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Scalable three-dimensional intact human organs labeling and clearing by tissue clearing technologies
Get PDFA systematic dissection of the catalytic and non-catalytic functions of TET1 at the interface of epigenetic regulation
Get PDFMammalian DNA consists of millions of base pairs. To fit the DNA into the nucleus of a cell the DNA is condensed into chromosomes. The DNA is wrapped around an histone octamer forming nucleosomes which are the basis of chromatin. Chromatin is the physiological form of DNA and altered by various epigenetic mechanisms, such as DNA methylation, histone modifications and RNA modifications. During development epigenetic mechanisms drive lineage choices and cell identity. In this doctoral work we used next generation sequencing and CRISPR/Cas9 genome engineering to study different epigenetic mechanisms in mESCs. The main focus was to study the non-catalytic functions of the DNA demethylase TET1. I have found that TET1 is involved in heterochromatin formation and retroviral silencing independent of DNA demethylation (Publication I). In the scope of this doctoral work I contributed to other projects with the focus on epigenetic proteins in mESCs. First, description of the role of the UBL domain of UHRF1 in the interplay with DNMT1 and DNA maintenance methylation (Publication II). Second, identification of DPPA3 as a regulator of UHRF1 and critical for global DNA demethylation (Publication III). Third, discovery of TET1 and TET2 stage-specific roles in DNA demethylation during early embryonic development (Publication IV). Last, in the scope of this doctoral work I contributed to study the role and function of the novel RNA methyltransferases METTL5 and METTL6 in the field of epitranscriptomics. METTL5 was found to be a specific ribosomal RNA methyltransferase critical for pluripotency and differentiation (Publication V). METTL6 was discovered as a transfer RNA methyltransferase involved in cancer (Publication VI). In summary, this doctoral work investigated and described novel non-catalytic mechanisms of TET1 and studied various epigenetic modifiers and mechanisms at different epigenetic levels
Rational development of stabilized cyclic disulfide redox probes and bioreductive prodrugs to target dithiol oxidoreductases
Get PDFCountless biological processes allow cells to develop, survive, and proliferate. Among these, tightly balanced regulatory enzymatic pathways that can respond rapidly to external impacts maintain dynamic physiological homeostasis. More specifically, redox homeostasis broadly affects cellular metabolism and proliferation, with major contributions by thiol/disulfide oxidoreductase systems, in particular, the Thioredoxin Reductase Thioredoxin (TrxR/Trx) and the Glutathione Reductase-Glutathione-Glutaredoxin (GR/GSH/Grx) systems.
These cascades drive vital cellular functions in many ways through signaling, regulating other proteins' activity by redox switches, and by stoichiometric reductant transfers in metabolism and antioxidant systems. Increasing evidence argues that there is a persistent alteration of the redox environment in certain pathological states, such as cancer, that heavily involve the Trx system: upregulation and/or overactivity of the Trx system may support or drive cancer progression, making both TrxR and Trx promising targets for anti-cancer drug development.
Understanding the biochemical mechanisms and connections between certain redox cascades requires research tools that interact with them. The state-of-the-art genetic tools are mostly ratiometric reporters that measure reduced:oxidized ratios of selected redox pairs or the general thiol pool. However, the precise cellular roles of the central oxidoreductase systems, including TrxR and Trx, remain inaccessible due to the lack of probes to selectively measure turnover by either of these proteins. However, such probes would allow measuring their effective reductive activity apart from expression levels in native systems, including in cells, animals, or patient samples. They are also of high interest to identify chemical inhibitors for TrxR/Trx in cells and to validate their potential use as anti-cancer agents (to date, there is no selective cellular Trx inhibitor, and most known TrxR inhibitors were not comprehensively evaluated considering selectivity and potential off-targets). However, small molecule redox imaging tools are underdeveloped: their protein specificity, spectral properties, and applicability remain poorly precedented.
This work aimed to address this opportunity gap and develop novel, small molecule diagnostic and therapeutic tools to selectively target the Trx system based on a modular trigger cargo design: artificial cyclic disulfide substrates (trigger) for oxidoreductases are tethered to molecular agents (cargo) such that the cargo’s activity is masked and is re-established only through reduction by a target protein.
The rational design of these novel reduction sensors to target the cell's strongest disulfide-reducing enzymes was driven by the following principles: (i) cyclic disulfide triggers with stabilized ring systems were used to gain low reduction potentials that should resist reduction except by the strongest cellular reductases, such as Trx; and (ii) the cyclic topology also offers the potential for kinetic reversibility that should select for dithiol-type redox proteins over the cellular monothiol background. Creating imaging agents based on such two-component designs to selectively measure redox protein activity in native cells required to combine the correct trigger reducibility, probe activation kinetics, and imaging modalities and to consider the overall molecular architecture.
The major prior art in this field has applied cyclic 5-membered disulfides (1,2 dithiolanes) as substrates for TrxR in a similar way to create such tools. However, this motif was described elsewhere as thermodynamically instable and was due to widely used for dynamic covalent cascade reactions. By comparing a novel 1,2 dithiolane-based probe to the state-of-the-art probes, including commercial TrxR sensors, by screening a conclusive assay panel of cellular TrxR modulations, I clarified that 1,2 dithiolanes are not selective substrates for TrxR in biological settings (Nat Commun 2022).
Instead, aiming for more stable ring systems and thus more robust redox probes, during this work, I developed bicyclic 6 membered disulfides (piperidine fused 1,2 dithianes) with remarkably low reduction potentials. I showed that molecular probes using them as reduction sensors can be mostly processed by thioredoxins while being stable against reduction by GSH. The thermodynamically stabilized decalin like topology of the cis-annelated 1,2 dithianes requires particularly strong reductants to be cleaved. They also select for dithiol type redox proteins, like Trx, based on kinetic reversibility and offer fast cyclization due to the preorganization by annelation (JACS 2021).
This work further expanded the system’s modularity with structural cores based on piperazine-fused 1,2 dithianes with the two amines allowing independent derivatization. Diagnostic tools using them as reduction sensors proved equally robust but with highly improved activation kinetics and were thus cellularly activated. Cellular studies evolved that they are substrates for both Trxs and their protein cousins Grxs, so measuring the cellular dithiol protein pool rather than solely Trx activity (preprint 2023).
Finally, a trigger based on a slightly adapted reduction sensor, a desymmetrized 1,2 thiaselenane, was designed for selective reduction by TrxR’s selenol/thiol active site, then combined with a precipitating large Stokes’ shift fluorophore and a solubilizing group, to evolve the first selective probe RX1 to measure cellular TrxR activity, which even allowed high throughput inhibitor screening (Chem 2022).
The central principle of this work was further advanced to therapeutic prodrugs based on the duocarmycin cargo (CBI) with tunable potency (JACS Au 2022) that can be used to create off-to-on therapeutic prodrugs. Such CBI prodrugs employing stabilized 1,2 dichalcogenide triggers proved to be cytotoxins that depend on Trx system activity in cells. They could further be exploited for cell-line dependent reductase activity profiling by screening their redox activation indices, the reduction-dependent part of total prodrug activation, in 177 cell lines. Beyond that, these prodrugs were well-tolerated in animals and showed anti-cancer efficacy in vivo in two distinct mouse tumor models (preprint 2022).
Taken together, I introduced unique monothiol-resistant reducible motifs to target the cellular Trx system with chemocompatible units for each for TrxR and Trx/Grx, where the cyclic nature of the dichalcogenides avoids activation by GSH. By using them with distinct molecular cargos, I developed novel selective fluorescent reporter probes; and introduced a new class of bioreductive therapeutic constructs based on a common modular design. These were either applied to selectively measure cellular reductase activity or to deliver cytotoxic anti cancer agents in vivo. Ongoing work aims to differentiate between the two major redox effector proteins Trx and Grx, requiring additional layers of selectivity that may be addressed by tuned molecular recognition. The flexible use of various molecular cargos allows harnessing the same cellular redox machinery by either probes or prodrugs. This allows predictive conclusions from diagnostics to be directly translated into therapy and offers great potential for future adaptation to other enzyme classes and therapeutic venues.Die zelluläre Redox-Homöostase hängt von Thiol/Disulfid-Oxidoreduktasen ab, die den Stoffwechsel, die Proliferation und die antioxidative Antwort von Zellen beeinflussen. Die wichtigsten Netzwerke sind die Thioredoxin Reduktase-Thioredoxin (TrxR/Trx) und Glutathion Reduktase-Glutathion-Glutaredoxin (GR/GSH/Grx) Systeme, die über Redox-Schalter in Substratproteinen lebenswichtige zelluläre Funktionen steuern und so an der Redox-Regulation und -Signalübertragung beteiligt sind. Persistente Veränderungen des Redoxmilieus in pathologischen Zuständen, wie z. B. bei Krebs, sind in hohem Maße mit dem Trx-System verbunden. Eine Hochregulierung und/oder Überaktivität des Trx-Systems, die bei vielen Krebsarten auftreten, unterstützt zudem das Fortschreiten des Krebswachstums, was TrxR/Trx zu vielversprechenden Zielproteinen für die Entwicklung neuer Krebsmedikamente macht.
Um die biochemischen Prozesse dahinter zu erforschen, sind spezielle Techniken zur Visualisierung und Messung enzymatischer Aktivität nötig. Die hierzu geeigneten, meist genetischen Sensoren messen ratiometrisch das Verhältnis reduzierter/oxidierter Spezies in zellulärem Umfeld oder spezifisch ausgewählte Redoxpaare. Die weitere Erforschung der exakten Funktion von TrxR/Trx und deren Substrate ist jedoch durch mangelnde Nachweismethoden limitiert. Diese sind außerdem zur Validierung chemischer Hemmstoffe für TrxR/Trx in Zellen und deren potenziellen Verwendung als Krebsmittel von großem Interesse. Bislang gibt es keinen selektiven zellulären Trx-Inhibitor und potenzielle Off-Target-Effekte der bekannten TrxR-Inhibitoren wurden nicht abschließend bewertet.
Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung niedermolekularer, diagnostischer und therapeutischer Werkzeuge, die selektiv auf das Trx-System abzielen und auf einem modularen Trigger-Cargo Design basieren. Hierzu werden zyklische Disulfid-Substrate (Trigger) für Oxidoreduktasen so mit molekularen Wirkstoffen (Cargo) verknüpft, dass dabei die Wirkstoffaktivität maskiert, und erst nach Reduktion durch ein Zielprotein wiederhergestellt wird. Diese neuartigen, synthetischen Reduktionssensoren basieren auf den folgenden Grundprinzipien: (i) Zyklische Disulfide sind thermodynamisch stabilisiert und können nur durch die stärksten Reduktasen gespalten werden; und (ii) die zyklische Topologie ermöglicht die kinetische Reversibilität der zwei Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen, die eine erste Reaktion mit Monothiolen, wie z. B. GSH, sofort umkehrt und so eine vollständige Reduktion verhindert.
Die meisten früheren Arbeiten auf diesem Gebiet verwendeten ein zyklisches, fünfgliedriges Disulfid (1,2 Dithiolan) als Substrat für TrxR. Das gleiche Strukturmotiv wurde jedoch an anderer Stelle als thermodynamisch instabil beschrieben und aufgrund dieser Eigenschaft explizit für dynamische Kaskadenreaktionen verwendet. Deshalb vergleicht diese Arbeit zu Beginn einen neuen 1,2 Dithiolan basierten fluorogenen Indikator mit bestehenden, z. T. kommerziellen, Redox Sonden für TrxR in einer Reihe von Zellkultur-Experimenten unter Modulation der zellulären TrxR Aktivität und stellt so einen Widerspruch in der Literatur klar: 1,2 Dithiolane eignen sich nicht als selektive Substrate für TrxR, da sie labil sowohl gegen die Reduktion durch andere Redoxproteine, als auch gegen den Monothiol Hintergrund in Zellen sind (Nat. Commun. 2022).
Als alternatives Strukturmotiv wird in dieser Arbeit ein bizyklisches sechsgliedriges Disulfid (anneliertes 1,2 Dithian) etabliert. Durch sein niedriges Reduktionspotenzial, also seine hohe Resistenz gegen Reduktion, werden molekulare Sonden basierend auf diesem 1,2 Dithian als Reduktionssensor fast ausschließlich von Trx aktiviert, nicht aber von TrxR oder GSH (JACS 2021). Dieses Kernmotiv bestimmt dabei die Reduzierbarkeit, und damit die Enzymspezifität, durch seine zyklische Natur und die Annelierung, auch unter Verwendung unterschiedlicher Farb-/Wirkstoffe. Auf dieser Grundlage konnte die molekulare Struktur durch einen weiteren Modifikationspunkt für die flexible Verwendung weiterer funktioneller Einheiten ergänzt werden. Obwohl zelluläre Studien ergaben, dass diese neuartigen 1,2 Dithian Einheiten in Zellen sowohl Trx als auch das strukturell verwandte Grx adressieren, sind die daraus resultierenden diagnostischen Moleküle wertvoll, um den katalytischen Umsatz zellulärer Dithiol-Reduktasen, der sogenannten Trx Superfamilie, selektiv anzuzeigen (Preprint 2023).
Begünstigt durch das modulare Moleküldesign stellt diese Arbeit zudem das erste Reportersystem RX1 zum selektiven Nachweis der TrxR-Aktivität in Zellen vor. Es basiert auf der Verwendung eines zyklischen, unsymmetrischen Selenenylsulfid-Sensors (1,2 Thiaselenan), der selektiv von dem einzigartigen Selenolat der TrxR angegriffen wird, und dadurch letztlich nur von TrxR reduziert werden kann. RX1 eignete sich zudem für eine Hochdurchsatz-Validierung bestehender TrxR Inhibitoren und unterstreicht dadurch den kommerziellen Nutzen derartiger Diagnostika (Chem 2022).
Das zentrale Trigger-Cargo Konzept dieser Arbeit wurde für therapeutische Zwecke weiterentwickelt und nutzt dabei den einzigartigen Wirkmechanismus der Duocarmycin-Naturstoffklasse (CBI) (JACS Au 2022) zur Entwicklung reduktiv aktivierbarer Therapeutika. CBI Prodrugs basierend auf stabilisierten Redox-Schaltern (1,2 Dithiane für Trx; 1,2 Thiaselenan für TrxR) reagierten signifikant auf TrxR-Modulation in Zellen. Sie wurden darüber hinaus durch das Referenzieren ihrer Aktivität gegenüber nicht-reduzierbaren Kontrollmoleküle für die Erstellung zelllinienabhängiger Profile der Reduktaseaktivität in 177 Zelllinien genutzt. Schließlich waren diese neuen Krebsmittel im Tiermodell gut verträglich und zeigten in zwei verschiedenen Mausmodellen eine krebshemmende Wirkung (Preprint 2022b).
Zusammenfassend präsentiert diese Dissertation monothiol-resistente reduzierbare Trigger-Einheiten für das zelluläre Trx-System zur Entwicklung neuartiger, selektiver Reporter-Sonden, sowie eine neue Klasse reduktiv aktivierbarer Krebsmittel auf Basis eines adaptierbaren Trigger-Cargo Designs. Diese fanden entweder zur selektiven Messung zellulärer Proteinaktivität oder zum Einsatz als Antikrebsmittel Verwendung. Es wurden chemokompatible Motive sowohl für TrxR als auch für Trx/Grx identifiziert, wobei deren zyklische Natur eine Aktivierung durch GSH verhindert. Eine weitere Differenzierung zwischen den beiden Redox-Proteinen Trx und Grx und anderen Proteinen der Trx-Superfamilie erfordert eine zusätzliche Ebene der Selektierung, z. B. durch molekulare Erkennung, und ist Gegenstand laufender Arbeiten.
Die flexible Verwendung verschiedener molekularer Wirkstoffe ermöglicht dabei die „Pipeline-Entwicklung“ von Diagnostika und Therapeutika, die von der zellulären Redox-Maschinerie analog umgesetzt werden, und dadurch Schlussfolgerungen aus der Diagnostik direkt auf eine Therapie übertragbar machen. Dies birgt großes Potenzial für künftige Entwicklungen bei einer potenziellen Übertragung des modularen Konzepts auf andere Enzymklassen und therapeutische Einsatzgebiete
The potential of Integrin α10β1-selected mesenchymal stem cells for therapy of post-traumatic osteoarthritis in a mouse model
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Beziehung zwischen Rauchverhalten und Charakteristika der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung (COPD)
Get PDFDie chronisch-obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist eine weit verbreitete Erkrankung, die in den westlichen Ländern in der überwiegenden Zahl der Fälle auf das Zigarettenrauchen zurückzuführen ist. Das Zigarettenrauchen ist sowohl mit langfristigen Schäden als auch mit akuten Reaktionen verbunden. Hierbei unterscheiden sich die Patienten im Ausmaß sowohl der langfristigen als auch der kurzzeitigen Reaktionen. Viele Patienten mit COPD haben das Rauchen aufgegeben, allerdings gibt es noch einen beträchtlichen Anteil, der mehr oder weniger stark weiter raucht. Es ist denkbar, dass Ex-Raucher und Aktivraucher unterschiedliche Beziehungen zwischen physiologischen und klinischen Größen zeigen, da zum Einen anzunehmen ist, dass Patienten mit COPD, die weiter rauchen, eine Auswahl darstellen, zum Zweiten das Rauchen akute Effekte ausüben könnte, welche die Beziehungen verändern. In den bisherigen statistischen Analysen von COPD-Kohorten wurde in der Regel das Rauchen durch Indikatoren repräsentiert, die erstens den Rauchstatus und zweitens die kumulative Belastung im Sinne der Packyears angeben. Falls jedoch das Rauchen nicht nur die Höhe von Messwerten, sondern das Bestehen und die Stärke der Beziehungen zwischen Mess¬parametern beeinflusst, wäre eine derartige gemeinsame Analyse von Aktivrauchern und Ex-Rauchern nicht ganz angemessen. Die vorliegende Arbeit hatte daher das Ziel, die physiologischen und klinischen Charakteristika von Aktivrauchern und Ex-Rauchern getrennt zu analysieren und herauszufinden, welche Unterschiede es zwischen diesen beiden Gruppen gibt und ob einzelne Beziehungen unterschiedlich ausgeprägt sind.
Zu diesem Zweck wurden Daten aus COSYCONET analysiert. COSYCONET ist eine multizentrische COPD-Kohorte, in die deutschlandweit 2741 Patienten rekrutiert wurden. Neben einer Vielzahl von Lungen¬funktionsmessgrößen, Fragebogenangaben und Informationen über Komorbiditäten wurden ausführliche Daten zur Rauchanamnese erhoben. Diese umfassten auch Angaben über das Alter, in dem das Rauchen begonnen wurde, sowie das Alter, in dem es möglicherweise beendet wurde. Für die Analysen wurden nur Patienten der spirometrischen Schwerdegrade GOLD 1 bis 4 herangezogen, ferner wurde gefordert, dass die Ex-Raucher mindestens 10 Packyears aufwiesen und mindestens ein Jahr lang nicht geraucht hatten. Diese Einschlusskriterien hatten das Ziel, die Gruppe der Ex-Raucher klar zu definieren. Die Daten wurden mit Hilfe von linearen Regressionsanalysen ausgewertet, mit dem Fokus darauf, die Gruppen der Aktivraucher und Ex-Raucher einerseits getrennt, andererseits gemeinsam zu analysieren. Die finalen Ergebnisse dieser Analysen wurden in zwei Pfad-Modellen (Strukturgleichungsmodellen) zusammen¬gefasst, um die Unterschiede der Beziehungen zwischen Aktivrauchern und Ex-Rauchern auch graphisch zu verdeutlichen.
Von den 2741 Patienten, die in COSYCONET eingeschlossen worden waren, genügten 404 Aktivraucher und 1190 Ex-Raucher den geforderten Einschlusskriterien. Die Aktivraucher zeichneten sich, verglichen mit den Ex-Rauchern, durch ein geringeres Alter, eine geringere Zahl von Packyears, ferner bessere Werte von FEV1 %Soll sowie einen geringeren Quotienten RV/TLC und insofern eine bessere Lungenfunktion im Sinne von Atemwegsobstruktion und trapped air aus. Andererseits zeigten sie einen geringeren Transfer¬koeffizienten KCO, als Hinweis auf eine alveolär-kapilläre Schädigung zumindest in der Lunge. Der Knöchel-Arm-Index (ABI), als Indikator der Funktion großer Gefäße, war gleich. Wenn man allerdings in Kombination mit der Altersabhängigkeit des ABI das unterschiedliche Alter berücksichtigte, waren die Aktivraucher von den Ex-Rauchern auch im ABI verschieden und gewissermaßen vorgealtert. Dies wurde dadurch kaschiert, dass sie jünger waren. Ähnliches galt für FEV1. Diese Ergebnisse verdeutlichten, dass scheinbar bessere oder gleiche Werte der Funktion bei den Aktivrauchern wesentlich auf das geringere Alter zurückzuführen waren. Korrigierte man für den Altersunterschied, wiesen die Aktivraucher schlechtere Werte auf. Möglicherweise standen diese Beobachtungen im Zusammenhang mit der Tatsache, dass die Aktivraucher im Mittel zwar eine geringere kumulative, zugleich aber eine länger dauernde Belastung aufwiesen als die Ex-Raucher. Das Alter des Rauchbeginns zeigte keine konsistenten Korrelationen mit den Funktionsparametern, wohl aber die Ex-Raucher-Zeit bei den Ex-Rauchern. Allerdings war dieser Effekt statistisch schwer von dem Effekt des Alters zu trennen, da Alter, Rauchdauer, Zeit des Rauchbeginns und Ex-Raucher-Zeit naturgemäß numerisch zusammenhängen. Daher war nicht zweifelsfrei klar, ob bei gegebenem Alter eine kürzere Zeit des Rauchens oder eine längere Zeit seit dem Rauchstopp für relative Verbesserungen der Funktion verantwortlich war.
Die in den Analysen gefundenen multiplen Beziehungen erforderten zum besseren Verständnis eine integrative Darstellung. Fasste man demgemäß die Beziehungen der Funktionsgrößen zueinander sowie zu den Risikofaktoren in anschaulichen Pfad-Modellen zusammen, so zeigten sich bei den Ex-Rauchern Beziehungen zwischen den Funktionsgrößen FEV1, RV/TLC, KCO und ABI. Was die Risiko- bzw. Expositionsfaktoren anbelangte, hatte primär die Rauchdauer einen Einfluss auf ABI und KCO, und zwar einen negativen. Ferner zeigten die Packyears einen unabhängigen, negativen Einfluss auf KCO. Rauchdauer und Packyears waren miteinander korreliert und somit keine völlig unabhängigen Prädiktoren. Insgesamt zeigte sich somit der abträgliche Effekt der Rauchbelastung vor allem auf die gefäßassozierten Parameter.
Bei den Aktivrauchern war die Beziehung der Funktionsparameter zueinander ähnlich derjenigen, die bei den Ex-Rauchern beobachtet wurde, ferner waren Rauchdauer und Packyears ebenfalls miteinander korreliert. Beide Risikofaktoren zeigten jedoch keine statistisch signifikanten Zusammenhänge mit den Funktions¬parametern, möglicherweise aufgrund von Auswahleffekten der Aktivraucherpopulation, möglicherweise aufgrund einer Überlagerung durch akute Effekte des Rauchens. Auswahleffekte wurden nahegelegt durch die Korrelation zwischen den Packyears und RV/TLC, denn diese Assoziation war nicht wie erwartet positiv, sondern negativ, d.h. mit zunehmender Zahl von Packyears war RV/TLC als Indikator von trapped air geringer. Dies könnte so erklärt werden, dass Patienten mit einem besseren funktionellen Status sich gewissermaßen noch erlauben konnten, weiter zu rauchen, ohne große Beschwerden zu verspüren.
Zusammengenommen legen diese Ergebnisse die Annahme nahe, dass Patienten mit COPD, die weiter rauchen, zumindest in der COSYCONET-Kohorte eine Art von Positivauswahl der COPD-Patienten darstellten. Diese Positivauswahl zeigte sich in besseren Werten für Parameter der Obstruktion und Lungenüberblähung bzw. trapped air. Allerdings war die Gasaufnahmefähigkeit, gemessen über die Diffusionskapazität, dazu diskrepant, indem sie geringer ausfiel. Gleiches galt für die Funktion der großen Gefäße, wenn man für das Alter adjustierte. Ein wichtiges Ergebnis war, dass nur bei Ex-Rauchern konsistente Beziehungen zur Zigarettenrauchbelastung gefunden wurden. Diese Beobachtungen legen den Schluss nahe, bei statistischen Auswertungen von Daten, die von Patienten mit COPD stammen, Ex-Raucher und Aktivraucher getrennt auszuwerten, und zwar vor allem dann, wenn es um Beziehungen zum Risikofaktor Rauchen geht. Möglicherweise gilt das auch für andere Risikofaktoren, beispielsweise solche beruflicher Art. Die Tatsache, dass diese Beziehungen qualitativ unterschiedlich ausfielen, weist darauf hin, dass für die Unterschiede nicht immer - wie üblich - mit einem additiven Indikator des Rauchstatus angemessen adjustiert werden kann. Hingegen waren die Beziehungen der Funktionsparameter zueinander ähnlich, sodass Aktivraucher und Ex-Raucher mit Recht zusammengefasst werden können, wenn die Analyse auf diese Parameter beschränkt ist. Aus diesem Grunde legen die Ergebnisse nahe, bei einer detallierten Analyse von Patienten mit COPD die Daten von Aktivrauchern und Ex-Rauchern je nach Fragestellung gemeinsam oder getrennt zu analysieren oder zumindest sich der in dieser Arbeit beschriebenen Unterschiede bewusst zu sein
Das Anti-Müller-Hormon beim weiblichen Kaninchen und seine Serumkonzentrationen im Verhältnis zu Kastrationsstatus, Scheinträchtigkeit und Follikelanzahl
Get PDFDas Anti-Müller-Hormon (AMH) wird fast ausschließlich in den Gonaden sezerniert und kann daher als Marker des Kastrationsstatus verwendet werden. Zu den AMH-Serumkonzentrationen weiblicher Kaninchen gibt es in der zugänglichen Literatur bisher noch keine Untersuchungen. Kenntnisse über die physiologischen AMH-Serumspiegel und mögliche zyklusabhängige Veränderungen der AMH-Konzentrationen sind erforderlich, um AMH bei der zu untersuchenden Spezies als diagnostisches Mittel nutzen zu können. Ziele dieser Studie waren die Bestimmung der AMH-Serumkonzentrationen bei weiblichen Kaninchen, und die Untersuchung von AMH als Diagnostikum zur Unterscheidung von kastrierten und sexuell intakten Individuen. Darüber hinaus sollten der Zusammenhang zwischen den gemessenen AMH-Serumspiegeln und Scheinträchtigkeiten sowie der Anzahl an Ovarialfollikel untersucht werden.
Für die Messung der AMH-Konzentrationen wurden Serumproben von sexuell intakten (n = 64) und kastrierten (n = 22), weiblichen Kaninchen gewonnen. Die kastrierten Tiere waren Vertreter unterschiedlicher Rassen und von unterschiedlichem Alter (1,6 - 12,1 Jahre). Bei den intakten Kaninchen handelte es sich um Zika-Hybrid-Kaninchen ähnlichen Alters (5,7 - 8,8 Monate). Die AMH-Messung wurde bei den intakten Kaninchen durch eine Bestimmung des Progesteron-Spiegels, eine gynäkologische Untersuchung und eine histopathologische Untersuchung der Gebärmutter bzw. der Eierstöcke ergänzt. Außerdem wurden die Follikel beider Ovarien klassifiziert und quantifiziert. Die AMH- bzw. Progesteron-Serumkonzentrationen wurden mit einem humanmedizinischen Chemilumineszenz-Immunoassay (CLIA) bzw. einem Enzyme-linked-Fluorescence-Assay (ELFA) gemessen. Abhängig von der jeweils gemessenen Progesteron-Konzentration wurden die sexuell intakten Tiere als scheinträchtig (Lutealphase; n = 12) bzw. nicht scheinträchtig (Follikelphase; n = 52) klassifiziert. Die mittleren AMH-Serumkonzentrationen der intakten und kastrierten Tiere betrugen 1,53 ng/ml (0,77 - 3,36 ng/ml) bzw. 0,06 ng/ml (≤ 0,01 - 0,23 ng/ml). Die AMH-Serumspiegel der intakten und kastrierten Kaninchen unterschieden sich signifikant und überschnitten sich nicht (P < 0,001). Bei einem Cut-off-Wert von 0,50 ng/ml ergab sich mittels ROC-Kurvenanalyse für den Assay eine Sensitivität und Spezifität von jeweils 100%. Follikel- oder Lutealphase hatten keinen signifikanten Einfluss auf die gemessenen AMH-Serumkonzentrationen (t = 0,061, df = 62, P = 0,951). Während die Anzahl der Sekundärfollikel signifikant mit den AMH-Serumspiegeln korrelierte (rs = 0,410, p = 0,001), war dies bei den Primär- und Antralfollikeln nicht der Fall (rs = 0,241, P = 0,055 bzw. rs = 0,137, P = 0,281).
Eine einzige Bestimmung der AMH-Serumkonzentration mit einem humanmedizinischen Chemilumineszenz-Immunoassay (CLIA) war ausreichend, um kastrierte, weibliche Kaninchen von intakten, weiblichen Kaninchen, unabhängig von der Zyklusphase, zu unterscheiden. Die Eierstöcke des Kaninchens scheinen, wie bei der Frau, der Hündin und der Katze, die Hauptquelle der AMH-Produktion zu sein. Der bei anderen Spezies beschriebene Zusammenhang zwischen kleinen, wachsenden Follikeln und den AMH-Serumkonzentrationen konnte teilweise bestätigt werden, da die Anzahl sekundärer Follikel signifikant mit den AMH-Spiegeln korrelierte.Anti-Müllerian hormone (AMH) is secreted almost exclusively in the male and female gonads. AMH can therefore be used as a diagnostic tool for the determination of the castration status. In the available literature, no research on serum AMH concentrations in female rabbits has been published so far. In the species of interest, knowledge about normal reference intervals and possible cycle-associated changes of serum AMH concentrations are required for its application in a clinical setting. The objectives of the present study were to measure serum AMH concentrations in female rabbits and to investigate the value of AMH as a diagnostic tool to differentiate between spayed and intact does. Furthermore, measured serum AMH concentrations were related to pseudopregnancy and ovarian follicle numbers.
For AMH measurement, serum samples were obtained from sexually intact (n = 64) and spayed (n = 22) female rabbits. Spayed does were of various breeds and ages (range 1.6 - 12.1 years); intact rabbits were Zika hybrid rabbits of similar ages (range 5.7 - 8.8 months). In the intact does, AMH measurement was complemented by determination of progesterone levels, gynaecological examination, and histopathologic evaluation of the uterus and ovaries, including follicle counts. Serum AMH and progesterone concentrations were measured using a human-based chemiluminescence immunoassay (CLIA) and an enzyme-linked fluorescence assay (ELFA), respectively. Depending on progesterone levels, sexually intact does were categorized as pseudopregnant (luteal phase, n = 12) or non-pseudopregnant (follicular phase, n = 52). Median serum AMH levels of intact and spayed does were 1.53 ng/ml (range 0.77 - 3.36 ng/ml) and 0.06 ng/ml (range ≤ 0.01 - 0.23 ng/ml), respectively. AMH concentrations between the intact and spayed rabbits differed significantly and did not overlap (p < 0.001). ROC curve analysis yielded a 100% sensitivity and specificity for the AMH assay at a cut-off level of 0.50 ng/ml. Whether does were in follicular or luteal phase had no significant influence on the measured serum AMH concentrations (t = 0.061, df = 62, p = 0.951). While the number of secondary follicles correlated significantly with AMH concentrations (rs = 0.410, p = 0.001), the number of primary or antral follicles did not (rs = 0.241, p = 0.055 and rs = 0.137, p = 0.281, respectively).
In conclusion, a single determination of serum AMH concentrations was adequate to distinguish spayed from intact female rabbits, regardless of luteal or follicle phase. As in women, bitches and queens, the does ovaries appeared to be the main source of AMH production. The relationship between small growing follicles and AMH levels as described in other species could be partly confirmed, as secondary follicles correlated significantly with AMH
Novel peptide probes for super-resolution microscopy and optimized DNA origami for cellular applications
Get PDFFluorescence microscopy is one of the most widely used techniques in the life sciences to observe cells, subcellular structures, single proteins and microorganisms due to the possibility of target-specific labeling and real-time imaging. However, conventional fluorescence microscopy is limited to a spatial resolution of ~200 nm due to the diffraction of light. This restrictive spatial resolution is insufficient for the observation of many biological structures with dimensions reaching only a couple of nanometers. In the last decades, fluorescence microscopy has seen a true revolution by the development of super-resolution techniques such as STED, PALM, STORM and PAINT that overcame the diffraction barrier.
More recently, DNA-PAINT was developed using the repetitive binding of dye-labeled DNA-based imager strands to complementary docking strands on target molecules. DNA-PAINT has become a straightforward method for super-resolution imaging of biological targets with an achievable resolution of <5 nm and offers spectrally unlimited multiplexing. However, DNA-PAINT fails to reach its true potential when it comes to cellular imaging due to the subpar performance of labeling probes with sizes often larger than 5 nm.
In the first part of this thesis, the programmability and transient binding nature of DNA-PAINT was translated to coiled coil interactions of short peptides for the development of Peptide-PAINT to address the issue related to probe sizes. The binding kinetics of different variations of one coiled coil pair was tested using a single-molecule imaging assay and the achievable spatial resolution was characterized on DNA origami structures (Publication I).
In the second part, a second coiled coil pair was introduced and proven to be orthogonal to the first coiled coil pair by performing single-molecule and DNA origami orthogonality assays. The novel coiled coil pair was tested as a small direct labeling tag in fixed cells and enabled super-resolution imaging of membrane proteins at the single-receptor level in 2D and 3D using Peptide-PAINT (Publication II).
In the third and final part of this thesis, the strand accessibility of disk-shaped 3D DNA origami structures was investigated. Here, the bottom side of the disk (facing the glass surface) was successfully imaged using DNA-PAINT with similar binding kinetics as the top side of the disk. Finally, all available functionalized handles of the disk were demonstrated to be accessible for DNA-PAINT imaging, despite the presence of a protective coating (Publication III)
Neuroimaging and psychophysiological markers of fear-related disorders
Get PDFFear-related disorders such as panic disorder, specific phobias, or post-traumatic stress disorder, are highly burdensome and prevalent, making research on their pathogenic mechanisms an imperative. One of the central etiologic models of fear-related disorders is that they arise and manifest based on differences in associative fear-learning mechanisms, presenting a unifying mechanism underlying currently distinct diagnoses. This suggests that capturing learning-related deficits indicates pathology and may thereby serve as an informative diagnostic biomarker. Importantly, no studies up to date have compared different psychophysiological readouts regarding their ability to index specific
fear-conditioning subprocesses with regard to fear-related pathology. Consequently, this thesis aimed at uncovering learning-related psychophysiological markers of fear-related disorders.
In the first study of this thesis, patients with fear-related disorders and healthy controls showed similar learning trajectories and there was also no evidence for a dimensional association between the severity of the disorder and learning or memory-related markers. In the context of an increasing number of studies reporting similar null findings, our results therefore question the diagnostic validity of the associative fear learning model of fear-related disorders.
In the second study of this thesis, patients with fear-related disorders and healthy controls were compared regarding their startle reflex, a basal measure of threat reactivity if probed in an aversive context. Patients with fear-related
disorders showed a significantly faster initiation of the startle reflex. As startle under threat depends on modulatory inputs of the amygdala and as shorter startle latencies were associated with smaller amygdala volumes, patients with fear-related disorders may be characterized by an increased readiness, or hyperarousal, of amygdala-modulated startle circuits.
The third study of this thesis investigated fear memory formation using an experimental trauma film paradigm in healthy participants, increasing the ecological validity of the classical fear conditioning setups used in the first two studies. There was no evidence for learning-related differences in predicting intrusion formation or loss of contextual memory, two core mnemonic symptoms of post-traumatic stress disorder. However, hippocampal deactivation towards highly aversive films predicted less severe intrusive memory formation. Such a distinct hippocampal stress-related signature may therefore be a correlate of adaptive stress signaling.
Together, the results of all three studies speak against learning-related differences as key characteristics of fear-related pathology and thereby against one of the dominant theories on the emergence and maintenance of fear-related disorders. Even if small differences in fear-conditioning existed, they would therefore be too small to be suited as a cross-diagnostic biomarker. Instead, results provide evidence for a sympathetic hyperarousal-account of fear-related disorders. Our findings therefore suggest a paradigm shift away from very specific fear-conditioning paradigms toward more basic fear-eliciting paradigms that prioritize the extraction of stable and reliable biological markers
