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Optimization of semisolid extrusion-based 3D printing process for drug delivery application
No full textTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A impressão 3D é uma tecnologia emergente e revolucionária no setor da indústria farmacêutica, possibilitando a personalização de formas farmacêuticas complexas. Embora promissora, a sua implementação enfrenta desafios técnicos e regulamentares rigorosos. Este trabalho de campo teve como objetivo a otimização dos processos de impressão 3D por um método de extrusão semissólida, avaliando-se os parâmetros críticos inerentes às diferentes etapas do processo de impressão de uma formulação hidrofílica e outra lipofílica.
Neste sentido recorreu-se a testes reológicos (viscosidade e oscilatório) para identificar a temperatura ideal de extrusão. Paralelamente, ensaios de extrudabilidade foram realizados para compreender a influência de diferentes diâmetros de ponteiras na pressão necessária para extrudir a formulação. Para validar a pressão e a velocidade de impressão, ensaios de fluxo e o teste das linhas foram analisados. Por fim, pensos quadrados com diversos padrões internos foram impressos e a sua uniformidade de massa foi determinada como parâmetro crítico de qualidade.
Os dados reológicos permitiram inferir sobre o comportamento do fluxo das formulações. Contudo, testes complementares de extrudabilidade revelaram-se essenciais para validar as temperaturas ótimas de impressão (42 °C para a formulação hidrofílica e 43 °C para a formulação lipofílica). A análise de textura revelou que as forças de extrusão variam de acordo com a ponteira utilizada, refletindo a pressão necessária para iniciar o processo de extrusão. Os principais parâmetros críticos, como a velocidade de impressão, a pressão aplicada e o diâmetro interno da ponteira foram sistematicamente controlados e otimizados durante a impressão, uma vez que têm impacto sobre o fluxo de extrusão e, consequentemente, sobre as dimensões e consistência do filamento. A validação final de todo o controlo de qualidade foi alcançada por meio da análise da uniformidade de massa, demonstrando conformidade com os limites estabelecidos na Farmacopeia Portuguesa 9.0 para formas farmacêuticas unitárias.
No geral, estes testes foram relevantes para a otimização do processo e devem ser incluídos em futuros protocolos de otimização.3D printing is an emerging and revolutionary technology in the pharmaceutical industry, making it possible to customize complex pharmaceutical products. Although promising, its implementation faces rigorous technical and regulatory challenges. This fieldwork aimed to optimize semisolid extrusion-based 3D printing processes, evaluating the critical parameters intrinsic to the different stages of the printing process for a hydrophilic and a lipophilic formulation.
To this end, rheological analysis (viscosity and oscillation) was used to determine the ideal extrusion temperature. In parallel, extrudability tests were performed to understand the influence of different sized nozzles on the pressure required to extrude the formulation. To validate pressure and printing speed, flow and line tests were carried out. Finally, square patches with different infill patterns were printed and their mass uniformity was determined as a critical quality parameter.
The rheological data enabled conclusions to be drawn regarding the formulation’s flow behavior. However, complementary extrudability tests proved essential to validate the ideal printing temperatures (42 °C for the hydrophilic formulation and 43 °C for the lipophilic formulation). Texture analysis revealed variations in extrusion forces depending on the nozzle selected, reflecting the pressure required to start the extrusion process. The main critical parameters, such as printing speed, the pressure applied and the nozzle’s inner diameter were systematically controlled and optimized during printing, since they have an impact on the extrusion flow and, consequently, on the dimensions and consistency of the filament. The final validation of the quality controls was achieved by analyzing the uniformity of mass, which demonstrated compliance with the limits established by the Portuguese Pharmacopeia 9.0 for pharmaceutical unit forms.
Overall, these tests were relevant to process optimization and should be included in future optimization protocols
Low doses of D-lactate modulate the lipid metabolism of skeletal muscle during MASLD
No full textTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O aumento da prevalência da doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD), juntamente com o ônus da doença e a atual falta de tratamentos eficazes, destaca a relevância da MASLD como um desafio de saúde global. A modulação da microbiota intestinal através de probióticos e dos seus metabolitos surgiu como uma potencial estratégia terapêutica para o tratamento da MASLD. Recentemente, demonstrámos que a administração de Limosillactobacillus reuteri DSM 17938 reduz a fibrose hepática, em parte através da redução da produção de TGF-b por macrófagos induzida pelo D-lactato. Dado que a MASLD é uma doença sistémica, colocámos a hipótese de que o metabolito D-lactato derivado da microbiota intestinal poderia aliviar os danos induzidos pela MASLD no músculo esquelético, elucidando ainda mais o papel de estripes Lactobacillaceae na melhoria da MASLD. Neste trabalho avaliámos o impacto da suplementação com D-lactato no metabolismo lipídico no tecido muscular de ratinhos alimentados com uma dieta de controlo ou com uma dieta rica em gordura e frutose (HFHF) durante 20 semanas. Posteriormente, explorámos a modulação do D-lactato em testes in vitro, expondo culturas celulares de miotubos a 125 μM de palmitato de sódio (PA) na presença ou ausência de 1 e 5 mM de D-lactato de sódio. A expressão génica e proteica de marcadores-chave relacionados com transporte, síntese, armazenamento e oxidação de ácidos gordos (FA), dinâmica e biogénese mitocondrial, inflamação e função muscular foram avaliados neste trabalho. Os resultados demonstraram que a suplementação com D-lactato preveniu significativamente o aumento de peso corporal e a acumulação de vesiculas lipídicas no fígado induzido pela HFHF em ratinhos. No músculo esquelético, a suplementação com D- lactato inibiu a regulação positiva dos marcadores de transporte de FA, aumentando também a expressão de genes envolvidos na oxidação de FA e na capacidade oxidativa muscular. Além disso, estudos in vitro mostraram que 1 mM de D-lactato, mas não 5 mM, protegeu eficazmente contra a acumulação de lípidos e melhorou ainda mais a capacidade oxidativa dos miotubos. Mais importante ainda, observámos que doses baixas de D-lactato podem ser benéficas, contrastando com os efeitos prejudiciais associados a níveis elevados de D-lactato circulante, como na D-lactato acidose. Estes resultados sugerem que o D-lactato atenua a acumulação de lípidos e melhora a função oxidativa das fibras musculares. Em conclusão, este estudo fornece novos conhecimentos sobre a influência dos metabolitos derivados da microbiota intestinal na homeostase metabólica do hospedeiro, enfatizando particularmente o papel regulador do D-lactato proveniente de L. reuteri no metabolismo muscular e o seu potencial como uma nova estratégia terapêutica para aliviar a MASLD.The increased prevalence of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD), along with its disease burden and the current lack of effective treatments, underscores the relevance of MASLD as a global health challenge. Modulating gut microbiota through probiotics and their metabolites has emerged as a potential therapeutic strategy for managing MASLD. Recently, we demonstrated that administering Limosillactobacillus reuteri DSM 17938 reduces liver fibrosis, partially via D-lactate-induced impaired macrophage TGF- b production. Given that MASLD is a systemic disease, we hypothesized that the gut microbiota-derived metabolite D-lactate might alleviate MASLD-induced damage in skeletal muscle. This would further elucidate the role of Lactobacillaceae in MASLD amelioration. We assessed the impact of D-lactate supplementation on lipid metabolism in muscle tissue of mice fed either a control or a high-fat high-fructose (HFHF) diet for 20 weeks. Subsequently, the observed modulations induced by D-lactate were explored in vitro by exposing myotubes to 125 μM sodium palmitate (PA) in the presence or absence of 1 and 5 mM sodium D-lactate. We examined gene and protein expressions of key makers related to fatty acid (FA) uptake, synthesis, storage, oxidation, mitochondrial dynamics and biogenesis, inflammation, as well as muscle function. The results demonstrated that D-lactate supplementation significantly prevented HFHF-induced body weight gain and liver lipid droplet accumulation in mice. In skeletal muscle, D-lactate supplementation inhibited the upregulation of FA transport and uptake markers while enhancing the expression of genes involved in FA oxidation and muscle oxidative capacity. In addition, in vitro data showed that 1 mM of D-lactate, but not 5 mM, effectively protected against lipid accumulation and further enhanced the oxidative capacity of myotubes. Most importantly, we observed that low doses of D-lactate could be beneficial, contrasting with the detrimental effects associated with elevated circulating levels of D-lactate, such as in D-lactate acidosis. These findings suggest that D-lactate mitigates lipid accumulation and improves muscle oxidative function. In conclusion, this study provides new insights into the influence of gut microbiota-derived metabolites on host metabolic homeostasis, particularly emphasizing the regulatory role of D-lactate from L. reuteri in muscle metabolism and its potential as a novel therapeutic strategy to alleviate MASLD.Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa), Faculty of Pharmacy, University of Lisbon in collaboration with Karolinska Intitutet, and received support from Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)
Preparação pré-operatória de doentes com feocromocitoma : o estado da arte
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024O feocromocitoma é um tumor neuroendócrino raro, localizado na medula da glândula suprarrenal, que se carateriza pela produção excessiva de catecolaminas. É o tumor humano com maior taxa de herdabilidade, apresentando-se, frequentemente, em contexto de síndromes hereditárias. O quadro clínico mais comum corresponde à tríade clássica de cefaleias, palpitações e diaforese. É também típica a presença de hipertensão arterial. Com a evolução da doença, podem surgir complicações cardiovasculares graves, por exemplo, doença coronária, miocardiopatia de Takotsubo e arritmias. O rastreio do feocromocitoma é feito através do doseamento das metanefrinas séricas. A resseção cirúrgica é a única opção terapêutica curativa e deve ser a 1ª linha de tratamento, exceto se contraindicado. Porém, sabe-se que os estímulos cirúrgicos propiciam a libertação de catecolaminas. Este facto, aliado à patogénese do feocromocitoma, que, por si só, está já associada a elevados níveis de catecolaminas circulantes, permite-nos compreender o elevado risco de instabilidade hemodinâmica destes doentes no período perioperatório. Entre as principais complicações cardiovasculares potencialmente fatais estão as crises hipertensivas, arritmias cardíacas, isquemia miocárdica e acidentes cerebrovasculares. De modo a evitar estas complicações, a preparação pré-operatória torna-se essencial e passa por alterações do estilo de vida e terapêutica antihipertensora, nomeadamente antagonistas dos recetores alfa e beta adrenérgicos. Com a realização deste trabalho, pretende-se fazer uma revisão da bibliografia mais recente referente à preparação pré-operatória de doentes com feocromocitoma. Será feito um breve resumo da fisiopatologia da doença e discutidas as atuais estratégias preconizadas.Pheochromocytoma is a rare neuroendocrine tumor, located in the medulla of the adrenal gland, which is characterized by excessive production of catecholamines. It is the human tumor with the highest heritability rate, often occurring in the context of hereditary syndromes. The most common clinical presentation corresponds to the classic triad of headaches, palpitations and diaphoresis. The presence of high blood pressure is also typical. As the disease progresses, serious cardiovascular complications may arise, for example, coronary disease, Takotsubo cardiomyopathy and arrhythmias. The screening of pheochromocytoma is made through the measurement of serum metanephrines. Surgical resection is the only curative therapeutic option and should be the first line of treatment, unless contraindicated. However, it is known that surgical stimuli promote the release of catecholamines. This fact, combined with the pathogenesis of pheochromocytoma, which, in itself, is already associated with high levels of circulating catecholamines, allows us to understand the high risk of hemodynamic instability in these patients in the perioperative period. Among the main potentially fatal cardiovascular complications are hypertensive crises, cardiac arrhythmias, myocardial ischemia and strokes. In order to avoid these complications, preoperative preparation becomes essential and includes lifestyle changes and antihypertensive therapy, namely alpha and beta adrenergic receptor antagonists. By carrying out this work, we intend to review the most recent literature regarding the preoperative preparation of patients with pheochromocytoma. A brief summary of the pathophysiology of the disease will be made and current recommended strategies will be discussed
Hemorragia da glândula supra-renal no período neonatal : a propósito de um caso clínico
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024A hemorragia da supra-renal é uma condição relativamente incomum em recém-nascidos. A etiologia não é completamente esclarecida, mas a asfixia perinatal parece ser fator de risco. É mais comum em recém-nascidos de termo e o sexo masculino é mais afetado. O envolvimento da glândula supra-renal direita é mais frequente, mas pode também ocorrer na glândula supra-renal esquerda ou, mais raramente, ser bilateral. Consoante o volume da hemorragia, a hemorragia da supra-renal pode ser assintomática ou manifestar-se como anemia e icterícia ou, em hemorragias mais graves, resultar numa massa abdominal palpável ou hematoma escrotal. A ecografia abdominal é o método de eleição para diagnóstico e follow-up e condições como o neuroblastoma e o abcesso da supra-renal fazem diagnóstico diferencial com esta entidade. Na maioria dos casos, a hemorragia da supra-renal é auto-limitada e resolve progressivamente num período que pode variar entre 3 semanas e 6 meses. O objetivo deste trabalho passa por discutir a etiologia, fatores de risco, diagnóstico diferencial e abordagem terapêutica das hemorragias da supra-renal no recém-nascido. A discussão é centrada num caso clínico de um recém-nascido com anemia e icterícia de etiologia desconhecida que posteriormente se vem a esclarecer ser secundária a uma hemorragia da supra-renal.Adrenal hemorrhage is a relatively uncommon condition in newborns. The etiology is not completely understood, but perinatal asphyxia appears to be a risk factor. It is more common in full-term newborns, with males being the most affected. The involvement of the right adrenal gland is more frequent, but it can also occur in the leV adrenal gland or, more rarely, bilaterally. Depending on its volume, adrenal hemorrhage can be asymptomatic or present as anemia and jaundice or, in more severe cases, result in a palpable abdominal mass or scrotal hematoma. Abdominal ultrasound is the method of choice for diagnosis and follow-up, and condi8ons such as neuroblastoma and adrenal abscess are part of the differen8al diagnosis. In most cases, adrenal hemorrhage is selflimi8ng and resolves progressively over a period that can range from 3 weeks to 6 months. The aim of this study is to discuss the etiology, risk factors, differential diagnosis, and therapeutic approach of adrenal hemorrhage in the newborn. The discussion is centered on a clinical case of a newborn with anemia and jaundice of unknown e8ology that was later determined to be secondary to adrenal hemorrhage
Infeções protésicas vasculares : uma complicação perioperatória rara, mas potencialmente devastadora : a propósito de um caso
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024As próteses vasculares e endovasculares (PVE) fornecem uma via substituta para o fluxo sanguíneo que permite que o segmento doente de um vaso seja reparado, excisado ou contornado através de um bypass. À semelhança de qualquer outro procedimento invasivo, a implantação destas próteses (por cirurgia aberta ou técnicas endovasculares) não é isenta de riscos, realçando-se as infeções que, apesar de infrequentes, constituem uma complicação grave e uma importante causa de morbimortalidade nestes doentes. Ainda que não sejam os principais agentes etiológicos de infeções de próteses vasculares e endovasculares (IPVE), os Enterobacterales devem ser equacionados, particularmente em ambiente nosocomial. Serratia marcescens destaca-se neste grupo por ser um agente etiológico de IPVE raro, mas potencialmente devastador, com um perfil de resistências frequentemente desafiante. Não obstante os avanços na área, as IPVE, particularmente aórticas, seguem frequentemente um curso rápido e catastrófico mesmo quando tratadas atempada e adequadamente. A elaboração de recomendações relativas à sua abordagem diagnóstica e terapêutica e ao seu seguimento revela-se desafiante dada a sua complexidade, condicionada pelos padrões microbiológicos locais e emergência de resistências, e pela grande diversidade de técnicas cirúrgicas atualmente disponíveis. Por conseguinte, a definição de cuidados ótimos nesta área é ainda fonte de discussão. De forma a ilustrar a complexidade da abordagem destas infeções, apresenta-se o caso clínico de uma doente diagnosticada com infeção de prótese endovascular da aorta torácica por S. marcescens produtora de carbapenemases OXA-48 e risco cirúrgico proibitivo. O propósito deste trabalho é abordar os desafios relativos ao diagnóstico, tratamento e seguimento das IPVE, procurando elucidar a evidência atual e, se possível, fornecer respostas às questões que surgem no contexto da abordagem conservadora desta doente (nomeadamente em relação à duração da antibioterapia), dos métodos de monitorização a longo prazo do seu status infecioso (realçando o potencial papel da PET-TC com 18F-FDG num futuro próximo) e das expetativas prognósticas.Vascular and endovascular prostheses (PVE) provide a substitute conduit for blood flow, allowing repair, excision, or bypass of the diseased segment of a vessel. Similar to any other invasive procedure, the implantation of these prostheses (via open surgery or endovascular techniques) is not without risks, with infections, even so infrequent, being highlighted as a serious complication and an important cause of morbidity and mortality among these patients. Although not the primary etiological agents of vascular and endovascular prostheses infections (IPVE), Enterobacterales are microorganisms to be considered, particularly in nosocomial settings. Serratia marcescens stands out within this group as a rare, but potentially devastating etiological agent of IPVE, with a frequently challenging resistance profile. Despite the advancements in the field, IPVE, particularly aortic, often follow a rapid and catastrophic course even when promptly and adequately treated. Developing recommendations regarding their diagnostic and therapeutic approach, as well as followup, proves to be challenging due to their complexity, influenced by local microbiological patterns and emergence of resistance, and the wide array of surgical techniques currently available. Consequently, defining optimal care in this area remains a subject of debate. To illustrate the complexity of these infections’ approach, we present a clinical case of a patient diagnosed with a thoracic aortic endovascular prosthesis infection caused by an OXA-48 carbapenemase-producing S. marcescens with prohibitive surgical risk. The purpose of this work is to address the challenges related to the diagnosis, treatment, and follow-up of IPVE, seeking to elucidate current evidence and, if possible, provide answers to questions arising in the context of a conservative approach to this patient (particularly regarding the duration of antibiotic therapy), long-term monitoring methods of her infectious status (highlighting the potential role of 18F-FDG PET-CT in the near future), and prognostic expectations
Assessing the vulnerability of urban tree species to climate change: The case study of Lisbon gardens
No full textTo mitigate the effects of climate change on urban green spaces, adaptive strategies are required, particularly regarding tree species. Lisbon is a most vulnerable city to extreme climate events and the performance and management of the numerous and diverse trees found in its gardens and parks are of much concern. We evaluated the vulnerability of such trees to predicted future Lisbon climates using the Climate Assessment Tool (Climate Change Alliance of Botanic Gardens, 2024) and inventories from 63 historical gardens and parks, including three botanical gardens. With the extensive information of the latter we: (i) identified and classified the species according to biogeographical origins; (ii) pinpointed those most vulnerable to, or favoured by climate change; and (iii) assessed the vulnerability of each studied site, according to the species present, their risk level and abundance. Among the selected 318 taxa (corresponding to 19,579 trees), the Palaearctic biogeographical region predominates. The highest risk levels were found in 50 % (77 %, for the most pessimistic climate scenario) of the Palaearctic species, which include many native taxa. Conversely, about 56 % of the Neotropical species are predicted to perform better under the worst climate change scenario. Only one of the ten most abundant tree species in Lisbon – Jacaranda mimosifolia – might remain invulnerable. Management plans for most Lisbon green spaces must therefore reexamine the use of Palaearctic species and tackle challenging adjustments, including the gradual replacement of familiar species (increasingly more difficult to maintain) by others with better performance under future climate conditions.info:eu-repo/semantics/acceptedVersio
Características imagiológicas de gliomas e linfomas do sistema nervoso central
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024Introdução: Os Gliomas são os tumores cerebrais primários mais frequentes, representando mais de 70% de todas as neoplasias do sistema nervoso central, sendo o tipo mais frequente o Glioblastoma. Por oposição ao Glioblastoma, o Linfoma Primário do Sistema Nervoso Central é uma neoplasia rara, que representa cerca de 4% de todos os tumores encefálicos. As características morfológicas de ambos são facilmente distinguíveis. No entanto, ocasionalmente, podem ter características sobreponíveis em estudos de ressonância magnética, tornando o diagnóstico diferencial difícil. Objetivos: Estudo das características imagiológicas dos glioblastomas e linfomas primários do sistema nervoso central e avaliação da concordância entre o diagnóstico imagiológico e histopatológico. Serão adicionalmente analisadas as características clínicas e epidemiológicas destes tumores. Metodologia: Através de consulta dos programas informáticos disponíveis no Serviço de Imagiologia Neurológica e bases de dados disponíveis da Neuropatologia procedeu-se ao estudo observacional, descritivo e retrospetivo de doentes adultos, com idades superiores a 18 anos, desde Janeiro de 2019 a Agosto de 2023, com diagnósticos imagiológicos e anátomo-patológicos de Linfomas Primários do Sistema Nervoso Central e de Glioblastomas, tendo sido analisadas as suas características imagiológicas e da anatomia patológica, bem como os dados demográficos dos doentes. Resultados: Foram identificados 95 doentes com os diagnósticos imagiológicos destes dois tipos de tumores, 28 com Linfoma do Sistema Nervoso Central e 67 com Glioblastoma, dos quais 83 com diagnóstico histopatológico. As características epidemiológicas, clínicas e de imagem de ambos os tumores foram, na sua maioria, consistentes com o previamente descrito na literatura. A concordância total entre o diagnóstico imagiológico e histopatológico foi de 79,5%. Conclusão: Com base em características convencionais de ressonância magnética, foi possível obter um diagnóstico imagiológico coincidente com o histopatológico na maioria dos casos. Contudo, a discrepância de diagnósticos nalguns casos, salienta a necessidade da utilização de técnicas avançadas de ressonância magnética para uma maior precisão diagnóstica.Introduction: Gliomas are the most common primary brain tumors, accounting for over 70% of all central nervous system neoplasms, with Glioblastoma being the most common type. On the other hand, Primary Central Nervous System Lymphoma is a rare neoplasm, representing about 4% of all brain tumors. Morphological characteristics of both are easily distinguishable. However, they may occasionally mimic each other on magnetic resonance imaging due to overlapping imaging features, making the differential diagnosis challenging. Objectives: To characterize both tumors in terms of imaging, clinical, and epidemiological features, and to assess the agreement between imaging and histopathological diagnosis. Methodology: Through the consultation of software programs available in the Neurological Imaging Service and available databases in Neuropathology, we conducted an observational, descriptive, and retrospective study of adult patients, aged 18 and older, from January 2019 to August 2023, with imaging and pathological diagnoses of Primary Central Nervous System Lymphomas and Glioblastomas. Imaging characteristics, demographic data, and pathological anatomy were studied. Results: A total of 95 patients with imaging diagnosis were identified, 28 with Primary Central Nervous System Lymphoma and 67 with Glioblastoma, of which 83 had histopathological diagnosis. Epidemiological, clinical, and imaging characteristics of both tumor types were mostly consistent with the literature. The total agreement between imaging and histopathological diagnosis was 79,5%. Conclusion: Based on conventional magnetic resonance imaging features, it was possible to achieve an imaging diagnosis consistent with histopathology in most cases. However, the diagnostic discrepancies in some instances underscore the need and significance of advanced magnetic resonance imaging techniques for greater diagnostic precision
Prevalência e aspetos subjacentes à polimedicação do idoso
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024Introdução: O envelhecimento da população em Portugal é evidenciado pelos censos de 2021. Em Viseu, cerca de 23,6% da população é idosa (≥ 65 anos). O envelhecimento populacional traz múltiplos desafios na área da saúde. A polimedicação é um fenómeno
crescente entre os idosos e poderá acarretar custos desnecessários, assim como riscos
significativos para a saúde. Para este estudo, a polimedicação foi aceite como o uso simultâneo de 5 ou mais fármacos por uma pessoa.
Objetivos: Determinar a prevalência da polimedicação nos utentes idosos em USF e
UCSP de Viseu e aspetos associados à mesma.
Metodologia: O trabalho original de investigação clínica incidiu sobre a população de idosos inscrita em duas unidades de saúde de Viseu (USF Viseu-Cidade e UCSP São Teotónio), através da aplicação presencialmente, por mais de um investigador, de um questionário de 23 perguntas, com posterior consulta do Sclínico, após aprovação da
Comissão de Ética. Recorreu-se a técnicas de estatística descritiva e inferencial (SPSS-
29).
Resultados: A população em estudo foi de 384 utentes, 37,5 % do sexo masculino e idade média de 76,09 anos. Foi identificada uma prevalência de polimedicação de 78,4%. Observou-se uma associação da polimedicação com diversos aspetos, como baixo nível socioeconómico (p=0,003), maior frequência de consultas com o MF (p=0,007), a assistência com a medicação (p=0,001), o número de patologias (p<0,001) e o recurso quer a especialidades hospitalares (p=0,002), MP (p=0,005) ou ao SU em 2022 (p=0,029). Fatores individuais como a idade avançada (p=0,004), a viuvez
(p=0,005), o não conhecimento do intuito de cada fármaco (p<0,001), a mobilidade reduzida (p=0,022) e a presença de “dor/mal-estar” (p=0,003), “ansiedade/depressão” (p=0,034), também contribuem para o fenómeno.
Conclusão: Este estudo permitiu concluir que a polimedicação é uma realidade prevalente na população idosa. Foram identificados múltiplos aspetos determinantes da
polimedicação do idoso. A abordagem holística/biopsicossocial associada à prática da medicina geral e familiar permite avaliar e ajustar em conformidade a polimedicação no idoso.Background: The aging of the population in Portugal is evidenced by the 2021 census. In Viseu, approximately 23,6% of the population is elderly (≥ 65 years old). Population aging brings multiple challenges in the healthcare sector. Polypharmacy is a growing phenomenon among the elderly and may entail unnecessary costs as well as significant
health risks. For this study, polypharmacy was defined as the simultaneous use of 5 or more drugs by an individual.
Purpose: Determining the prevalence of polypharmacy in elderly patients in USF and UCSP in Viseu, as well as associated factors.
Methodology: The original clinical research focused on the elderly population enrolled in two healthcare units in Viseu (USF Viseu-Cidade and UCSP São Teotónio), through the in-person administration, by more than one researcher, of a 23-question questionnaire, followed by consultation of the Sclínico, after approval by the Ethics Committee. Descriptive and inferential statistical techniques were employed (SPSS-29).
Results: The study comprised 384 participants, with 37,5% being male and an average age of 76,09 years. A prevalence of polypharmacy of 78,4% was observed. Polypharmacy was found to be associated with various aspects, such as low socioeconomic status (pvalue=0,003), increased frequency of consultations with the GP (p-value=0,007),
medication assistance (p-value=0,001), number of pathologies (p-value < 0,001), and the use of hospital specialties (p-value=0,002), private physicians (p-value=0,005), or the Emergency Department in 2022 (p-value=0,029). Individual factors such as advanced age (p-value=0,004), widowhood (p-value=0,005), lack of knowledge about the purpose of each drug (p-value < 0,001), reduced mobility (p-value=0,022), and the presence of "pain/discomfort" (p-value=0,003), "anxiety/depression" (p-value=0,034) also contribute to the phenomenon.
Conclusion: This study allowed us to conclude that polypharmacy is a prevalent reality in the elderly population. Multiple determinants of elderly polypharmacy were identified. The holistic/biopsychosocial approach associated with general and family medicine practice allows for the evaluation and adjustment of polypharmacy in the elderly accordingly
Antimicrobial resistance and phylogenetic analyses of commensal and zoonotic bacteria at livestock-wildlife interfaces
No full textTese de Mestrado, Microbiologia Aplicada, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA resistência a antimicrobianos (RAM) é considerada uma das pandemias do século XXI, contribuindo
globalmente para milhões de mortes e causando anualmente perdas socioeconómicas expressivas. O uso
intensivo e pouco criterioso de antimicrobianos em sistemas de produção animal e noutros sistemas de
produção de alimentos tem sido apontado como umas das principais causas de RAM, contribuindo para
a emergência e disseminação de microrganismos resistentes a diferentes classes de antibióticos, com
impacto na saúde pública global.
O aumento da circulação de agentes zoonóticos também representa um desafio significativo para a saúde
humana e animal, gerando efeitos negativos em cascata. Este problema é exacerbado pela crescente
proximidade entre humanos e animais, impulsionada pelo crescimento demográfico humano,
urbanização, globalização, desflorestação, e fragmentação ou perda de habitat. Os animais de produção,
tais como bovinos, aves e suínos, são reservatórios de bactérias comensais e potencialmente zoonóticas.
A proximidade entre animais de produção e animais selvagens em paisagens progressivamente
dominadas pelo Homem aumenta a probabilidade de disseminação, em sistemas multi-hospedeiro, de
bactérias resistentes a antibióticos e de genes passíveis de transferência horizontal. A propagação de
determinantes de RAM entre diferentes taxa microbianos e espécies hospedeiras coloca em causa a
eficácia dos antibióticos.
Neste contexto, o presente trabalho gerou novos dados fenotípicos, moleculares e genómicos na
interface entre os animais de produção, os animais selvagens e o ambiente, visando contribuir para uma
melhor compreensão da epidemiologia da RAM. Para o efeito, realizou-se o isolamento de bactérias
comensais e potencialmente zoonóticas selecionadas, nomeadamente Escherichia coli, Salmonella spp.
e Campylobacter spp., devido à sua importância em saúde pública e potencial para albergar e trocar
genes de RAM. Estimou-se a sua taxa de colonização em diferentes hospedeiros e matrizes ambientais
de diferentes regiões geográficas, testando-se a suscetibilidade a antibióticos, caracterizando-se a
relação filogenética com isolados obtidos noutros estudos e o potencial genómico associado a RAM
(resistoma) e virulência (viruloma). Foi ainda analisada a composição plasmídica (plasmidoma).
Procedeu-se à colheita e análise de 178 amostras de diferentes origens: bovinos (n=93) (das raças
autóctones Barrosã, Minhota, Mertolenga, Aberdeen-Angus, e Limousine, e ainda bovinos cruzados de
Limousine), javalis (n=37), veados (n=18), raposas (n=14), fuinhas (n=6) e amostras ambientais (n=10).
As amostras de bovinos provinham de oito explorações de produção animal distribuídas no norte, centro
e sul de Portugal, enquanto as amostras de ungulados selvagens representam oito zonas de caça do centro
e sul do país. Após o isolamento em diferentes meios seletivos, procedeu-se à identificação taxonómica
por métodos moleculares baseados na amplificação de genes específicos das espécies/géneros
presuntivos. Os testes de suscetibilidade antimicrobiana foram adaptados à espécie/género bacteriano
em causa, incluindo um painel alargado de antibióticos de diferentes classes. Procedeu-se à
sequenciação completa do genoma de 90 isolados obtidos neste trabalho, selecionados de acordo com
critérios epidemiológicos, focando-se as análises computacionais subjacentes no resistoma, viruloma e
relações filogenéticas com outros isolados depositados nas bases de dados públicas.
Os resultados deste estudo evidenciaram a presença de E. coli, incluindo E. coli produtora de toxinas
Shiga (STEC), e Salmonella spp. em 93,2 %, 4,2 %, 1,2 %, respetivamente, das amostras processadas
para o isolamento de cada microrganismo. Nos isolados identificados como STEC, obtidos de bovinos,
javalis e veados, detetou-se por PCR o gene stx2 em 85,7 % dos isolados, enquanto a co-ocorrência dos
genes stx1 e stx2 foi detetada apenas num isolado (14,3 %). A deteção presuntiva de Salmonella spp.
ocorreu em amostras de bovinos, fuinha e raposa. Os microrganismos que cresceram em meios seletivos que visavam o isolamento de Campylobacter spp. foram identificados por sequenciação do gene do
rRNA 16S como Chelatococcus composti e Pseudoroseomonas coralli.
Os isolados de E. coli testados exibiram predominantemente resistência fenotípica à tetraciclina e
azitromicina, sendo a resistência à tetraciclina mais frequente em animais selvagens e a resistência à
azitromicina observada em todos os tipos de amostras analisadas, incluindo as amostras ambientais.
Entre os cinco isolados de Salmonella spp., apenas foi detetada resistência fenotípica à azitromicina. A
sequenciação total do genoma confirmou que alguns isolados presuntivamente identificados por PCR
como Salmonella spp., posteriormente reclassificados como outras espécies, exibiam resistência
intrínseca a β-lactâmicos, macrólidos, tetraciclinas, fosfomicina e/ou trimetoprim. A prevalência de
multirresistência fenotípica em E. coli foi estimada em 2,4 %, tendo a maioria dos isolados
multirresistentes sido obtidos de bovinos, possivelmente devido à sua maior exposição a antibióticos.
Em relação à análise in silico dos genomas sequenciados para identificação de genes de resistência, e
após revisão da classificação taxonómica, detetou-se em dois isolados de E. coli, dois isolados de
Escherichia marmotae, dois isolados de Morganella morganii (multirresistentes) e quatro isolados de
Enterobacter spp. (dos quais um multirresistente) genes que codificam β-lactamases associadas à
resistência a penicilinas e cefalosporinas. No isolado de Proteus mirabilis, apesar da multirresistência
fenotípica relacionada com resistência intrínseca a três antibióticos, não foram detetados in silico genes
que codificam β-lactamases.
No que diz respeito à análise in silico do viruloma, foi encontrada uma diversidade considerável de
determinantes, destacando-se a deteção de genes que codificam toxinas, tais como ehxA e epeA, em
alguns isolados de E. coli de bovinos e animais selvagens. Estes genes estão frequentemente associados
a estirpes patogénicas de E. coli, como as STEC. A deteção em isolados obtidos de animais de produção
e espécies cinegéticas de genes de virulência que codificam toxinas que exacerbam as doenças de origem
alimentar em humanos constitui motivo de preocupação para a saúde pública e segurança alimentar,
nomeadamente associada à manipulação das carcaças e ao consumo de carne. De notar, ainda, o caso
atípico de um isolado, no qual se detetou por PCR o gene eae, não se identificando, no entanto, a
característica co-ocorrência do plasmídeo EAF (que alberga o gene bpfA). Análises adicionais
permitiram confirmar tratar-se de uma E. coli enteropatogénica atípica. Em 3,0 % das amostras,
identificou-se conjuntos de genes característica de ExPEC. Em contrapartida, nos isolados de
Salmonella spp. detetou-se principalmente genes de virulência associados à adesão e a sistemas de
secreção, essenciais para o processo de infeção e patogenicidade. Foram também identificados genes
relacionados com resistência a metais e biocidas, embora em menor número quando comparados com
os genes de virulência. Importa destacar que em E. coli alguns dos genes de resistência detetados,
nomeadamente qnrB19, que medeia a resistência a quinolonas, bem como alguns dos genes de virulência
identificados, tais como ehxA e o operão iro, se encontram associados a plasmídeos, evidenciando a
importância dos plasmídeos na transferência de genes de resistência a antimicrobianos e de
determinantes de virulência. A diversidade de plasmídeos foi particularmente notável em isolados de E.
coli, enquanto nos isolados de Salmonella spp. apenas um único plasmídeo foi identificado.
A análise de 73 genomas de E. coli obtidos neste trabalho demonstrou elevada diversidade de patotipos,
serotipos e de sequências tipo. A análise filogenómica subsequente, com inclusão de genomas presentes
nas bases de dados, revelou relações significativas entre isolados provenientes de diferentes hospedeiros
e regiões geográficas, o que sugere a possibilidade de eventos de transmissão intra- e interespecífica em
diferentes contextos. Estes resultados causam preocupação no âmbito da resistência antimicrobiana,
dada a possibilidade de disseminação de genes de resistência a antibióticos e, ainda, de determinantes
de virulência que aumentam a patogenicidade das estirpes em circulação. No caso da análise dos cinco
genomas de Salmonella enterica subsp. salamae obtidos neste trabalho, a similaridade observada nos
genes de resistência e de virulência identificados in silico está de acordo com a proximidade filogenética encontrada à escala do genoma, discriminando-se um reduzido número de polimorfismos, o que
globalmente sugere uma estreita relação epidemiológica entre os isolados. Ressalva-se o facto destes
isolados terem sido obtidos de duas amostras não invasivas de raposa, colhidas oportunisticamente no
campo a poucos metros de distância, pelo que a possibilidade de serem do mesmo indivíduo não pode
ser desconsiderada.
Este estudo demonstrou que bactérias comensais como E. coli, incluindo STEC, e Salmonella spp.,
mesmo quando presentes em prevalências reduzidas, podem atuar como reservatórios de genes de
resistência e virulência em diferentes ecossistemas. A expressão de resistência fenotípica a antibióticos
de diferentes classes e clinicamente relevantes, tais como azitromicina, tetraciclina e β-lactâmicos,
constitui uma preocupação para a saúde animal e para a saúde pública. A confirmação, neste trabalho,
da presença de microrganismos resistentes a antibióticos em animais selvagens, teoricamente não
sujeitos a terapêuticas antimicrobianas, sugere contaminação ambiental de origem antrópica e/ou a
transmissão potencial de bactérias a partir de animais de produção nas interfaces de contacto, não sendo
também de desconsiderar a possibilidade de animais selvagens poderem, por sua vez, transmitir
determinantes de resistência a outras populações de animais selvagens, animais de produção, animais
domésticos e, porventura, ao Homem.
Os resultados do presente trabalho evidenciam globalmente a necessidade de se reforçar a monitorização
e vigilância da RAM, abrangendo-se várias espécies de hospedeiros, regiões territoriais, contextos
ecológicos e diferentes sistemas de maneio animal, destacando-se para o efeito a importância da
vigilância genómica e da abordagem de Uma Só Saúde, que reconhece a interconexão entre a saúde
humana, animal e ambiental, essenciais para a prevenção e controlo da RAM e da disseminação de
agentes zoonóticos.Antimicrobial resistance (AMR) is a global health issue, causing millions of deaths and substantial
socio-economic losses annually. A significant contributor to this problem is the widespread use of
antibiotics in food-producing animals, among other factors. This study aimed to enhance surveillance
of prototypical commensal and potentially zoonotic bacteria at the livestock-wildlife-environment
interface, improving our understanding of AMR epidemiology. For these purposes, Escherichia coli,
Salmonella spp., and Campylobacter spp. were selected as models for their public health importance
and potential to harbor and exchange resistance and virulence genes.
Samples from cattle, wild animals, and the environment (n=178) were analyzed using microbiological,
molecular, and whole-genome sequencing (WGS) (n=90 isolates). E. coli was isolated from 93.2 % of
samples, including Shiga toxin-producing E. coli (STEC) (4.2 %) from bovine, red deer, and wild boar.
Detection of Salmonella spp. was rare (1.2 %) and no Campylobacter spp. was isolated. Phenotypic
resistance was most frequently observed for azithromycin and tetracycline, although other clinically
relevant AMR (including colistin) occurred. Multidrug resistance was limited to 2.4 % of E. coli. WGS
analyses revealed the presence of gene which encoded resistance against different antibiotic classes,
with those encoding -lactamases being frequently detected. Virulence genes encoding toxins (e.g.,
ehxA and epeA) were detected, particularly in pathogenic E. coli isolates (i.e., STEC) that also harbored
stx2, stx1 and/or eae. Phylogenetic analysis revealed significant genetic relatedness among E. coli from
different hosts and geographic regions, suggesting transmission potentially driven by animal
movement/interactions and human activities. The Salmonella enterica subsp. salamae isolates showed
a high degree of similarity (maximum 6 SNPs of difference).
This study emphasizes that commensal bacteria from livestock under extensive husbandry and wild
animals harbor potentially transmissible clinically relevant strains and genes, highlighting the need to
reinforce AMR monitoring and genomic surveillance under One Health perspectives, supporting datadriven interventions
Targeting cyclin-dependent kinases/ phosphoinositide-3- phosphate for metastatic breast cancer treatment: pre-clinical studies
No full textTese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasAtualmente, o cancro da mama (CM) é um dos principais responsáveis pelo aumento do número de
casos de doença oncológica, sendo a neoplasia mais diagnosticada e a principal causa de mortalidade
feminina. Apesar dos avanços na taxa de sobrevivência dos pacientes com CM, o surgimento de
metástases leva ao seu declínio. Exacerbando a situação, cerca de 30% dos pacientes com CM
metastático desenvolvem metástases encefálicas (ME), uma condição incurável e associada a um
prognóstico severo. Este prognóstico deve-se, sobretudo, à permeabilidade seletiva que a barreira
hematoencefálica (BHE) apresenta, dificultando o tratamento de pacientes nesta condição. Entre os
subtipos de CM, o triplo-negativo não só é um dos mais agressivos, como também é dos que apresenta
uma maior incidência de ME. Estes factos, aliados à escassez de opções terapêuticas oriundas do
desconhecimento de alvos moleculares específicos para este subtipo, determina o prognóstico severo e
enfatiza a urgência do desenvolvimento de novas terâpeuticas. Neste sentido, modular alterações
moleculares e vias de sinalização que as células tumorais exploram para a progressão do cancro é crucial
para o desenvolvimento de terapias direcionadas. Vias como a ciclina D1-cinases dependentes de ciclina
(CDK) 4/6 e a fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K)/proteína cinase B (AKT)/alvo da rapamacina em
mamíferos (mTOR), que promovem a progressão do CM, constituem potenciais alvos terapêuticos
particularmente relevantes para o CM triplo-negativo, que apresenta alterações a elas associadas. Neste
âmbito, estudos prévios realizados no nosso laboratório identificaram um inibidor promissor de ambas
as vias ciclina D1-CDK4/6 e PI3K/AKT/mTOR, pelo que o objetivo deste trabalho consistiu na
avaliação da sua eficácia e segurança em modelos pré-clínicos distintos: um modelo esferóide tumoral
tridimensional (3D) in vitro com células de adenocarcinoma humano triplo-negativo (MDA-MB-231-
Br4), o qual foi também combinado num modelo da BHE in vitro, assim como um modelo in vivo que
recorre à inoculação de células de CM triplo-negativo de murino (4T1) para o desenvolvimento de ME.
Por conter várias camadas com comportamentos distintos, o modelo esferóide mimetiza a complexidade
tumoral e confere uma resistência terapêutica análoga à observada em respostas humanas. Por outro
lado, o modelo murino escolhido para o estudo de ME do CM (MECM) facilita o desenvolvimento de
metástases experimentais ao replicar com precisão a formação e a localização das MECM em locais
típicos, como o hipocampo. Logo, ambos os modelos têm grande potencial para simular ME,
justificando sua escolha para os estudos pré-clínicos realizados. Para o nosso trabalho começámos por
estabelecer e caracterizar um modelo tumoral 3D de MECM usando as células MDA-MB-231-Br4, uma
linha celular com propensão para a metastização no encéfalo. Para a monitorização diária do diâmetro
e da morfologia dos esferóides foi utilizado um microscópio de fluorescência widefield, enquanto que
para a monitorização da função metabólica foi medida a intensidade de fluorescência após o ensaio da
resazurina. Foram testadas três densidades celulares (1000, 2000 e 5000 células/poço), para as quais se
observou um crescimento dos esferóides até o quarto dia, seguido de um declínio após o sexto em
cultura. A atividade metabólica dos esferóides mostrou-se crescente até ao oitavo dia,
independentemente da densidade celular, sugerindo uma viabilidade sustentada. Os resultados mais
promissores foram observados para a densidade de 2000 células/poço, onde as alterações morfológicas
foram menos drásticas comparativamente, proporcionando melhor reprodutibilidade. O terceiro dia foi
escolhido como ideal para os estudos, pois a integridade estrutural e viabilidade foram mantidas até ao
quarto dia permitiriam ensaios de 24 horas (tempo escolhido para ensaios in vitro) em condições ótimas.
Visando avaliar a ação do inibidor duplo previamente identificado, 10 μM deste foram aplicados em
esferóides formados (com três dias, ponto ótimo) durante 24 horas e foram avaliadas as alterações
estruturais e na expressão das proteínas alvo por imunocitoquímica. Usando um microscópio de
fluorescência widefield, verificou-se que tanto os esferóides não tratados, como os tratados com
abemaciclib (controlo positivo, inibidor CK4/6 permeável à BHE) preservaram a sua integridade
estrutural, enquanto os tratados com o inibidor duplo apresentaram um índice de deformação acentuado (p<0.01). Por sua vez, a avaliação da expressão proteica através de microscopia confocal permitiu inferir
que o inibidor reduz eficazmente a proliferação celular (expressão do Ki-67, p<0.001), ao contrário do
abemaciclib. A redução na expressão da CDK4 (p<0.001) também foi evidente, mas o inibidor não teve
efeito significativo na expressão da ciclina D1 e da CDK6, enquanto o abemaciclib provocou o seu
aumento (p<0.001). Para complementar esta última avaliação, repetimos a análise com uma
concentração mais elevada do inibidor (100 μM), para estudar o seu efeito na expressão das proteínas
que se mantiveram inalteradas com a concentração inicialmente usada (10 µM). Observou-se que uma
maior dose de inibidor aumentou a expressão da ciclina D1, embora sem significância, contrariamente
ao abemaciclib, que manteve o seu aumento significativo (p<0.001). Curiosamente, houve um ligeiro
aumento da expressão da CDK6 (p<0.001) por parte do inibidor duplo, enquanto o abemaciclib diminuiu
acentuadamente a sua expressão (p<0.001). Estes resultados sugerem que o inibidor duplo poderá ter
afinidade superior pela CDK4 em relação à CDK6, à semelhança do controlo positivo, o que explicaria
a redução significativa na expressão de CDK4 com menores doses de fármaco e a mínima variação na
expressão do CDK6. Dado que este trabalho visava o tratamento das MECM, avaliámos a segurança do
inibidor para as células do endotélio cerebral, assim como a sua eficácia com o endotélio da BHE. Para
tal, foi utilizado um modelo robusto da BHE in vitro em que células endoteliais humanas da
microvasculatura cerebral (HBMECs) são cultivadas sobre membranas semi-permeáveis (transwells),
colocados em poços de caixas de cultura, definindo um compartimento superior (que mimetiza o
compartimento sanguíneo) e um inferior (que mimetiza o encéfalo), onde são colocados os esferóides.
Após a aplicação de 100 μM de inibidor (maior concentração testada), foram medidas a resistência
elétrica transendotelial e a permeabilidade paracelular das monocamadas endoteliais, não se tendo
observado alterações significativas em ambos os parâmetros de integridade, confirmando a segurança
do fármaco para as HBMECs. Adicionalmente, a eficácia do inibidor nos esferóides foi avaliada por
imunocitoquímica e microscopia confocal, confirmando novamente a redução da proliferação celular
(Ki-67, p<0.001) e da expressão da CDK4. Houve também uma redução da expressão da ciclina D1
(p<0.001), enquanto a CDK6 aumentou com o inibidor duplo (p<0.001), possivelmente por mecanismos
compensatórios. Dado os resultados promissores obtidos in vitro, com células humanas, projetou-se
avançar para estudos in vivo como prova de conceito. Começou por se assegurar a atividade do inibidor
em células murinas (4T1) usadas no modelo in vivo, recorrendo à análise imunocitoquímica da
proliferação celular. Observou-se uma redução significativa na expressão de Ki-67 (p<0.001),
semelhante aos resultados com células humanas em culturas simples, o que nos permitiu avançar. O
modelo murino da patologia foi estabelecido através da inoculação de células 4T1 na artéria carótida
comum de ratinhos imunocompetentes, promovendo o desenvolvimento de ME. Sete dias após a
injeção, quando já existem metástases bem estabelecidas, os animais foram tratados durante quatro dias
por gavagem oral com 100 mg/kg de inibidor duplo ou de abemaciclib. Em contrapartida, o grupo de
controlo negativo recebeu apenas o veículo e os animais foram sacrificados ao 11º dia. Para avaliar a
extensão das ME após o tratamento, realizou-se uma coloração de hematoxilina-eosina (HE) em secções
coronais do hipocampo cranial, onde as metástases são mais frequentes. A análise das secções revelou
uma redução da carga tumoral e do número de metástases em animais tratados com ambos os inibidores,
mas sem significância estatística. No entanto, o inibidor duplo reduziu significativamente estes dois
parâmetros especificamente na região do hipocampo (p<0.05) comparativamente aos grupos de
controlo. Adicionalmente, foi realizada a avaliação histológica nos pulmões que revelou um redução na
carga tumoral e no número de metástases por parte do inibidor duplo, ainda que sem significância.
Assim, os resultados histológicos evidenciam a eficácia do inibidor duplo em diferentes regiões e a sua
permeabilidade à BHE. Seguidamente, efetuámos uma caracterização molecular do efeito do tratamento
na proliferação e na progressão do ciclo celular das ME via imunohistoquímica, examinando as mesmas
proteínas dos ensaios 3D. Verificou-se uma semelhança na ação sobre o Ki-67, a CDK4 e a ciclina D1,
cuja expressão foi eficazmente reduzida (p<0.001). Em oposição ao in vitro, a CDK6 foi mais suprimida com o inibidor duplo do que com o abemaciclib (p<0.001), possivelmente devido aos diferentes regimes
de tratamento. Contudo, ambos acentuam a ação antitumoral do inibidor duplo e seu efeito sobre a via
da ciclina D1-CDK4/6. Avaliou-se ainda a segurança do inibidor aplicando o esquema de tratamento
usado anteriormente (100 mg/kg de cada um dos inibidores por gavagem oral durante 4 dias e veículo
para o grupo de controlo) em animais saudáveis. As análises bioquímicas plasmáticas não revelaram
alterações nos vários marcadores bioquímicos avaliados (creatinina cinase, ureia e alanina
aminotransferase), tal como os exames histológicos não revelaram toxicidade ou danos estruturais nos
órgãos periféricos (pulmões, fígado, rins e coração), confirmando a segurança do inibidor duplo para o
tratamento do CM triplo-negativo metastático. No seu conjunto, este trabalho lança as bases para uma
abordagem terapêutica pioneira para pacientes com CM triplo-negativo metastático, principalmente
aqueles afetados por ME, reduzindo a letalidade e melhorando o seu bem-estar.Breast cancer (BC) is a major contributor to the global cancer burden, standing as the most diagnosed
cancer and the foremost cause of death in women, particularly in its metastatic form. Targeting pathways
like cyclin D1-cyclin-dependent kinases (CDK) 4/6 and phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/protein
kinase B (AKT)/mammalian target of rapamycin (mTOR), which drive BC progression, could serve as
an effective therapeutic strategy. Our previous studies identified a promising inhibitor of both pathways.
This project aimed to evaluate the dual inhibitor in distinct pre-clinical models: an in vitro threedimensional (3D) tumor spheroid model with human MDA-MB-231-Br4 cells [triple-negative (TN)
BC] and a blood-brain barrier (BBB) in vitro model incorporating spheroids, along with an in vivo
murine model of BC brain metastases (BCBM) relying on the intracarotid inoculation of murine
mammary carcinoma TN 4T1 cells. By containing diverse layers with different behaviours, the spheroid
model mimics the complexity of tumors and confers treatment resistance similar to human responses.
Our BCBM murine model promotes BCBM formation, particularly in the hippocampus. So, both
models display substantial therapeutic promise for replicating BC metastases. We observed that the
inhibitor significantly reduced cell proliferation in both models. Assessment of CDK4/6 and PI3K
pathway associated proteins confirmed that the inhibitor consistently affected CDK4 expression in both
models. Further, in a BBB in vitro model, the inhibitor penetrated the BBB integrity while maintaining
its integrity. Also, the tumor burden was reduced in the hippocampus of animals administered with this
inhibitor, suggesting that it crosses the BBB also in vivo, and addressing the need for an efficient
treatment of brain metastases (BM). Together, our findings emphasise the potential of inhibiting CDK4/6
and PI3K signaling pathways as a promising therapeutic approach for metastatic BC (MBC), particularly
for patients encountering BM, a condition marked by poor prognostic outcomes