Laboratoire de Physique Théorique
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Un laboratoire sur puce pour la séparation et la qualification des vésicules extracellulaires
Get PDFLes vésicules extracellulaires (ou EVs) sont des sous-espèces cellulaires, de tailles nanométriques et hétérogènes, libérées par toutes les cellules de l'organisme. Elles circulent librement dans les fluides biologiques et sont aujourd'hui considérées comme de potentiels marqueurs et indicateurs de nombreuses maladies. Ainsi, les identifier et les caractériser reste un défi majeur qui pourrait conduire à des diagnostics et pronostics rapides de nombreuses pathologies. Cependant, de par leurs tailles hétérogènes, aucune technique actuelle ne permet de bien les quantifier et les caractériser. Ainsi, seule une combinaison de technologies pourrait permettre de fournir des informations importantes sur ces espèces d'intérêts. Dans ce but, ce travail de thèse a pour objectif de développer un laboratoire sur puce qui permettrait d'isoler les EVs à partir d'un fluide biologique. Le laboratoire sur puce est basé sur un principe de filtration hydrodynamique permettant la séparation des EVs provenant de milieux complexes. Ce principe permet de séparer les particules selon une taille définie. Il s'agit d'une méthode simple et passive (aucun champ extérieur), robuste et moins sujette au risque de colmatage. Son principe est basé sur l'exclusion en taille des particules dont le diamètre est supérieur à une valeur définie, appelée le rayon de coupure, définie par le rapport des débits entre une canalisation principale et une ou plusieurs canalisations latérales. En choisissant judicieusement les dimensions des canalisations, il a été possible de concevoir plusieurs dispositifs permettant la séparation à un rayon de coupure donné. Nous avons conçu et fabriqué, des puces microfluidiques permettant la séparation des particules à un rayon de coupure adapté à l'application des EVs (entre 150 et 900 nm). Nous avons utilisé une technique originale basée sur le laminage successif de films secs (DF) et la photolithographie. Nous avons fait la preuve de concept à l'aide de trois nanoparticules biofonctionnalisées fluorescentes (NP 140-CAS, N 480-OVA et NP 920) couvrant la gamme de distribution des EVs. Une fois la validation faite dans des milieux synthétiques, nous avons décidé de complexifier les mélanges et nous avons injecté des milieux biologiques associés à de nanoparticules dans les dispositifs de tri. Une fois les différentes séparations effectuées, nous avons pu quantifier et analyser à l'aide de différentes techniques (par Tunable Resistive Pulse Sensing, par cytométrie de flux, par comptage directe) nos échantillons. Nous avons démontré qu'à l'aide de nos dispositifs, nous pouvons récolter 35 µL d'échantillon filtré en 30 minutes d'injection ce qui est hautement compatible avec les exigences de l'analyse de quantification. Nous avons comparé chaque échantillon filtré avec ceux injectés et nous avons observé des concentrations identiques pour les nanoparticules de taille inférieure (NP 140-CAS, NP 480-OVA) au rayon de coupure, nous indiquant un rendement de 100 % de récupération. Pour les autres nanoparticules (NP 920) et les grosses cellules présentes dans les milieux biologiques (globules rouges, blancs, etc...) nous avons obtenu un rendement de filtration de l'ordre de 96 à 98%. Nous démontrons ainsi que l'utilisation de fluide biologique (sang, plasma, PPL), n'affecte en aucun cas les résultats de séparation. Ceci prouve que cette méthode de séparation est un bon candidat pour le traitement des échantillons naturels et pourrait être la base d'une nouvelle génération de tests diagnostiques.Extracellular vesicles (or EVs) are heterogeneous nano-sized cellular subspecies released by all cells in the body. They circulate freely in biological fluids and are today considered as potential markers and indicators of many diseases. Thus, identifying and characterizing them remains a major challenge that could lead to rapid diagnosis and prognosis of many diseases. However, due to their heterogeneous sizes, no current technique allows for their proper quantification and characterization. Thus, only a combination of technologies could provide important information on these molecules of interest. To this end, this thesis aims at developing a lab on chip that would allow the isolation of EVs from a biological fluid. To achieve this separation, we chose to use hydrodynamic filtration. This principle allows the separation of particles according to a defined size. It is a simple and passive method (no external field), robust and less prone to clogging than standard filtration techniques. Its principle is based on the size exclusion of particles whose diameter is greater than a defined value, called the cut-off radius, monitored by the ratio of flow rates between a main channel and one or more side channels. We have designed and manufactured microfluidic chips allowing the separation of particles at a cut-off radius adapted to the EV application (between 150 and 900 nm). We used an original microfabrication technique based on successive dry film lamination (DF) and photolithography to manufacture the devices. We demonstrated the proof of concept using three fluorescent biofunctionalized nanoparticles (NP140, N480 and NP 920) covering the EV distribution range. Once the validation was done in synthetic media, we injected biological media spiked with nanoparticles into the sorting devices. We were able to quantify and analyze filtered samples using different techniques (Tunable Resistive Pulse Sensing, flow cytometry, direct counting). We have demonstrated that using our device we were able to collect 35 µL of filtered sample within 30 minutes which is highly compatible with the requirements of the subsequent quantification analysis. We compared filtered samples to injected samples and observed identical concentrations for the nanoparticles (NP 140-CAS, NP 480-OVA) smaller than the cut-off radius, indicating a 100% recovery yield. For nanoparticles larger than the cut off radius (NP 920) and cells present in the biological media (red and white blood cells, etc.) we obtained a filtration yield of the order of 96 to 98 %. We thus demonstrate that the use of biological fluid (blood, plasma, PPL), does not affect the separation results in any way. These results proved that this separation method is a good candidate for treatment of natural samples and could serve as a new range of diagnostic and prognostic tests for pathologies
Façonnage d'ondes de matière dans un réseau optique dépendant du temps : du chaos quantique au contrôle quantique
Get PDFEn attendant de parvenir à construire un ordinateur quantique universel, les physiciens se sont attelés à développer des simulateurs quantiques : un système capable d'émuler des modèles de divers domaines de la physique sur lequel l'utilisateur possède un grand degré de contrôle. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur un tel simulateur réalisé à l'aide condensats de Bose-Einstein manipulés par un réseau optique unidimensionnel. Dans ce manuscrit, nous décrivons plusieurs travaux expérimentaux réalisés en proche collaboration avec des physiciens théoriciens. Le premier d'entre eux porte sur le contrôle d'halos de diffusion. Nous proposons un nouveau protocole de contrôle de ces halos portant sur un décalage abrupt de la phase du réseau optique. Cette première étude soulève une nouvelle question : peut-on, par un variation adéquate de la phase du réseau optique, façonner la distribution en impulsion du condensat ? Cette question est un problème d'optimisation bien posé auquel la théorie du contrôle optimal peut répondre. Grâce à ce formalisme, nous sommes en mesure de contrôler l'état quantique du condensat dans le réseau optique. Ces nouveaux types de protocoles peuvent permettre de préparer des états initiaux permettant d'observer de nouveaux effets physiques. Un de ces effets est le transport d'un nuage d'atomes dans un paysage classiquement chaotique. Nous avons modulé périodiquement l'amplitude du réseau optique de telle manière à générer un espace des phases mixtes dans lequel nous avons mis en évidence un effet tunnel dit "assisté par le chaos".While seeking to build a universal quantum computer, physicists have been working on developing quantum simulators : a system capable of emulating models of others domains of physics over which the user has a large degree of control. The work presented in this thesis concerns such a simulator realized with Bose-Einstein condensates manipulated by a one-dimensional optical lattice. In this manuscript, we describe several experimental works realized in close collaboration with theoretical physicists. The first one is about the control of scattering halos. We propose a new protocol to control these halos by abruptly shifting the phase of the optical lattice. This first study then naturally raises a new question : can we, by an adequate variation of the optical lattice's phase, shape the momentum distribution of the condensate ? This question is an optimization problem that optimal control theory is able to answer. Using this formalism, we are able to control the quantum state of the condensate within the lattice. These new types of protocols open interesting perspectives as the preparation of initial states for the observation of physical effects that are difficult to observe. One of these effects is the the transport of a cloud of atoms in a classically chaotic landscape. We have periodically modulated the amplitude of the optical lattice in such a way as to generate a mixed phase space in which we have demonstrated a so-called "chaos-assisted tunneling"
Optimisation d'un procédé pyrochimique de préparation de métaux stratégiques : application au néodyme
Get PDFCette thèse s'inscrit dans la continuité du programme européen REE4EU dont l'objectif était d'étudier la mise en œuvre d'une chaîne de recyclage du néodyme contenu dans les aimants permanents. A l'issue de ce programme, l'oxyde de néodyme (Nd2O3) obtenu est converti en Nd métallique par électrolyse à haute température d'un mélange LiF-NdF3-Nd2O3 (procédé de type Hall-Héroult). Dans ce procédé, Nd2O3 est dissout sous la forme d'un oxyfluorure NdOF54- qui est consommé lors de l'oxydation d'une anode en carbone (1), tandis que le composé NdF3 du solvant, qui se présente sous la forme NdF63-, est réduit en néodyme sous la forme de métal liquide (2). 2NdOF54- + C(s)+2F- → 2NdF63- + CO2(g)+ 4e- (1) NdF63- + 3e- → Nd(l) + 6F- (2) La réaction globale du procédé est alors la suivante : Nd2O3 + 3/2 C(s) → 2Nd(l) + 3/2 CO2(g)(3) L'objectif principal a été de développer des outils aidant à la gestion de ce procédé tout en déterminant des conditions opératoires optimales. Pour cela, trois thématiques de recherche ont été étudiés :(I) Développer une méthode de dosage de l'oxyde de néodyme qui soit rapide et in-situ pour gérer les ajouts de Nd2O3 et éviter la formation de boues denses polluant le métal produit. Dans cette étude, il a été montré que la dissolution de Nd2O3 dans LiF-NdF3 conduit à l'apparition d'ion oxyde libre O2-. Une méthode de dosage de O2- par voltammétrie à vague carrée utilisant une électrode de Pt est alors développée dans LiF-NdF3-Nd2O3. Cette méthode de dosage est finalement utilisée afin de déterminer la solubilité de Nd2O3 dans LiF-NdF3 entre 850 et 1050 °C. (II) Etudier l'influence de la teneur en Nd2O3 sur l'oxydation d'une anode en carbone dans LiF-NdF3-Nd2O3 afin d'éviter la production de CFX(g) pouvant engendrer un effet d'anode. En analysant par spectroscopie IR les gaz anodiques produits par électrolyse, il a été montré que lorsque l'apport en élément oxyde à l'électrode ne permettait pas d'assurer seule l'oxydation du carbone, du CF4(g) et du C2F6(g) étaient également produit. L'influence de la teneur en Nd2O3 sur la densité de courant limite de diffusion de l'oxyde de néodyme dissout a alors été déterminée par voltammétrie à l'état stationnaire entre 850 et 1050 °C. (III) Etudier l'influence de la densité de courant cathodique sur la production de Nd liquide pour optimiser le rendement et faciliter la récupération du métal. En utilisant la technique de la chronopotentiométrie inverse, il a été mis en avant une augmentation du rendement faradique avec la densité de courant. Dans les conditions de l'étude, le rendement faradique maximal est de 85%. Il a également été observé que la coalescence du néodyme liquide était favorisée pour des densités de courant cathodique élevées (> 3 A.cm-2) facilitant alors sa récupération.
A l'issue de ce travail, l'influence d'un changement d'échelle sur le rendement de production de Nd a été étudié en réalisant une électrolyse visant à produire environ 100 g de métal, avec les paramètres opératoires optimisés (densités de courant anodique et cathodique). Un impact significatif du changement d'échelle sur le procédé a ainsi pu être observé avec la dispersion et la dissolution de particules de Nd métal dans le sel. Les résultats obtenus ont permis de proposer des pistes d'étude pour poursuivre l'optimisation du procédé.This thesis follows previous works realized in the REE4EU European program, dedicated to the deployment of neodymium permanent magnets recycling chain. At the end of this program, neodymium oxide (Nd2O3) is obtained then and converted into Nd metal by electrolysis of a LiF-NdF3-Nd2O3 mixture at high temperature (analog to Hall-Heroult process). In this process, Nd2O3 is solubilized into an oxyfluoride complexe NdOF54- that is consumed by anodic reaction to produce CO2(g) (1), meanwhile NdF3 compound (complexed as NdF63-) is reduced into liquid metal (2).
2NdOF54- + C(s)+2F- → 2NdF63- + CO2(g)+ 4e- (1) NdF63- + 3e- → Nd(l) + 6F- (2) The global reaction of the process is: Nd2O3 + 3/2 C(s) → 2Nd(l) + 3/2 CO2(g)(3) The main objectives were to develop tools and methods that help to operate the process and determine optimized parameters. This works was divided into three problematics: (I) Develop a fast and in-situ Nd2O3 titration method in order to manage Nd2O3 feeding and prevent sludge formation that pollutes the produced metal. In this study, it was observed that Nd2O3 dissolution leads to O2- formation. A titration method of O2- using square wave voltammetry on Pt electrode was then developed in LiF-NdF3-Nd2O3. This method was also used to determine Nd2O3 solubility in LiF-NdF3 in the 850 - 1050 °C temperature range. (II) Investigate the influence of Nd2O3 content on the oxidation of carbon anode in LiF-NdF3-Nd2O3 in order to prevent CFX(g) formation that could lead to an anode effect. IR spectroscopic analysis of anodic gas shows that oxide depletion leads to CF4(g) and C2F6(g) production instead of CO2(g). The influence of Nd2O3 content on the critical current density, above which one CFX(g) are produced, was determined by steady state voltammetry in the 850 - 1050 °C temperature range. (III) Investigate the influence of cathodic current density on neodymium production in order to optimize current efficiency and facilitate metal recovering. The chronopotentiometry with current reversal method allowed to observe a current efficiency increase with current density. In our experiment conditions, maximum that could be obtained is 85%. Moreover, a better liquid neodymium coalescence (and then recovery) was observed for high current density (above 3 A.cm-2). Finally, an electrolysis able to produce 100 g of Nd metal was realized in order to study the scale up influence on Nd production with optimized cathodic current density. Dispersed neodymium particles and neodymium dissolution were observed and impacted the neodymium production. The results permit then to propose new research thematic to improve neodymium process
Influence de la salinité sur la dynamique couplée océan-atmosphère de l'océan Atlantique tropical
Get PDFL'océan Atlantique tropical présente une salinité de surface très contrastée, avec notamment une faible salinité de surface dans l'ouest et le centre du bassin. Cette faible salinité est due à d'importants apports d'eau douce provenant de fortes précipitations dans la zone de convergence intertropicale et de grands fleuves tels que l'Amazone, l'Orénoque et le Congo. Il en résulte une forte stratification en sel qui peut influencer le mélange vertical, et donc la température de surface de la mer et les flux air-mer. L'objectif de cette thèse est d'étudier l'influence de la salinité - et en particulier de la forte stratification en sel - sur le climat de l'océan Atlantique tropical. Pour ce faire, un modèle couplé océan-atmosphère au 1/4° de la région est développé, utilisant NEMO comme composante océanique, WRF comme composante atmosphérique et OASIS comme coupleur. L'utilisation d'un modèle couplé océan-atmosphère permet de prendre en compte toutes les interactions air-mer et les processus de rétroaction, dont l'impact sur le climat régional a déjà été mis en évidence et qui sont au cœur de cette étude. Une série de tests de sensibilité a ensuite été menée avec ce modèle, afin d'évaluer l'impact de processus de plus en plus fins. Tout d'abord, l'impact de la stratification en sel totale sur la température de surface de la mer et sur les flux air-mer est évalué en la retirant du modèle. Ensuite, les fleuves Amazone et Orénoque, contributeurs majeurs à la stratification en sel dans l'Atlantique tropical, sont retirés du modèle. La variabilité interannuelle du débit des fleuves est ensuite étudiée pour quantifier l'impact des crues extrêmes de l'Amazone. Enfin, l'expérience sans stratification en sel est menée dans un climat futur, où plusieurs des variables clés identifiées dans le climat actuel sont très distinctes de leur état actuel, permettant une compréhension plus profonde des processus en jeu.
De ces tests de sensibilité se dégage un mécanisme dans l'Atlantique tropical nord-ouest en été, similaire quelle que soit la force de la stratification en sel. La présence de la stratification en sel diminue le refroidissement par mélange vertical, ce qui entraîne une augmentation de la température de surface de la mer. Ce réchauffement est ensuite modéré par une rétroaction négative de l'atmosphère : la réponse océanique est atténuée par le biais d'une diminution du flux thermique, qui est principalement due à une augmentation de la perte de chaleur latente, mais aussi à une réduction du rayonnement solaire atteignant la surface de l'océan, en lien avec une augmentation de la convection profonde et de la couverture nuageuse et des précipitations associées. Le changement de température final est déterminé par l'équilibre entre le réchauffement dû au mélange vertical et le refroidissement dû à la rétroaction atmosphérique, les deux dépendant du type de test de sensibilité. Cependant, le changement de température de surface de la mer résultant est toujours relativement faible (0,5°C au maximum). En hiver, les impacts de la stratification en sel sont beaucoup plus faibles, probablement en raison d'une couche mélangée plus profonde en cette saison. Des changements de température de surface de la mer sont finalement observés dans la région de la langue d'eau froide, liés à des modifications de la profondeur de la thermocline. Des variations de température en subsurface sont présentes tout au long de l'année, mais la saisonnalité de l'apparition de l'upwelling détermine le moment où les changements de température apparaissent à la surface. Dans cette thèse, l'impact de la stratification en sel sur le climat moyen de l'Atlantique tropical est étudié, mais le modèle développé ici pourrait être adapté pour étudier l'impact de la stratification en sel sur les cyclones. En effet, le panache de l'Amazone est traversé par de nombreux cyclones tropicaux, et l'impact de la stratification en sel qui lui est associée reste controversé.The tropical Atlantic Ocean has a highly contrasted surface salinity, with low surface salinity in the western and central parts of the basin. This low salinity is due to an important freshwater supply from large rivers such as the Amazon, Orinoco and Congo, and from heavy precipitation in the intertropical convergence zone. This results in a strong salinity stratification that may influence the vertical mixing, and thus the sea surface temperature (SST) and air-sea fluxes. The aim of this thesis is to investigate the influence of salinity - and especially the strong salinity stratification - on the tropical Atlantic Ocean climate. To do so, a 1/4° coupled ocean–atmosphere model of the region is developed, using NEMO as the ocean component, WRF as the atmospheric component and OASIS as the coupler. The use of a coupled ocean-atmosphere model allows to take into account all the air-sea interactions and feedback processes, which have been shown to impact the regional climate and are at the heart of this study. A series of sensitivity experiments is then conducted with this model, in order to assess the impact of increasingly detailed processes. First, the impact of the total salinity stratification on SST and air-sea fluxes is assessed by removing it from the model. Then, the Amazon and Orinoco rivers, major contributors to salinity stratification in the tropical Atlantic, are removed from the model. Interannual variability of river discharge is then studied to quantify the impact of Amazon extreme floods. Finally, the experiment without salinity stratification is conducted in a future climate, where several of the key variables identified in the present climate are very distinct from their present state, allowing a deeper understanding of the processes at stake. From these sensitivity tests, a consistent mechanism emerges in the northwestern tropical Atlantic in summer. The presence of salinity stratification decreases the cooling by vertical mixing, which leads to an increase in SST. This warming is then damped by a negative feedback from the atmosphere: the oceanic response is mitigated by a decrease in net heat flux. This decrease in net heat flux is primarily due to an increase in latent heat loss, but also to a reduction in shortwave radiation reaching the ocean surface, related to an increase in deep convection and associated cloud cover and precipitation. The final change in SST is determined by the balance between the warming due to the vertical mixing and the cooling due to the atmospheric feedback, both depending on the sensitivity test. However, the resulting SST change is always relatively small (0.5°C maximum). In winter, the impacts of salinity stratification are much weaker, most probably because of a deeper mixed layer at this time. SST changes are finally observed in the cold tongue region, related to changes in the thermocline depth. Subsurface temperature changes are present throughout the year, but the seasonality of upwelling occurrence dictates the timing of SST changes. In this thesis, the impact of salinity stratification on the mean tropical Atlantic climate is studied, but the model developed here could be adapted to study the impact of salinity stratification on the cyclones. Indeed, the Amazon plume is crossed by numerous tropical cyclones, and the impact of its associated salinity stratification remains controversial
Caractériser l'épuisement lymphocytaire T global ou donneur-spécifique après transplantation rénale : analyse phénotypique et fonctionnelle
Get PDFL'utilisation d'une immunosuppression (IS) au long cours reste indispensable après transplantation, même si le phénotype des rejets se modifie avec le délai de greffe. Cependant, les complications liées à la sur- IS (néoplasies, infections...), ou sous- IS (rejet aigu ou chronique) réduisent toujours la survie des patients ou des greffons. Améliorer la compréhension des mécanismes lymphocytaires impliqués dans les modifications des réponses allo-spécifiques ou non spécifiques après greffe est importante pour individualiser la prescription des immunosuppresseurs et limiter leurs complications. Une altération des fonctions lymphocytaires T peut survenir au cours des mécanismes allo-immuns, ou sous traitement immunosuppresseur au long cours. L'épuisement lymphocytaire T (ELT) caractérise un état de dysfonction affectant les lymphocytes T mémoires, dans des situations de stimulation chronique avec persistance de l'exposition à un antigène. Cet état est caractérisé par une baisse des capacités prolifératives ou fonctionnelles de ces cellules, et la co-expression de récepteurs inhibiteurs (RIs). Bien que des modèles murins aient récemment souligné le rôle de l'ELT dans le rejet de greffe, cet état dysfonctionnel reste peu étudié. Dans une première étude, nous avons analysé l'expression de 3 RIs classiquement associés à l'ELT (2B4 (CD244), Programmed cell Death protein (PD)-1), et CD160, au cours du traitement par anti-PD1 (nivolumab) de 3 transplantés rénaux présentant une leucoencéphalopathie multifocale progressive. L'analyse des RIs dans les CD4+ et CD8+ a montré des taux élevés d'expression de 2B4, PD-1, et CD160 avant traitement, suggérant un ELT. Après traitement, seule l'expression de PD-1 diminuait, alors que les autres RIs n'étaient pas affectés par l'utilisation du traitement, suggérant la persistance de cet dysfonction lymphocytaire. Par la suite, nous avons cherché par une étude transversale à caractériser l'ELT dans une population de patients exposés à de forts niveaux d'IS, les patients greffés avec anticorps spécifiques du donneur préformés (greffes HLA incompatibles, HLAi). Ces patients recevaient tous une induction par sérum anti-lymphocytaire et rituximab, ainsi qu'un traitement de maintenance par tacrolimus, acide mycophenolique, et corticoides. Afin de comparer l'expression des RIs (PD-1, Tigit, 2B4) et les capacités de production cytokinique (IFNgamma, TNFalpha, IL2) de ces patients, nous avons utilisé un groupe de patients greffés en incompatibilité ABO (greffes ABOi) recevant un traitement d'induction et de maintenance similaire, mais exposé à un antigène dont la réponse est T-indépendante. Nous avons pu observer une augmentation de la co-expression des récepteurs inhibiteurs dans le groupe de patients HLAi en comparaison aux patients ABOi. Particulièrement, Tigit présentait un niveau d'expression dans les CD4 et CD8 du groupe HLAi plus élevé comparativement aux ABOi. De plus, alors que Tigit était négativement corrélé aux capacités fonctionnelles des LT du groupe ABOi, toute corrélation était perdue dans le groupe HLAi. Ces données suggèrent que l'ELT au cours de la reconstitution lymphocytaire serait plus important après greffe HLAi, ce qui est cohérent avec le niveau élevé de complications infectieuses et néoplasiques décrites après ce type de greffe. Dans une deuxième étude transversale portant sur des patients transplantés rénaux, libres de toute complication infectieuse, néoplasique, allo-immune, et sous traitement immunosuppresseur standard, nous avons montré une corrélation positive entre le délai de greffe et l'expression de Tigit dans les CD4 mémoires, alors que la proportion de cellules CD4+ TIGIT-CD226+ diminuait. L'analyse fonctionnelle de ces cellules nous a permis de montrer une dysfonction de l'axe Tigit/CD226 au cours du temps dans les CD4 mémoires. Dans les CD8 mémoires, nous avons pu montrer un profil dysfonctionnel de ces cellules, associé à une augmentation d'expression des cellules CD8+PD-1+Tigit+. La réponse allo-spécifique (approchée par réaction lymphocytaire mixte) était diminuée en comparaison à la réponse non-spécifique, et corrélée au pourcentage de cellules mémoires CD4+Tigit+CD226+Tim3-PD-1-2B4- avant stimulation. Enfin, nous avons étudié les différences immunologiques T et B au cours de formes modérées et graves du COVID-19 chez des patients transplantés d'organe solide, et montré des différences immunologiques majeures au sein des différents compartiments entre les deux groupes. Par ces différents travaux nous avons montré que l'ELT pourrait être impliqué dans la diminution progressive des rejets T-médiés après greffe. La caractérisation d'une signature d'ELT post greffe pour limiter les complications liées à l'IS parait utile pour améliorer les résultats post-transplantation.Kidney transplantation requires the long-term use of immunosuppressive therapy (IT) even if a modification of rejections phenotype with time was previously noted. However, patient and graft survival remain entailed by over-IT (e.g cancer and infections), or under-IT (e.g acute or chronic rejections) complications. A better comprehension of immune mechanisms involved in changes concerning global or allo-specific responses is a key point to improve the individualization of IT and decrease IT-related complications. Several dysfunctional states could occur during allo-immune response, or on long-term immunosuppressive therapy. T cell exhaustion (TCE) is a dysfunctional state affecting memory T cells during chronic stimulation due to the persistent exposure of a high load of foreign antigen. This state is characterized by a decrease proliferative capacity, reduced production of cytokines, and is associated with co-expression of inhibitory receptors (IRs) expression. Murine models of solid organ transplantation suggested a role for T cell exhaustion. However, until now this dysfunctional state is barely studied after transplantation. We first analyzed the expression of 3 IRs classically associated with T cell exhaustion (2B4 (CD244), Programmed cell Death protein (PD)-1), and CD160), in 3 kidney transplant recipients treated with anti-PD1 (nivolumab) therapy for progressive multifocal leukoencephalopathy. Before treatment, we observed a high-level expression of IRs in both CD4 and CD8+ T cells, suggesting T cell exhaustion. After treatment, PD-1 expression, but not of others IRs, decreased, suggesting the persistence of this dysfunctional state, strengthened by the absence of clinical improvement. We next investigated TCE in a cross-sectional study in a highly immunocompromised population, patients with preformed donor-specific antibodies (HLA incompatible, HLAi). All included patients received anti-lymphocyte globulins and anti-20 antibodies (rituximab), followed by a maintenance therapy (tacrolimus, mycophenolic acid, and steroids). We compared IRs expression ( PD-1, Tigit, 2B4) and cytokine production (IFNgamma, TNFalpha, IL2) of these patients to ABO incompatible recipients that received the same induction and maintenance therapy, but was exposed to a T-independent response antigen. We observed an increased co-expression of IRs in the HLAi group comparing with ABOi. Especially, Tigit expression was expressed in higher levels by CD4+ and CD8+ T cells in HLAi comparing with ABOi. Moreover, while Tigit was as expected negatively correlated with functional capacities in ABOi patients, we did not observe any correlation between Tigit expression and function in HLAi recipients. These data suggest that TCE during reconstitution of HLAi patients would be more important than in ABOi recipients, which is consistent with the higher rate of infectious and neoplastic complications previously reported in this group. Thereafter, we performed a second cross-sectional study a living-donor kidney transplant recipients, free from infectious, neoplastic, alloimmune complications, and receiving a standard immunosuppressive maintenance therapy (no induction, maintenance with tacrolimus, mycophenolic acid, steroids). We observed a positive correlation between time post transplantation and Tigit expression in memory CD4+ T cells, while the proportion of CD4+Tigit-CD226+ decreased. Functional analysis of these cells revealed a dysfunctional state of Tigit/ CD226 axis with time post transplantation in memory CD4. In memory CD8+ T cells, we observed a dysfunctional profile of these cells with time post transplantation, associated with an increased proportion of CD8+PD-1+Tigit+ cells. Donor-specific response, investigated by the mean of mixed lymphocyte reaction, was reduced comparing with third-parties responses, and was correlated to the percentage of CD4+Tigit+CD226+Tim3-PD-1-2B4- before stimulation. Finally, we studied T and B cells differences during moderate and severe forms of COVID-19 in solid organ transplant recipients. We observed accurate immunological differences between mild and severe forms (lower CD3+ and CD8+ T cells number, higher proportion of activated CD4+ T cells and lower proportion of regulatory T cells, NK cells, and transitional B cells in severe forms). This work suggests that TCE could be involved in the progressive decrease of T cell rejection post transplantation. Characterizing a post-transplant TCE signature to reduce immunosuppression-related complication appears to be usefull to improve post-transplant outcomes
Synthèses de fréquence à bas bruit basées sur des oscillateurs opto-électroniques couplés intégrées en technologie BiCMOS SiGe 130nm
Get PDFLes hyperfréquences jouent un rôle indispensable dans le domaine des télécommunications, que ce soit pour la téléphonie mobile, les radars automobiles, le Wi-Fi ou encore la transmission satellitaire, sans que cette liste ne soit évidemment exhaustive. Pour l'ensemble de ces applications omniprésentes dans la société actuelle, ce sont ces signaux hyperfréquences qui servent de porteuses pour transmettre l'information sur de plus ou moins longues distances. Les méthodes de génération de signaux hyperfréquences actuelles sont basées sur des boucles à verrouillage de phase (PLL). Elles réalisent une multiplication d'une fréquence de référence basse de quelques dizaines à quelques centaines de mégahertz pour l'amener à quelques gigahertz voire dizaines de gigahertz. Il y a cependant un inconvénient majeur lié à cette méthode : synthétiser une fréquence par multiplication d'une référence basse s'accompagne d'une augmentation théorique du bruit de phase du signal généré, d'autant plus que le rapport de multiplication est élevé. À l'inverse, une synthèse par division de fréquence diminue le bruit de phase théorique. Or on voit apparaître depuis quelques années des références à des fréquences déjà élevées, basées sur des oscillateurs optoélectroniques couplés (COEO), qui peuvent dès lors servir à réaliser des synthèses basées sur de la division de fréquence, et c'est dans ce cadre que se situe le travail de cette thèse. Nous utilisons pour référence de fréquence, des COEO qui génèrent un signal de fréquence élevée à haute pureté spectrale, à 10 et 30 GHz. L'objectif est alors d'être capable de générer des signaux dont la fréquence est inférieure à 30 GHz et aussi basse que 1 GHz. Ces signaux synthétisés doivent conserver autant que possible la pureté spectrale du signal de référence en pénalisant le moins possible le bénéfice théorique apporté par la division. Cette thèse décrit la conception de diviseurs hyperfréquences à très faible bruit de phase résiduel disposant au final de rapports de division fractionnaires et/ou programmables. Dans un premier temps, nous avons conçu des diviseurs de rapports fixes afin d'estimer les performances en bruit de phase atteignables à cette fréquence de travail sur les technologies utilisées. Plusieurs diviseurs ECL par 2 et par 3 ont été conçus, fabriqués et mesurés pour une division jusqu'à 30 GHz. Un diviseur CMOS par 10 ainsi qu'une technique de resynchronisation permettant d'annuler la majeure partie du bruit de phase de la chaîne de division sont également présentés. Plusieurs diviseurs analogiques à rang fixe ont également été conçus, bien que s'étant révélés moins performants au final : un diviseur à verrouillage par injection (ILFD) et un diviseur à renforcement du second harmonique, qui réalisent tous les deux une division par 3 autour de 30 GHz. Pour terminer, nous avons conçu des diviseurs fractionnaires large bande fonctionnant au moins jusqu'à 30 GHz et offrant des performances en bruit de phase compétitives. Si ces modèles s'inspirent du principe régénératif connu de Miller, nous en proposons une déclinaison tout à fait originale. Une première série de diviseurs fractionnaires fixes a ainsi été réalisée pour des rapports fixes de 1,25, 2,5 et 4,5. Pour terminer, un diviseur fractionnaire dont la partie décimale est programmable a été ensuite été réalisé et mesuré. Il s'agit d'un diviseur fractionnaire dont la partie entière du rapport de division est 4 et la partie décimale codée sur 4 bits.Microwave signals are essential in the field of telecommunications whether for mobile telephony, automotive radar, Wi-Fi or even satellite transmission, without this list being exhaustive. For all these ubiquitous applications in our current society, microwave signals are the carriers for the transmission of information from a system to another. Microwave signals synthesis techniques are mostly based on Phase-Locked Loop (PLL). PLL multiply a low frequency reference ranging from a dozen to a few hundred megahertz toward a few gigahertz to a few dozen gigahertz. However, there is one main drawback with this synthesis technique: synthesizing a frequency by multiplying a low frequency reference induces an unavoidable rise of the theoretical phase noise of the synthesized signal, even more if the multiplication factor is high. On the contrary, frequency synthesis by division lowers the theoretical phase noise. Yet, high frequency high spectral purity frequency references called Coupled OptoElectronic Oscillator (COEO) are being developed for a few years. They are perfect candidate to be used as reference for frequency synthesis by division, and this is within this framework that our research takes place. We use as frequency references two COEO generating high spectral purity signals at 10 and 30?GHz. The aim of our work is then to be able to generate different signals whose frequencies are below 30?GHz and as low as 1?GHz. These synthesized signals must preserve as much as possible the spectral purity of the reference while deteriorating as less as possible the theoretical benefit brought by the division. This thesis describes the conception of low residual phase noise microwave frequency dividers operating, for the most evolved ones, fractional and/or programmable division ratios. In a first place, we designed static frequency dividers in order to estimate the phase noise performance that we can conceivably reach with the technology we use. Several ECL dividers by 2 and by 3 are designed, fabricated and measured for a division up to 30?GHz. A CMOS divider by 10 along with a resynchronization technique allowing to cancel most of the phase noise in a cascaded divider are also presented. In a second place, we designed analog dividers, although they have proven to be less competitive than digital dividers: an Injection-Locked Frequency Divider (ILFD) and a regenerative second-harmonic frequency divider, both realising a frequency division by 3 around 30 GHz. Finally, we designed wideband fractional dividers operating at least at 30 GHz with competitive phase noise performance. Even though they are inspired by Miller's regenerative frequency dividers, we introduce here an innovative declination of fractional dividers. A first series of static fractional dividers has been designed with ratios of 1.25, 2.5 and 4.5. Ultimately, a fractional divider with a programmable decimal part has been designed and measured. This divider has an integer part of 4 and a decimal part programmed on 4 bits
Détection ultrasensible d'agents pathogènes à l'aide d'un biocapteur à ADN uniques original
Get PDFAlors que la pollution des eaux et de notre environnement s'accroit, et des contaminants dits "émergents" sont constamment ajoutés à la liste de surveillance de la Commission Européenne, de nouvelles méthodes de suivi de la qualié de l'eau sont nécessaires. Les principaux critères de détection et suivi de ces contaminants incluent sensibilité,
robustesse et rapidité de réponse. C'est dans le but de répondre à ces besoins que nous développons un biocapteur combinant la biopuce à ADN uniques et des aptamères. La biopuce est basée sur la technique de Tethered Particle Motion. Des nanoparticules sont ancrées à une lame de microscopie à motifs par des molécules d'ADN uniques, et suivent un mouvement brownien en solution. La trajectoire et l'amplitude de mouvement de centaines de particules en parallèle sont suivis et traités par vidéo-microscopie et analyse d'images. L'amplitude de mouvement des particules étant fonction de la longueur effective de l'ADN, la biopuce permet d'étudier la dynamique conformationnelle des molécules d'ADN. Le projet est de combiner la biopuce à des molécules de détection pour développer un biocapteur spécifique. Nous avons choisi de travailler avec les aptamères, petits oligonucléotides synthétiques et simples brin, considérés comme analogues des anticorps. Ils sont en effet capables de reconnaitre spécifiquement leur cible, avec de hautes affinités. Leur nature cependant les rendent plus stables que les anticorps, et plus facilement modifiables et fonctionnalisables, ce qui ont font des candidats idéaux pour la conception de capteurs robustes. Deux aptamères en particulier sont considérés comme standard de référence pour ces études : les aptamères dirigés contre la thrombine T29 et T15. Ce sont ces deux aptamères que nous avons utilisés pour la preuve de concept de ce projet. Les configurations des tests sont basées sur le test ELISA pour la détection de petites molécules : une forme "sandwich" et une forme "compétition". La faisabilité de ces deux configurations a pu être validée avec la thrombine. Dans le premier test, le sandwich, l'aptamère T29 est inséré sur l'ancre ADN alors que le T15 est greffé sur les particules. Quand les deux aptamères reconnaissent et se lient à une même molécule de thrombine, l'ancre ADN se boucle et l'amplitude de mouvement de la particule liée diminue. La première étape du projet a été d'insérer l'aptamère T29 au milieu de l'ancre ADN. Nous avons testé des méthodes chimiques, sans succès, pour finalement opter pour une solution plus simple, basée sur les propriétés d'hybridation des acides nucléiques. Une gamme de détection de la thrombine humaine a alors été obtenue, concentration- dépendante après 30 minutes d'incubation et avec une limite de détection proche de celle du test ELISA pour cette même protéine. Bien que cette configuration ne soit pas une solution universelle, puisque peu de couples d'aptamères reconnaissant la même cible ont été sélectionnés jusqu'à aujourd'hui, nous pensons qu'il était important de la développer avec notre système. La solution plus universelle, testée dans un second temps, est la compétition. L'aptamère T29 est toujours inséré sur l'ancre ADN, mais un oligonucléotide partiellement complémentaire est greffé sur les particules et s'hybride avec le T29. La formation du duplex entraine un état initial bouclé de l'ADN, donc l'équilibre est déplacé par la détection spécifique de thrombine. L'amplitude de mouvement des particules est
alors augmentée. La première étape pour valider le test compétition était de cribler plusieurs oligonucléotides avant de trouver le bon candidat : la séquence permettant une hybridation stable avec le T29, mais pouvant toujours être déplacée par la cible spécifique. Plusieurs séquences que nous avons conçues ont été testés directement sur la
biopuce. Le candidat retenu a ensuite pu être utilisé pour la première preuve de concept avec le compétiteur parfait : l'antisens parfait du T29. Nous avons ainsi obtenu une
gamme dose-dépendante. En résumé, nous avons établi la preuve -de-concept de l'utilisation de la biopuce à ADN uniques avec des aptamères pour une reconnaissance spécifique et rapide de molécules. Tester la détection de contaminants d'intérêt pour l'eau est la prochaine étape pour complétement valider notre aptacapteur, mais nous pouvons déjà assurer que cet outil est prometteur pour la détection sensible de contaminants dans l'eau.As water pollution is ever increasing, and emerging contaminants are constantly added to the European Commission watch list, novel methods for water quality monitoring are
needed. Sensitivity, robustness and rapid response are among the most important criteria for the detection and monitoring of these contaminants. In order to fulfill these needs,
we work at developing a biosensor in our team, combining the single DNA biochip with aptamers. This biochip is based on the Tethered Particle Motion technique. A nanoparticle is
tethered to a patterned glass slide through a single DNA molecule, and undergoes Brownian motion in a flow cell. Using video-microscopy and image analysis, the amplitude of
motion of hundreds of beads in parallel are analyzed. As the motion amplitude of the particles is function of the effective length of the tethers, we can study the
conformational dynamics of DNA. The idea of the project was to smartly combine the biochip to recognition molecules as to observe a significant change of motion amplitude of the
particles upon target detection, for the development of a specific biosensor. We chose to work with aptamers, small synthetic single-stranded nucleic acids able to selectively
bind their targets with high affinity. Their nature makes them more stable than antibodies, and more easily chemically modified. Two aptamers in particular are considered to be
the golden standard for the development of novel aptasensors: the T29 and T15 thrombin-binding aptamers. They were thus chosen for the proof-of-concept of this project. Assays configurations were based on ELISA tests for the detection of small molecules: a sandwich and a competition assay. In the sandwich assay, the T29 aptamer is inserted on the DNA tether while the T15 aptamer is grafted on the particles. When both aptamers bind to the same thrombin molecule, the DNA tether 'loops' and the amplitude of motion of the particle tethered decreases. In the first part of this project, we proceeded to the insertion of the aptamer in the middle on the DNA tether. Chemical-based solutions were tested and failed, after which we adapted a protocol for the functionalization of double-stranded DNA. We obtained a dose-response curve for the detection of human thrombin, with a limit of detection on par with the thrombin ELISA test limit and a response after 30 minutes of incubation. While this solution is not universal, since few targets can be recognized by a pair of aptamers, we deemed it important to test this classical detection configuration. The more universal configuration is the competition assay. T29 is still inserted on the DNA tether, but is hybridized with a partially complementary oligonucleotide grafted on the particles. From an initial 'looped' DNA state, the detection of thrombin displaces the equilibrium of the duplex and unloops the DNA, therefore increasing the amplitude of motion of the particles. Finding the balance between a strong enough hybridization that the DNA looping was stable in buffer, but could be specifically displaced by the target, was the first step of developing this assay. We designed several candidates, and screened them directly on the biochip. The displacement feasibility was obtained using the perfect competitor, the antisense of T29 with one of those candidates. Here again, we obtained a dose-dependent signal, after incubation of the target on the biochip for 30 minutes only. Thrombin detection on the other hand did not yield a quantifiable signal. All in all, we obtained the proof-of-concept of the use of our single DNA biochip as a time-sensitive, specific and user friendly aptasensor. Showing that the approach is still valid with a water pollutant is yet to be done. However, we can safely say that this biosensor is a promising new tool for the sensitive detection of contaminants
Intégration et caractérisation de couches sensibles de ZnO:Ga et de cobaltites spinelles (CoxFe3-xO4 ; 1<=x<=3) sur véhicules de test pour la détection de dioxyde d'azote sub-ppm et d'éthanol
Get PDFLa mesure des polluants atmosphériques est un défi. La plupart des polluants gazeux, tels que le dioxyde d'azote (NO2) ou les composés organiques volatile (COV), se produisent à des niveaux de parties par milliard (part per billion ou ppb) dans l'air et sont mélangés avec des milliers d'autres composés. Aujourd'hui, le réseau public de surveillance de la qualité de l'air repose sur des stations de mesure fixes, les organismes de contrôle utilisent les détecteurs les plus performants, mais les plus onéreux et le coût d'une station multi-détection étant élevé, la résolution spatiale des mesures se trouvent
fortement réduites. Dans le cadre de cette thèse nous proposons de trouver des matériaux capables de détecter de très faibles concentrations de gaz polluants et de les intégrer par une technique de dépôt en phase vapeur sous forme de couche minces (de quelques dizaines de nanomètre d'épaisseur) sur des micro-plateformes dans le but de fabriquer des capteurs de gaz résistifs low-cost. Dans cette objectif, l'oxyde de zinc dopé au gallium (noté ZnO : Ga) a tout d'abord été étudié pour la détection du NO2. Ce dernier a été déposé par pulvérisation cathodique par radiofréquence sur des substrats de silice fondu pour des caractérisations structurale et microstructurales. La couche obtenue se présente comme une croissance colonnaire et circulaire polycristallin avec une surface poreuse, idéale pour l'adsorption des gaz. La diffraction aux rayons X montre une structure wurtzite avec le plan (002) parallèle au substrat. Les caractérisations électriques et thermoélectriques montrent un matériau de type-n, peu résistif (comparé au ZnO brut). Ces couches minces de ZnO:Ga ont été déposé sur des plateformes de caractérisation (développé et fabriqué durant cette thèse) spécialement pour ces essais préliminaires de détection sous atmosphère contrôlée, mais aussi pour la détermination des paramètres de détection optimales du matériau. Ces essais ont prouvé qu'à 250°C le ZnO :Ga présente une bonne sensibilité à 500 ppb de NO2 dans une atmosphère comportant 50% d'humidité relative . Ensuite, les couches minces ont été déposé sur des micro-plateformes en utilisant un shadowmask (mis au point et fabriqué pour ce procédé) pour obtenir des dépôts bien localisé afin de fabriquer le capteur et de le caractériser dans des conditions de fonctionnement réelles. Ainsi, les capteurs fabriqués sont très sensibles à 500 ppb de NO2 avec 50 % d'humidité relative. Parallèlement à l'étude de ZnO : Ga, une évaluation exploratoire a été mené sur des poudres de cobaltites de fer (noté CoxFe3-xO4 avec 1 <ou= x <ou= 3) pour la détection des COVs. Des poudres avec différentes
compositions ont été étudié : Co1.16Fe1.84O4, Co1.5Fe1.5O4, Co1.7Fe1.3O4, Co2FeO4, Co2.7Fe0.3O4 et Co3O4. Ces poudres ont été déposé sur des substrats d'alumine porté à différentes températures et testé sous 25 ppm d'éthanol sous air sec. Parmi toutes les compositions, le Co3O4 présente la meilleure réponse à basse température. En conclusion, cette thèse présente les couches minces de ZnO :Ga comme étant un matériau prometteur pour la détection du NO2 à très faible concentration. Il reste cependant à déterminer une façon plus correcte d'exploiter ce matériau, dépendant des applications, en prenant en compte ses atouts (sensibilité, temps de réponses, température ...) et ses défauts (vieillissement etc...). Le Co3O4 semble intéressant dans la détection de l'éthanol, il faut à présent porter l'étude sur les couches minces de celui-ci pour détecter des concentrations plus basses et l'intégrer sur les micro-plateformes pour fabriquer les capteurs fonctionnels.Measuring air pollutants is a challenge. Most gaseous pollutants, such as nitrogen dioxide (NO2) or volatile organic compounds (VOCs), occur at parts per billion (ppb) levels in the air and are mixed with thousands of other compounds. Today, the public air quality monitoring network relies on fixed measuring stations, monitoring organisations use the most efficient but expensive detectors and the cost of a multi-detector station is high, resolution of the measurements is strongly reduced. In this thesis, we propose to find materials capable of detecting very low concentrations of polluting gases and to integrate them by a vapour deposition technique in the form of thin layers (a few tens of nanometres thick) on micro-platforms in order to manufacture low-cost resistive gas sensors. To this end, gallium-doped zinc oxide (ZnO:Ga) was first studied for the detection of NO2. This material was deposited by radio frequency sputtering on fused silica substrates for structural and microstructural characterisation. The resulting layer appears as a columnar and circular polycrystalline growth with a porous surface, ideal for gas adsorption. X-ray diffraction shows a wurtzite structure with the (002) plane parallel to the substrate. The electrical and thermoelectric characterisations show a low resistive n-type material (compared to bulk ZnO). These ZnO:Ga thin films were then deposited on characterisation platforms (developed and fabricated during this thesis) especially for these preliminary detection tests under controlled atmosphere, but also for the determination of the optimal detection parameters of the material. These tests proved that at 250°C the ZnO:Ga has a good sensitivity to 500 ppb NO2 in an atmosphere with 50% relative humidity. Then, the thin films were deposited on micro-platforms using a shadowmask (developed and fabricated for this process) to obtain well localised depositions in order to fabricate the sensor and characterise it under real operating conditions. Thus, the fabricated sensors are very sensitive to 500 ppb NO2 at 50% relative humidity. In parallel to the study of ZnO:Ga, an exploratory evaluation was conducted on iron
cobalt powders (denoted CoxFe3-xO4 with 1 <or=x <or= 3) for the detection of VOCs. Powders with different compositions were studied: Co1.16Fe1.84O4, Co1.5Fe1.5O4, Co1.7Fe1.3O4, Co2FeO4, Co2.7Fe0.3O4 and Co3O4. These powders were deposited on alumina substrates, heated to different temperatures and tested under 25 ppm ethanol in dry air. Of all the compositions, Co3O4 showed the best response at low temperatures. In conclusion, this thesis presents ZnO:Ga thin films as a promising material for NO2 detection at very low concentrations. However, it remains to determine a more correct way to exploit this material, depending on the applications, considering its assets (sensitivity, response time, temperature ...) and its shortcomings (aging etc...). Co3O4 seems to be interesting for ethanol detection, and it is now necessary to study its thin layers in order to detect lower concentrations and to integrate it into micro-platforms for the manufacture of functional sensors
Rôle des étangs dans l'atténuation des contaminants (azote et métaux) dans une zone critique agricole (Vallée de la Save, Gascogne, France)
Get PDFComme dans de nombreuses zones critiques (ZC) à agriculture traditionnelle, le sud-ouest de la France est confronté à
certains risques agro-environnementaux dus à la contamination par l'azote et les Eléments Potentiellement Toxiques (EPT) (métaux) issus des intrants anthropiques. Depuis des décennies, de nombreux étangs ont été construits dans cette zone pour l'irrigation et / ou l'aménagement paysager. Peu d'études ont abordé la distribution des deux types de contaminants à l'échelle du bassin versant d'une ZC agricole. Le rôle des étangs sur la distribution et le transfert de ces deux types de contaminants a été également rarement étudié. Pour combler ce manque de connaissance, nous avons étudié le comportement de l'azote et des EPT dans l'eau et les sédiments de fond des cours d'eau et des étangs de trois bassins versants adjacents du bassin de la Save (sud-ouest de la France), à travers notamment leurs distributions spatiales et les principaux facteurs de
contrôle, tout en abordant les conséquences en termes de gestion. Le taux de dénitrification potentiel (TDP) dans les
sédiments varie spatialement en raison de l'hétérogénéité des propriétés géo-physico-chimiques, même à petite échelle. Bien que le TDP dans les ruisseaux soit plus important que dans les étangs à cause d'une plus grande disponibilité des éléments nutritifs, les plus grands étangs ont montré une efficacité élevée d'élimination des nitrates. Un long temps de résidence hydraulique (TRH) pourrait augmenter les temps de réaction et atténuer davantage les nitrates. Une chaîne de plusieurs étangs consécutifs le long du cours d'eau permet une meilleure atténuation des nitrates par rapport à la présence d'un seul étang. La dénitrification est plus élevée dans les étangs localisés en amont du bassin versant, mais le processus de dénitrification incomplet dans ces étangs peut entraîner un dégazage de N2O contribuant à la production des émissions de gaz à effet de serre et des conséquences négatives pour l'environnement, qui nécessitent des études plus approfondies. L'application d'engrais et de pesticides sur les sols cultivés a contribué à l'accumulation de EPT, en particulier pour Cu, Ni et Cd, dans les sédiments des ruisseaux et des étangs, notamment en amont des bassins versants, en raison d'une forte érosion du sol et d'une plus faible dilution. La distribution des EPT a également été affectée par la gestion des étangs. Une température élevée, un pH élevé et un TRH long dans un grand étang créent un environnement favorable à la sédimentation
des EPT par adsorption sur des particules fines et la co-précipitation avec les carbonates de cette zone critique agricole. Bien que les sédiments accumulés dans les étangs puissent stocker des EPT, les sédiments drainés par les ruisseaux en sortie d'étang sont une source secondaire de EPT par la remise en suspension et la turbulence des eaux courantes, en particulier pour les petits étangs non dragués. L'accumulation de EPT n'a pas affecté le TDP car la contamination par les EPT n'était pas très conséquente dans cette zone critique agricole. Toutefois, la teneur en argiles des sédiments affecte simultanément le taux de dénitrification et l'accumulation des EPT. La gestion des étangs doit ainsi prendre en compte à la fois la dénitrification et l'accumulation de EPT. Une chaîne de plusieurs étangs peut permettre de stocker les EPT et atténuer les excès de nitrate simultanément, en particulier en positionnant de grands étangs en amont des bassins versants. L'activité de dragage des sédiments des étangs doit également être gérée avec précaution.As in many critical zones (CZ) with traditional agriculture, southwestern France is confronted with some agro-environmental risks due to the contamination by nitrogen and potential toxic elements (PTE) (metals) from anthropogenic inputs. For decades, numerous ponds have been constructed in this area for irrigation and/or landscaping. Few studies have focused on the distribution of the two types of contaminants at the catchment scale of an agricultural CZ. The role of ponds on the distribution and transfer of these two types of contaminants has also been rarely studied. To fill this knowledge gap, we studied nitrogen and PTE behavior in the water and sediments of streams and ponds of three adjacent catchments of the Save basin (southwestern France), particularly for their spatial distributions and the main controlling factors, while addressing the consequences in terms of pond management. Potential denitrification rate (PDR) in sediments varied spatially due to the heterogeneity of geo-physico-chemical properties even at a small scale. Although PDR in stream was more active than in pond due to the greater nutrient availability, larger ponds have showed high NO3- removal efficiency. Long hydraulic retention time (HRT) could increase the reaction time and mitigate NO3- further. A chain of multiple constructed ponds along the stream provided a better ability to mitigate NO3- compared to a single pond. Denitrification was higher in ponds located upstream of a catchment, but the incomplete denitrification process in these ponds can lead to the release of N2O contributing to the greenhouse gas emission and negative consequences for the environmental, which requires further investigations. Application of fertilizers and pesticides to cultivated soils has contributed to PTE accumulation in stream and pond sediments, especially for Cu, Ni, and Cd in upstream sediments attributing to high soil erosion and low discharge
dilution. PTE distribution has also been affected by pond management. High temperature, high pH, and long HRT in a large pond created a favorable environment for PTE sedimentation via adsorption to fine particles and co-precipitation with carbonates from this agricultural CZ. Although the sediments accumulated in ponds can store PTEs, the sediments drained by streams left the pond as a secondary source of PTEs through resuspension and turbulence of the running water, especially for small, non-dredged ponds. PTE accumulation did not affect PDR since the PTE contamination was not very severe in this agricultural CZ. However, sediment clay content can affect denitrification rate and PTE accumulation simultaneously. Pond management must therefore consider both denitrification and PTE accumulation. A chain of several constructed ponds can be
able to store PTEs and mitigate excessive nitrate simultaneously, especially with some large ponds located in upstream. The dredging activity for pond sediments should also be managed carefully
Fonctions normales et pathologiques de la protéine de signalisation des lymphocytes T, THEMIS, dans les lymphocytes T CD4+
Get PDFLes lymphocytes T (LT) CD4+ (aussi appelés LT helper ou LTh) jouent un rôle central dans le déclenchement et le contrôle des réponses immunitaires adaptatives. Les LT CD4+ dits naïfs peuvent se différencier en différentes sous-populations de LT effecteurs ayant des fonctions immunitaires spécifiques, qui contribuent à orchestrer la défense de l'hôte contre diverses classes d'agents pathogènes. Ce processus de différentiation dépend de l'intégration de plusieurs signaux déclenchés par le récepteur d'antigène des LT (TCR), qui reconnait des peptides du Soi ou étrangers associés aux molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), et par un ensemble de récepteurs aux cytokines plus ou moins stimulés selon les cytokines présentes dans le milieu extracellulaire. En plus de signaux contrôlant la différentiation des LT effecteurs, des signaux supplémentaires sont importants pour contrôler l'amplitude des réponses effectrices des LT et établir un équilibre optimal entre une bonne efficacité des réponses immunitaires et la prévention de réponses potentiellement pathologiques. THEMIS est une protéine de la lignée des LT qui joue un rôle essentiel lors de leur sélection positive dans le thymus. THEMIS a été identifiée comme une protéine de signalisation du TCR mais sa fonction dans ce contexte est encore controversée. Son rôle dans les LT périphériques, en particulier dans les LT CD4+, reste mal caractérisé. L'objectif de cette étude a été d'étudier le rôle de THEMIS dans les réponses normales et pathologiques des lymphocytes T CD4+. En utilisant un modèle murin sélectivement déficient pour THEMIS après l'étape de sélection positive dans le thymus (souris lateCD2-Cre themisflox/flox; nommées themis-TKO), nous avons observé que le déficit en THEMIS a des conséquences opposées sur les réponses des LT CD4+ lors de la stimulation du TCR in vitro et après immunisation avec des antigènes étrangers et/ou du Soi in vivo. In vitro, le déficit en THEMIS entraîne une augmentation sélective de la production d'IFNƴ dans les LTh1 due à une augmentation spécifique de la phosphorylation des MAP kinases ERK1/2 suite à la stimulation du TCR. En revanche, l'absence de THEMIS n'a pas d'effet sur les signaux pro-Th1 déclenchés par les récepteurs à l'IL-12 et à l'IFNƴ. In vivo, la déficience en THEMIS entraîne une diminution de la production d'IFNƴ par les LT CD4+ spécifiques d'antigènes exogènes associée à des niveaux d'expression plus faible du facteur de transcription pro-Th1 T-bet. En outre, la susceptibilité au développement de l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), le modèle murin classique de sclérose en plaques, est diminuée chez les souris themis-TKO. Les LT CD4+ déficients en THEMIS sont caractérisés par un potentiel encéphalitogénique atténué, de faibles niveaux d'expression du facteur de transcription T-bet et du récepteur CXCR3 ainsi qu'une moindre capacité à produire de l'IFNLes lymphocytes T (LT) CD4+ (aussi appelés LT helper ou LTh) jouent un rôle central dans le déclenchement et le contrôle des réponses immunitaires adaptatives. Les LT CD4+ dits naïfs peuvent se différencier en différentes sous-populations de LT effecteurs ayant des fonctions immunitaires spécifiques, qui contribuent à orchestrer la défense de l'hôte contre diverses classes d'agents pathogènes. Ce processus de différentiation dépend de l'intégration de plusieurs signaux déclenchés par le récepteur d'antigène des LT (TCR), qui reconnait des peptides du Soi ou étrangers associés aux molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), et par un ensemble de récepteurs aux cytokines plus ou moins stimulés selon les cytokines présentes dans le milieu extracellulaire. En plus de signaux contrôlant la différentiation des LT effecteurs, des signaux supplémentaires sont importants pour contrôler l'amplitude des réponses effectrices des LT et établir un équilibre optimal entre une bonne efficacité des réponses immunitaires et la prévention de réponses potentiellement pathologiques. THEMIS est une protéine de la lignée des LT qui joue un rôle essentiel lors de leur sélection positive dans le thymus. THEMIS a été identifiée comme une protéine de signalisation du TCR mais sa fonction dans ce contexte est encore controversée. Son rôle dans les LT périphériques, en particulier dans les LT CD4+, reste mal caractérisé. L'objectif de cette étude a été d'étudier le rôle de THEMIS dans les réponses normales et pathologiques des lymphocytes T CD4+. En utilisant un modèle murin sélectivement déficient pour THEMIS après l'étape de sélection positive dans le thymus (souris lateCD2-Cre themisflox/flox; nommées themis-TKO), nous avons observé que le déficit en THEMIS a des conséquences opposées sur les réponses des LT CD4+ lors de la stimulation du TCR in vitro et après immunisation avec des antigènes étrangers et/ou du Soi in vivo. In vitro, le déficit en THEMIS entraîne une augmentation sélective de la production d'IFNƴ dans les LTh1 due à une augmentation spécifique de la phosphorylation des MAP kinases ERK1/2 suite à la stimulation du TCR. En revanche, l'absence de THEMIS n'a pas d'effet sur les signaux pro-Th1 déclenchés par les récepteurs à l'IL-12 et à l'IFNƴ. In vivo, la déficience en THEMIS entraîne une diminution de la production d'IFNƴ par les LT CD4+ spécifiques d'antigènes exogènes associée à des niveaux d'expression plus faible du facteur de transcription pro-Th1 T-bet. En outre, la susceptibilité au développement de l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), le modèle murin classique de sclérose en plaques, est diminuée chez les souris themis-TKO. Les LT CD4+ déficients en THEMIS sont caractérisés par un potentiel encéphalitogénique atténué, de faibles niveaux d'expression du facteur de transcription T-bet et du récepteur CXCR3 ainsi qu'une moindre capacité à produire de l'IFNƴ. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que THEMIS exerce des effets inhibiteurs sur la signalisation du TCR et les réponses des lymphocytes T CD4+ in vitro ; effets contrebalancés in vivo par des signaux indépendants du TCR qui amplifient les réponses Th1 normales et neuro-inflammatoires. En conclusion, ce travail de thèse apporte un nouvel éclairage sur les fonctions de THEMIS sur la signalisation du TCR et identifie des effets potentiellement pathologiques de THEMIS dans les maladies auto-immunes affectant le système nerveux central. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que THEMIS exerce des effets inhibiteurs sur la signalisation du TCR et les réponses des lymphocytes T CD4+ in vitro ; effets contrebalancés in vivo par des signaux indépendants du TCR qui amplifient les réponses Th1 normales et neuro-inflammatoires. En conclusion, ce travail de thèse apporte un nouvel éclairage sur les fonctions de THEMIS sur la signalisation du TCR et identifie des effets potentiellement pathologiques de THEMIS dans les maladies auto-immunes affectant le système nerveux central.CD4+ T cells or T helper (Th) cells play a pivotal role in triggering and shaping adaptive immune responses. Naïve CD4+ T cells may differentiate into multiple effector subsets with distinct lineages and specific immune functions which help to orchestrate host defense against various classes of pathogens. The mechanism that controls cell fate decision depends on the integration of multiple signals triggered by the T cell antigen receptor (TCR), which recognize Self or foreign peptide associated with the molecules of the Major Histocompatibility Complex (MHC), and by an array of cytokines receptors which are stimulated according to the cytokines present in the extracellular environment. In addition to those cell fate decision signals, additional signals are important to control the magnitude of T cell effector responses and set the balance between effective and pathologic immune responses. THEMIS is a T cell lineage protein that plays an essential role during the positive selection of T cells in the thymus. THEMIS has been characterized as a TCR signaling protein, but whether it operates as an inhibitor or enhancer of TCR signals has been controversial. Its function in peripheral T cells, especially in peripheral CD4+ T cells, remains poorly characterized. The objective of this study was to investigate the role of THEMIS in normal and pathological CD4+ T cell responses. By using a mouse model which is selectively deficient for THEMIS after the stage of positive selection (lateCD2-Cre themisflox/flox mice; named themis-TKO), we observed that THEMIS deficiency has opposite consequences on CD4+ T cell responses upon TCR stimulation in vitro and following immunization with foreign- and self-antigens in vivo. In vitro, THEMIS deficiency leads to a selective increase of interferon-gamma production in Th1 polarized CD4+ T cells. The absence of THEMIS did not affect pro-Th1 signals mediated by IL-12 and IFNƴ receptors but results in a specific increase of the phosphorylation of ERK1/2 MAP kinases following TCR stimulation which is responsible for the increased production of Th1 cytokines observed in THEMIS deficient CD4+ T cells. In vivo, immunization of themis-TKO with a foreign antigen leads to decreased production of IFNƴ by antigen-specific CD4+ T cells associated with a lower expression level of the transcription factor T-bet. Also, susceptibility to the development of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), the murine model of Multiple Sclerosis, is decreased in themis-TKO mice. This is associated with an attenuated encephalitogenic potential of themis-TKO CD4+ T cells, which express lower levels of the pro-Th1 transcription factor T-bet and of the chemokine receptor CXCR3 and produce reduced amounts of interferon-gamma. Altogether, these results suggest that THEMIS exerts inhibitory effects on TCR-mediated signaling and CD4+ T cell responses in vitro, which are overcome in vivo by TCR-independent signals that promote normal and neuro-inflammatory Th1 responses. In conclusion, this thesis work presents insights that may explain the previous discrepancy associated with the function of THEMIS on TCR signaling and identifies a deleterious effect of THEMIS on the regulation of Central Nervous System autoimmunity