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The use of metagenomic approaches by NGS-based 16S rRNA to analyse tick’s microbial communities
No full textTese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasTicks are ectoparasitic arthropods that feed exclusively on blood from a large range of hosts,
including humans. These arthropods are included in families Argasidae, Ixodidae and Nuttalliellidae.
They are of great importance in health, especially the Ixodidae, due to their capacity to transmit
microorganisms, some of which may be responsible for high morbidity and mortality rates in domestic
and wild animals and humans. For the present study, tick samples were collected from dogs and cats in
veterinary clinics distributed throughout national territory, which constitute the FCISA - Tick
Collection, deposited in the Department of Animal Biology of the Faculty of Sciences of the University
of Lisbon.
This work aims to evaluate tick species circulating in domestic dogs and cats (mainland Portugal) and
their bacterial microbiome. Ticks were morphologically identified and confirmed by COI genetic
marker. To understand the tick microbiome, eight DNA pools were created to perform metagenomic
analysis by NGS-based 16S rRNA. Morphological and molecular identification of tick species were
concordant, highlighting the presence of several species parasitizing dogs and cats. The 16S rRNA
metagenomic results showed a high diversity of bacteria in the tick species studied, with "Candidatus
Midichloria”, Coxiella, Francisella, Wolbachia and Pseudomonas being the most abundant bacterial
genera. Other Bacteria associated with soil, water, plants, arthropods and vertebrates were identified in
this study and have already been related to ticks, suggesting that these bacteria may be acquired from
the environment and from host, which potentially result in variations in the tick microbiome. Many other
minor genera Bacteria (<1%) have also been detected, which have not yet been associated with ticks
and whose importance is unknown.
This study demonstrated which Bacteria are present in the microbiome of the most abundant ticks in
Portugal, but it can be improved with further studies
TRIFECTA - Development of a novel trispecific antibody for the anticancer immune targeting of non-Hodgkin Lymphoma
No full textTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética , 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasNon-Hodgkin Lymphoma (NHL) is among leading causes of cancer-related death
worldwide, although prognosis has improved in recent years. Several innovative drugs are in
clinical development for NHL treatment; however, approvals remain limited, partly due to the
lack of clinically relevant models for validation. Immunotherapy strategies have been developed;
however, the high pace of clinical application present challenges, highlighting the need for novel
strategies and models for developing successful and cost-effective immunotherapies. Due to its
similarity to human disease, the canine lymphoma model has been suggested as a powerful tool
for translating novel immunotherapies into clinical practice. A promising approach to optimize
immunotherapy involves the development of bispecific antibodies that simultaneously bind to
cancer cells and recruit T-lymphocytes, redirecting and unleashing T-lymphocytes cytotoxicity
against cancer cells. However, by engaging the TCR/CD3 complex alone, most bispecific
antibodies lead to T-lymphocytes activation and faster exhaustion. This project aimed to develop
a trispecific antibody (TsAb) targeting CD20 receptor, overexpressed in B-lymphocytes
malignancies, and CD3 and CD28 receptors on T-lymphocytes. Targeting CD3 activates Tlymphocytes, while targeting CD28 supports long-lasting T-lymphocytes proliferation by
supplying a co-stimulatory signal that activates an alternate signal transduction pathway and
inhibits apoptosis. For that purpose, TsAb targeting canine CD20, CD3, and CD28 was
engineered, produced, and purified. Optimization of canine T-lymphocyte isolation was
conducted for in vitro assays evaluating TsAb’s ability to promote T- lymphocyte activation and
canine NHL cell cytotoxicity. A Phage Display selection was carried out on a rabbit single domain
(sdAb) antibody library, identifying antibodies specific to canine CD3. ELISA screening allowed
the selection of sdAbs with promising expression and binding properties, which could be
integrated into improved TsAb in the future. Overall, this project supports the development of
next-generation T- lymphocytes engager antibodies for cancer treatment, while providing realistic
opportunities for clinical translation
Bacterial persistence and antibiotic resistance
No full textTese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasQuando populações de bactérias geneticamente sensíveis a um antibiótico bactericida são expostas a
esse composto, as células não morrem de forma instantânea. Inicialmente, observa-se uma fase de morte
exponencial, na qual a maioria das células é eliminada, levando a uma redução significativa do tamanho
populacional. No entanto, segue-se uma segunda fase distinta, durante a qual uma subpopulação residual
de células sobrevive por períodos consideravelmente mais longos. Nesta fase, o declínio do número
populacional ocorre de forma muito mais lenta, dando a impressão de que estas células são
geneticamente resistentes ao antibiótico, embora, na realidade, não o sejam. Esta segunda fase deve-se
a um fenómeno denominado de persistência, caracterizado por um estado de dormência em que células
com baixa atividade metabólica e taxa de crescimento conseguem sobreviver à exposição a agentes
citotóxicos, como os antibióticos. Contudo, estas células diferem das células resistentes, pois ao
dividirem-se, acabam por morrer. A sua capacidade de sobrevivência ao agente citotóxico está limitada
ao período em que permanecem neste estado de dormência.
O fenómeno da persistência foi descoberto há mais de 80 anos. No entanto, as suas causas moleculares,
fisiológicas e evolutivas permanecem ainda por esclarecer. A maioria dos investigadores que estuda este
fenómeno considera que a persistência tem uma base genética que terá evoluído especificamente para a
sobrevivência em certas condições de stress, como por exemplo exposição a compostos citotóxicos.
Contudo, outros investigadores têm usado argumentos evolutivos, matemáticos e experimentais para
defender a hipótese que a persistência não tem uma base genética específica. De acordo com esta
segunda hipótese a persistência resulta de erros aleatórios que ocorrem durante a divisão celular, e é
apenas a consequência direta da incapacidade temporária de algumas células retomarem as divisões
celulares, sendo estas células temporariamente incapazes de se replicar, e também temporariamente
refratárias aos antibióticos. Esta hipótese foi recentemente corroborada com resultados experimentais
realizados com uma estirpe bacteriana contendo um plasmídeo, não sendo claro qual o papel deste
elemento extra-cromossómico. Outra hipótese, mais recentemente formulada, que tenta explicar a
persistência, congrega ambas as perspetivas das duas hipóteses que a antecederam. Segundo esta nova
hipótese a persistência é o resultado da disrupção aleatória de grandes redes biomoleculares, em vez da
ativação de vias génicas específicas. Apesar disto, aquando do estudo de células persistentes, os
investigadores tendem a encontrar perturbações em certas vias génicas que surgem mais frequentemente
alteradas. Nomeadamente, em genes correlacionados com: módulos toxina-antitoxina; resposta ao
stress; reparação de danos no DNA; regulação do metabolismo; comunicação celular; sistemas de
bombas de efluxo e modificações epigenéticas.
Devido à capacidade de retomar o crescimento após o cessar dos tratamentos e do ambiente estar livre
de antibióticos, nos últimos anos as células persistentes têm vindo a ser reconhecidas pela comunidade
científica como uma das maiores causas do insucesso destas terapias e da recorrência de doenças
infeciosas bacterianas. Contudo, a resistência a antibióticos continua a ser o maior obstáculo ao combate
e eliminação destas infeções, dado que a mesma se encontra imensamente dispersada pelas comunidades
microbianas, sendo facilmente adquirida e desenvolvida pelas bactérias. Dado este contexto, este estudo
foi desenvolvido com o principal objetivo de estudar o impacto de mutações cromossómicas e de
plasmídeos, conferentes de resistência a diferentes antibióticos, no decaimento de uma população
bacteriana e na sua subpopulação de células persistentes, quando submetidas a um antibiótico
(ampicilina) para o qual não possuem resistência. Para isto, utilizámos estirpes de Escherichia coli K12,
com mutações pontuais no seu cromossoma bacteriano que conferem resistência a antibióticos com
mecanismos de ação diferentes dos da ampicilina, nomeadamente o ácido nalidíxico e/ou a rifampicina,
e/ou com plasmídeos isolados naturais (RN3 e R702) que conferem resistência a outros antibióticos que não a ampicilina. Como controlo, utilizámos uma estirpe derivada de E. coli K12 que não é resistente a
antibióticos nem contém qualquer plasmídeo.
Ao analisar curvas de morte de bactérias, de acordo com argumentos matemáticos, é esperado que as
populações bacterianas decaiam numa primeira fase de forma rápida e exponencial. Contudo, numa
segunda fase, quando apenas se mantêm vivas as subpopulações de células persistentes, é esperado que
estas decaiam mais lentamente e de acordo com uma distribuição exponencial ou de lei de potência se a
persistência tiver ou não uma base genética, respetivamente. Dado isto para além do objetivo principal
acima descrito, esta tese teve ainda como objetivo secundário o estudo matemático das cinéticas de
morte das populações bacterianas na primeira e segunda fase do seu decaimento. E desta forma avaliar
quais das duas distribuições matemáticas (exponencial ou lei de potência) melhor descreve o decaimento
das subpopulações de células persistentes.
Para analisar as cinéticas de morte das diferentes bactérias acima listadas foram realizados vários
ensaios de curva de morte. Estes ensaios consistiram na adição de um antibiótico (ampicilina) para o
qual as células bacterianas não apresentavam resistência, e tiveram uma duração de 6 dias, durante os
quais, diferentes amostras das culturas foram retiradas em períodos de 24 h, de forma a estimar o número
de células bacterianas ao longo do tempo. Após a contagem de colónias e estimação do número de
células bacterianas ao longo do tempo em cada momento analisado, as cinéticas de morte das diferentes
estirpes analisadas foram calculadas, e o seu decaimento foi estudado matematicamente e ilustrado em
diferentes gráficos.
Os nossos resultados indicam que na primeira fase das curvas de morte, as bactérias E. coli K12 com
mutações cromossómicas conferentes de resistência a apenas um antibiótico (ácido nalidíxico ou
rifampicina) decaem mais rápido do que o controlo (que não possui resistência a algum antibiótico),
enquanto que as bactérias com mutações cromossómicas conferentes de resistência a ambos os
antibióticos apresentam uma taxa de sobrevivência maior nas primeiras horas de decaimento. Contudo,
as subpopulações de células persistentes destas bactérias apresentaram taxas de decaimento semelhantes
às do controlo, não revelando nenhum impacto destas mutações na segunda fase das curvas de morte
destas estirpes. Para além disto, neste estudo também observámos que a subpopulação de células
persistentes de E. coli portadoras do plasmídeo R702 ou do plasmídeo RN3 apresentaram uma taxa de
decaimento maior ou reduzida em comparação com o controlo, respetivamente. Contudo, nenhum destes
plasmídeos teve um impacto significativo na primeira fase de morte destas bactérias, tendo esta sido
idêntica à da estirpe controlo.
Com o objetivo de avaliar se a taxa de crescimento das bactérias estudadas se encontrava
correlacionada com as suas respetivas taxas de decaimento, medimos as curvas de crescimento de todas
as estirpes analisadas. Para isto, foi utilizado um leitor de microbiologia (Bioscreen), que nos permitiu
acompanhar o crescimento das diferentes bactérias, ao medir a absorbância a OD600 nm de 10 min em
10 min durante um período de 24 h. Uma vez que a maioria dos antibióticos apenas consegue matar
células em crescimento, as bactérias com menores taxas de crescimento deveriam apresentar também
menores taxas de decaimento. Contudo, após calcular as taxas de crescimento das diferentes estirpes
analisadas, observámos que as diferenças nas taxas de crescimento não conseguiam explicar as
diferenças observadas no decaimento destas estirpes. Ao analisar as estirpes com menores taxas de
crescimento, observámos que algumas destas não seguem esta hipótese, nomeadamente as que possuem
mutações cromossómicas que conferem resistência à rifampicina e aquelas que contém o plasmídeo
R702 (e possuem ou não resistências cromossómicas), uma vez que numa determinada fase das suas
curvas de morte, estas decaem mais rapidamente do que a estirpe controlo. Para além disto, esta hipótese
não conseguiu explicar outros resultados (como o decaimento mais rápido na primeira fase da curva de
morte da estirpe que possui mutações cromossómicas e carrega o plasmídeo RN3, ou as taxas de decaimento na segunda fase, semelhantes ao controlo, das estirpes com mutações cromossómicas que
conferem resistência ao acido nalidíxico e/ou à rifampicina). Portanto, suspeitamos que outras causas
(como a epistasia genética) possam explicar esses resultados. Sendo que, após o estudo matemático dos
decaimentos das diferentes populações bacterianas, os nossos resultados evidenciavam uma ligeira
tendência que favorecia a distribuição exponencial em detrimento da distribuição de lei de potência,
indicando possivelmente um mecanismo genético para a persistência. Contudo, estes resultados não são
suficientes para definir adequadamente qual distribuição (exponencial ou lei de potência) melhor se
adequa ao decaimento das subpopulações de persistentes, sendo necessária a realização de mais
experiências com este objetivo.Bacterial persistence is a state of dormancy in which a subpopulation of bacterial cells with low
metabolic activity and growth rates are capable to survive to temporary exposition to antibiotics. In
contrast, antibiotic resistance is the ability of a bacterial population not only to survive but also to
replicate in the presence of an antibiotic. While antibiotic resistance is widely recognised as the main
cause of antibiotic treatments failure, persistence has emerged in recent years as a significant contributor
to the recurrence of bacterial infections, posing a severe threat to human health. To investigate whether
resistance to different antibiotics, conferred whether by chromosomal point mutations or plasmids can
affect the decay of bacterial populations (including their subpopulation of persisters), we measured the
decay of such bacteria under exposition to ampicillin. Additionally, as the decay of persister cells
populations can follow an exponential or power-law distribution, we mathematically analysed the decay
patterns of these populations. Our results revealed that, Escherichia coli K12 spontaneous mutants
resistant to only one antibiotic (nalidixic acid or rifampicin) initially decay faster than expected. In
contrast, the double resistant mutant exhibited greatersurvival during the early stages of decay compared
to the control strain (lacking resistance determinants). Furthermore, we observed distinct decay rates
among persister subpopulations: E. coli carrying the R702 plasmid shown an increased decay rate, while
those with the RN3 plasmid demonstrated a reduced decay rate. These variations in the bacterial
population decay could not be attributed solely to the differences in growth rates of the respective
bacterial strains, suggesting that other factors, such as gene epistasis may play a role. Finally, our results
were inconclusive in determining whether an exponential or power-law distribution better fits the decay
patterns of persister populations
differences in judgments of the self, individuals, and collectives
No full textResearch on comparative biases has long shown a better-than-average effect—whereby people tend to believe themselves to be better than the average other person—as well as a tendency to judge individuals more favorably than groups. Whereas self-other differences have been extensively studied, less is known about individual-collective differences: what features of others best predict when asymmetries occur, what processes explain those asymmetries, and what sources of information people draw from in their judgments. In three empirical chapters, I seek to provide answers to these questions. I found that singularity (i.e., the target’s status as a mere individual versus multiple individuals) is sufficient to generate different judgments. In three different paradigms, adapted from very different areas of research, I consistently find that individuals are judged more benevolently than collectives—even when the individuals are described with no further individuating information than collectives (i.e., participants simply know they are making judgments about a single individual, as opposed to members of a collective). In Chapter II, I introduce a novel measure of the valence of moral judgments, clearly distinguishing whether people (self or other people) are judged positively or negatively. Whereas people consistently display self-positivity (i.e., they see themselves as morally adequate), others are perceived negatively or positively as a function of whether they are a collective or a single individual. We replicated this effect of singularity with additional paradigms, showing that people (a) perceive the attitudinal responses of an individual as more authentic than those of the group the individual belongs to (Chapter III); and (b) put greater value on individual lives than on the lives of collectives when assessing casualties (of wars or other events; Chapter IV). Moreover, whereas previous research showed that people rely on target-related attributes (e.g., population base rates and target-idiosyncratic information) when making social judgments, these studies show evidence for perceiver-related influences on judgment: In Chapter II, we
show that participants’ anticipated feelings about misjudging others predict the moral judgments they make about those people. Specifically, participants expected to feel worse when misjudging an individual versus a collective, and this explains why their judgments are benevolent for individuals. In Chapter III, we measured participants’ attitudinal conflict towards various social groups (i.e., the fact that their automatic attitudinal responses were sometimes more negative than their controlled responses) and showed that this conflict influenced perceptions of the authenticity of others’ attitudes: When participants themselves were conflicted about a group, they tended to perceive others’ attitudinal responses toward that group as less authentic. In the final chapter, I discuss the main contributions and societal implications of this work and reflect on open questions and future research that my findings inspire
Resistência a antimicrobianos em isolados patogénicos e não patogénicos de Escherichia coli humanos e não humanos – Importância em Saúde Pública
No full textTese de mestrado, Microbiologia Aplicada, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO aumento significativo e diversificado de doenças infeciosas causadas por microrganismos
patogénicos, quer nos humanos quer nos animais, tem incentivado a procura de substâncias capazes de
inibir o crescimento, ou até mesmo eliminar, esses microrganismos. Neste estudo, foram caracterizadas
fenotípica e genotipicamente 388 estirpes de Escherichia coli (E. coli) isoladas de produtos biológicos
de origem humana (n = 111), de fezes de animais produzidos para consumo (APC), nomeadamente
suínos (n = 93) e bovinos (n = 40), e de fezes de animais de companhia (AC), como caninos (n = 64) e
felinos (n = 80). Foram identificados patotipos de E. coli patogénica intestinal em 13,5% dos isolados
clínicos, em 17,3% dos isolados de APC e em 20,8% dos isolados de AC. Todas as estirpes submetidas
a sequenciação completa do genoma (n = 171) apresentaram genes de virulência associados a E. coli
patogénica extraintestinal. A diversidade de serotipos e de sequências tipo foi elevada em todos os
grupos. Em relação ao perfil de resistência a antibióticos, 38,4% dos isolados apresentaram resistência
a pelo menos um dos antibióticos testados. Foram identificadas estirpes multirresistentes em isolados
de casos clínicos (25,2%), de suínos (51,6%), de caninos (10,9%) e de felinos (6,3%). As resistências à
ampicilina, tetraciclina e sulfametoxazol foram as mais frequentes em isolados de casos clínicos
(28,2%), de suínos (57,7%), de caninos (9,4%) e de felinos (9,2%). Foram identificados dez isolados de
E. coli produtores de beta-lactamases de espectro alargado, um com mutações no promotor ampC e 16
com o gene mcr-1.1. A análise filogenética permitiu identificar 15 clusters. Nenhum cluster integrou
isolados provenientes de grupos diferentes. Este estudo evidencia a necessidade de abordar o conceito
One Health para melhorar a compreensão e reduzir as vias de transmissão de bactérias patogénicas,
assim como limitar a disseminação de genes que conferem resistência aos antimicrobianos.The significant and diversified increase in infectious diseases caused by pathogenic microorganisms
in both humans and animals has driven the search for substances capable of inhibiting the growth, or
even eliminating, these microorganisms. In this study, 388 strains of Escherichia coli (E. coli) isolated
from biological products of human origin (n = 111), faeces from animals produced for consumption
(APC), namely pigs (n = 93) and cattle (n = 40), and faeces from companion animals (AC), such as dogs
(n = 64) and cats (n = 80), were phenotypically and genotypically characterized. Pathotypes of intestinal
pathogenic E. coli were identified in 13.5% of clinical isolates, 17.3% of APC isolates, and 20.8% of
AC isolates. All strains subjected to whole-genome sequencing (n = 171) showed virulence genes
associated with extraintestinal pathogenic E. coli. The diversity of serotypes and sequence types was
high in all groups. Regarding antibiotic resistance profiles, 38.4% of isolates showed resistance to at
least one of the tested antibiotics. Multidrug-resistant strains were identified in clinical cases (25.2%),
pigs (51.6%), dogs (10.9%), and cats (6.3%). Resistance to ampicillin, tetracycline, and
sulfamethoxazole was most frequent in clinical isolates (28.2%), pigs (57.7%), dogs (9.4%), and cats
(9.2%). Ten extended-spectrum beta-lactamase-producing E. coli isolates, one with ampC promoter
mutations, and 16 with the mcr-1.1 gene were identified. Phylogenetic analysis identified 15 clusters,
with no cluster integrating isolates from different groups. This study highlights the need to address the
One Health concept to better understand and reduce the transmission pathways of pathogenic bacteria
and limit the spread of antimicrobial resistance genes
Genomic and phenotypic analyses of antimicrobial-resistant enterobacteria circulating in official animal shelters
No full textTese de Mestrado, Microbiologia Aplicada, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA resistência antimicrobiana (RAM) é um problema complexo e global que coloca em risco a saúde
humana, animal e ambiental. Estimativas recentes indicam que, até 2050, 10 milhões de pessoas morrerão
anualmente devido à RAM. O uso excessivo, inadequado, mas também o uso adequado de antibióticos são
considerados os principais impulsionadores da RAM, embora outros fatores contribuam para a resistência
bacteriana, tais como a globalização, mudanças demográficas e contaminação ambiental. Apesar de uma
vasta e crescente literatura sobre RAM, os processos ecológicos de transmissão de determinantes de
resistência impulsionados local ou globalmente na interface animal-humano-ambiente permanecem
desconhecidos, enquanto abordagens integradas na perspectiva de Uma Só Saúde são ainda escassas.
O principal foco de RAM na componente animal no seio das abordagens de Uma Só Saúde tem incidido
nos animais de produção. No entanto, os animais de companhia também podem veicular determinantes de
RAM, quer a nível intraespecífico, quer para os seus tutores. A este respeito, o risco zoonótico potencial
deve ser enfatizado, considerando o número crescente, nas últimas décadas, de pessoas com animais de
companhia, principalmente cães, e que com eles se relacionam em grande proximidade.
Por outro lado, os animais errantes podem representar elevado potencial de transmissão de agentes
patogénicos e de determinantes de resistência e virulência. Estes animais são expostos a variados ambientes
urbanos e rurais, sendo potencialmente sujeitos a stresses vários, incluindo lesões, doenças infecciosas,
abusos e maus tratos. Quando admitidos nos Centros de Recolha Oficiais de animais (CRO), estes animais
acarretam risco para a saúde dos outros animais abrigados, dos voluntários e dos trabalhadores das
instalações, sendo escassos os registos médico-veterinários e o rastreio de doenças infecciosas antes da
admissão. Neste estudo, tivemos como objetivo gerar dados de resistência antimicrobiana nesta população
animal, estabelecendo, para o efeito, colaboração com a Associação Nacional de Médicos Veterinários
Municipais e três municípios do território continental nacional para monitorizar a circulação de
enterobactérias resistentes nos cães albergados nos CRO.
Foram recolhidas 44 amostras fecais de cães alojados em três CRO do norte de Portugal: CRO1 (20
amostras), CRO2 (16 amostras), CRO3 (oito amostras). Grande parte das amostras representa mais do que
um indivíduo devido ao alojamento dos animais no mesmo parque. Após recuperação não-seletiva, as
amostras foram inoculadas em meio seletivo para bactérias Gram-negativas, especificamente agar
MacConkey (MAC), o que resultou na seleção de mais de 220 isolados de Enterobacterales. Numa primeira
abordagem, os isolados foram testados em MAC suplementado com um de quatro antibióticos (cefotaxime,
meropenemo, ciprofloxacina e tetraciclina), registando-se uma elevada percentagem de isolados
provisionalmente resistentes à tetraciclina, consistente com a sua larga utilização em medicina veterinária.
A identificação molecular dos mais de 220 isolados foi realizada por amplificação dos genes lacZ e 16S
rDNA, resultando na deteção presuntiva dos géneros Escherichia (n=177 isolados), Proteus (n=40),
Enterobacter (n=3), Citrobacter (n=1) e Morganella (n=1). Realizou-se a avaliação da suscetibilidade dos isolados a 19 antibióticos por teste de difusão em agar, ou
microdiluição em microplaca (quando adequado), seguindo os procedimentos preconizados pela EUCAST.
Os antibióticos testados incluem: ampicilina (AMP), amoxicilina/ácido clavulânico (AMC),
ampicilina/sulbactam (AMS), meropenemo (MER), cefoxitina (CXI), cefotaxime (CTA), ceftazidime
(CTZ), cefepime (CEP), aztreoname (AZT), ciprofloxacina (CIP), ácido nalidixico (NAL),
trimetoprima/sulfametoxazol (TRS), gentamicina (GEN), tetraciclina (TET), tigeciclina (TIG), azitromicina
(AZI), fosfomicina (FOS), cloranfenicol (CHL), e colistina (COL). A proporção de isolados resistentes a βlactâmicos (incluíndo cefalosporinas de segunda geração) e macrólidos foi elevada, aproximadamente 44 %
e 34 %, respetivamente, sendo a percentagem de multiresistência avaliada em cerca de 27,5 %. A resistência
intrínseca a antibióticos exibida pelos géneros bacterianos em menor prevalência nas amostras fecais
analisadas, nomeadamente Proteus, terá contribuído para este resultado. No CRO1, onde se analisou maior
número de amostras e isolou maior número de Enterobacterales, registou-se maior riqueza específica e
maior percentagem de resistência fenotípica. Não se registou resistências a monobactamas, carbapenemos
e cefalosporinas de última geração. A avaliação dos padrões fenotípicos de resistência evidenciou a
abundância (61.3 %) de isolados presuntivos de Escherichia coli resistentes a apenas um antibiótico (AMP,
GEN, TET or AZI). Nos restantes géneros de Enterobacterales, registou-se elevada prevalência de coresistência a COL-TET-AZI, seguida de co-resistência a AMP-COL-CIP-NAL-TRS-TET-AZI, o que se
atribui às resistências intrínsecas dos isolados em estudo. Em alguns casos, verificou-se que a elevada
frequência de padrões específicos de co-resistência estava relacionada com a sobre-representação de clones
bacterianos.
Não se registou correlação significativa alta entre a presença de bactérias multirresistentes e variáveis
relacionadas com a história de vida dos indivíduos, nomeadamente o sexo, faixa etária, origem, coocorrência de parasitas gastrointestinais, consistência das fezes, tratamento com antiparasitários, ou com
outros metadados da amostra, designadamente o tipo de amostra (mista ou individual). Informação
específica sobre a utilização de antibióticos nos indivíduos analisados não se encontrava disponível à data
de conclusão do estudo, não tendo, pois, sido possível testar a associação entre a utilização de antibióticos
e as resistências detetadas. No entanto, as resistências encontradas são compatíveis com as classes de
antibióticos mais vendidas a nível Europeu.
Dos mais de 220 isolados de Enterobacterales obtidos neste trabalho, selecionou-se 19 para
sequenciação completa do genoma com base no seu perfil fenotípico de resistência, incluindo-se nesta
análise isolados dos géneros bacterianos menos prevalentes nas amostras e menos explorados na literatura:
Proteus (n=11), Enterobacter (n=3), Citrobacter (n=1) e Morganella (n=1). A análise do resistoma foi
baseada nos genomas montados de novo (assemblies), utilizando-se para o efeito as ferramentas
“ResFinder” do Centro de Epidemiologia Genómica (CGE) e a ferramenta “abriTAMR”. Nas condições
testadas in sílico, detetaram-se elementos genéticos homólogos a genes que codificam β-lactamases
clinicamente relevantes, nomeadamente blaTEM, e β-lactamases do tipo AmpC, em 68,4 % dos isolados de
Enterobacterales. No entanto, nos respetivos testes de suscetibilidade a antibióticos não foi observado
fenótipo consistente com a expressão de β-lactamases de espectro alargado. Outros elementos genéticos
detetados, como acrF, emrD, mdtM e oqxAB, codificam bombas de efluxo que conferem resistência a
múltiplos agentes, incluindo as fluoroquinolonas. A análise de correlação demonstrou frequentemente correspondência entre o fenótipo e o genótipo, bem como associações estatisticamente significativas entre
grupos de genes. Registou-se a co-ocorrência num mesmo genoma de genes que conferem resistência a
antibióticos da mesma classe e, ainda, correlações entre genes que conferem resistência a diferentes classes
de antibióticos, nomeadamente entre sulfonamidas e aminoglicosídeos.
Complementarmente, a análise de genes de virulência por recurso às ferramentas “VirulenceFinder”
(CGE), “abriTAMR” e “ABRicate” (com a base de dados do “VFDB”) foi realizada sobre os genomas
montados anteriormente, com deteção de determinantes relacionados com a adesão celular, estrutura
fimbrial, biogénese de curli, quorum sensing, absorção de ferro e outros processos metabólicos. Verificouse que isolados de Escherichia spp. (n=3) e Proteus mirabilis (n=3) albergam plasmídeos passíveis de
transportar genes de resistência a antibióticos, nomeadamente dos grupos Inc e p3M-2A (Col3M),
respetivamente, de acordo com a análise efetuada com recurso à ferramenta “PlasmidFinder” (CGE).
A análise filogenética dos isolados de P. mirabilis sequenciados neste trabalho e de genomas depositados
nas bases de dados públicas, obtidos em Portugal e Espanha, num total de 44 genomas, foi realizada após
mapeamento contra o genoma de referência Proteus mirabilis HI4320, identificando-se globalmente de
122104 posições variáveis. A análise de máxima verossimilhança evidenciou um clade constituído por
isolados clínicos de origem humana e com o mesmo perfil alélico. Os isolados de P. mirabilis obtidos no
presente estudo da mesma amostra apresentaram perfis alélicos idênticos. Esta análise destacou ainda um
grupo de quatro isolados obtidos nos CRO com maior distância filogenética dos restantes isolados, dos quais
três são filogeneticamente próximos de um isolado de P. mirabilis obtido de um cão em Espanha.
Adicionalmente, dois isolados obtidos de cães alojados em CRO diferentes revelaram-se filogeneticamente
próximos.
Os resultados deste estudo sugerem elevada incidência de enterobactérias resistentes a antimicrobianos
nos cães alojados nos CRO. Especificamente, verificou-se que as resistências fenotípicas observadas
estavam associadas a determinantes genómicos, dos quais cerca de 80 % são passíveis de transferência
horizontal, favorecendo a disseminação da RAM. A combinação de análises fenotípicas e genotípicas na
monitorização da RAM em cães alojados nos CRO pode informar as práticas de utilização de
antimicrobianos, o maneio animal e as práticas de biossegurança no CRO, contribuindo para a resposta
global aos atuais desafios de saúde pública e saúde animal, nomeadamente no domínio da RAM. As análises
fenotípicas fornecem uma visão imediata da resistência in vitro aos antibióticos, enquanto as genotípicas
revelam a estrutura e composição do genoma, incluindo a presença e diversidade de determinantes de
resistência e virulência, informando ainda sobre o potencial para a sua disseminação. Esta abordagem
integrada não só facilita a gestão de casos clínicos individuais, mas também suporta a implementação de
medidas preventivas e políticas de controlo da utilização de antibióticos mais eficazes, fortalecendo a
vigilância regular e a mitigação dos riscos associados à RAM, contribuindo para abordagens integradas na
Era de Uma Só Saúde.Antimicrobial resistance (AMR) is acknowledged by the World Health Organization as an urgent and
global public health issue, putting at risk control of infectious diseases. Stray and shelter dogs are vulnerable
animals exposed to a variety of stressors, but they remain an overlooked population in One Health
surveillance of AMR.
This pilot study aimed to establish baseline data on the occurrence of AMR commensal bacteria among
sheltered dogs, generating for that purpose phenotypic and genomic data on selected Enterobacterales.
Forty-four fecal samples from dogs were collected from three official animal shelters, from which over
220 Enterobacterales were obtained in descending order of genus
prevalence: Escherichia, Proteus, Enterobacter, Citrobacter, and Morganella. Susceptibility testing
against 19 antibiotics classified 27.5 % of the isolates as multiresistant, primarily due to intrinsic resistance
of less prevalent genera to specific antimicrobials (~15 %). Resistance to macrolides and β-lactams,
including second-generation cephalosporins, was common, while resistance to monobactams and
carbapenems was absent. Whole genome sequencing of 19 selected resistant isolates retrieved genes
encoding resistance against β-lactams, quinolones, sulfonamides, aminoglycosides, and tetracyclines,
with blaTEM (26.3 %) and AmpC β-lactamases (42.1 %) detected in Enterobacterales genomes, although no
extended-spectrum β-lactamase were phenotypically detected. Virulence genes associated with cell
adhesion, fimbrial structure, curli biogenesis, quorum sensing, iron uptake, and other metabolic processes,
were detected, along with Inc plasmids in Escherichia spp. and the p3M-2A (Col3M) plasmid in Proteus
mirabilis. Phylogenetic examination of P. mirabilis genomes generated in this work, along with publicly
available genomes, uncovered phylogenetic relatedness of three isolates from this study with a dog isolate
from Spain.
Phenotypic and genotypic analyses of commensal and zoonotic bacteria in this study support the need
for regular AMR surveillance of shelter dogs to shed light on the overall AMR burden and promote
antimicrobial stewardship in the One Health Era
Estudo das propriedades antimicrobianas e de superfície de resinas acrílicas de impressão em 3D incorporadas com clorexidina
No full textObjetivo: Avaliar o efeito da incorporação de clorexidina a 2,5% nas propriedades antimicrobianas e de molhabilidade de superfície de resinas acrílicas para base de prótese removível, impressas tridimensionalmente.
Materiais e Métodos: Elaboraram-se discos de resina fotopolimerizável (10x2 mm) Denture 3D+ (NextDent), constituindo-se um grupo experimental com a incorporação de 2,5% (m/m) de clorexidina e um grupo controlo (0% clorexidina). Os microrganismos selecionados para os ensaios microbiológicos foram Staphylococcus aureus (ATCC® 25932) e Candida Albicans (ATCC® 10231TM). Para a avaliação antimicrobiana recorreu-se ao teste microbiano de Kirby- Bauer, no qual se procedeu à observação e medição dos halos de inibição presentes (n=4), e à avaliação da atividade antibiofilme com recurso ao ensaio de cristal violeta tendo-se, no final, avaliado a resposta por espetrofotometria, recorrendo a um espetrofotómetro (n=3). A molhabilidade de superfície foi determinada através da medição do ângulo de contacto (θ) pela técnica da gota séssil (2 μl de água ultra pura) na superfície de cada espécime (n=3), após a deposição da água (t=0’) e após 10 minutos (t=10’), utilizando um microscópio digital (magnificação 1600x).
Resultados: No ensaio de inibição de crescimento, o grupo experimental evidenciou a existência de um halo de inibição para ambos os microrganismos. No ensaio antibiofilme, para ambos os microrganismos, o grupo experimental mostrou uma redução de crescimento face ao grupo de controlo (p<0,001). Na avaliação da molhabilidade de superfície, os valores do ângulo de contacto medido no grupo controlo não apresentaram diferenças estatisticamente significativas relativamente aos do grupo experimental no tempo 0 minutos (p=1,000) e 10 minutos (p=0,700).
Conclusão: A incorporação de clorexidina a 2,5% em resinas acrílicas para base de prótese removível, impressas tridimensionalmente, aumenta significativamente a atividade antimicrobiana destas resinas, tanto no biofilme envolvente como na superfície dos espécimes. Contudo, esta veiculação aparenta manter a molhabilidade de superfície, caracterizando-se como uma superfície hidrofílica.Objective: To evaluate the effect of incorporating 2.5% chlorhexidine on the antimicrobial properties and surface wettability of three-dimensionally printed acrylic resins for removable prosthesis bases.
Materials and Methods: Denture 3D+ (NextDent) light-curing resin discs (10x2 mm) were made, with an experimental group incorporating 2.5% (m/m) chlorhexidine and a control group (0% chlorhexidine). The microorganisms selected for the microbiological tests were Staphylococcus aureus (ATCC® 25932) and Candida albicans (ATCC® 10231TM). The Kirby- Bauer microbial test was used for the antimicrobial evaluation, in which the inhibition halos present were observed and measured (n=4), and the antibiofilm activity was evaluated using the crystal violet test, after which the response was assessed by spectrophotometry using a spectrophotometer (n=3). Surface wettability was determined by measuring the contact angle (θ) using the sessile drop technique (2 μl of ultrapure water) on the surface of each specimen (n=3), after water deposition (t=0') and after 10 minutes (t=10'), using a digital microscope (1600x magnification).
Results: In the growth inhibition test, the experimental group showed the existence of an inhibition halo for both microorganisms. In the antibiofilm test, for both microorganisms, the experimental group showed a reduction in growth compared to the control group (p<0.001). In the evaluation of surface wettability, the contact angle values measured in the control group showed no statistically significant differences from those of the experimental group at 0 minutes (p=1.000) and 10 minutes (p=0.700).
Conclusion: The incorporation of 2.5% chlorhexidine into three-dimensionally printed acrylic resins for removable prosthesis bases significantly increases the antimicrobial activity of these resins, both in the surrounding biofilm and on the surface of the specimens. However, this carrier appears to maintain surface wettability, characterizing it as a hydrophilic surface
Plasmodium determinants critical for the generation of pre-erythrocytic sterile immunity
No full textTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasAn effective vaccine that will provide sterile protection against Plasmodium, the etiologic agent
of malaria, is crucial for disease eradication. Efforts in the last five decades culminated in a WHOendorsed malaria vaccine. Albeit significantly reducing severe disease cases, this vaccine consistently
fails at conferring sterile immunity to vaccinees.
The high protection attained following experimental immunization with attenuated parasites
halting their development soon after hepatocyte infection raises the possibility that early events during
pre-erythrocytic infection are important for protective immunity against Plasmodium. Prior to the
productive infection of an hepatocyte, Plasmodium parasites journey across biological barriers by
traversing several host cells first in the skin, and subsequently in the liver sinosoids and parenchyma.
By employing the cell traversal-deficient parasite lines Pbspect1- and Pbplp1-
, we show that
cell traversal is crucial for the establishment of sterile protection upon radiation-attenuated sporozoitesbased immunization of C57BL/6J mice. Furthermore, we show that loss of protection in the absence of
cell traversal is independent of the timing of intrahepatic development arrest of parasites, as CPS-based
immunizations with Pbspect1- parasites equaly failed to confer full protection upon infectious
challenge. Analysis of the immune mechanisms relevant for sterile protection revealed that, while
humoral resposes were not impacted by the lack of cell traversal, the establishment of CD8+ T cell
responses following vaccination was impaired in Pbspect1- RAS-immunized mice.
Together, our data suggest that cell traversal by Plasmodium parasites is a critical determinant
for the establishment of sterile protection following vaccination by eliciting and/or maintaining cellular
immunity aimed at eliminating Plasmodium intrahepatic forms.
These findings challenge the current understanding that malaria vaccination largely depends on
parasite development, and raise the possibility that enhancing cell traversal motility of immunizing
parasites may constitute a valid strategy to boost malaria vaccine candidates efficacy and take us one
step closer to a malaria-free world
Originalidades no moderno colonial português em África: Um estudo tectónico
No full textTese de Doutoramento. Arquitetura (Tecnologia e Gestão da Construção). Universidade de Lisboa. Faculdade de Arquitetura. 2024A designação Moderno Colonial Português em África confrontou-nos com uma “alegação” de especificidade da Arquitectura Moderna produzida e projectada nos territórios em causa e dita “livre”, relativamente à Arquitectura Moderna também ali produzida no mesmo período, mas projectada a partir da Metrópole e apodada de “vinculada”. A diferenciação sugere uma eventual gradação na “sujeição” à ideologia do Estado Novo, presumindo que, nas ex-Colónias, ela fosse menor e, portanto, a atitude criativa mais aberta e inovadora. Face às características do Movimento Moderno, sobretudo na sua vertente Internacional e dada a conhecida qualidade de autores e métodos de trabalho envolvidos, a dúvida pareceu-nos legítima. O seu esclarecimento é o objecto desta investigação, no âmbito da qual pretendemos compreender o edificado em causa, em ambas as circunstâncias referidas. Uma vez que o Moderno colonial é já objecto de vasta produção historiográfica, para nós, o exercício faria mais sentido se baseado em critérios intrínsecos ao próprio acto de projectar Arquitectura. Assim, com base no conceito de Tectónica procedemos à desconstrução de um conjunto de casos concretos, representativos da alegada dualidade, de modo a compreender as eventuais diferenças. Foi, primeiro, necessário definir, justificar e operacionalizar um referencial teórico com base no qual procedemos à dita desconstrução, para avaliar de que modo o dito referencial está presente nas Arquitecturas em causa. Um trabalho que nos permitiu concluir que a alegada distinção não tem razão de ser. Simultaneamente, esboça-se uma reflexão sobre os desafios decorrentes da crise climática e da escassez de recursos. Desafios que, num quadro de soluções tecnológicas, como a Inteligência Artificial, que confrontam a Arquitectura com a obsolescência de muitos dos métodos actuais, tornam urgente, para lá de raciocínios de eficácia e produtividade, preservar a essência do acto arquitectónico. A generalização de uma Cultura Tectónica de projecto, é, parece-nos, o caminho a seguir.The designation Modern Colonial Portuguese in Africa presented us with a “claim” of specificity regarding Modern Architecture produced and designed in the mentioned territories, described as “free”, in comparison to Modern Architecture also produced in those territories in the same period, but designed from the Metropolis and referred to as “bound”. This differentiation suggests a potential inclination towards the ideology of Estado Novo, suggesting that in the ex-Colonies, constraints would be less tight, and the creative attitude more open and innovative. Given the characteristics of the Modern Movement, particularly in its International aspect, and considering the renowned quality of authors and methods involved, legitimate doubt arises. Clarifying this doubt is the objective of this investigation, within which we aim to understand the specific Architecture in question in both mentioned circumstances. Since colonial Modernism is already the subject of extensive historiographical production, we believe the exercise would make more sense if based on criteria intrinsic to the act of designing Architecture. Based on the concept of Tectonics, we proceeded to deconstruct a set of specific cases, representative of the alleged duality, to understand potential differences. First, it was necessary to define, justify, and operationalize a theoretical framework based on which we carried out the mentioned deconstruction, aiming to establish how the said framework is present in these Architectures. A study that allowed us to conclude that the initial distinction lacks justification. Simultaneously, a reflection is outlined on the challenges arising from the climate crisis and resource scarcity. Challenges that, within a framework of technological solutions, such as Artificial Intelligence, confronting Architecture with the obsolescence of many current methods, make it urgent, beyond considerations of efficiency and productivity, to preserve the essence of the architectural act. The generalization of a Tectonic Culture of design seems to us the path to follow.N/
Neoplasias não definidoras de SIDA como diagnóstico final de internamento num serviço de infeciologia em doentes com infeção por VIH
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024Introdução: A introdução da terapêutica antirretroviral combinada resultou numa melhoria significativa da morbilidade e mortalidade dos doentes com infeção por Vírus da Imunodeficiência Humana (VIH), alterando a epidemiologia das doenças oncológicas neste grupo de doentes. Ocorreu uma diminuição na incidência de neoplasias definidoras de SIDA (NDS) e um aumento da incidência de neoplasias não definidoras de SIDA (NNDS). Os doentes infetados por VIH apresentam um risco superior ao da população geral para o desenvolvimento de determinadas neoplasias.
Objetivo: Caracterização da epidemiologia das NNDS em doentes com infeção por VIH num ambiente hospitalar, análise do espectro de malignidades diagnosticadas e caracterização demográfica, clínica e imunológica da população em estudo.
Métodos: Estudo de coorte retrospetivo para avaliação de doentes adultos com infeção por VIH com diagnóstico final de internamento de NNDS, no Serviço de Infeciologia do Hospital Garcia de Orta, no período entre janeiro de 2017 e dezembro de 2022.
Resultados: Foram identificados 19 casos de NNDS, sendo a maioria do sexo masculino (78,9%), de naturalidade portuguesa (68,4%) e com idade mediana de 57,5 anos. As neoplasias mais frequentes foram a neoplasia do pulmão (15,8%), do rim (15,8%), de cabeça e pescoço (15,8%), de pele (10,5%) e hepáticas (10,5%). O tempo médio entre o diagnóstico da infeção por VIH e o diagnóstico da NNDS foi de 13,5 ± 6,8 anos. A maioria dos doentes estava sob TARV (89,5%), encontrando-se imunologicamente controlado. A maioria apresentava doença localizada ao diagnóstico (63,2%) e apresentou boa evolução. Registaram-se três mortes.
Conclusões: Atualmente, o rastreio de neoplasias nos doentes com infeção por VIH é similar ao aplicado à restante população, sendo fundamental o desenvolvimento de políticas de prevenção específicas para os doentes com infeção por VIH.Introduction: The introduction of combination antiretroviral therapy (cART) has significantly improved the morbidity and mortality of patients with Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection, altering the epidemiology of oncological diseases in this group of patients. There has been a decrease in the incidence of AIDS-defining cancers (ADC) and an increase in the incidence of non-AIDS-defining cancers (NADC). HIV-infected patients have a higher risk than the general population for developing certain neoplasms.
Objective: To characterize the epidemiology of NADCs in HIV-infected patients in a hospital setting, analyze the spectrum of diagnosed malignancies, and characterize the demographic, clinical, and immunological aspects of the study population.
Methods: A retrospective cohort study was conducted to evaluate adult HIV-infected patients with a final diagnosis of NADC hospitalized at the Infectious Diseases Department of Hospital Garcia de Orta between January 2017 and December 2022.
Results: A total of 19 cases of NADC were identified, with the majority being male (78,9%), of Portuguese nationality (68,4%), and with a median age of 57,5 years. The most frequent neoplasms were lung cancer (15,8%), kidney cancer (15,8%), head and neck cancer (15,8%), skin cancer (10,5%), and liver cancer (10,5%). The average time between the diagnosis of HIV infection and NADC was 13,5 ± 6,8 years. The majority of patients were on cART (89,5%) and were immunologically controlled. Most presented with localized disease at diagnosis (63,2%) and had a favorable outcome. Three deaths were reported.
Conclusions: Currently, cancer screening in HIV-infected patients is similar to that applied to the general population, making it essential to develop specific prevention policies for this population