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Genic characterization of "Living Fossil" Latimeria menadoensis
No full textI celacantiformi sono fossili viventi che costituiscono il probabile anello mancante
tra pesci e tetrapodi. Ad oggi sono state identificate solo due specie superstiti di celacanti,
quella africana, Latimeria chalumnae, e la specie indonesiana, Latimeria menadoensis.
Due esemplari di Latimeria menadoensis, una femmina ed un maschio,
recentemente catturati nella parte settentrionale del mare di Sulawesi (Maggio 2007 e
Settembre 2009) sono stati analizzati in un progetto di collaborazione di ricerca tra
l’Università Politecnica delle Marche e la Sam Ratulangi University di Manado (Indonesia).
Il contenuto di DNA (C-value) di Latimeria menadoensis (3.47 pg/cell), misurato con
la citofluorimetria di flusso è molto prossimo ai valori del contenuto di DNA della Latimeria
chalumnae precedentemente riportati. La metilazione del DNA è stata valutata con
cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC): la percentuale di citosine metilate (5mC)
raggiunge l’1.25% e la percentuale di GC il 41.8%. Latimeria menadoensis presenta un
elevato C-value e un basso valore di metilazione rispetto a quelli degli altri pesci.
I geni 18S rDNA e l’istone 3 (H3) sono stati sequenziati ed analizzati a partire dal
DNA genomico. Le sequenze hanno confermato la stretta relazione evolutiva tra la specie
indonesiana e la specie africana. Entrambi i geni sono stati usati per costruire alberi
filogenetici in cui i due celacanti, L. menadoensis e L. chalumnae, appaiono vicini ai
tetrapodi. Inoltre, al fine di rendere l’analisi più precisa anche l’H3 di Protopterus
aethiopicus (un pesce polmonato africano) e di Polypterus senegalus (bichir) sono stati
determinati.
Per comprendere meglio le relazioni tra Latimeria ed i tetrapodi, inoltre, sono state
valutate le sequenze di due specifici mRNA, la vitellogenina AB (precursore del vitello) e
DMRT1 (un fattore di trascrizione coinvolto nel differenziamento sessuale). Gli alberi
filogenetici di queste due parziali sequenze di mRNA mostrano ancora la stretta relazione
tra L. menadoensis ed i tetrapodi.
Le sequenze del celacanto fanno luce su caratteristiche utili per decifrare i genomi
dei tetrapodi fornendo al contempo un punto d’osservazione privilegiato per indagare la
storia evolutiva
Caratterizzazione fenotipica, molecolare e proprietà immunoregolatorie delle cellule staminali mesenchimali
No full textLe cellule staminali mesenchimali (Mesenchymal Stem Cells, MSCs) sono una popolazione con
elevata capacità proliferativa e con potenziale di differenziazione multilineare; rappresentano,
quindi, delle buone candidate per la terapia cellulare e la medicina rigenerativa.
In questo studio sono state valutate MSCs fetali isolate da villi coriali (Chorionic Villi, CV) e da
liquido amniotico (Amniotic Fluid, AF), confrontandole con le MSCs ottenute da midollo osseo
(Bone Marrow, BM), per la capacità di crescita in presenza di siero umano allogenico (human
serum, HS) o di lisato piastrinico (platelet lysate, PL), per le caratteristiche immunofenotipiche, il
profilo di espressione citochinico e l’attività immunoregolatoria su linfociti allogenici stimolati e
sottopopolazioni immunoselezionate.
Data l’elevata potenzialità di espansione delle MSCs fetali, le cellule studiate sono state valutate per
la loro stabilità replicativa tramite lo studio della lunghezza dei telomeri, l’attività dell’enzima
telomerasi, l’espressione dei geni hTERT, c-myc e p53 e l’analisi del cariotipo.
Una popolazione omogenea di cellule fibroblastoidi positiva ai tipici marcatori di superficie
mesenchimali è stata isolata da tutti i campioni di CV ed AF analizzati. Le cellule di CV espandono
rapidamente in HS (20 raddoppiamenti di popolazione, PDs, in 59 giorni e 6 passaggi di coltura),
mentre in siero animale (fetal bovine serum, FBS) raggiungono 27 PDs in 65 giorni e 7 passaggi. Il
PL determina un’espansione nel 60% dei campioni CV, comunque minore rispetto a quella in HS. I
campioni di AF espandono, invece, 40 PDs in 90 giorni, ma solo nel 20% dei campioni analizzati,
non proliferano in PL, mentre in FBS espandono 28.5 PDs in 66 giorni.
Le cellule fetali studiate inibiscono la proliferazione di linfociti allogenici stimolati e regolano la
crescita anche di popolazioni linfocitarie selezionate CD4+ e CD8+.
Nonostante il loro elevato potenziale di espansione, le MSCs fetali studiate hanno mostrato una
lunghezza stabile dei telomeri durante la cultura a lungo termine, assenza dell’attività telomerasica,
nessuna espressione di hTERT, livelli costanti di espressione di c-myc e p53 e nessuna anomalia
cromosomica.
In conclusione, i risultati mostrano che i CV rappresentano un’ottima fonte di MSCs con proprietà
immunoregolatorie, capace di espandere in un sistema di proliferazione umanizzato a lungo termine
senza alterazioni genetiche. In più del 90% dei campioni di CV analizzati si ottiene un’espansione
su larga scala in presenza di siero umano, incoraggiante per potenziali applicazioni cliniche
Biosintesi della vitamina B3: studi strutturali e funzionali di isoenzimi nicotinamide mononucleotide adenililtrasferasi coinvolti nella protezione dalla neurodegenerazione
No full textLa Nicotinamide MonoNucleotide AdenililTrasferasi (NMNAT) è l’enzima chiave per la biosintesi del NAD+, sia nella via de novo che in quelle di recupero (salvage pathways). Nelle vie di recupero, l’NMNAT consente alla cellula di rigenerare il coenzima dalla vitamina B3 (niacina) o PP (Pellagra Preventing) assunta attraverso fonti esogene o ottenuta metabolicamente dalla degradazione intracellulare del dinucleotide stesso. Catalizzando il trasferimento dell’adenilato dall’ATP all’NMN, la forma mononucleotidica della vitamina B3, l’enzima porta alla formazione di PPi e NAD+. Il NAD+ è coinvolto nella cellula in vitali funzioni redox e non redox e la sua carenza è associata ad una vasta gamma di patologie nell’uomo, tra cui malattie neurodenegerative. È stato scoperto che la proteina chimerica WldS, proveniente da una mutazione spontanea sul cromosoma 4 nel ceppo murino C57BL/6J, è in grado di ritardare la degenerazione assonale. La porzione enzimaticamente attiva della proteina chimerica è l’omologo murino dell’enzima umano NMNAT1, una delle 3 isoforme note di NMNAT nei mammiferi che catalizzano la biosintesi del NAD+ in diversi distretti cellulari. Diversi lavori pubblicati hanno mostrato la capacità delle 3 isoforme di conferire protezione in varia misura, anche se non concordano su quale sia l’isoforma responsabile della protezione dalla neurodegenerazione. Per chiarire i meccanismi molecolari alla base del fenomeno sono state studiate proprietà cinetiche e molecolari delle 3 isoforme NMNAT note da mammifero. Tale studio ha permesso di mettere a punto un saggio di determinazione individuale della loro attività applicabile direttamente a estratti tissutali grezzi. Tale saggio consente di rilevare in maniera diretta le alterazioni a carico delle singole isoforme, già osservate in varie patologie cronico-degenerative riguardanti il sistema nervoso, nella pellagra e in stati patologici cellulari definiti “pellagra-like”, strettamente connessi alla carenza nutrizionale della vitamina PP
Characterization of a personal learning environment as a lifelong learning tool
No full textNegli ultimi anni, crescente attenzione è stata posta al Personal Learning Environment (PLE) come sistema efficace per i lifelong learners e al bisogno di integrazione di apprendimento formale ed informale. La presenza sul web di una gamma sempre più ampia di applicazioni open source e gratuite per l’apprendimento offre ai lifelong learners potenti strumenti per costruire e ca-
ratterizzare i propri PLE. Da un punto di vista tecnologico, questo cambiamento di prospettiva si manifesta in un web per l’apprendimento in cui l’informazione è distribuita in siti diversi. Tut-
tavia, il knowledge management diventa un problema pressante e la personalizzazione richiede il supporto della semantica applicata alle componenti sociali. Questa tesi è focalizzata sulla caratterizzazione dei PLE di lifelong learners adulti attraverso tools im-
pliciti ed espliciti di personalizzazione. Lo studio ha esplorato la sinergia di apprendimento for-
male ed informale nella costruzione dinamica del PLE di un lifelong learner. E’ stato creato il format SSW4LL (Social Semantic Web for Lifelong Learners) e il sistema SSW4LL, costruito su Moo-
dle 2.0 integrato con un meccanismo adattivo (attività condizionali) e alcuni tools di Social Semantic Web (Semantic MediaWiki, Diigo e Google+), è stato progettato, implementato e validato con successo come mezzo idoneo a fornire un ambiente di apprendimento personalizzato dinamica-
mente per il lifelong learner
Emotional mapping of museum augmented places
No full textIl mobile e ubiquitous learning è stato messo in relazione alle nuove tecnologie dell’informazione e della comunicazione che si trovano incorporate negli oggetti della vita quotidiana. Una varietà invisibile di strumenti integrati sono stati sviluppati e collegati a Internet. I confini tra apprendimento, gioco, simulazione o giochi di ruolo non sono chiaramente definiti. Ne consegue che anche una visita in luoghi di interesse culturale (es. musei, parchi archeologici, città storiche, trekking urbani ecc.), utilizzando uno smartphone o un tablet, potrebbe offrire un’esperienza educativa unica come descritto nelle sperimentazioni del format EMMAP (Emotional Mapping of Museum Augmented Places) presso il Museo Civico Archeologico "Giuseppe Moretti" di San Severino Marche, il Museo della Carrozza di Macerata e la passeggiata attorno alle mura urbiche di Macerata, per osservare la mostra “Poesia di Strada” in realtà aumentata.
EMMAP è un format didattico che mira a sviluppare pedagogie innovative, utilizzando la tecnologia portatile, combinata con i codici QR, il broadcast e la realtà aumentata. Questi strumenti sono utili alla creazione di ambienti mobili e ubiqui di apprendimento idonei al coinvolgimento emotivo dei partecipanti in situazione di apprendimento autentico
Selection and analysis of differentially expressed genes in the interaction between Fusarium and Verticillium wilt pathogens and eggplant carrying the Rfo-sa1 resistance locus introgressed from S. aethiopicum
No full textFusarium oxysporum f. sp. melongenae (Fom) e
Verticillium dahliae (Vd) sono funghi vascolari che
provocano ingenti danni alle coltivazioni di
melanzana sia in serra che in pieno campo. Il locus di
resistenza (Rfo-sa1) a Fusarium è stato introgresso da
S. aethiopicum in melanzana coltivata (Solanum
melongena). Lo studio degli effetti dell’espressione
della resistenza a Fusarium oxysporum sulla risposta
anche agli attacchi di Verticillium dahliae è stato
condotto prendendo in esame sia l’aspetto fenotipico
che l’aspetto molecolare. Sono state allestite diverse
prove di inoculazione fungina con cinque genotipi di melanzana, tre dei quali resistenti a Fom
(All96/6x1F59, All96/6 e 305-E40) e due sensibili a
Fom (1F59 e Tal1/1). I diversi genotipi sono stati
inoculati con sospensione conidica di Fom, Vd e
entrambi i funghi insieme con 5 differenti modalità.
L’andamento della malattia è stato valutato rilevando,
dopo 15, 22 e 30 giorni dall’inoculazione, l’indice di
progressione della malattia lungo il fusto (IESF) e
l’indice di alterazione fogliare (IAF). I risultati hanno
confermato nei tre genotipi possedenti il locus Rfosa1
di resistenza a Fusarium, c’è totale assenza di
sintomi in seguito ad inoculazione con Fom, e , fatto
molto più importante, che sintomi nelle inoculazioni
miste (Fom e Vd) sono risultati significativamente di
minore intensità per IESF e IAF rispetto a quella
con solo Verticillium, come osservato in lavori
preliminari. Per l’individuazione e lo studio dei geni
coinvolti nei meccanismi di interazione funghimelanzana
è stata utilizzata la linea All96/6x1F59.
Sono state applicate diverse tecniche molecolari:
PCR select, qRT-PCR e microarray. E’ stato estratto
l’mRNA da campioni di radice di melanzana
sottoposti a inoculazione con Fom, Vd e entrambi i
funghi contemporaneamente, più un’inoculazione con
acqua come controllo. sono state create tre librerie
sottrattive (una per ogni inoculazione considerata) a
cDNA utilizzando la tecnica PCR select, e il
confronto degli spot sui filtri Dot-blot ha permesso di
selezionare un totale di circa 1000 cloni come
differenzialmente espressi in seguito ad inoculazione.
Tutti questi cloni sono stati sequenziati e classificati a
livello funzionale. La selezione del gene GAPDH
(gliceraldeide fosfato deidrogenasi) come gene
housekeeping è stata piuttosto laboriosa. E’ stata
quindi svolta la valutazione dell’espressione,
mediante qRT-PCR, di cinquanta geni selezionati. Di
particolare interesse sono risultati alcuni geni
appartenenti alle categorie di meccanismi di difesa,
trasporto e metabolismo secondario. E’ stato poi
preparato e ibridato un chip microarray Combimatrix,
al fine di ottenere una panoramica più ampia sui geni
differenzialmente espressi in seguito a inoculazione
con i due funghi. I risultati dell’array sono stati
validati con la tecnica qRT-PCR. L’analisi
comparativa dei dati ottenuti dalle tre tecniche
utilizzate (SSH, array e qRT-PCR) ha permesso di
selezionare alcuni geni differenzialmente espressi in
seguito alle diverse inoculazioni. Questi geni, tutti
implicati ai meccanismi di risposta ai patogeni,
rappresentano il punto di partenza per l’impostazione
di studi di genomica funzionale
Rigenerazione e trasformazione mediata da A. Tumefaciens di una varietà di pesco Big Top e portinnesto GF677 per indurre la resistenza al virus della vaiolatura delle drupacee (PPU) con costrutti che inducono il silenziamento genico post-trascrizionale
No full textLe produzioni frutticole rappresentano un’importante settore produttivo per il mercato dell’area del Mediterraneo. Questo risulta spesso essere penalizzato da problemi di carattere fitopatologico con consistenti ripercussioni sulla produzione, sulla qualità e nei relativi costi. La trasformazione genetica di piante da frutto offre enormi potenzialità per il miglioramento della produzione, della qualità e per l’ottenimento di cultivar con maggiore resistenza ai patogeni.
Lo scopo della ricerca è stato quello di sviluppare efficienti protocolli di trasformazione e rigenerazione da applicare ad una varietà ed ad un portainnesto di pesco. La trasformazione genetica è stato effettuata adattando ed ottimizzando il metodo già sviluppato su due cultivar di uva da tavola (Thompson senza semi e Silcora) da Mezzetti nel 2002. Questo metodo si basa sulla produzione in vitro di ammassi meristematici ad elevata capacità di differenziare i germogli avventizi tramite organogenesi. Da questi ammassi vengono preparate delle piccole fettine da utilizzare per la trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens di una varietà di pesco (Big Top) e di un portainnesto (GF677). La selezione dei putativi transgenici è stata eseguita su appropriati substrati, contenenti l’agente di selezione (Kanamicina) a concentrazioni crescenti (50 mg l-1, 75 mg l-1 and 100 mg l-1). I tessuti in selezione ogni 20 giorni ( due passaggi per ogni concentrazione) sono stati trasferiti su nuovi substrati al fine di ottenere una selezione più efficiente.
Il metodo ha previsto l’utilizzato di costrutti genici che inducono il silenziamento genico post-trascrizionale al fine di indurre la resistenza al virus (PPV) e studiarne la funzione genetica. Inoltre per velocizzare la fase di screening dei germogli ed osservarne il loro sviluppo in vitro, durante le fasi di selezione, sono state effettuate delle trasformazioni utilizzando un nuovo costrutto sfruttante la capacità della proteina fluorescente verde (GFP).
Dopo aver effettuato le analisi molecolari (PCR) e lo screening con UV non sono risultate piante trasformate anche se con il costrutto (GFP) 4 linee sono risultate positive alle analisi PCR utilizzando la coppia di primer disegnati sul gene nptII ma nessuna utilizzando la coppia di primer disegnati sul gene della GFP
Utilizzo energetico della biomassa ligno-cellulosica ottenuta da Dichrostachys cinerea in processi di termodecomposizione
No full textIl presente lavoro di ricerca esamina la possibilità di utilizzo energetico della biomassa forestale,
ottenuta da Dichrostachys cinerea specie attualmente considerata infestante nell’isola di Cuba, e
vuole contribuire ad una maggiore conoscenza delle caratteristiche delle biomasse di origine
forestale come fonte di energia rinnovabile, in processi di termodecomposizione.
Inizialmente, lo studio ha previsto la determinazione delle principali caratteristiche fisico-chimiche
per l’utilizzo energetico di D. cinerea in modo da valutarne l’idoneità a processi di decomposizione
termica. Inoltre, è stata studiata la cinetica di devolatilizzazione del materiale attraverso un’analisi
termogravimetrica e sono stati determinati i principali parametri, cioè temperature e velocità di
conversione.
Dai dati ottenuti da analisi termogravimetriche dinamiche, a diverse velocità di riscaldamento, in
atmosfera ossidante (ossigeno) ed inerte (azoto), è stato fatto uno studio cinetico ed una
modellazione simultanea per i processi di pirolisi e combustione, basato su un meccanismo
rispettivamente, a tre e quattro reazioni parallele. Il modello cinetico proposto è in grado di
prevedere le curve di decomposizione per entrambi processi con un errore inferiore al 5%.
Numerosi esperimenti di torrefazione sono stati eseguiti in un reattore semi-continuo seguendo un
disegno fattoriale 22. Le variabili indipendenti studiate sono state temperatura e tempo, mentre
come variabile di risposta è stata misurata la percentuale di solido ottenuto. I risultati hanno
mostrato che la temperatura ha un effetto quattro volte maggiore del tempo di torrefazione. Infine è
stato possibile verificare che il materiale torrefatto ottenuto presenta migliori caratteristiche come
combustibile in confronto alla biomassa di partenza.
Con i dati a disposizione è stata fatta una simulazione di un ipotetico impianto per generare energia
elettrica della potenza di 19 MW, utilizzando come combustibile D. cinera in forma di biomassa o
come materiale torrefatto. Il materiale sottoposto a trattamento termico ha mostrato maggiori
benefici energetici e ambientali
Progettazione di stampi in conglomerato cementizio per il processo di stampaggio ad iniezione di materiali plastici
No full textObiettivo della tesi, è la progettazione di uno stampo per stampaggio ad iniezione di materiali plastici da realizzare utilizzando miscele di conglomerato cementizio. Questa tecnica innovativa consiste nel realizzare lo stampo gettando il conglomerato direttamente su un modello del particolare plastico da realizzare evitando così molte lavorazioni meccaniche connesse alla costruzione di uno stampo metallico e abbassando così i costi di produzione. Dopo una lunga fase preliminare di simulazione numerica del processo di stampaggio necessaria per una prima verifica di applicabilità della tecnica, sono stati realizzati due prototipi utilizzando due differenti miscele di conglomerato; queste miscele sono state gettate in una forma realizzata in pvc contenente il modello, che in entrambi i casi è un cuneo ferma ruote. Sono stati ottenuti ottimi risultati per la finitura superficiale, sebbene dal primo prototipo non sia stato possibile estrarre il modello del cuneo, mentre nel secondo si è visto che a stampo caldo, quindi come nelle reali condizioni operative, tali problemi non si presentano. Dalle misure della conduttività termica è emersa una sufficiente capacità di scambio termico, questo incide molto sui tempi macchina; nonostante questi siano raddoppiati rispetto a quelli standard, questa nuova tecnica realizzativa risulta ancora economicamente conveniente. I valori delle tensioni massime di rottura misurati nelle prove di resistenza meccanica sono di un ordine di grandezza inferiore a quelli dei metalli, e ciò comporta un aumento delle dimensioni degli stampi in cemento rispetto a quelli tradizionali al fine di resistere agli stessi carichi. Concludendo; la facilità di esecuzione, il basso costo dei materiali utilizzati, la semplicità con cui si possono riprodurre forme anche complesse con ottime finiture superficiali, rendono questa tecnica economicamente molto vantaggiosa: dagli aspetti valutati e dalle misure effettuate è emerso che essa è applicabile sebbene da affinare
Mutazioni germinali di geni correlati alla Sindrome di Lynch
No full textLa Sindrome di Lynch (anche chiamata Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer,
HNPCC) è il termine usato per indicare la predisposizione genetica a sviluppare il tumore
del colon-retto non poliposico e, in misura minore, in altri distretti.
La sindrome di Lynch è trasmessa con modalità autosomica dominante a penetranza
incompleta, e rende conto del 5%-10% di tutte le neoplasie del grosso intestino. A livello
molecolare, la sindrome di Lynch è correlata a mutazioni germinali di uno dei geni che
caratterizzano il MMR (MisMatch Repair), un complesso multienzimatico preposto alla
riparazione degli errori di replicazione del DNA e che svolge un ruolo fondamentale nel
mantenimento della stabilità dell’informazione genetica. I geni coinvolti nel sistema del
MMR, presumibilmente implicati nella sindrome di Lynch finora identificati, sono:
MLH1 (3p21), MLH3 (14q24.3), PMS2 (7p22), MSH2 (2p22), MSH3 (5q11) e MSH6
(2p16); di questi MLH1 e MSH2 rappresentano quelli più frequentemente mutati con un’
incidenza pari al 50 e 40 %.
L’identificazione dei soggetti candidati allo studio si è basata sulle caratteristiche
dell’anamnesi familiare e sulle linee guida di Bethesda, riviste nel 2003.
Lo studio della sequenza nucleotidica di tutti gli esoni dei geni MLH1, MSH2 e MSH6 è
stato effettuato tramite sequenziamento diretto, usando un sequenziatore automatico a
capillare e MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification).
Fino ad oggi, sono entrati in studio 313 pazienti, di cui 181 donne e 132 uomini, con un’età
mediana di 48 anni (range 16-85). Sono state identificate 11 diverse mutazioni di MLH1 in
19 pazienti differenti, di cui 7 missenso, 1 silente e 3 mutazioni nel sito di splicing. Nel gene
MSH2, sono state individuate 16 diverse mutazioni germinali in 24 pazienti: 8 di tipo
missenso, 3 mutazioni frameshift, 2 mutazioni non-senso, 1 nel sito di splicing e 2
riarrangiamenti genici, quest’ultimi rilevati tramite MLPA. A carico del gene MSH6 sono
state trovate 4 diverse mutazioni germinali in 5 pazienti: 2 mutazioni missenso, 1
frameshift e 1 mutazione non-senso. L’analisi genetica è stata inoltre estesa a 69 soggetti
sani, appartenenti a famiglie in cui è stata riscontrata una mutazione nei geni MLH1,
MSH2 o MSH6, per identificare i portatori sani della mutazione ed avviarli a programmi di
screening. Ventisette dei 64 soggetti analizzati sono risultati portatori del difetto
molecolare individuato nella famiglia, mentre 37 soggetti sono risultati negativi per la
mutazione caratteristica della famiglia di appartenenz