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Regulation of histone proteins with cell volume and genome content in Saccharomyces cerevisiae
Get PDFThis thesis addresses the fundamental biological question of how cells achieve different regulations of protein subgroups with cell volume and ploidy (ch. 1). For most proteins, the production is coupled to cell volume, leading to constant concentrations with increasing cell volume. However, strongly DNA-bound proteins, such as histones, are likely needed at constant amounts, which would lead to decreasing concentrations as a function of cell volume. It still remains unclear how cells could achieve to couple the production of some protein subgroups to cell volume, but decouple it from cell volume for other protein subgroups.
To answer this question, I focused on the regulation of histone proteins, using the model organism Saccharomyces cerevisiae and made use of genetics in order to achieve a wider range of observable cell volumes (ch. 2.1). Additionally, I performed live-cell fluorescence microscopy (ch. 2.3), reverse-transcription quantitative PCR (ch. 2.4), flow cytometry (ch. 2.5) and single-molecule fluorescence in situ hybridization (ch. 2.6).
First, I demonstrate that histone protein and mRNA concentrations decrease with cell volume and are coupled to their respective gene copy number (ch. 3.2 & 3.3). Then, I show that this regulation is achieved by the histone promoter (ch. 3.4), is not an effect of the cell cycle dependent production of histones (ch. 3.7), and most likely does not require direct transcriptional feedback or degradation mechanisms (ch. 3.8). I also detail a minimal mathematical model that describes the dependence of promoter transcription rates with cell volume (ch. 3.5). This model predicts that the behaviour of a histone promoter can be changed to that of most promoters, solely by decreasing its transcription
initiation rate. Using a series of promoter truncations, I confirm this theoretical prediction experimentally (ch. 3.6).
In summary, this work shows that the regulation of histone proteins with cell volume and genome content is likely an intrinsic property of histone promoters, where direct transcriptional feedback or degradation mechanisms might play a role but are not necessary. The model introduced during this work lays a foundation for a deeper understanding of protein regulation with cell volume and ploidy in general. Interestingly, this regulation is likely conserved across most eukaryotic cells
Untersuchung der Wirkung von antimikrobiellen Peptiden auf die Formation von parodontalpathogenen Biofilmen in-vitro
Get PDFDie Rolle eosinophiler Granulozyten in der Entstehung atherosklerotischer Plaques - am Mausmodell
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Comparison of two vitrification-systems, Cryotop® versus VitTrans, in biopsied bovine embryos
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Synthesis and real structure effects in Zr-based metal–organic frameworks
Get PDFAfter more than two decades of research in the field of metal–organic frameworks (MOFs), a plethora of structures has been reported and used for a variety of applications including catalysis, gas adsorption, and drug delivery. Zr-based MOFs have emerged as pioneering materials due to their outstanding stability and structural flexibility. Although new Zr-based MOFs are published frequently, systematic investigations on disorder and vacancies in the structures, which are known to affect the materials’ properties, remain sparse. In addition, synthetic reports are often irreproducible, leading to phase mixtures of two or more MOFs limiting their utility in targeted applications. This thesis investigates the structural complexity of Zr-based MOFs, in particular cluster disorder and vacancies, and explores the link between synthesis parameters and product outcome.
Combination of Zr-oxo clusters with the chromophore tetrakis(4-carboxyphenyl)porphyrin gives rise to a series of porphyrinic MOFs with interesting (opto)electronic properties. Chapter 2 explores the structures of the cubic representatives PCN-221, MOF-525, and PCN-224. Based on a comprehensive synthetic and structural analysis spanning the local- and long-range, it was found that PCN-221 consists of octahedral Zr6O4(OH)4 clusters tilted in four directions, rather than cubic Zr8O6 clusters as previously reported in literature. A new structure model—disordered PCN-224 (dPCN-224)—was established to understand cubic porphyrinic Zr-based MOFs with varying degrees of orientational cluster disorder, linker vacancies, and cluster–linker coordination. In a further step, Chapter 3 evaluates the complexities of synthesising porphyrinic Zr-based MOFs, specifically dPCN-224. A detailed step-by-step formation pathway of dPCN-224 was characterized, revealing that the MOF formed via an intermediate. Importantly, it was shown that the Zr source and water content in the reaction influenced the formation of the inorganic building unit and with this the resultant product.
Additionally, Chapter 4 explores the structural complexity of Zr-based MOFs with methane-tetrakis(p-biphenylcarboxylate) (MTBC) linkers. Two new MTBC-based structures are presented, namely c-(4,12)MTBC-Zr6 and t-(4,12)MTBC-Zr6, that show unexpectedly high structural versatility. The 12-fold cluster coordination found in both structures is enabled by a combination of cluster disorder and linker flexibility. Importantly, Hf analogues were also obtained for both structures revealing that the structural flexibility is not limited to Zr–MTBC compounds
Klimawandel im Gefüge städtischer Alltagspraktiken
Get PDFDas Klima hat sich verändert, Gesellschaft soll sich verändern – ausgehend von dieser Grundannahme wird Klimawandel in dieser Arbeit als alltägliches Phänomen betrachtet, das städtische Praktiken zwischen Menschen und ihrer Umwelt zu Veränderungen anstößt. Beispielhafter Schauplatz ist die Stadt Kassel, mitten in Deutschland.
Es gilt zunächst, städtische Gefüge und ihren Zuammenhang mit Klimawandel zu verstehen. Dazu zeichnet diese Arbeit nach, wie das In-Beziehung-Setzen zwischen Menschen und Stadtnaturen komplexen, dynamischen Gefügen entspringt, die sich (in)direkt auf Klimawandel beziehen.
In drei Fallbeispielen – einem städtischen Wald unter Biodiversitätsschutz, einer temporären Klimaküche und gestresstem Stadtgrün und seiner Verwaltung – werden menschliche und nicht-menschliche Akteure in den Blick genommen, die in Alltagspraktiken miteinander verbunden sind. Mithilfe einer Klimaethnografie können so spezifische Mensch-Umwelt-Belange aufgezeigt werden, die in Verwaltungs-, Föderungs- und Initiativenlogiken bisher wenig beachtet werden. Die Arbeit setzt damit Denkanstöße für eine tiefere Betrachtung von Alltagspraktiken für den städtischen Umgang mit Klimawandel.
Catharina Lüder studierte an der FU und HU in Berlin Kommunikationswissenschaft und Europäische Ethnologie. Für ihre Promotion forschte sie an der Universität Kassel und der LMU München zu städtischen Transformationen im Klimawandel. Ihr Interessensschwerpunkt liegt auf alltäglichen Mensch-Umwelt-Beziehungen in Wissenschaft und Gesellschaft, speziell in Bezug auf Wetter und Klima
Identification of substrate requirements for γ-secretase cleavage of the amyloid precursor protein
Get PDFIntramembrane proteolysis is of vital importance for numerous cellular processes and its dysfunction has repeatedly been associated with various diseases, such as Alzheimer’s disease (AD) and cancer. γ-Secretase is an intramembrane-cleaving protease complex involved in the production of the amyloid-β peptide (Aβ), one of the neuropathological hallmarks of AD. To date, a vast number of γ secretase substrates have been identified with C99, the precursor of Aβ, being one of the best studied substrates. Yet, despite recent advances in the field, the factors determining substrate recognition and efficient cleavage remain largely elusive. No specific consensus sequence motif for the discrimination between substrates and non substrates is currently known to exist. However, several lines of evidence suggested that the presence of a flexible region (e.g., a glycine-glycine (GG)-hinge motif) within the transmembrane domain (TMD) of a substrate might be critical for substrate recruitment and cleavage by γ secretase and intramembrane proteases in general, although, conflicting data existed.
The cleavage of a γ-secretase substrate (substrate processing) can be divided into two stages: the initial cleavage and the subsequent trimming, also referred to as processivity. To illuminate the principles of substrate recognition and cleavage by γ-secretase, this thesis combined biophysical studies with biochemical data on the cleavability of various C99-based constructs. The work presented here, demonstrated that the GG-hinge motif in C99 conveys a flexibility necessary for the interaction with γ-secretase. A certain flexibility appears to be critical for the translocation from the exosites (distal binding sites) to the active site and correct positioning of the scissile bond at the active site. Indeed, the presence of a flexible motif in the N terminal half of the TMD (TM N) of C99 proved to be a sufficient substrate requirement for cleavage of C99 and may even be a substrate requirement for a subgroup of γ secretase substrates. The cleavage region, in the C terminal TMD (TM-C), turned out to be equally important for substrate cleavage by γ secretase. It appears that specific interactions between the substrate’s TM-C and the enzyme are far more important than a flexible motif in this region of C99. It is possible, that the TM C is vital for docking of the scissile bond at the active center, as well as for the formation of a β sheet, which has been shown to stabilize the substrate and to bring the scissile bond into position. Intriguingly, both the flexible motif and the cleavage region must cooperate to enable efficient cleavage of C99. After the initial cleavage, however, a helical TMD promoted further trimming. Altogether, these data indicate that cleavage of C99 is determined by the presence of a flexible region in the TM N, facilitating the translocation to the active site, and the cleavage region in the TM-C, crucial for the formation of a cleavage competent state, while a helical TMD is required for efficient trimming. Overall, this work further illuminated the principles of substrate recognition and cleavage by γ secretase, helping to advance our understanding of the structurally and functionally most complex intramembrane protease known.Die Intramembranproteolyse ist für zahlreiche grundlegende zelluläre Prozesse von entscheidender Bedeutung. Eine Dysfunktion dieses Prozesses wurde bereits mehrfach mit verschiedenen Krankheiten, wie der Alzheimer-Krankheit (AK) und Krebs, in Verbindung gebracht. Die γ Sekretase ist eine Intramembranprotease, welche an der Produktion von Aβ, Hauptbestandteil eines der neuropathologischen Merkmale der AK, beteiligt ist. Bis heute wurde eine Vielzahl von γ Sekretase Substraten identifiziert, wobei C99, das Vorläuferprotein von Aβ, eines der am besten untersuchten Substrate darstellt. Jedoch sind, trotz der jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der γ Sekretase Forschung, die Faktoren, die für die Erkennung und effiziente Spaltung der Substrate ausschlaggebend sind, nach wie vor weitgehend unbekannt. So wurde bisher kein spezifisches Erkennungsmotiv für die Unterscheidung von Substraten und Nicht-Substraten identifiziert. Diverse Hinweise deuten jedoch darauf hin, dass das Vorhandensein einer flexiblen Region (z. B.: ein Glycin Glycin- (GG ) Scharnier-Motiv) innerhalb der Transmembrandomäne (TMD) eines Substrats entscheidend für die Spaltung durch die γ Sekretase, und Intramembranproteasen im Allgemeinen, sein könnte. Die Datenlage bezüglich der Rolle einer flexiblen TMD für die Substratspaltung war allerdings nicht eindeutig.
Die Spaltung eines γ-Sekretase-Substrats (Prozessierung) kann in zwei Abschnitte unterteilt werden: die initiale endoproteolytische Spaltung und die anschließende carboxyterminale Spaltung. Um die Prinzipien der Substraterkennung und -spaltung durch die γ-Sekretase besser verstehen zu können, wurden in dieser Arbeit biophysikalische Analysen mit biochemischen Daten zur Spaltbarkeit verschiedener C99 basierter Konstrukte kombiniert. Die hier vorgestellten Ergebnisse machen deutlich, dass das GG Motiv in C99 eine für die Interaktion zwischen dem Substrat und der γ Sekretase notwendige Flexibilität vermittelt. Eine gewisse Flexibilität scheint für die Translokation von den „Exosites“ (Bindestellen abseits des aktiven Zentrums) hin zu dem aktiven Zentrum, sowie die korrekte Positionierung der zu spaltenden Peptidbindung in dem aktiven Zentrum der γ-Sekretase entscheidend zu sein. Tatsächlich erwies sich das Vorhandensein eines flexiblen Motivs in dem N-terminalen Teil der TMD (TM N) von C99 als hinreichende Substratanforderung für die Spaltung durch die γ Sekretase. Möglicherweise stellt ein solches Motiv sogar eine Substratanforderung für eine Untergruppe von γ-Sekretase Substraten dar. Der C terminale Teil der Spaltregion, lokalisiert in der C terminalen Hälfte der TMD (TM-C), erwies sich als ebenso essenziell für die Spaltung durch die γ Sekretase. Es scheint, dass spezifische Interaktionen zwischen dem TM-C von C99 und dem Enzym viel wichtiger sind als ein flexibles Motiv in dieser Region des Substrats. Möglicherweise ist die TM-C entscheidend für das Andocken der zu spaltenden Bindung an das aktive Zentrum, sowie für die Bildung eines β-Faltblattes, welches das Substrat stabilisiert und die zu spaltende Bindung in Position bringt. Interessanterweise war ein Zusammenspiel zwischen dem flexiblen Motiv und der natürlichen Spaltregion notwendig, um eine effiziente Spaltung von C99 zu ermöglichen. Die weitere carboxyterminale Spaltung des Substrats, die im Anschluss an die initiale Spaltung erfolgt, wurde hingegen durch eine helikale Konformation der TMD des Substrats begünstigt. Folglich wird die Spaltung von C99 durch das Vorhandensein einer flexiblen Region im TM-N, welche die Translokation zum aktiven Zentrum ermöglicht, und der natürlichen Spaltregion im TM C, welche für die Positionierung des Substrats wichtig ist, bestimmt. Während eine helikale TMD für eine effiziente carboxyterminale Spaltung erforderlich ist. Insgesamt hat diese Arbeit dazu beigetragen, die Prinzipien der Substraterkennung und -spaltung durch die γ Sekretase aufzuklären und unser Verständnis der strukturell und funktionell komplexesten, bekannten Intramembranprotease, voranzutreiben