Repositório Científico de Acesso Aberto da ULisboa
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Splicing modulation to rescue the repair activity of a biallelic BRCA2 mutant in a patient derived cell line
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024Através de splicing alternativo, um conjunto de transcritos de BRCA1 e BRCA2 expressos em células portadoras de variantes associadas ao cancro hereditário pode codificar proteínas internamente truncadas, mas funcionais. Até à data, uma análise sistemática da abundância e funcionalidade das proteínas resultantes de isoformas de splicing específicas ainda não foi realizada. Aqui, usámos a variante BRCA2:c.681+5G>C, que induz o skipping do exão 8, como modelo. Tirando proveito da alta precisão e sensibilidade do “One-step droplet digital RT-PCR” (ddRT-PCR), identificámos e quantificámos duas isoformas de mRNA específicas da variante expressas em células homozigóticas para a variante alélica. A isoforma de transcrito mais abundante apresenta alteração do quadro de leitura, a qual gera um codão de terminação prematuro (PTC) resultando na sua degradação por “nonsense-mediated mRNA decay” (NMD). Uma isoforma alternativa, menos abundante, foi identificada. Esta apresenta recuperação do quadro de leitura, prevendo-se que codifique uma proteína internamente truncada, sem domínios não essenciais. No entanto, apesar da presença da proteína BRCA2, avaliada por “WesternBlot”, as células portadoras da variante em homozigotia apresentam defeitos na reparação do DNA. Para testar a hipótese de que a isoforma de splicing menor não produz proteína BRCA2 com capacidade funcional suficiente, usámos edição genómica mediada por CRISPR-Cas9 para induzir o “skipping” do exão 7 nas células mutantes, visando a produção de transcritos com o quadro de leitura corrigido. Em comparação com as células derivadas dos doentes, as células editadas geneticamente formaram significativamente mais focos de RAD51 após exposição ao etoposido e mostraram significativamente menos quebras cromossómicas induzidas por mitomicina C. Estes resultados apresentam uma evidência para o potencial terapêutico da modulação de “splicing”, através da indução da produção de transcritos com o quadro de leitura correto mesmo que truncados em alguns exões não essenciais, como estratégia para resgatar a função de BRCA2 em células mutantes, prevenindo assim o desenvolvimento de cancro.Through alternative splicing, a subset of BRCA1 and BRCA2 transcripts expressed in cells harboring genetic variants associated with hereditary cancer may encode internally truncated, yet functional proteins. To date, a systematic analysis of variant-specific splicing isoform abundance and functionality of the encoded protein has not been performed. Here, we used the BRCA2 c.681+5G>C variant, which induces skipping of exon 8, as a model system. Taking advantage of the high precision and sensitivity of Onestep droplet digital RT-PCR (ddRT-PCR), we identified and quantified two variant-specific mRNA isoforms expressed in cells homozygous for the variant allele. The most abundant transcript is out-of-frame, contains a premature termination codon (PTC) and is targeted for degradation by the nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway. A less abundant isoform maintains the reading frame and is predicted to encode an internally truncated protein lacking non-essential domains. However, despite the presence of BRCA2 protein, as assessed by immunoblot, homozygous mutant cells were defective in DNA repair. To test the hypothesis that the minor splicing isoform does not produce sufficient BRCA2 activity level, we used CRISPR-Cas9 gene editing to induce skipping of exon 7 in mutant cells, thereby increasing the expression of in-frame transcripts. Compared to the parental patient-derived cells, the gene-edited cells formed significantly more RAD51 foci after exposure to etoposide and showed significantly less chromosome breaks induced by mitomycin C. These results provide evidence for the therapeutic potential of splicing modulation, by inducing the expression of in-frame transcripts that lack non-essential exons, as a strategy to rescue BRCA2 function in mutant cells, thereby preventing the development of cancer
Post-stroke pathological laughing and crying during cognitive inhibitory control tests : case report
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024O Riso e Choro Patológico (PLC) constitui uma perturbação comportamental, caraterizada por episódios, súbitos e incontroláveis, de riso e/ou choro incongruentes com o estado emocional do doente. É uma condição que afeta significativamente o quotidiano dos doentes, uma vez que se manifesta sob a forma de expressão emocional exagerada e, muitas vezes, em contextos sociais inadequados. Pode ocorrer associada a várias doenças do foro neurológico, como o Acidente Vascular Cerebral (AVC). Acredita-se que os tratos corticobulbares inibitórios sejam os mais afetados nos doentes com PLC. Mais recentemente, foi possível associar a PLC à disfunção de uma rede cortico-límbica-subcortico-talamo-ponto-cerebelar e compreender a PLC como um resultado de uma diasquisis, em que há perda do controlo cortical inibitório sobre um sistema emocional que está afetado. Contudo, a fenomenologia e a fisiopatologia da PLC ainda carecem de uma compreensão mais aprofundada. Este trabalho apresenta um novo aspeto, não previamente descrito, da fenomenologia da PLC. Trata-se de um homem de 63 anos, com uma história prévia de um AVC isquémico protuberancial esquerdo, que iniciou sintomas de PLC após um AVC isquémico no território protuberancial direito. Na avaliação neurocomportamental, o doente apresentava uma caraterística particular - os episódios de riso descontrolado, incongruentes com o humor e com o contexto, aumentavam significativamente durante a realização dos testes de controlo cognitivo inibitório. Esta nova descrição pode contribuir para uma melhor compreensão da fisiopatologia deste fenómeno.Pathological Laughing and Crying (PLC) is a behavioral disorder characterized by sudden, uncontrollable episodes of laughing and/or crying incongruent with the patient’s emotional state. It significantly impacts patients’ daily lives because they usually happen during inappropriate social contexts or manifest as exaggerated emotional expression in terms of intensity and frequency. This condition may be encountered in patients suffering various neurological disorders, including stroke. It is believed that the inhibitory corticobulbar tracts are the most affected in patients with PLC. More recently, it was possible to link PLC with dysfunction in a cortico-limbicsubcortico- thalamo-ponto-cerebellar network. This evidence supports that PLC is a result of diaschisis, causing a lack of inhibitory cortical control over a damaged emotional system. However, more research is needed to better understand the phenomenology and physiopathology of PLC. Our case describes a novel phenomenological aspect, not previously described, of PLC. A 63-year-old man, with a previous history of a left pons stroke, started exhibiting symptoms of PLC after an ischemic stroke in the right pons. On the neurobehavioral assessment, the patient displayed a particular feature - the uncontrolled laughing episodes, that were not congruent with humor or context, significantly increased during the performance of cognitive inhibitory control tests. This new report may contribute to better understand the pathophysiology of this phenomenon
Inflammatory bowel disease in the elderly population : a retrospective cohort study
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024Introdução: A prevalência dos doentes idosos com doença inflamatória intestinal (DII) tem vindo a aumentar. Além disso, a incidência de DII de início tardio (IT) (diagnóstico após os 60 anos de idade) está a aumentar globalmente. A evidência acerca desta subpopulação ainda é escassa. O nosso objetivo com este estudo é descrever as características clínicas da população idosa, bem como comparar os resultados entre doentes com DII-IT e de início precoce (IP). Métodos: Estudo de coorte retrospectivo que incluiu todos os doentes com DII (Doença de Crohn (DC) e Colite Ulcerosa (CU)) seguidos no Hospital Beatriz Ângelo desde 2012 a 2022. Os dados demográficos e clínicos foram obtidos através dos processos clínicos. DII-IT foi definida como diagnóstico após os 60 anos e DII-IP como diagnóstico previamente a essa idade. DII-IT foi definida como diagnóstico após os 60 anos. Os resultados primários incluem complicações relacionadas com a DII (escalar terapêutica, cirurgia, hospitalizações com abcesso/fístula/estenoses na DC; agudizações graves ou extensão proximal da doença na CU), complicações infecciosas e diagnósticos de cancro. Resultados: Um total de 158 doentes foram identificados. Destes, 44% tinham DC e 56% tinham CU. A mediana da idade ao diagnóstico nos doentes DII-IT foi 66 (63-71) e nos doentes DII-IP foi 52 (39-57). Os doentes com DII-IT eram mais frequentemente homens (DII-IT 62% vs DII-IP 46%, p=0,055), apresentaram menos manifestações extra-intestinais (DII-IT 10% vs DII-IP 22%, p=0,010) e tiveram pontuações maiores na avaliação da fragilidade (mFI-5 ≥ 2: DII-IT 40% vs DII-IP 21%, p=0,011). Relativamente às complicações, os doentes com DII-IT apresentaram mais complicações infecciosas (DII-IT 36% vs DII-IP 20%, p=0,034) e apresentaram uma tendência para desenvolvimento mais precoce de complicações relacionadas com a DII (HR 1.53 IC (0.95 - 2.48), p=0,081) e de complicações tumorais (HR 2.27 IC (0.98 - 5.28), p=0,056). Analisando as subpopulações de DC e CU, nos doentes com DC-IT a terapêutica foi menos escalada (DC-IT 69% vs DC-IP 90%, p=0,050). Doentes com CU-IT tiveram mais complicações relacionadas com a DII no geral (CU-IT 54% vs CU-IP 31%, p=0,035) e mais complicações infecciosas (CU-IT 42% vs CU-IP 10%, p<0,001). Conclusão: Doentes com DII-IT apresentaram maior risco de desenvolverem complicações infecciosas e uma tendência para um desenvolvimento mais precoce de complicações relacionadas com a DII e complicações tumorais.Background: The prevalence of elderly patients with inflammatory bowel disease (IBD) is increasing. Additionally, elderly-onset (EO) IBD (diagnosis ≥ 60 years-old) is also rising worldwide. Data is scarce regarding these specific patients. We aimed to describe clinical features of elderly IBD and to compare EO-IBD patients with younger-onset (YO) patients. Methods: Retrospective cohort study including all IBD patients (Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC)) followed at Hospital Beatriz Ângelo from 2012 to 2022. Demographic and clinical data were retrieved from medical charts. EO-IBD was defined by diagnosis ≥ 60 years old and YO-IBD with a diagnosis prior to that age. EO-IBD was defined by diagnosis ≥ 60 years old. Primary outcomes included IBD-related complications (need to escalate therapy, surgery, hospitalizations with abscess/fistula/stricture in CD; acute severe ulcerative colitis episode or proximal disease extension in UC), infectious complications and cancer diagnosis. Results: A total of 158 patients were identified. 44% had CD and 56% had UC. Median age of diagnosis in the EO-IBD patients was 66 (63-71) and in YO-IBD patients was 52 (39-57). EO-IBD patients were more frequently males (EO-IBD 62% vs YO-IBD 46%, p=0,055), presented less extra-intestinal manifestations (EO-IBD 10% vs YO-IBD 22%, p=0,010) and had higher frailty scores (mFI-5 ≥ 2: EO-IBD 40% vs YO-IBD 21%, p=0,011). Regarding outcomes, EO-IBD patients had more infectious complications (EO-IBD 36% vs YO-IBD 20%, p=0,034) and presented a trend towards an earlier development of IBD-related complications (HR 1.53 CI (0.95 - 2.48), p=0,081) and tumour complications (HR 2.27 CI (0.98 - 5.28), p=0,056). When analysing CD and UC separately, EO-CD patients had lower need to escalate therapy (EO-CD 69% vs YO-CD 90%, p=0,050). EO-UC patients had more IBD-related complications overall (EO-UC 54% vs YO-UC 31%, p=0,035) and more infectious complications (EO-UC 42% vs YO-UC 10%, p<0,001). Conclusion: Elderly-onset IBD patients presented a higher risk of infectious complications and trend towards an earlier development of IBD-related complications and tumour complications
Design of innovative ROS-responsive prodrugs
No full textTese de mestrado, Química Medicinal e Biofarmacêutica, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Apesar dos avanços científicos significativos e da grande variedade de tratamentos já disponíveis, o cancro continua a ser uma das principais causas de morte em todo o mundo. A quimioterapia, que é frequentemente um dos primeiros tratamentos a ser oferecido aos pacientes, padece regularmente de baixa seletividade para as células cancerígenas, o que leva ao aparecimento de efeitos secundários. Assim, torna-se imperativo desenvolver alternativas que não danifiquem os tecidos saudáveis e que permitam que os fármacos sejam entregues de forma segura e seletiva às células cancerígenas. Uma maneira de alcançar tal objetivo consiste em utilizar as diferenças existentes entre as células saudáveis e as células normais para direcionar os fármacos para o microambiente tumoral. Comparativamente com as células normais, as células cancerígenas caracterizam-se por apresentarem elevadas concentrações de espécies reativas de oxigénio (ROS) devido ao stress oxidativo a que as mesmas estão sujeitas, resultante da perturbação da homeostase redutiva-oxidativa. Desta forma, no presente trabalho pretendeu-se desenvolver profármacos cuja ativação ocorre especificamente nas células cancerígenas, quando os mesmos entram em contacto com as ROS. Os profármacos desenhados neste trabalho são precursores de dois inibidores de histonas deacetilases (HDACi), o panobinostat e o vorinostat. Para além de sofrerem de instabilidade química e rápida eliminação metabólica, estes agentes anticancerígenos apresentam efeitos secundários e toxicidade nas células saudáveis uma vez que inibem de forma não seletiva a maioria das isoformas desta enzima. Posto isto, os profármacos concebidos poderão ser uma possibilidade para aumentar a seletividade e melhorar as propriedades dos fármacos selecionados.
No desenho de profármacos responsivos às ROS, é importante ter em atenção a escolha do grupo responsável pela ativação. Tal grupo deve ser altamente reativo e selectivo para as ROS, mas deve ser estável até chegar às células cancerígenas, não sendo oxidado antecipadamente. Para além disso, não deve reagir com moléculas endógenas. Já existem diversos grupos reativos às ROS, sendo possível destacar os ácidos e ésteres borónicos como os mais utilizados até ao momento. Todavia, apesar de serem oxidados ao álcool correspondente na presença de ROS, estes dois grupos funcionais apresentam uma aplicabilidade terapêutica limitada pela falta de estabilidade que demonstraram.
Diazaborinas (DABs) são heterociclos de boro e nitrogénio, e são geralmente obtidas através da reação entre hidrazinas e aldeídos ou cetonas aromáticas que possuem um ácido borónico na posição ortho. Por se terem revelado extremamente estáveis em condições biologicamente relevantes, mostrando-se simultaneamente capazes de manter uma reatividade com as ROS semelhante à dos ácidos e ésteres borónicos, estas podem ser utilizadas como alternativas a estes últimos grupos funcionais no desenho de profármacos. Assim, nos profármacos concebidos neste trabalho, a DAB vai ser a unidade capaz de responder a um estímulo (elevados níveis de ROS), para garantir a ativação do profármaco e a libertação seletiva do fármaco ativo nas células cancerígenas. De forma a ser possível obter estes heterociclos de boro e nitrogénio após reação com o ácido 2-formilfenilborónico (2-FPBA), foi necessário proceder a algumas modificações estruturais nos dois HDACi escolhidos. Essas modificações consistiram em converter o ácido hidroxâmico do vorinostat e do panobinostat numa hidrazida. Mais tarde, o análogo do vorinostat foi transformado num outro composto que possuía uma hidrazina em vez de uma hidrazida.
Antes de se proceder à síntese dos análogos dos HDACi e correspondentes profármacos, foi realizado um estudo computacional através de um modelo de machine learning para se obter uma previsão da atividade inibitória dos dois análogos do vorinostat idealizados. Tal como ambicionado, os resultados obtidos neste estudo sugerem que os dois novos compostos mantêm o mesmo tipo de atividade inibitória que a pequena molécula original. Isto significa que os valores de IC50 estimados são semelhantes aos do vorinostat, não sendo esperado que estes análogos sejam seletivos para determinadas isoformas da enzima.
De seguida, começaram por ser sintetizados os análogos do vorinostat e do panobinostat constituídos por uma hidrazida. Apesar de ter sido possível a obtenção de ambos os compostos, a formulação do correspondente profármaco não foi exequível. A análise dos espetros de ressonância magnética nuclear (NMR) e cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espetrometria de massa de alta resolução (HPLC-HRMS) dos produtos obtidos após a reação de cada um destes dois análogos com o 2-FPBA indicou que estas reações não foram tão eficientes como era expectável. Nesses espetros foi identificada a presença de ambos os materiais de partida, sendo que estes estavam em quantidade igual ou superior à da DAB. Tendo em conta estes resultados, pensou-se que ao contrário das hidrazinas, as hidrazidas poderiam não ser os substratos mais adequados para a formação das DABs pretendidas. Assim, posteriormente estudou-se a reação de formação da DAB com recurso ao HPLC-HRMS, utilizando a benzohidrazida e a benzilhidrazina como substratos modelos com o objetivo de tentar compreender de que forma estes poderiam influenciar o produto formado. Verificou-se que quando a reação era realizada com a benzohidrazida, rapidamente era estabelecido um equilíbrio entre os reagentes e o produto, pelo que a concentração das três espécies em solução se manteve constante ao longo do tempo. Para além disso, ao analisar-se a solução após 3 horas de reação, constatou-se que a concentração dos reagentes era superior à da DAB, o que corroborou os resultados anteriormente obtidos. Por outro lado, quando foi utilizada a benzilhidrazina, observou-se um decréscimo na concentração dos dois reagentes e, em simultâneo, um aumento na concentração da DAB ao longo do tempo. Nestas condições, a DAB foi a espécie maioritária identificada na solução após 3 horas de reação. Os resultados descritos sugerem que a formação de DABs derivadas de hidrazinas é mais favorável, tendo impulsionado a idealização de um novo análogo do vorinostat que possuía uma hidrazina em vez da hidrazida.
De seguida, foi sintetizado um novo análogo do vorinostat que possuía uma hidrazina. Não obstante ter sido obtido com sucesso, vários dos passos sintéticos utilizados para a formação deste composto ainda necessitam de ser otimizados. Obtido este análogo, foi possível fazer reagir o mesmo com o 2-FPBA e isolar o correspondente profármaco com um rendimento igual a 65%. Após confirmada a obtenção da DAB, a sua estabilidade hidrolítica foi avaliada a três valores diferentes de pH (5.0, 7.5 e 9.0) através de HPLC-HRMS. Neste estudo, verificou-se que a concentração do composto se manteve praticamente inalterada ao fim de 24 horas nas três condições testadas, sendo um indicativo de que o mesmo era estável. Ainda assim, no futuro este ensaio pode ser repetido para que seja seguido durante um período superior. Por fim, a cinética de oxidação foi estudada numa solução de bicarbonato de amónia 10 mM (pH 7.4) com peróxido de hidrogénio com recurso a análises por HPLC. A oxidação do composto foi observada tanto na presença de 100 equivalentes como na presença de 10 equivalente do oxidante. Em ambas as condições, o tempo de semi-vida ("t" _("1/2, 100 eq " "H" _"2" "O" _"2" )= 1,5 horas e "t" _("1/2, 10 eq " "H" _"2" "O" _"2" ) = 4 horas) e velocidade de reação ("k" _("obs, 100 eq " "H" _"2" "O" _"2" ) = 0.008 min-1 e "k" _("obs, 10 eq " "H" _"2" "O" _"2" ) = 0.001 min-1) alcançados são compatíveis com as possíveis futuras aplicações in vivo.
No entanto, esta estratégia ainda se encontra numa fase inicial, pelo que ainda são necessários mais estudos in vitro. A hidrólise da hidrazona formada após a oxidação da DAB deverá ser avaliada, para confirmar que ocorre a libertação do fármaco ativo. Para além disso, ensaios de inibição enzimática deverão ser realizados com o análogo mais recente do vorinostat nas várias isoformas da enzima, e a atividade inibitória do mesmo deverá também ser avaliada em diferentes linhas celulares cancerígenas. Por fim, o profármaco sintetizado também irá ser testado em diferentes linhas celulares cancerígenas e saudáveis, para que seja possível confirmar a seletividade e especificidade do mesmo para as células cancerígenas.
Em conclusão, os resultados obtidos demonstram que o profármaco desenvolvido neste trabalho poderá vir a ser utilizado como uma nova abordagem promissora e viável para entregar seletivamente fármacos citotóxicos às células cancerígenas. Mais ainda, as DABs provaram ser estruturas com potencial de serem utilizadas como grupos protetores de hidrazinas, compostos conhecidos pela sua elevada toxicidade.Despite significant advances in science and the wide variety of available treatments, cancer remains a major cause of death worldwide. Chemotherapy, which is frequently one of the first-line treatments, suffers from low selectivity to cancer cells and limited efficacy due to the appearance of important side effects. Thus, it becomes imperative to develop a new generation of targeted alternatives that spare healthy tissues by safely and selectively delivering cytotoxic payloads to cancer cells. One way to accomplish this goal consists of designing therapeutic agents that target biological events specific to cancer cells. Given that cancer cells are characterized by high ROS concentrations, this work aimed to develop a new generation of improved ROS-responsive prodrugs.
In this work, a diazaborine scaffold was chosen as the ROS-responsive unit. Diazaborines, which are aromatic B-N heterocycles, were envisioned as alternatives to boronic acids, compounds that, despite showing good reactivity and selectivity towards ROS, still display important stability shortcomings. The proposed prodrugs are precursors of HDACi, panobinostat and vorinostat. To employ the novel approach and design these prodrugs, the selected anticancer agents were structurally modified, through the replacement of the hydroxamic acid group by a hydrazide or a hydrazine. A machine learning computational study predicted that these modifications allowed the new analogues to retain similar inhibitory activity as the original molecules.
The formation of hydrazine-derived diazaborines was shown to be more efficient and favorable, and it was only possible to isolate the diazaborine derived from the vorinostat analogue that possesses a hydrazine (65% yield). Once isolated, this compound proved to be stable after 24 hours at different pH values, and was oxidized in the presence of H2O2 even when only 10 equivalents of the oxidant were used (kobs = 0.001 min-1 and t1/2 = 4 hours).
Altogether, this work provides preliminary results that highlight the potential of diazaborines as ROS-responsive units to design tumor-targeted prodrugs
Estágio curricular em "O Cactuu" - Design de equipamento modular e multifuncional
No full textO presente Relatório de Estágio Académico de índole profissional
na área do Design de Produto apresenta o trabalho
desenvolvido na empresa "O Cactuu", sediada em Braga.
Para além de documentar o processo realizado durante o
Estágio Académico, este relatório contém ainda uma contextualização
teórica sobre temas relevantes da identidade da
empresa como a Modularidade, Multifuncionalidade, Artesanato
Português e Materiais como o MDF e Valchromat, de
modo a optimizar as suas características técnicas em prol dos
conceitos da marca.
É também demonstrado de forma esquemática o desenvolvimento
projetual no período pós-estágio, que teve como
objetivo prolongar o trabalho e dar continuidade a conceitos
discutidos durante o momento do estágio.
Na elaboração deste relatório foram utilizadas diversas
metodologias. Para o momento de investigação, a revisão da
literatura. Para os momentos de desenvolvimento projetual,
a metodologia de projeto de design baseada em quatro fases:
pesquisa, conceito, desenvolvimento e produção, esboços,
diversos moodboards e ainda, reuniões semanais com o
supervisor bem como com o orientador.
A colaboração com a empresa "O Cactuu" resultou na
concretização de dois equipamentos com características
modulares e/ou multifuncionais e com a possibilidade de
apresentar-se em três variantes distintas, de acordo com as
necessidades dos projetos ou pretensões dos clientes.Design presents the work carried out at the company "O
Cactuu", based in Braga.
As well as documenting the process carried out during the
Academic Internship, this report also contains a theoretical
contextualisation of relevant themes in the company's identity
such as Modularity, Multifunctionality, Portuguese Handicrafts
and Materials such as MDF and Valchromat, in order
to optimise their technical characteristics in favour of the
brand's concepts.
The project's post-internship development is also shown in
schematic form, with the aim of extending the work and
giving continuity to the concepts discussed during the internship.
Various methodologies were used to prepare this report.
For the research stage, the literature review. For the design
development stage, the design project methodology based on
four phases: research, concept, development and production,
sketches, various moodboards and weekly meetings with the
supervisor as well as the supervisor.
The collaboration with the company "O Cactuu" resulted
in the realisation of two pieces of equipment with modular
and/or multifunctional characteristics and with the possibility
of being presented in three different variants, according to
the needs of the projects or the wishes of the clients.N/
Assessment of genotoxicity biomarkers in the scope of a human biomonitoring study in workers from E-waste management industries
No full textTese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente , 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasElectrical and electronic waste (e-waste) represents a pressing global challenge with its rapid
growth and hazardous composition. This recycling sector often involves inadequate worker safety,
exposing e-workers to harmful substances like heavy metals and flame retardants via several routes,
causing significant short- and long-term health risks. Human Biomonitoring (HBM) is a useful tool in
assessing exposure and associated health outcomes through biomarkers like micronucleus (MN) in
blood or epithelial cells, enabling the identification of early biological changes and linking exposure to
disease.
This HBM study used two assays,- the Buccal Micronucleus Cytome (BMNCyt) assay and the
Cytokinesis-Block Micronucleus Cytome (CBMNCyt) assay,- to assess potential genotoxic effects from
occupational e-waste exposure. The BMNCyt assay, conducted under the HBM4EU initiative, targets
buccal mucosa epithelial cells, a primary barrier against hazardous agents, thus assessing local genotoxic
effects. The CBMNCyt assay in peripheral blood lymphocytes, conducted under the PARC Project,
reliably measures structural and numerical chromosomal changes, reflecting a systemic effect.
This research aimed to assess early biological effects from exposure to pollutants from e-waste
in PBL and buccal epithelial cells of European e-waste workers, comparatively with control groups.
The BMNCyt assay showed no significant differences in MN frequency between the exposed
and control groups, while the CBMNCyt assay detected significantly increased frequencies of MN in
the exposed compared with non-exposed groups. Factors like small sample sizes, interindividual
differences, and the use of protective equipment might have influenced results. Demographic/lifestyle
variables showed differing impacts on MN formation between assays, but also potential influence, thus
the importance of their consideration.
Concluding, expanding e-waste occupational health research to include more workers/activities
within the waste management industry and broader biomonitoring efforts is paramount. Boosting the
understanding of health risks associated with those activities will help developing protective measures
and mitigation strategies to safeguard the exposed workers’ health
Symptom-based stratification of patients with Sjögren’s disease
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024Introdução: A Doença de Sjögren (DSj) é uma patologia reumática crónica e autoimune caracterizada por sintomas de secura, fadiga e dor. Tratando-se de uma doença sistémica, pode afetar qualquer sistema de órgãos, e esta importante heterogeneidade fenotípica constitui um desafio na abordagem a estes doentes. Com este estudo, pretendemos investigar uma população de doentes com DSj, agrupados com base nos seus sintomas, de modo a analisar as suas características específicas. Métodos: Incluímos doentes do estudo prospetivo Observational Lisbon Sjögren’s Syndrome Prospective (OLISSIPO) e utilizámos a Newcastle Sjögren's Stratification Tool (NSST), de modo a categorizar os doentes em quatro clusters diferentes: low-symptom burden (LSB), high symptom burden (HSB), pain dominant with fatigue (PDF) and dryness dominant with fatigue (DDF). Por fim, procedemos à comparação de características clínicas, laboratoriais, patológicas e de imagem entre estes grupos. Resultados: Distribuímos 319 pacientes (94,4% do sexo feminino, idade média de 58,5±13,6 anos) pelos quatro grupos: LSB (n=39), HSB (n=95), PDF (n=155) e DDF (n=30). Observámos menor fluxo salivar não estimulado nos grupos DDF (1,3 ml/15min) e HSB (1,8 ml/15min), e maior uso de pilocarpina (37% no HSB e 33% no DDF). O grupo DDF apresentou os títulos mais elevados de anticorpos anti-La/SSB (1084 IU/l), e o grupo PDF os níveis mais altos de proteína C-reativa (0,39 mg/dl). A fibromialgia e a depressão foram mais prevalentes em HSB e menos em LSB e o impacto na qualidade de vida aparenta ser também maior em HSB e menor em LSB. Conclusão: A heterogeneidade da Doença de Sjögren é evidenciada pelos quatro clusters de doentes com diferentes sintomas e gravidade da doença. O cluster DDF mostrou maior disfunção das glândulas salivares, títulos mais elevados de anticorpos anti-La/SSB e maior necessidade de secretagogos. O cluster HSB apresentou o maior impacto na qualidade de vida, em contraste com o grupo LSB. O cluster PDF pode ser um grupo intermédio com um fenótipo mais "inflamatório".Introduction: Sjögren's disease (SjD) is a chronic autoimmune rheumatic condition typically characterized by xerophthalmia, xerostomia, fatigue, and pain. As a systemic disease, it can affect virtually any organ system, resulting in a wide range of symptoms. In fact, this important phenotypical heterogeneity represents a major obstacle when approaching these patients. Herein, we aimed to study a SjD population based on symptom clusters, detailing and comparing their characteristics. Methods: We included patients from the Observational Lisbon Sjögren’s Syndrome Prospective Observational (OLISSIPO) cohort. We employed the Newcastle Sjögren's Stratification Tool (NSST) to categorize patients into four different symptom-based clusters: low-symptom burden (LSB), high symptom burden (HSB), pain dominant with fatigue (PDF) and dryness dominant with fatigue (DDF). We then compared patients in these clusters across clinical, laboratory, pathological, and imaging features. 7 Results: We allocated 319 patients (94.4% female, mean age 58.5±13.6 years ) into the four symptom-based clusters: LSB (n=39, 12.2%), HSB (n=95, 29.8%), PDF (n=155, 48.6%) and DDF (n=30, 9.4). Significant differences were observed across these groups revealing lower unstimulated salivary flow in the DDF (1.3 ml/15min) and HSB (1.8 ml/15min) groups, alongside with higher pilocarpine usage (37% in HSB and 33% in DDF). The DDF group had higher anti-La/SSB antibody titers (1084 IU/l), while the PDF group showed the highest CRP levels (0.39 mg/dl). Fibromyalgia, depression and decreased quality of life were more commonly observed in the HSB cluster and were less frequent in the LSB group. 8 Conclusion: Heterogeneity of SjD is evidenced by four clusters of patients with different symptoms and disease burden. The DDF cluster showed higher salivary gland dysfunction, anti-La/SSB titers and need for secretagogues, the HSB cluster had the worst disease impact, which contrasted with the LSB group. The PDF cluster may be an intermediate group with a more “inflammatory” endotype
O papel do sistema nervoso central no desenvolvimento de leiomiomas
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024Os leiomiomas uterinos são tumores benignos frequentes em idade reprodutiva, dada a sua elevada dependência hormonal.
O Sistema Nervoso Autónomo desempenha um papel crucial na homeostase corporal e está dividido em Sistema Nervoso Simpático e Sistema Nervoso Parassimpático. Foram correlacionados níveis elevados de noradrenalina, adrenalina e dopamina com o desenvolvimento tumoral. A variante do polimorfismo rs1042713 do gene ADRB2 faz com que os níveis de ação de noradrenalina e adrenalina se mantenham altos o que confere um fator de risco ao desenvolvimento tumoral.
O presente estudo foi realizado com o intuito de avaliar a contribuição do polimorfismo rs1042713 do gene ADRB2, de forma isolada ou em interação com os polimorfismos rs9282801 e rs2297518 do gene NOS2 no desenvolvimento de leiomiomas uterinos.
Recorreu-se ao software IBM SPSS Statistics para fazer estudos de associação entre os genótipos e a doença, tendo sido realizada uma análise isolada e outra em epistasia entre os polimorfismos.
Os resultados da análise isolada indicam que a variante do polimorfismo do gene ADRB2 é um fator de risco para o desenvolvimento de leiomiomas (OR=6,917 para o modelo dominante e OR=2,017 para o modelo recessivo).
Nas interações epistáticas, observou-se que o genótipo AA do rs1042713 do ADRB2, em interação com o genótipo CC do rs9282801 do NOS2 ou com o genótipo GG do rs2297518 do NOS2, aumentam o risco da doença (OR=3,1 e OR=3,636, respetivamente).
Este tipo de estudos permitem estabelecer relações de causalidade entre os polimorfismos em estudo, tanto isoladamente como em epistasia e o desenvolvimento de leiomiomas, que poderão ser úteis para o desenvolvimento de estratégias preventivas e de novos tratamentos da doença.Uterine leiomyomas are common benign tumors in reproductive-age individuals, due to their high hormonal dependence.
The Autonomic Nervous System plays a crucial role in body homeostasis and is divided into the Sympathetic Nervous System and the Parasympathetic Nervous System. Elevated levels of noradrenaline, adrenaline, and dopamine have been correlated with tumor development. The variant of the rs1042713 polymorphism in the ADRB2 gene leads to sustained high levels of noradrenaline and adrenaline, posing a risk factor for tumorigenesis.
This study was carried out to assess the contribution of the rs1042713 polymorphism in the ADRB2 gene, either alone or in interaction with the rs9282801 and rs2297518 polymorphisms in the NOS2 gene, to the development of uterine leiomyomas.
IBM SPSS Statistics software was used to conduct association studies between genotypes and the disease, with both independent and epistatic analyses of polymorphisms.
Results from independent analysis indicate that the ADRB2 gene polymorphism variant is a risk factor for leiomyoma development (OR=6.917 for the dominant model and OR=2.017 for the recessive model).
In epistatic interactions, it was observed that the AA genotype of rs1042713 in ADRB2, in interaction with the CC genotype of rs9282801 in NOS2 or the GG genotype of rs2297518 in NOS2, increases the disease risk (OR=3.1 and OR=3.636, respectively).
Such studies help to establish causal relationships between the polymorphisms under investigation, both independently and in epistasis, and the development of leiomyomas. This information could be valuable for developing preventive strategies and new treatments for the disease
Marine pollution effects on sea turtles nesting in São Tomé and Príncipe
No full textMarine ecosystems are increasingly threatened by pollution which poses significant risks to vulnerable species like sea turtles. São Tomé and Príncipe archipelago serves as a crucial nesting site for threatened green sea turtles (Chelonia mydas) and has the last significant rookery of the critically endangered hawksbill turtles (Eretmochelys imbricata) in the Eastern Atlantic. This thesis investigates metal and persistent organic pollutants (POPs) accumulated by female sea turtles from these populations and their impacts on turtles' health and reproductive success. In general, green turtles had higher overall metal levels than hawksbills, except for mercury and selenium. In green turtles, changes in gene expression related to detoxification, antioxidant defenses, reproduction, and embryonic development were observed, concomitantly with increased levels of specific metals and POPs. Moreover, genotoxic effects with strong links to metal contamination were identified, and in particular to Hg which was highly correlated with the formation of lobed nuclei in female erythrocytes of both species. Metals were also found to be associated with alterations in egg morphometry and in egg quality for both species, particularly affecting yolk fatty acids, with more pronounced effects in the phospholipid fraction. The POPs analysis in green turtles showed that contaminant transfer from females to their eggs is occurring, although with different transference rates depending on the specific congener or metabolite. POP contamination was further associated with alterations in the yolk's fatty acid profile of this species, posing complex risks to their embryonic development. Possible effects of the overall egg quality and POP levels on the hatching success of green turtles were also observed. Overall, this thesis identifies specific biomarkers that provide valuable tools for future monitoring studies and emphasizes the need for enhanced conservation strategies and further research on the effects of environmental contaminants on these endangered sea turtles
Estratégias de formulação para aumento de seletividade da Agelastatina A
No full textTese de mestrado, Química Medicinal e Biofarmacêutica, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Os produtos marinhos são conhecidos como reservatórios infindáveis de estruturas químicas únicas e complexas, repletas de atividades biológicas diversificadas.
A Agelastatina A (AglA) é um alcaloide de origem natural isolado pela primeira vez da esponja marinha Agelas dendromorpha. Desde a sua descoberta, a AglA tem atraído grande interesse devido às suas potentes atividades biológicas, incluindo, atividade inseticida e contra a artémia, e uma potente atividade citotóxica contra diversos cancros, nomeadamente, cancro da mama, colón, pâncreas, próstata e diversas leucemias. No entanto, a sua baixa seletividade para as células tumorais dificulta a sua aplicabilidade na prática clínica. A síntese total da (-)-AglA tem sido um desafio para os químicos sintéticos, devido à complexidade estrutural deste alcalóide, mas avanços recentes permitiram a síntese eficiente deste composto.
Este trabalho apresenta o aprimoramento de uma síntese total da (-)-AglA, anteriormente desenvolvida pelo nosso grupo de investigação, visando a sua posterior aplicação para a síntese em maior escala. Empregando uma síntese total de 8 etapas, partindo da piridina e recorrendo a reações de fotoquímica e de resolução cinética enzimática em fluxo contínuo, foi possível obter a (-)-AglA com um rendimento final total de 1,6% e 92% ee.
Posteriormente, de forma a contornar os problemas de solubilidade e seletividade associados à AglA, neste projeto, foram desenvolvidos dois hidrogéis com diferentes fins de administração. Foi desenvolvido um hidrogel termorresponsivo à temperatura corporal, para aplicação intratumoral in situ que apresentou alguns desafios, desta forma, paralelamente, foi desenvolvido um hidrogel à base do carbopol para aplicação tópica. As propriedades viscoelásticas dos hidrogéis desenvolvidos foram avaliadas recorrendo à análise reológica, permitindo obter uma avaliação específica do comportamento mecânico e funcional das formulações.
Numa última instância, foi avaliado o perfil de libertação da AglA recorrendo a ensaios de libertação in vitro em células de carácter hidrofílico e hidrofóbico. A partir do ensaio realizado, foi possível verificar que a AglA após 24h apresentou em média, uma permeação de 26% em células de carácter hidrofílico, sem apresentar resultados de permeação em células de carácter hidrofóbico.Marine products are known as endless reservoirs of unique and complex chemical structures, full of diverse biological activities.
Agelastatin A ((-)-AglA) is an alkaloid of natural origin first isolated from the marine sponge Agelas dendromorpha. Since its discovery, AglA has attracted great interest due to its potent biological activities, including insecticidal and brine shrimp activity, and potent cytotoxic activity against various cancers, including breast, colon, pancreatic and prostate cancer, and various leukemias. However, its low selectivity for tumour cells makes it difficult to apply in clinical practice. The total synthesis of (-)-AglA has been a challenge for synthetic chemists due to the structural complexity of this alkaloid, but recent advances have enabled the efficient synthesis of this compound.
This work presents the improvement of a total synthesis of (-)-AglA, previously developed by our research group, with a view to its subsequent application for large-scale synthesis. Using an 8-step total synthesis, starting from pyridine and using photochemical and enzymatic kinetic resolution reactions in continuous flow, it was possible to obtain (-)-AglA with a final total yield of 1,6% and 92% ee.
Subsequently, in order to overcome the problems of solubility and selectivity associated with AglA, two hydrogels were developed for different administration purposes. A hydrogel that was thermoresponsive to body temperature was developed for intratumoral application in situ, but did not show promising results, so a carbopol-based hydrogel was developed in parallel for topical application. The viscoelastic properties of the hydrogels developed were evaluated using rheological analysis, allowing a specific assessment of the mechanical and functional behaviour of the formulations.
Finally, the release profile of AglA was assessed using in vitro release tests on hydrophilic and hydrophobic cells. The test showed that AglA permeated hydrophilic cells by an average of 26% after 24 hours, with no permeation results in hydrophobic cells.Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa; Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa)