e a absorção de lípidos pelas
células depende da disponibilidade destes no microambiente, algo que foi demonstrado em estudos
anteriores. Para testar esta teoria, repetiram-se ensaios de morte e análises de peróxidos lipídicos, em
que as células de BC foram expostas ao SeChry, 5k e SeChry + 5K, cultivadas na presença ou ausência
de ácido linoleico (C18:2). Observou-se uma diminuição de viabilidade celular compatível com a
acumulação de peróxidos lipídicos nas linhas celulares de TNBC quando expostas a um ambiente rico
em ácidos gordos. Estes resultados revelam que as células de TNBC que correspondem ao subtipo de
BC com pior prognóstico são as mais suscetíveis a este tipo de morte celular.
Secções congeladas dos tumores de ratinhos foram analisadas por histoquímica com Nile red e
Bodipy 581/591 C11, para avaliar a presença de LD e peróxidos lipídicos, respetivamente. Observou-se
que os tumores dos ratinhos tratados com SeChry@PUREG4-FA2 apresentavam evidências de ferroptose.
Verificou-se uma diminuição da produção de LD nos tumores de ratinhos tratados com
SeChry@PUREG4-FA2 e SeChry@PUREG4-FA2 + 5k. Contudo, o aumento dos níveis de peróxidos
lipídicos apenas se verificou nos tumores dos ratinhos tratados com SeChry@PUREG4-FA2, o que
justifica o volume reduzido dos tumores. Estes resultados permitem concluir que o 5k de facto protege
as células de BC da ferroptose induzida pelo SeChry.
Adicionalmente, com o objetivo de caracterizar os efeitos do SeChry@PUREG4-FA2 in vitro,
determinou-se a concentração de EC50 para as linhas celulares através de ensaios de morte. A expressão
do recetor de folato for avaliada por imunofluorescência indireta e confirmou-se que todas as linhas
celulares de BC expressam este recetor. Num ensaio de comparação equimolar, avaliou-se o potencial
diferencial anti-cancerígeno do SeChry (SeChry@PUREG4-FA2), do selénio (Se@PUREG4-FA2) e da
crisina (Chry@PUREG4-FA2) encapsulados na nanopartícula. Todas as linhas celulares apresentaram
respostas diferentes, mas em suma ambos o SeChry@PUREG4-FA2 e a Chry@PUREG4-FA2 foram
eficazes a induzir morte celular.
Para concluir, este trabalho reforça que as células de BC dependem do metabolismo da cisteína para
controlo do stress oxidativo e que os ácidos gordos contribuem para a biologia da doença. Assim, a
inibição de xCT com o SeChry poderá ser uma estratégia eficaz de tratamento de BC, sendo o
mecanismo de ação mais provável a indução de ferroptose.Breast cancer (BC) affects millions of people worldwide. A better understanding of BC biology,
including metabolic remodeling of malignant cells, can aid in identifying new biomarkers and
therapeutic targets. Our team disclosed the relevance of fatty acids in BC to sustain bioenergetics and
biosynthesis, and the role of cysteine reliance in metabolism and redox control.
This project aimed to explore whether disturbing fatty acid and cysteine uptake would induce
ferroptosis, a form of cell death involving the accumulation of lipid peroxidation, in BC. This was tested
by inhibiting the transporters FATP1 and xCT with 5k arylpiperazine and selenium-chrysin (SeChry),
in BC cell lines from different molecular subtypes and in in vivo BC mouse models. In vitro, cell death
was assessed by flow cytometry using annexin-V-FITC and propidium iodide labeling, and the levels
of lipid droplets (LD), reactive oxygen species (ROS), and lipid peroxides were assessed by
cytochemical stains and fluorescence microscopy. SeChry, but not 5k, increased cell death,
accompanied by decreased accumulation of LD and ROS and increased levels of lipid peroxides, which
is compatible with ferroptosis. Moreover, in a fatty acid-enriched environment, SeChry and 5k induced
higher cell death in TNBC cell lines compared with luminal cell lines. It was also confirmed that SeChry
is the best option for BC cells, since it induced significant cell death in all BC cell lines, while selenium
presented significant toxicity in MDA-MB-231 cells, and chrysin was more toxic to BT474 and
HCC1806 cells than SeChry. In vivo, SeChry significantly reduced the tumor volume, but 5k inhibited
the effect of SeChry. These results were underlined by ferroptosis activation upon SeChry and
ferroptosis inhibition upon 5k, due to decreased accumulation of LD and ultimately decreased lipid
peroxidation.
This work reinforces SeChry as a therapeutic opportunity to tackle metabolism and improve the
clinical management of BC
Crosstalk between RANK signalling, expression of hormone receptors and senescence in breast cancer
No full textTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasThe RANK-RANKL pathway is crucial in several physiological processes, such as bone
remodelling, mammary gland development and activation of immune cells. Over the past decade,
this pathway was found to be important in breast tumorigenesis, breast cancer progression, and
therapy resistance. Despite the efficacy of the existing therapeutic combinations for metastatic
luminal breast cancer, which involve endocrine therapy and CDK4/6 inhibitors, intrinsic and
acquired resistance occur, resulting in elevated rates of relapse and disease progression, and
representing a major clinical challenge. Previous work from our group has shown that RANK
overexpression can be associated with resistance to both therapies in luminal A breast cancer, where
it induces cellular phenotypes related to tumour aggressiveness, cell stemness and transient
senescence. Importantly, we found that genetically targeting the RANK pathway or treating with
RANKL inhibitors rescued therapy sensitivity. Moreover, we have also observed an upregulation of
the androgen receptor in RANK overexpressing human breast cancer cell line-derived xenografts
growing in mice. Therefore, we hypothesised that a combination of the standard-of-care treatments
with the pharmacological inhibition of the RANK pathway and/or androgen receptor or
senotherapeutics may control the expansion of stem-cell-enriched populations and prevent the
formation of senescent niches, eliminating the therapy-resistant cancer cells. Hence, in this master’s
thesis, we evaluated the expression of hormone receptors and senescence markers, in human luminal
A breast carcinoma cell lines with different levels of RANK expression, confirming that therapyresistant models have a senescent-like phenotype and an upregulation of the androgen receptor. We
identified an association between anti-estrogen receptor therapy and androgen receptor expression
and vice-versa. Furthermore, we determined the cells’ sensitivity to androgen receptor inhibitors and
senolytics in combination with CDK4/6 inhibitors and RANK pathway inhibition. Both combined
therapies were more effective than monotherapies, supporting further investigation of therapyresistant models and their response to alternative combined therapies
Efeito dos probióticos nos doentes com depressão : uma revisão sistemática da literatura
No full textTese de mestrado, Nutrição Clínica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2024Introdução: A presente pesquisa está contextualizada na crise sanitária causada pela doença do COVID-19. Tal crise foi associada, entre outros efeitos, ao agravamento dos casos de depressão, principalmente pós-pandemia. As pesquisas relatam que doentes com depressão podem apresentar resistência à farmacoterapia. Diante desse fato, parece ser necessário o estudo de novos tratamentos adjuvantes. Em vista disso, os probióticos são considerados uma possível estratégia de tratamento, pois podem regular a microbiota intestinal trazendo benefícios neurológicos para o hospedeiro. O objetivo desta revisão sistemática foi sistematizar e revisar os estudos com relação aos benefícios dos probióticos nos sintomas da depressão. Metodologia: Para esse fim, foi realizada uma pesquisa na base de dados PubMed/Medline com as palavras-chaves (depression) AND (probiotics). Fez-se uma coleta de 63 artigos publicados entre 2013 e 2022. Para esta revisão, foram incluídos estudos clínicos randomizados controlados que avaliaram os efeitos dos probióticos nos sintomas da depressão em homens e mulheres com idade superior ou igual a 18 anos. Resultados: Foram incluídos nove estudos conduzidos em adultos com diagnóstico de depressão. Na maioria dos estudos (88,8%) o uso de probióticos como adjuvantes ao tratamento farmacológico em doentes, apresentou efeitos positivos nos sintomas da depressão, resultando na diminuição das pontuações nos testes de depressão por meio da Escala de Depressão de Hamilton, o Inventário de Depressão de Beck ou a Escala Hospitalar de Ansiedade e Depressão, em intervenções realizadas entre quatro e seis semanas. Além disso, um tamanho reduzido de doentes apresentaram efeitos colaterais leves Conclusão: Observa-se que a modulação da microbiota intestinal por meio de probióticos têm o potencial de agir no estado imunológico e inflamatório do indivíduo com impacto positivo no eixo-cérebro e consequentemente nos sintomas da depressão. Apesar dos resultados, são necessários mais estudos clínicos para comprovar a eficácia dos probióticos nos sintomas da depressão.Introduction : Cette recherche est contextualisée dans la crise sanitaire provoquée par la maladie COVID-19. Cette crise a été associée, entre autres effets, à une aggravation des cas de dépression, en particulier après la pandémie. Les recherches ont montré que les patients dépressifs peuvent présenter une résistance aux médicaments. De ce fait, il semble nécessaire d'étudier de nouveaux traitements adjuvants. Dans ce cadre, les probiotiques sont considérés comme une stratégie de traitement possible, car ils peuvent réguler le microbiote intestinal, ce qui a des effets bénéfiques sur le plan neurologique pour l'hôte. L'objectif de cette revue systématique était de systématiser et de revoir les études portant sur les bénéfices des probiotiques sur les symptômes de la dépression. Méthodologie : Pour ce faire, une recherche a été effectuée dans la base de données PubMed/Medline en utilisant les mots-clés ("depression") ET ("probiotics"). Au total, 63 articles publiés entre 2013 et 2022 ont été identifiés. Pour cette revue, nous avons sélectionné des études cliniques contrôlées randomisées qui ont évalué les effets des probiotiques sur les symptômes de la dépression chez les hommes et les femmes de plus de 18 ans. Résultats : Neuf études réalisées auprès d'adultes souffrant de dépression ont été incluses. Dans la majorité des études (88,8 %), l'utilisation de probiotiques en complément d'un traitement pharmacologique chez les patients a montré des effets positifs sur les symptômes de la dépression, se manifestant par une diminution des scores aux tests de dépression utilisant l'échelle de dépression de Hamilton, l'inventaire de dépression de Beck ou l'échelle hospitalière d'anxiété et de dépression, lors des interventions réalisées entre quatre et six semaines. De plus, un petit nombre de patients ont présenté des effets secondaires légers Conclusion : La modulation du microbiote intestinal par les probiotiques a le potentiel d'agir sur l'état immunologique et inflammatoire de l'individu, avec un impact positif sur l'axe cerveau, et par conséquent sur les symptômes de la dépression. Malgré ces résultats, d'autres études cliniques sont nécessaires pour confirmer l'efficacité des probiotiques sur les symptômes de la dépression
Synthesis of novel guanidino nucleosides with potential therapeutic interest
No full textTese de Mestrado, Química, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasDe acordo com o Gold Book da IUPAC, nucleósidos são glicosilaminas ou N-glicósidos
formados pela combinação de ribose ou desoxirribose com bases nitrogenadas, que podem ser
pirimidinas (uracilo, timina e citosina) ou purinas (adenina e guanina). A diferença entre nucleósidos e
nucleótidos é a ausência de grupo fosfato nos nucleósidos. Nucleótidos são formados pela esterificação
dos grupos hidroxilo dos nucleósidos com ácido fosfórico.
Os nucleótidos são os monómeros dos ácidos nucleicos, conectados por grupos fosfato na
posição 5' de um açúcar ao grupo hidroxilo da posição 3' do seguinte. O ADN (acido
desoxirribonucleico) apresenta uma estrutura de dupla hélice composta por duas cadeias
polinucleotídicas complementares, unidas por pontes de hidrogênio entre pares de bases específicas
(adenina-timina e guanina-citosina), tendo a notável capacidade de codificar a informação genética. O
ARN (acido ribonucleico), geralmente de cadeia simples, é produzido pela transcrição do ADN,
resultando em ARN mensageiro (mARN) que serve como molde para a síntese de proteínas. A
replicação do ADN, a transcrição em ARN e a tradução de ARN são processos essenciais para a
expressão genética e a divisão celular, sendo ainda cruciais para a replicação viral em células
hospedeiras.
Além de serem componentes dos ácidos nucleicos, os nucleótidos têm outros papéis biológicos
importantes, como na sinalização celular (nucleótidos cíclicos), no fornecimento de energia (ATP ou
GTP) e como substratos ou cofatores de enzimas, como as quinases que utilizam ATP e regulam o ciclo
celular.
Os análogos de nucleósidos são um grupo de moléculas com elevado interesse em Química
Medicinal. Estes surgem do acoplamento de monossacáridos, derivados de furanoses ou piranose, a
bases nitrogenadas ou unidades hétero-aromáticas análogas/miméticas destas, podendo ainda integrar
outros sistemas miméticos de grupos fosfato, passando então a miméticos de nucleótidos. Este grupo de
compostos tem vindo a ser utilizado como pró-fármacos, cujas formas ativas (monofosfatos, difosfatos
ou trifosfatos) inibem a síntese de ácidos nucleicos, bloqueando polimerases ou sendo incorporados nos
ácidos nucleicos, levando à morte celular ou interrompendo a replicação viral. Nucleósidos e nucleótidos
sintéticos, conhecidos como análogos de nucleósidos, são cruciais no tratamento de doenças como
cancro e infeções bacterianas ou virais, pois interferem em processos dependentes de nucleósidos,
frequentemente superativados em doenças.
Entre os análogos anticancerígenos aprovados pela Food and drug administration (FDA)
incluem-se citarabina, fludarabina, clofarabina, cladribina e gemcitabina, que inibem polimerases do
ADN. Alguns análogos, como floxuridina e trifluorotimidina, interferem na síntese do ADN através de
metabolitos de monofosfato. Adicionalmente, estes análogos podem afetar a elongação de cadeias de
ARN e as vias de reparação de ADN, atuando como agentes antiproliferativos.
A atividade antiviral destes análogos é destacada pela inibição da síntese de ácidos nucleicos.
Exemplos incluem remdesivir, aciclovir, zidovudina e lamivudina, que se integram nas cadeias de ADN
ou ARN viral, terminando a replicação ou inibindo as polimerases virais. Os análogos de nucleósidos
também mostraram potencial como agentes antibacterianos. A puromicina inibe a síntese de proteínas
pela incorporação catalisada por ribossomas em C-terminais das cadeias em crescimento, bloqueando a
elongação da cadeia polipeptídica e resultando na terminação prematura da tradução. Os antibióticos do
tipo miharamicina contêm um grupo guanidina terminal e apresentam atividade antibacteriana de amplo espectro. A incorporação desses análogos nos ácidos nucleicos bacterianos leva à replicação defeituosa
e morte celular. Pesquisas demostraram que antibióticos nucleósidicos, que combinam estruturas de
nucleósidos com funcionalizações adicionais pela presença de grupos potencialmente miméticos quer
de nucleobase, quer de grupo fosfato, exemplificando com a guanidina, podem combater eficazmente
bactérias multirresistentes. A exploração contínua destes compostos tem permitido pôr em evidência o
seu potencial para combater infeções virais e bacterianas numa era de crescente resistência
antimicrobiana.
No contexto da doença de Alzheimer (DA), os análogos de nucleósidos têm demonstrado
potencial como inibidores de colinesterase, visando o tratamento sintomático da DA ao restaurar os
níveis de acetilcolina, inibindo principalmente a acetilcolinesterase (AChE). Pesquisas promissoras
foram realizadas com novos análogos de nucleósidos contendo teobromina e 6'-isonucleósidos de
piranosilo e, mais recentemente, com 5’-azido e 5’-guanidino nucleósidos sintetizados na equipa de
investigação do Doutor Nuno Manuel Xavier, inserida no Grupo de Química dos Glúcidos do Centro de
Química Estrutural da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, os quais revelaram a
capacidade de inibir seletivamente acetilcolinesterase ou butirilcolinesterase.
Apesar da sua eficácia clínica, os análogos de nucleósidos enfrentam desafios como baixa
biodisponibilidade oral e resistência de células cancerígenas devido a vários mecanismos. Para superar
estes desafios, é importante desenvolver novos análogos de nucleósidos com melhor permeabilidade
celular e que possam atuar por mecanismos de ação alternativos.
Posto isto, e motivados pelos resultados previamente obtidos, este trabalho de Dissertação de
Mestrado teve como objetivo a síntese de novos compostos que combinem estruturas nucleosídicas a
uma unidade guanidinica. As moléculas planeadas têm na sua estrutura um derivado purínico ou
pirimidínico ligado à posição anomérica de uma unidade de xilofuranose ou de D-glucuronamida, bem
como um grupo guanidina conectado a uma posição terminal (C-5) da unidade glicosílica ou à base
azotada. As vias de síntese envolveram a preparação de dadores de glicosilo 1,2-di-O-acetilados de
xilofuranose e de D-glucuronamida N-substituídos e funcionalizados nas posições pretendidas, através
de procedimentos que incluíram reações de O-alquilação com diferentes brometos de alquilo, proteção
com o grupo isopropilideno, bem como reações de remoção do mesmo, reações de clivagem oxidativa,
de redução, de tosilação, geralmente seguida da reação de azidação, hidrólises e acetilações, tendo sido
estas as reações mais vulgarmente utilizadas para a síntese dos precursores do trabalho que aqui se
apresenta.
Para a obtenção dos compostos alvo, dá-se destaque às reações de N-glicosilação, de Staudinger
e de guanidinilação. A N-glicosilação é uma reação crucial na Química de Carboidratos, especialmente
na síntese de análogos de nucleósidos. Este processo envolveu a formação de uma ligação C–N
glicosídica entre uma nucleobase e um dos percursores acetilados, onde a nucleobase atua como
nucleófilo e o açúcar como eletrófililo. Intermediários como o catião oxocarbenium assistido pelo grupo
éster vizinho, permitem que a substituição do tipo SN1 ocorra estereosseletivamente. Para melhorar a
eficiência da N-glicosilação, foi introduzido o método de silyl-Hilbert-Johnson, que utiliza nucleobases
sililadas, obtidas por meio da reação com hexametildisilazano (HMDS) ou N,Obis(trimetilsilil)acetamida (BSA). Esta abordagem permite melhorar a solubilidade das nucleobases em
solventes orgânicos, resultando em reações mais homogêneas, bem como aumentar a sua nucleofilia.
Catalisadores como triflato de trimetilsililo (TMSOTf) e tetracloreto de estanho (SnCl₄) são
frequentemente utilizados, influenciando as taxas de formação dos isómeros N9 e N7 para purinas, e N1
e N3 para pirimidinas. Relativamente à reação de Staudinger, esta reação promove a conversão de azidas (-N₃) em
aminas (-NH₂). Este método é vital na via sintética levada a cabo, por permitir a obtenção da amina
essencial à síntese dos derivados guanidinilados, especialmente quando a hidrogenação não é uma opção
viável. O mecanismo deste tipo de redução envolve a reação de uma fosfina com uma azida, formando
um intermediário fosfazida que é convertido a um iminofosforano pela saída de nitrogênio molecular,
gerando por hidrólise a amina desejada.
Por fim, dando ênfase à importância desta reação no âmbito desta dissertação, na qual um grupo
guanidina é incorporado a análogos de nucleósidos previamente sintetizados, as reações de
guanidinilação são discutidas. A guanidina é uma base forte e um grupo funcional versátil, sendo a
guanidinilação direta realizada utilizando um derivado de guanidina estrategicamente protegido, como
o N,N'-bis(tert-butoxicarbonil)-N''-trifilguanidina, em presença de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA).
Inspirados pelo amplo leque de aplicações terapêuticas demonstradas pelos análogos de
nucleósidos e nucleótidos, tanto os comercialmente utilizados como aqueles já reportados, alguns
inclusive por nós, é através das técnicas de síntese orgânica, extensamente apresentadas neste relatório,
que surge um novo conjunto de moléculas. As moléculas reportadas apresentam na sua constituição uma
unidade guanidinica acoplada a um análogo de nucleósido, variavelmente funcionalizado nas restantes
posições. Estas serão então testadas para o amplo leque de aplicações terapêuticas pelo qual esta grande
família é conhecida. As análises biológicas terão especial foco para as atividades antiproliferativas de
algumas linhas cancerígenas como o cancro da mama, a leucemia e o cancro colorretal, bem como a
capacidade dos compostos sintetizados para inibir colinesterases.Synthetic analogues of nucleos(t)ides play a crucial role in chemotherapy by acting as prodrugs
that interfere with the biosynthesis of nucleic acids by integrating into nucleic acids, leading to cellular
apoptosis or interrupting viral replication. FDA approved anticancer analogues are mentioned in this
dissertation.
In the context of Alzheimer's disease (AD), nucleoside analogues have demonstrated potential
as cholinesterase inhibitors, primarily inhibiting acetylcholinesterase (AChE). Promising research has
been conducted with new nucleoside analogues containing theobromine and pyranosyl 6'-
isonucleosides, and more recently with azido and guanidine nucleosides synthesized in our research
team. These compounds have shown the ability to selectively inhibit acetylcholinesterase or
butyrylcholinesterase.
Despite their clinical efficacy, nucleoside analogues face challenges such as low oral
bioavailability and resistance of cancer cells due to various mechanisms. To overcome these challenges,
it is essential to develop new nucleoside analogues with better cell permeability and alternative
mechanisms of action.
On the other hand, previous research in our team demonstrated promising results with
xylofuranosidic derivatives containing a guanidine group, exhibiting antiproliferative activity against
cancer cells and inhibitory activity against acetylcholinesterase. These findings suggest the potential of
monosaccharide-based molecules containing guanidine, particularly nucleoside analogues, in both
anticancer therapies and treatments for AD.
Motivated by these results, this Master’s Dissertation aims to synthesize compounds that
combine nucleosidic structures with a guanidine unit. The planned molecules have a purinic or
pyrimidinic derivative linked to the anomeric position of a xylofuranose or D-glucuronamide unit, as
well as a guanidine group connected to a terminal position (C-5) of the glycosylic unit or the nitrogenous
base. The synthesis pathways involve the preparation of 1,2-di-O-acetylated glycosyl donors of
xylofuranose and N-substituted and functionalized D-glucuronamide in the desired positions, which will
be subsequently coupled with nitrogenous base derivatives. Key reactions in these synthesis pathways
include azidation, guanidinylation, and N-glycosylation
The mechanism of nonsense-mediated mRNA decay and its players
No full textTese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA expressão génica nos seres vivos tem como objetivo a transferência da informação proveniente dos
ácidos desoxirribonucleicos (DNA) para RNA mensageiro (mRNA) e, a partir deste, proceder à síntese
proteica. Por ser um processo complexo, é preciso haver uma regulação contínua de forma a impedir a
passagem de erros. O decaimento de RNA mensageiro mediado por codões nonsense (NMD) é
considerado um de vários mecanismos de vigilância celular, tendo duas funções: 1) identificação e
degradação de transcritos que contêm codões de terminação prematura da tradução (PTC), evitando a
produção de proteínas truncadas que podem ter efeitos deletérios na célula e 2) regulação de mRNAs
fisiológicos (codificantes de proteínas funcionais) em resposta às necessidades celulares, mantendo a
qualidade da expressão génica. Acredita-se que este mecanismo influencia os níveis de expressão de
aproximadamente 10 % dos transcritos em eucariotas, estando implicado em vários processos biológicos
que moldam o respetivo programa de expressão génica. Além disso, acredita-se que um terço das
mutações encontradas em doenças genéticas humanas, incluindo o cancro, resultam em transcritos
portadores de PTC, que podem ser eliminados por NMD.
No NMD, há vários fatores envolvidos que podem atuar de diferentes maneiras, dependendo do conjunto
de transcritos a regular, contribuindo para a diversificação deste mecanismo em dois modelos principais:
NMD dependente do complexo da junção exão-exão (EJC) e NMD independente de EJC.
Adicionalmente, vários estudos têm observado a ramificação deste mecanismo aquando da depleção de
uma das proteínas intervenientes, havendo a utilização de caminhos alternativos pelos outros fatores
para que se dê a cascata de reações. Por conseguinte, acredita-se que o modelo da via de NMD
dependente de EJC se possa diversificar, por sua vez, em duas vias: uma, dependente da proteína upframeshift 3B (UPF3B) e da proteína do gene 3 candidato à suscetibilidade ao cancro (CASC3); e outra,
dependente da UPF2 e da proteína de ligação a RNA com domínio 1 rico em serina (RNPS1). Ambas
RNPS1 e CASC3 são proteínas associadas ao EJC. No modelo de NMD independente de EJC, há
atuação da UPF3B em associação com UPF2 sem o envolvimento de EJC.
De uma forma geral, após reconhecimento do transcrito, o mecanismo de NMD é ativado, havendo
interação do fator UPF1 com os fatores de terminação da tradução 3 e 1 (eRF3 e eRF1), associados ao
complexo proteico de tradução, e, ainda, com o supressor de efeito morfológico na genitália 1 (SMG1),
formando o complexo SURF. Este complexo irá interagir de forma variável, dependendo dos fatores
envolvidos na reação e, consequentemente, do ramo. Independentemente destes acontecimentos, a
interação destes fatoresirá formar o complexo de indução de decaimento (DECID) e, consequentemente,
a fosforilação da UPF1 pela SMG1, conduzindo ao recrutamento das SMG6 ou SMG5/7, que
desencadeiam a degradação do transcrito.
Alguns estudos identificaram que uma das enzimas envolvidas nesta última etapa é a exoribonuclease
3'-5' independente do exossoma – DIS3L2. Esta enzima está associada a vários processos celulares como
a divisão celular e carcinogénese, assim como ao desenvolvimento de síndrome de Perlman.
O presente estudo visa esclarecer como a proteína DIS3L2 atua no NMD e a sua relação com os vários
ramos deste mecanismo.
No nosso primeiro objetivo, pretendeu-se analisar a correlação entre os diferentes ramos do NMD e a
sua expressão nos cancros do útero e cólo do útero. Para tal, efetuou-se uma análise bioinformática de
dados transcritómicos disponíveis publicamente na plataforma Xena, comparando a expressão de cada
um dos transcritos que codificam para proteínas especificas dos diferentes ramos de NMD — UPF2,
RNPS1, UPF3B e CASC3 — em tecido saudável e cancerígeno, no útero e no cólo do útero. Detetámos
a sobreexpressão do mRNA de RNPS1 e UPF3B em tecidos do cancro de cólo do útero e do útero.
Contrariamente, observou-se níveis baixos de mRNA de CASC3 nas amostras destes dois cancros,
comparativamente com os respetivos níveis em amostras saudáveis. Apesar de não podermos concluir a sua função nestes tecidos, estes três fatores poderão ter um grande potencial clínico como possíveis
biomarcadores de cancro do cólo do útero e do útero e como alvos terapêuticos. Quanto à expressão de
UPF2, embora com diferenças estatisticamente significativas nos seus níveis de mRNA, a gama em que
se encontram os valores observados é muito semelhante entre células saudáveis e cancerígenas nos
tecidos de cólo do útero e de útero e, consequentemente, não podemos concluir o efeito de UPF2. Com
base nestas análises, não se detetou nenhum efeito conjunto a nível de ramos de NMD, sendo que fatores
que constituam o mesmo ramo obtiveram expressões de mRNA diferentes consoante tecido saudável e
cancerígeno. Era de esperar que fatores que constituíssem o mesmo ramo tivessem efeitos semelhantes
aquando da análise da sua expressão transcricional, mas não foi isso que se observou. Desta forma, não
se pode concluir que no cólo do útero e no útero, haja uma atuação especifica de um ramo ou outro do
NMD, mas sim que cada fator se comporta de maneira diferente e, consequentemente, podem influenciar
o próprio mecanismo a atuar positiva ou negativamente na tumorigénese.
O segundo objetivo do estudo teve como intuito investigar em qual dos ramos de NMD, DIS3L2
funciona, em particular, perceber se há uma associação especifica entre DIS3L2 e os ramos de NMD
dependentes de UPF2 e UPF3B (independente de EJC) ou dependentes de UPF2 e RNPS1. Para tal,
selecionou-se, com base nos resultados obtidos em Garcia-Moreno et al. e na literatura disponível, cinco
transcritos-alvo cuja modulação é específica de DIS3L2 e de um fator de cada ramo de NMD (UPF2,
RNPS1 e UPF3B). De seguida, procedeu-se ao silenciamento (KD) singular e combinado de três dos
fatores envolvidos no NMD — UPF2, RNPS1 e UPF3B — e de DISL32 na linha celular HeLa. Após a
avaliação da eficiência de KD, analisou-se o nível de expressão dos transcritos-alvo por transcrição
reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) semiquantitativa em todas as condições
de KD efetuadas. Os respetivos níveis de expressão de mRNA observados por eletroforese foram
quantificados, mas os valores obtidos apresentaram grandes discrepâncias entre replicados, pelo que as
diferenças não foram estatisticamente significativas, o que invalidou a interpretação biológica. Na
verdade, este estudo carece da otimização de diversas condições como a baixa eficiência de
silenciamento que se verificou em alguns dos ensaios e a análise da expressão dos transcritos feita por
RT-PCR, técnica pouco rigorosa, o que pode ter causado a incongruência observada nos resultados dos
ensaios. Assim sendo, não se conseguiu determinar se DIS3L2 atuava em associação com algum dos
ramos de NMD.
Relativamente ao terceiro objetivo, este estudo visou testar que região genómica de transcritos-alvo de
NMD é responsável pelo acionamento da degradação por DIS3L2. Para tal, recorreu-se a um sistema de
construções génicas contendo diferentes combinações das regiões genómicas 5’ e 3’ não traduzidas
(UTR) e codificante do gene GADD45A (alvo conhecido de NMD e DIS3L2), clonadas às do gene beta
()-globina (HBB) (resistente ao NMD e à DIS3L2), com o intuito de formar quatro genes-híbridos e,
sequencialmente, analisar os seus níveis de expressão. Esta análise teve como base resultados anteriores
no grupo, em que se avaliou os níveis de expressão de genes-híbridos contendo combinações de regiões
genómicas dos genes referidos anteriormente, mas cuja região codificante pertencia ao gene HBB.
Verificou-se que a 3’UTR tornava o transcrito mais suscetível à ação de degradação da proteína DIS3L2.
Isto poderá estar relacionado com as proteínas terminais uridiltransferases, que adicionam
oligonucleótidos de uracilo na extremidade 3’ dos transcritos, os quais são reconhecidos pela DIS3L2.
De forma a continuar este estudo, procedeu-se à clonagem dos quatro genes híbridos referidos
anteriormente. Contudo, apenas conseguimos obter três dos quatro construtos inicialmente planeados.
Apesar das várias otimizações feitas durante o processo, não se conseguiu clonar o construto
5’HBB_GADD45A ORF_3’GADD45A.
Em suma, os resultados dos últimos dois objetivos são inconclusivos, havendo necessidade de otimizar
algumas das técnicas efetuadas e continuar com as experiências em falta para obter conclusões
definitivas. Em todo o caso, observámos uma possível associação entre alguns fatores (UPF3B, RNPS1 e CASC3) de NMD e os seus níveis de mRNA em amostras de cancro do útero e do cólo do útero. Por
conseguinte, o papel que o NMD tem ao nível tumorigénico e, como se relaciona com a DIS3L2 na
degradação dos seus diferentes alvos, poderá revelar novos pontos de partida para o desenvolvimento
de futuras estratégias terapêuticas.Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a post-transcriptional surveillance mechanism harbouring
two functions: identification and degradation of transcripts containing premature translation-termination
codons (PTC), preventing deleterious effects in the cell; and downregulation of mRNAs in response to
cellular needs, maintaining the quality of gene expression. One-third of gene mutations in human genetic
diseases, including cancer, are due to nonsense mutations or frameshift that result in transcripts
harbouring nonsense codons and can be eliminated by NMD. The several factors involved in this
mechanism may act in diverse ways depending on the set of transcripts to be regulated, contributing to
the branching of this pathway. Cytoplasmic DIS3 exosome independent 3′-5′ exoribonuclease 2
(DIS3L2) has been reported as one of the factors to induce NMD targets decay. Therefore, this study
aims to enlighten how DIS3L2 functions in NMD: i) analyse the correlation between the distinct
branches of NMD and cervical and uterus cancer; ii) investigate which branch guides DIS3L2-mediated
degradation; and iii) test which region of the NMD/DIS3L2-targets mediate DIS3L2 degradation
through a system of hybrid-genes. For our first aim, we detected no correlation between any of the
branches of NMD and uterus and cervical cancer. Each factor acts independently. In our second
objective, we analysed the mRNA expression of five transcripts, but none displayed a significant
alteration in their expression to infer a correlation between DIS3L2 and a particular NMD branch.
Relatively to the last aim, we successfully cloned three out of the four constructs but due to time
constrictions we could not continue. Nonetheless, further testing is needed to better understand this
mechanism and how transcript degradation is mediated, including the diverse factors needed for its
activation, which might be the key to future advanced therapeutic strategies