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Micro particle image velocimetry: application to a micro flow chamber for endothelial cells
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Formulazione di un nuovo modello Symmetrical condensed Node (SCN) - Transmission Line Matrix (TLM)
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Studio analitico-numerico delle grandezze idrodinamiche che generano trasporto di sedimenti in interventi di ripascimento emerso e sommerso
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Human NAD metabolism regulation: kinetic, functional, regulatory and structural characterization of nicotinate phosphoribosyl transferase (NaPRT)
No full textL’enzima nicotinato fosforibosiltranferasi (NaPRT), coinvolto nella prima reazione della via di Preiss-Handler per la biosintesi della nicotinammide adenindinucleotide (NAD), catalizza la conversione del nicotinato (Na) in Na mononucleotide (NaMN). L’importanza della NaPRT nel metabolismo del NAD è dimostrato dal fatto che, nelle cellule renali embrionali umane, l’aggiunta di Na aumenta sensibilmente il livello intracellulare di NAD, che non mostra un’inibizione a feedback nei confronti dell’enzima (1).
Viene qui descritta la caratterizzazione enzimatica della NaPRT umana.
La proteina è stata espressa nelle cellule BL21 (DE3) di Escherichia coli e purificata in omogeneità con cromatografia di affinità tramite resina Ni-NTA. Sono stati successivamente determinati i principali parametri cinetici della NaPRT. L’enzima segue una cinetica del tipo Michaelis-Menten con un meccanismo di reazione random. Inoltre, la Km del Na e il PRPP è risultata essere di 44 e 22 M, rispettivamente e la Vmax ha un valore di 0,012 U/mg, anche se in presenza di Pi aumenta fino a 0,3 U/mg. L’ATP sembra svolgere un duplice effetto sull’enzima: a basse concentrazioni di substrato (fino a 80 M) ha un effetto di stimolazione dell’attività, mentre a concentrazioni saturanti dei substrati (1 mM) il nucleotide funge da inibitore.
Oltre alla caratterizzazione cinetica, è stato investigato l’effetto di vari metaboliti sull’attività della NaPRT. Come atteso, NAD e NaAD, insieme a NMN e NaMN, non hanno effetto sull’enzima, mentre il piruvato e il diidrossiacetonfosfato producono un effetto stimolatorio. Al contrario, numerosi metaboliti coinvolti nel metabolismo del glucosio e degli acidi grassi inibiscono l’enzima, facendo ipotizzare una regolazione in vivo della sintesi del NAD dipendente dalla NaPRT da parte di questi composti.
Inoltre, per meglio comprendere il ruolo di residui altamente conservati all’interno della struttura primaria della proteina, sono stati effettuati studi di mutagenesi sito-diretta. Si è determinato che, le mutazioni che hanno coinvolto i residui situati nel dominio / barrel dell’enzima, diminuiscono fortemente l’attività enzimatica, se confrontata con i valori della proteina wild-type.
La NaPRT umana è stata inoltre co-cristallizzata in presenza dell’inibitore enzimatico Acetil-CoA, usando come principale precipitante PEG 4000. I cristalli ottenuti utilizzando radiazioni al sincrotrone all’ ESRF (Grenoble, Francia) mostrano diffrazione con una risoluzione maggiore di 3.0 Å e sono in corso studi di ottimizzazione per ottenere cristalli utili per la determinazione cristallografica.
In attesa dell’ottenimento della struttura cristallografica, è stata predetta la struttura 3D dell’enzima attraverso l’homology modeling ed il modello ottenuto è stato utilizzato per condurre simulazioni di docking molecolare al fine di identificare i residui coinvolti nel riconoscimento e nella stabilizzazione dei ligandi