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Towards the development of antimicrobial peptides active against bacterial biofilms
No full textAntibiotic-resistant bacteria are rapidly emerging, and the number of available therapeutic options to fight them is decreasing. In addition, as a surviving strategy, bacteria can aggregate and form biofilms, a multicellular community embedded in a self-produced matrix of extracellular polymeric substances (EPS), which contributes significantly to the reduced susceptibility of bacteria towards conventional antibiotics and innate host defenses. It has been estimated that biofilms are responsible for most infections in tissues and are also recurrent colonizers of biomedical devices. Hence, the identification of novel antimicrobial agents capable to fight infections caused by resistant bacteria and bacterial biofilms is urgently needed. Antimicrobial peptides (AMPs) have been proposed as promising therapeutic alternatives to conventional antibiotics due to their broad-spectrum activity, fast-killing kinetics, and distinct mechanisms of action. In general, AMPs selectively target and kill bacteria through membrane-disruptive mechanisms, thus their activity is independent of the cellular metabolism. This feature confers AMPs the ability to act on dormant populations, which are frequently found in biofilms and are particularly difficult to target by conventional antibiotics. Taking advantage of the fact that viral proteins are an underexplored source of bioactive peptides with antimicrobial properties and based on the knowledge that cell-penetrating peptides (CPPs) can act as AMPs, the present work identified one viral-derived peptide, vCPP2319, active against bacteria in the planktonic and biofilm forms. The peptide was able to effectively kill bacteria through a mechanism of action involving bacterial membrane permeabilization. Nonetheless, vCPP2319 had a limited effect on the biofilm EPS matrix itself. Thus, biofilm treatment with vCPP2319 and a matrix-degrading enzyme, α-amylase, was studied. This combination did not improve the antibacterial action of the peptide. Given the knowledge that cyclization of bioactive peptides is a promising approach for improving peptides’ stability and bioactivity, the antibiofilm activity of the cyclic peptide, [G1K,K8R]cGm, was investigated against S. aureus biofilms. The peptide was able to kill biofilm-embedded cells in a concentration-dependent manner. Mechanistic studies showed that [G1K,K8R]cGm causes morphological changes on bacterial cells and permeabilizes their membranes with a half time of 65 min. Also, we tested an analogue of [G1K,K8R]cGm without disulfide bonds, and a linear unfolded analogue, and found both to be inactive. This finding suggests that the three dimensional structure of [G1K,K8R]cGm and its stabilization by disulfide bonds are essential for its antibacterial and antibiofilm activities. Overall, this study demonstrates the potential of viral proteins as rich sources of new bioactive peptides with antibacterial and antibiofilm properties. In addition, peptide backbone cyclization proved to be valuable strategy to enhance AMPs activity against preformed biofilms
Análise de segurança do filtro solar salicilato de octilo (salicilato de 2-etil-hexilo) em Oftalmologia
No full textSkin cancer is one of the most prevalent cancers in the world. Chapter 1 introduces the Eyelid and Conjunctiva Epithelial Tumours: A Review of Risk Factors and Primary Prevention Options. Risk factors associated with the development of eyelid and conjunctiva epithelial tumours were identified. Data of two studies were presented in Chapter 2, namely, Incidence of malignant eyelid skin tumours in Centro Hospitalar de Setúbal, Portugal: a 6-year-period review (2015-2021). In addition, are we capable of contributing to the reduction of eyelid basal cell carcinoma? Building a healthcare team in Portugal. Given the complexity of eyelid tumours, in Chapter 3, preliminary formulations with octyl salicylate (OS) are proposed for preventive use of the appearance of eyelid tumours caused by UVB radiation. In this preliminary phase, formulations that did not suit the ideal organoleptic characteristics for the continuation of the work were discarded. In order to optimize the physical stability and homogeneous appearance, without changing the composition percentage of the prepared preliminary formulations, in Chapter 4 a new preparation methodology was applied, then such formulations were optimized and characterized. Regarding the safety and toxicity analysis of the selected formulation (B5), Chapter 5 describes the procedures for the safety analysis in ophthalmology of the OS component present in the formulation. The EpiOcularTM method has shown lack of toxicity and absence of ocular irritation. In Chapter 6, Pharmacist-physician Collaboration on Prevention and Treatment of Eyelid Basal Cell Carcinoma, in order to explore the relevance in the exchange of communication of the professional practice of pharmacists and physicians to impact the prevention and treatment of Basal cell carcinoma, the most common skin cancer in the world, which constitutes 85-95% of malignant tumours particularly located in the epithelial eyelids. All the findings described in this work allowed to conclude (Chapter 7) that the preliminary formulation of the sunscreen based on of OS in particular using methyl--cyclodextrin presents safety to use in humans and that the innovative model collaborative between pharmacist-physician in Ophthalmology is effective in the development of health
Dimensionality reduction methods : an application to gene expression data in cancer diseases
No full textTrabalho de Projeto de Mestrado, Bioestatística, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA variação da expressão de genes ao longo do tempo pode ser considerada ao examinar como o organismo responde a doenças. O cancro é uma das doenças mais mortais e muitas pessoas morrem por
todo mundo por causa desta doença. É do conhecimento comum que o cancro ocorre devido a um distúrbio genético, sendo o estudo da expressão dos genes de grande importância. A expressão genética nada
mais é do que o nível de produção de moléculas de proteínas definidas por um gene. Assim, os dados
de expressão genética têm se revelado de grande importância na investigação e diagnóstico de doenças
oncológicas. No entanto, a recolha de dados através de perfis de expressão genética leva investigadores
a considerar dezenas de milhares de genes. A elevada quantidade de características a considerar para
cada medição complica a análise deste tipo de dados por uma abordagem estatística (em modelos de
regressão). Neste caso, os dados tornam-se menos relevantes para explicar como a expressão varia entre
genes. Caso o número de genes exceda a amostra de indivíduos, surge o problema da elevada dimensionalidade. Em um conjunto de dados de elevada dimensionalidade, as observações com respeito a cada
indivíduo são obsoletas em uma análise estatística desses dados. Isto torna-se um desafio na utilização
de dados de expressão genética na investigação de doenças, assim como a sua utilidade para fins terapêuticos. No sentido de aperfeiçoar a tomada de decisões de tratamento, é necessário aplicar técnicas
que lidem com a elevada dimensionalidade destes dados. Na literatura existem várias metodologias de
redução de dimensionalidade que abordam este problema. No entanto, o mesmo não acontece quando
consideramos dados longitudinais de expressão genética, em que pode existir uma grande diferença entre a ordem de grandeza do número de variáveis e de indivíduos. Técnicas de regularização são uma
solução que consiste na introdução de restrições ao problema de optimização. Isto leva à exclusão de
parâmetros de regressão associados a genes e consequentemente à esparsidade do modelo. Os métodos
a utilizar na análise destes dados terão ainda de cumprir pressupostos relativamente à interpretação dos
parâmetros do modelo. Será por isso necessário abordar métodos aplicáveis à construção dos tipos de
modelo mais úteis na análise de dados longitudinais (modelos marginais e modelos de efeitos mistos).
Com este trabalho pretende-se aplicar metodologias existentes com base em regularizadores a dados
longitudinais de elevada dimensão, em particular a dados de expressão genética. Para tal são utilizados
microarrays provenientes de dados públicos e de simulação. Os dados públicos a que se teve acesso são
aqui designados por dados CDC15 e dados Glue Grant.
O conjunto de dados CDC15 (Spellman et al., 1998) visa criar uma lista abrangente de genes de
levedura Saccharomyces cerevisiae cujos níveis de transcrição variam periodicamente dentro do ciclo
celular, usando microarrays de ácido desoxirribonucleico (ADN) e amostras de culturas de levedura.
Nestes dados constam métricas correspondentes aos níveis de ácido ribonucleico mensageiro (mARN)
em todo o genoma de 6178 quadros de leitura abertos de levedura (segmentos de genes) em um período
de dois ciclos celulares. As medições foram realizadas em 18 instantes, abrangendo as 5 etapas do
processo do ciclo celular. Este é um processo de vida regulado onde a célula cresce, replica o seu ADN e
se prepara para a divisão celular. As fases que geralmente dividem o ciclo celular são M/G1, G1, S, G2, e M. Aqui M significa mitose, G1 para GAP 1 (quando a célula aumenta de tamanho), S refere-se a síntese
de ADN, e G2 significa GAP 2 (quando a célula se prepara para se dividir). Foram identificados 800
genes que atendem a um critério mínimo para regulação do ciclo celular. Porém, para entender melhor o
fenómeno subjacente ao processo do ciclo celular, é importante identificar fatores de transcrição (FT) que
regulam os níveis de expressão genética de genes regulados no ciclo celular. Esses FT são essencialmente
proteínas que controlam a regulação de genes, determinando a taxa de transcrição da informação genética
do ADN para o mARN. Os dados incluídos no pacote PGEE para o software R caracterizam 283 genes
regulados no ciclo celular (unidades de estudo) através das probabilidades de ligação estandardizadas
de 96 FT, medidas em 4 instantes durante a fase G1. Além das variáveis explicativas e de resposta, os
conjuntos de dados longitudinais no formato longo também incluem colunas que especificam a unidade
de estudo e o instante de tempo.
O programa de investigação colaborativa Glue Grant é um estudo sobre inflamação e resposta à
lesão (Natasa Rajicic et al., 2006) que investiga as razões biológicas pelas quais os pacientes podem
apresentar resultados dramaticamente diferentes após sofrer uma lesão traumática. Este estudo faz uso
de dados de expressão genética para prever o tempo de recuperação dos pacientes. Assim, o objetivo
é identificar os genes que mostram maior atividade ao longo do período de recuperação. Estes dados
foram recolhidos durante um período de acompanhamento de 28 dias (a partir do momento em que cada
paciente relata lesão traumática e é admitido no ventilador). Os pacientes são medidos em 7 instantes de
tempo correspondentes aos dias 0, 1, 4, 7, 14, 21 e 28. A amostra contém a expressão de 54.675 genes
medidos no máximo em 7 instantes de tempo dos 168 pacientes com lesão traumática que participaram
no estudo. Também consta o número de dias passados no ventilador e na unidade de terapia intensiva.
São ainda fornecidos detalhes complementares sobre os pacientes, como idade e sexo.
A estrutura de ambos os conjuntos de dados longitudinais públicos usados neste trabalho consiste
na medição da expressão de milhares de genes com uma variável que a ordena cronologicamente (em
formato long). É ainda importante que conste o estado clínico (evento de interesse) nos mesmos instantes
que as medições, pois isto também varia no decorrer do estudo. Outras características que não variam
com o tempo também poderão estar incluídas, como biometria e identificação dos indivíduos disponível
no conjunto de dados Glue Grant. Para além do carácter dos dados também é importante conhecer a razão
pela qual os indivíduos não foram observados o mesmo número de vezes caso tal aconteça (mecanismo
de omissão de dados). Os métodos utilizados na análise de dados longitudinais que toleram valores
omissos poderão lidar com estes assumindo um certo mecanismo de omissão de dados.
O processamento, análise e simulação de dados será realizada através do software R. Nomeadamente
será usada a implementação de equações de estimação generalizadas penalizadas (PGEE) com o pacote
PGEE, e os pacotes glmmixedlasso e glmmlasso que implementam métodos de regularização de tipo
lasso baseados na verosimilhança. Com estes métodos poderão ser ajustados modelos marginais, através
do PGEE, e modelos de efeitos mistos através de regularizadores de tipo lasso. O PGEE consiste na
reformulação das equações de estimação generalizadas, com a introdução de um termo de penalização
(smoothly clipped absolute deviation). Quanto aos métodos baseados na verosimilhança, o problema
de otimização consiste em um termo proporcional à função de verosimilhança e na norma L1 do vetor
de parâmetros de regressão. Para todos os métodos utilizados neste trabalho o termo de penalização é
ajustado por um parâmetro λ, pelo que é necessário considerar apenas o valor de λ correspondente ao
modelo que revela melhores resultados. Neste trabalho, este valor foi determinado através de validação
cruzada em 3 e 5 etapas, utilizando o conjunto de treino.
Os modelos obtidos na análise para cada metodologia serão ainda utilizados para comparar o seu
desempenho quanto à esparsidade e qualidade de ajustamento. As métricas usadas na comparação do seu desempenho quanto à qualidade de ajustamento são a área de curvas ROC (AUC), para respostas
binárias. Para respostas contínuas os modelos serão avaliados pela raíz do erro quadrático médio (RMSE)
e erro absoluto médio (MAE). A comparação de modelos com base nestas métricas será importante
para identificar as vantagens de aplicar um método em relação a outros, e estimular o desenvolvimento
de novas metodologias com base na crítica. Com este tipo de abordagem pretende-se contribuir para o
desenvolvimento de ferramentas médicas para prestar tratamento personalizado a pacientes oncológicos.Gene expression data has proven to be of great importance in the research and diagnosis of cancer
diseases. In order to improve treatment decision making, it is necessary to apply techniques that
handle the high dimensionality of the data. In the literature there are several dimensionality reduction
methodologies that address this problem. However, this is not the case when we consider highdimensional longitudinal data. This work aims to apply existing methodologies based on regularizers
for high-dimensional longitudinal data, particularly to gene expression data. For this we use microarrays
from public and simulated data. Data processing, analysis and simulations will be performed using the
R software. The models built in the analysis corresponding to each methodology will also be used to
compare their performance in terms of sparsity and goodness of fit. Considering marginal models we
use penalized generalized estimating equations (PGEE), whereas linear mixed models are built with
the methods GLMMLasso and glmmlasso. With this type of approach, we aim to contribute to the
development of medical tools to provide personalized treatment to cancer patients
How do urban green space designs shape avian communities? Testing the area–heterogeneity trade-off
No full textIn cities, green areas are essential for biodiversity conservation, with land cover heterogeneity being a decisive factor. Yet, as heterogeneity increases for a given green area, the patch size of land covers automatically decreases, as the area available for individual species, especially habitat specialist species. This relationship, known as the area-heterogeneity trade-off, is expected to lead to a unimodal relationship between species richness and land cover heterogeneity, and contrasted effects between species according to their level of urban avoidance.
We investigated the potential consequences of this trade-off on birds in green areas selected along an urban intensity gradient in six European cities. Using a European database on bird occurrences in nesting habitats, we defined a continuous gradient of urban avian avoidance.
We confirmed the marked area-heterogeneity trade-off in urban green areas but found no effect of land cover heterogeneity on total avian richness at green area level. However, both land cover heterogeneity and patch size were positively associated with richness of urban avoider species, indicating that urban avoiders fared better in green areas with large and heterogeneous patches. Total richness was also higher in green areas surrounded by an urban matrix composed of a variety of land covers.
To protect urban bird avoiders, which are most at risk in cities, green area managers and urban planners should thus be aware that land cover heterogeneity is not a panacea if patch sizes are too small. To conserve avian richness, we stress the importance of maintaining large vegetated areas as well as heterogeneity in land covers within the urban matrix.info:eu-repo/semantics/acceptedVersio
Desafios regulamentares na sustentabilidade de produtos cosméticos
No full textTese de mestrado, Cosmetologia Avançada, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.De acordo com a legislação da União Europeia aplicável aos produtos cosméticos, um cosmético para ser colocado no mercado tem de ser seguro, eficaz e de qualidade comprovada. No entanto, a legislação atual aplicável a estes produtos é omissa relativamente à sua sustentabilidade. No seguimento do compromisso da União Europeia com o desenvolvimento sustentável, estão previstas várias alterações legislativas de modo a dar cumprimento aos objetivos traçados para as metas de sustentabilidade. Estas alterações serão transversais a todos os setores da União Europeia, incluindo o setor cosmético. Adicionalmente, prevê-se também uma revisão do Regulamento (CE) Nº1223/2009, relativo aos produtos cosméticos. Deste modo, torna-se essencial o estudo e seguimento destas alterações legislativas de modo que as empresas do setor cosmético possam dar cumprimento às suas obrigações legais. Esta dissertação pretende sumarizar as principais alterações previstas neste âmbito, com vista à elaboração de um plano de comunicação que permita promover e facilitar o alinhamento das empresas do setor com as novas exigências regulamentares.According to the European Union legislation applicable to cosmetic products, a cosmetic must be safe, effective, and of proven quality in order to be placed on the market. However, current legislation regarding these products does not specifically address their sustainability. Following the European Union's commitment to sustainable development, several legislative changes are expected to meet the goals set for sustainability targets. These changes will be cross-sectoral across all European Union industries, including the cosmetic sector. Additionally, a review of Regulation (EC) No 1223/2009 concerning cosmetic products is anticipated. Therefore, it is essential to study and monitor these legislative changes so that companies in the cosmetic sector can meet their legal obligations. This dissertation aims to summarize the key anticipated changes in this regard, to develop a communication plan that promotes and facilitates the alignment of companies in the sector with the new regulatory requirements
Quality and regulatory considerations for the manufacture and banking of clinical GRADE iPSCs: The EU AND US perspectives
No full textTese de mestrado, Regulação e Avaliação do Medicamento e Produtos de Saúde, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Introdução: A descoberta de células estaminais pluripotentes induzidas (induced pluripotent stem cells) e a sua capacidade de diferenciação em diferentes tipos de células, revolucionou a medicina regenerativa, tornando-se crucial o desenvolvimento de protocolos que permitam o seu fabrico em conformidade com as Boas Práticas de Fabrico. As terapias celulares alogénicas derivadas de iPSCs, são neste momento a opção de fabrico preferencial. Esta opção requer o estabelecimento de bancos celulares mestre de iPSCs qualificados para aplicação clínica.
Objetivos: No presente estudo pretendeu-se rever os requisitos Regulamentares e de Qualidade das duas principais jurisdições mundiais – Europa e Estados Unidos – no que diz respeito ao fabrico de bancos celulares mestre de iPSCs para aplicação clínica. Os requisitos mínimos aplicáveis às iPSCs para validar a sua utilização em ensaios clínicos iniciais “first-in-human” foram também revistos, bem como as melhores práticas atualmente seguidas pelos fabricantes para a caraterização analítica de iPSCs.
Metodologia: A metodologia seguida neste trabalho foi a revisão de diferentes fontes de informação que incluíram a literatura científica, orientações publicadas e disponíveis nos sites da EMA e da FDA, orientações GMP e ICH, e as monografias compendiais aplicáveis.
Conclusão: Os fabricantes de bancos celulares de iPSCs que pretendem a sua qualificação para aplicação clínica, fundamentam-se nas orientações ICH procurando adaptar os seus os seus requisitos. Com especial impacto, as áreas seguintes deveriam ser objeto de orientação e harmonização: i) os vetores de expressão autorizados para a criação das iPSCs; ii) testagem mínima para identificação; iii) testagem mínima para avaliação de pureza (incluindo testagem de agentes adventícios) e iv) avaliação da estabilidade. As ICH atuais referentes a produtos biotecnológicos/biológicos deveriam ter o seu âmbito alargado para incluir a aplicação a bancos de células usados para terapias celulares.Introduction: The discovery of induced pluripotent stem cells (iPSCs) and the development of protocols for their differentiation in different cell types have revolutionized regenerative medicine. Developing manufacturing protocols for safe and GMP-compliant final products has become crucial. The allogeneic iPSCs-derivative cell therapies are now the preferred production alternative. This option requires the establishment of clinical-grade Master Cell Banks of iPSCs.
Objectives: The present study aimed to review the Quality and Regulatory requirements from the two main jurisdictions in the world - Europe and the United States - concerning the manufacture of clinical grade Master Cell Banks (iPSCs). The minimum requirements applicable to iPSCs for use in “first-in-human” clinical trials, were also reviewed, as well as current best practices followed currently by manufacturers of iPSCs banks, for final product characterization.
Methodology: The methodology used for this work was the review of different sources of information ranging from scientific literature; published guidance documents available on the EMA and FDA websites; GMP and ICH guidelines; and applicable compendial monographs.
Conclusion: The manufacturers of iPSC cell banks looking to qualify them for clinical use, turn to ICH guidelines and try to adapt their requirements. Specifically with impact in the field of iPSC cell banks, the following areas should be the object of orientation and harmonization: i) expression vectors authorized for iPSC creation; ii) minimum identity testing; iii) minimum purity testing (including adventitious agents testing) and iv) stability testing. Current ICH guidelines for biotechnological/biological products should be expanded to include application to cell banks used for advanced cell therapies