EKE Repository of Publications

Kiss, Attila

Petrusán, János

Forgó, Péter

ATTILA KISS*, JÁNOS PETRUSÁN, PETER FORGO
REVEALING TRANSFORMATION PATHWAYS AND
DEGRADATES OF INULINE BY NEW ELSD-METHOD
Abstract: Within current experimental report a newly developed high per-
formance liquid chromatography (HPLC) method for the measurement of pure
inulin and its thermaly degraded derivatives using evaporative light scattering
(ELS) detection is proposed. The fructan composition has been characterised by
a chromatographic method developed after several optimizations of sample
preparation procedure and apparatus. The procedure contains a direct detection
of native and thermally treated inulin/fructooligosaccharide components after
dissolving samples in water at room temperature and by detecting their chain-
distribution with the use of HPLC coupled with ELS detection. The thermal
treatment procedures were selected from 150oC up to 230oC (10 oC increments
each sample) in order to determine the ideal heating temperature and treating
period for preserving inulin's oligomeric or/and polymeric structure. The method
is accurate, simple and without interferences from the detectable signals of
mono- and disaccharides as thermal decomposition products of inulin. The ana-
lytical procedure makes it unnecessary to use artificial hydrolysis of the macro-
molecule.
Key words: inulin, HPLC, evaporative light scattering detection, degradates,
thermal treatment, carbohydrate polimers
Introduction
Inulin-type fructans can be found in more than 36.000 plant species and they
might be regarded as the most abundantly occurring carbohydrates the in nature
following starch.1 Inulin is a polydisperse substance with linear chains contain-
ing fructose monomers having a terminal glucose moiety. The number of fruc-
tose monomers is typical for the plant produicing inulin. The chain length of
inulin varies from 3 to 65 monomer molecules in chicory root with an average
degree of polymerisation (DP) of 10.2
Inulins with a terminal glucose are known as alpha-D-gluco-pyranosyl-[beta-
D-fructo-furanosyl](n-1)-D-fructo-furanosides (or fructo-oligosaccharides), which
are abbreviated GpyFn. Inulins without glucose are beta-D-fructo-pyranosyl-[D-
Eszterházy Károly College, EGERFOOD Regional Knowledge Centre, Leányka str. 6., H-3300, 
Eger, Hungary. Correspondence to Dr. Attila Kiss: attkiss@ektf.hu
37
fructofuranosyl](n-1)-D-fructo-furanosides (or inulo-oligosaccharides), abbre-
viated as FpyFn. Letter n refers to the number of fructose residues in inulin; py is
the abbreviation for pyranosyl, the simplest structural formulas are shown in
figure 1.3, 4 In contrast to the previously applied sample preparation methods
(solution in hot water and filtering), comparison of distinctive protocols has been
performed. Throughout this study inulin powder-samples of Chicorium intybus
L. (chicory), Dahlia species (dahlia), Helianthus tuberosus (Jerusalem artichoke)
were treated in parallel at 8 different temperature values for 9 distinctive time
periods. Thermal treatments were carried out from 150 oC up to 230 oC (10 oC
increments each sample) in order to characterise the thermal degradation of in-
ulin and determine all the produced oligo- and polymers.5, 6 7
GFn Fn
n-1
HO
OH
n-2
Figure 1. The structure o f inulin, n or m equal to the number offructose units,
G= glucose, F=fructose.
Relevance of the studies is enhanced by the fact that major prebiotic effect
might be attributed to fructans depending substantially on their degree of poly-
merization.8, 9 Up to now by using GC, HPLC (High Performance Liquid Chro-
matography) with RI or PAD techniques average polymerisation degree of inulin
was found to be 20. Isolation and identification of fructan oligomers has been
accomplished between DP2-DP42 so far. The aim of the work was to obtain in-
terpretable chromatographic data of non-heated inulin and its decomposition
products, and to reveal the degradation pathways by altering the heating temper-
ature and heating period of inulin. This was accomplished by an accurate, new
and simple method achieved by detecting the after-treatment arising degradates
38
and measuring their quantity using HPLC and ELS (evaporative light scattering)
detection. On the other hand structural comparison of the degradates led to clear
comprehension of the thermal transformation process.
Experimental procedure
High purity nutritional inulin powder was obtained from Sensus (Roosendaal,
The Netherlands). Chicory inulins for chemical use were from Sigma Aldrich
(Steinheim, Germany) and Fluka, (Buchs, Switzerland), medium chain nutrition
grade chicory and artichoke inulins were obtained from Sensus (Roosendaal,
The Netherlands), Orafti (Belgium) and from Ökoszervíz Kft. (Szentendre,
Hungary). Chemical reagents used for chromatography were from Merck
(Darmstadt, Germany). High purity 1-kestose, 1,1-kestotetraose, 1,1,1-
kestopentaose were obtained from Noack Group of Companies (Vienna, Austria)
for the identification of low-molecular weight oligomers. The sample prepara-
tion procedure was carried out without previous enzymatic or chemical hydroly-
sis of powder samples. The chromatographic detection was carried out by using
ultrahigh-purity water and acetonitrile as gradient mobile phases. The liquid
chromatography was carried out using a HPLC system consisting of a SIL-20A
autosampler, an LC-20AB binary pump, a DGU-20A3 degasser, a CBM20A
communication module, a CTO-20A column chamber all from Shimadzu Manu-
facturing Inc. and a Prevail Carbohydrate column (250mm x 4,6 mm, 5pm) from
Altech Association Inc. (Deerfield, Ireland). All inulin samples were treated at
all the nine heating temperatures and expositional times. Inulin samples (0.8
grams) were placed in opened glass vials and have been heated in an oven at
temperatures shown in table 1. Sample preparation resumed only to water disso-
lution and filtering the samples. 10 ml of hot (85oC) ultra-high purity water was
added to the inulin samples, the solutions were sonicated for 60 minutes and
syringe filtered (0.45 pm, nylon) into a glass autosampler vial for injection,
standard solutions were prepared using low-molecular weight oligomers. Detec-
tion and identification of inulin thermal degradates of standard oligomers were
performed by the above mentioned method using a PL-ELS-2100 evaporative
light scattering liquid chromatographic detector. Injection volume was 8 pl of
samples containing 80 mg carbohydrate per 1 ml ultra-high pure water. The flow
rate of the eluent was 0.4 ml/min. 112 minutes were needed for complete separa-
tion for control (non-heated) inulin samples and 77 minutes for the heated sam-
ples with a gradient mobile phase of acetonitrile-water (initial rate: 88/12).
39
Table 1. Temperatures of the thermal treating and exposition times.
Heating temperature, oC Time of exposition, min
150 22,5
160 20,0
170 17,5
Inulin samples
180 15,0
190 12,5
200 10,0
210 7,5
220 5,0
230 2,5
Results and discussion
In order to investigate the pathways of thermal degradation and its impact on
initial structure of inulins, chromatographic separation of control (non-heated)
inulin samples were also performed. By applying high-performance liquid-
chromatography coupled with evaporative light scattering detection of the non-
heated sample (Figure 2.) oligo-, and polymer derivatives were separated effi-
ciently ranging from DP3 up to DP31. Fructooligosaccharide standards are only
available from 3 to 5 DPs, while the upper fructan oligomers appeared in the
complex polymeric chromatograms were also identified and isolated. From alte-
ration of retention times and molecular weights exact number of fructose units
might be concluded. The applied method resulted in a chromatogram with solid
evidences on the DPs of specific components. The principal fructo- oligosaccha-
rides are well known and relevant peak IDs were confirmed by using the stan-
dards mentioned above (Figure 3.). The homologue peaks can be assigned as
being the chromatographic signals of carbohydrate oligomers increased by one
fructose unit (Figure 4.).
40
F igure 2. ELS detected HPLC chromatogram o f non-heated, control inulin sample.
c
b
Figure 3. HPLC signals o f the three known standards (a: trimer, RT: 41.86 min.; b:
tetramer, RT: 43.97 min.; c: pentamer, RT: 45.58 min.).
41
d____________________l
c 1
b 1
F igure 4. HPLC Data Comparison o f the three known standards and heated inulin at
180 oC (a: heated inulin, b: trimer, c: tetramer, d: pentamer)
The chromatograms of heated samples (Figure 5.) provided with relevant in-
formation on the degradation of the oligo-derivatives. In cases of the heated
samples the increased occurrence of thermally degraded derivatives is propor-
tionally correlated with the temperature. It was clearly observed that the chroma-
tographic signals of products having lower polymerisation degree were enhanced
with increased extent of thermal treatment, meanwhile higher polymers com-
pletely disappeared (Figure 5.). During heating experiments fructose and glucose
content remained unchanged. Only saccharose level was slightly raised with the
increase of time-interval and temperature of the applied thermal treatment.
b
Figure 5. Data comparison o f „Intact” and heated inulin
(a: control; b: 180 oC; c: 210 oC).
42
Conclusions
It can be concluded that intense thermal treatment of inulin leads to decrease
of the amount of „intact” inulin from Cichorium intybus L. Degradation process
could be well observed in the chromatograms of the heated samples. Fructan
oligomers appeared in the chromatograms were isolated and identified.
Accurate structural information of oligo-and polymer derivatives (from DP3
up to DP31) were obtained by applying high-performance liquid-chromato-
graphy coupled with evaporative light scattering detection. From alteration of
retention times and molecular weights exact number of fructose units might be
concluded.
One of the most important conclusions of the experiments is that fructans
with or without thermal treatment may be directly determined without previous
enzymatic or chemical hydrolysis with the application of a simple sample prepa-
ration procedure avoiding usage of harmful chemicals and complex extraction
processes. Thus, HPLC-ELS might be regarded as a very powerful tool of fruc-
tan detection as its resolution power is able to separate each degree of polymeri-
sation within macromolecule of inulin.
Acknowledgements
This work was financially supported by the Pázmány Péter Program (RET
09/2005) financed by Hungarian National Office on Research and technology.
References
1. Schmid, A., Dordick, J. S., Hauer, B., Kiener, A., Wubbolts, M., & Whitholt, B.:
Industrial biocatalysis today and tomorrow. Nature, 2001, 409, 258-268.
2. Ronkart, S. N., Blecker, C. S., Fourmanoir Hélene, Fougnie, C., Deroanne, C., Van Herck
J.-C., Paquot J.: Isolation and identification of inulooligosaccharides resulting from 
inulin hydrolysis., Analytica Chimica Acta, 2007.07.073, ACA 228629
3. Kang, S. L., Chang, Y. I., Kim, K. Y., Kim, S.I.: Agricultural Chemistry and Biotech-
nology, 1999, 42, 166.
4. Tanaka, M., Nakajima, Y., Nishio, K.: Japanese Carbohydrate Chemistry 12, 1993, 49-62.
5. Ponder, G. R., Richards, G. N.: Pyrolysis of inulin, glucose, and fructose. Carbohydr.
Res., 1993, 244: 341-59.
6. Blize, A. E., Manley-Harris, M., Richard, G. N.: Di-D-fructose dianhydrides from the
pyrolisis of inulin. Carbohydr. Res., 1994 265: 31-39.
7. Böhm A., Kaiser, I., Trebstein, A. and Henle, T.: Heat-induced degradation of inulin.
Eur. Food Res. Technol., 2004, 220: 466-471.
8. Böhm, A., Kleessen, B., Henle, T.: Effect of dry heated inulin on selected intestinal
bacteria. Eur. Food Res. Technol., 2005, 222: 737-740
9. Roberfroid, M. B.: Functional foods: concepts and application to inulin and oligofruc-
tose. British Journal of Nutrition, 87 (Suppl. 2), 2002, S139-S143.
43


Revealing transformation pathways and degradates of inuline by new ELSD-method

Kovács, Zoltán

Varga, János

Dudás, György

K O V Á C S  Z O L T Á N * -  V A R G A  JÁNOS** -  D U D Á S  GYÖRGY***
ADATOK A KAZÁRI VÍZVÖLGY PÓKFAUNÁJÁHOZ
Abstract: Our examination area lies near Kazár village, „Vízvölgy” Karancs 
Medves Landscape protection area. Analysing zoological collection of 
intervertebrates 29 spider species of 7 spider families were gathered.
Bevezetés és célkitűzések
Vizsgálataink során a kazári Vízvölgy gerinctelen faunáját mértük fel. Jelen 
munkában a felmérések pókfaunisztikai eredményeit közöljük.
Mintavételi terület
Vízvölgy térsége Kazár község (Nógrád megye) külterületén észak-nyugati 
irányban, a Bélatelep-erdő és a Forgó-domb között, a települést Salgótarjánnal 
összekötő 013-as közút két oldalán található (1. ábra), nevét a völgyön végigfo-
lyó patakról kapta (DORNYAI,. 1944). A területet korábban szántóföldként, egy 
részét kenderföldként, majd legelőként hasznosították. Mára a rendszeres legel-
tetés is megszűnt.
A terület gerinctelen faunájáról LANTOS (2003) közöl adatokat. A mintavételi 
terület flórájának ismertetéséhez SRAMKÓ, G. (2008.) vizsgálatait használtuk fel. 
A társulások elkülönítése a Nemzeti Biodiverzitás-monitorozó Rendszer II. „A 
magyarországi élőhelyek leírása, határozója és a Nemzeti Élőhely-osztályozási 
Rendszer” (FEKETE et al, 1997) alapján történt. A mintavételi területen két gyűj-
tőhely került kijelölésre.
1. gyűjtőhely: D-DNy-i kitettségű, gyomos üde gyeptársulás (Á-NÉR kód 
O8.) Felhagyott, erősen cseijésedő egykori legelő, amelyen a pusztai csenkesz 
(Festuca rupicola), a cérnatippan (Agrostis capillaris) és a keskenylevelű perje 
domináns. A bolygatott -  vaddisznók által feltúrt -  helyeken pionír és gyomfa-
jok szaporodtak fel. A gyep fiziognómiáját a zárt füves gyep és a nyíltabb foltok 
váltakozása jellemzi. A fás szárúak közül a Rosa canina sl., a fagyal (Ligustrum
vulgare), az egybibés galagonya (Crataegus monogyna), a kökény (Prunus
spinosa) és a vadkörte (Pyrus pyraster) fokozódó jelenléte eredményezi a terület 
cserjésedését.
*
**
***
3127 Kazár, Diófau. 41.
Eszterházy Károly Főiskola Állattani Tanszék, 3300 Eger, Leányka út 6. 
Bükki Nemzeti Park Igazgatóság, 3304 Eger, Sánc út 6.
67
2. gyűjtőhely: Északi kitettségű domb- és hegyvidéki gyomos száraz gyep-
társulás (Á-NÉR kód: O7). Rendszeresen leégetett, a helyi lakosság által idősza-
kosan legelőként hasznosított terület. A gyűjtési időszak alatt a leégetés elma-
radt. A korábbi években történt leégetések hatása ma is fellelhető. Ezeken a ré-
szeken a növényzet homogénebb összetételű, uralkodó faj a cérnatippan. Kisebb 
jelentőségű, de szintén jellemző faj a pusztai csenkesz. A területen kevesebb a 
zavarástűrő gyom, és kisebb mértékű a cserjésedés. A fás szárú növényeket a 
Rosa canina sl, kökény, fagyal és a csertölgy (Quercus cerris) képviselik.
A gyűjtőhelyek társulásainak egyike sem tekinthető tipikusnak, de jól lefedik 
karakter és domináns fajaikban a megadott társulásokat.
1. ábra: A mintavételi területek elhelyezkedése
Anyag és módszer
A mintavételeket 10 centiméter szájátmérőjű, 0,5 liter űrtartalmú élvefogó ta-
lajcsapdákkal végeztük. Összesen húsz (gyűjtőhelyenként 10-10) csapdát he-
lyeztünk ki a II-es gyűjtőhelyen random, míg az I-es gyűjtőhelyen csoportos 
elhelyezésben (3-3-4 csapda). A mintavételeket a 2007. március 18-tól 2008. 
március 15-ig folytattuk. A talajcsapdákat kéthetente helyeztük ki, majd 48 óra 
elteltével gyűjtöttük be. A begyűjtött egyedeket 75%-os etil-alkoholban tároltuk, 
a határozást LOKSA, I. (1969, 1972), NENTWIG, HÁNGGI, KROPF & BLICK (Vers-
ion 8. 12. 2003) alapján végeztük. A pókok elnevezése NORMAN I. PLATNICK 
(2009) alapján történt. A gyűjtött anyag az Eszterházy Károly Főiskola Állattani 
Tanszékén van elhelyezve.
68
Eredmények
A gyűjtések során 7 pókcsalád 29 faját gyűjtöttük be az egyedszám183 (1. 
táblázat). Védett faj a gyűjtések során nem került elő. Legnagyobb arányban 
(80,8%) a farkaspókok (Lycosidae) kerültek elő a területről, miként az a csapdá- 
zási módszerek alapján várható is volt. A farkaspókok talajon mozgó, aktív va-
dászok, talajcsapdás gyűjtések során a begyűjtött anyag jelentős tömegét adják.
1. táblázat. A kazári Vízvölgy területén gyűjtött pókfajok listája.
Gyűjtőhely/faj 1. gyűjtőhely 2. gyűjtőhely
Araneidae
Agalenatea redii (Scopol i, 1763) juv. 1
Argiope bruennichi (Scopol i, 1772) 1
Cercidia prominens (West r ing, 1851) juv. 1
Tetragnathidae
Pachygnatha degeeri (Sundeva l l , 1830) 1
Lycosidae
Alopecosa_accentuata (La t r eil l e, 1817) 3 1
Alopecosa cuneata (Cl er ck, 1757) 6 13
Alopecosa inquilina (Cl er ck, 1757) 2 4
Alopecosa pulverulenta (Cl er ck, 1757) 3
Alopecosa trabalis (Cl er ck, 1757) 10 6
Aulonia albimana (Wa l ckena er , 1805) 3 2
Pardosa agrestis (West r ing, 1861) 1
Pardosa alacris (C.L. Koch, 1833) 1
Pardosa amentata (Cl er ck, 1757) 1
Pardosa bifasciata (C.L. Koch, 1834) 2
Pardosa paludicola (Cl er ck, 1757) 8 7
Pardosa riparia (C.L. Koch, 1833) 19 30
Trochosa ruricola (De Geer , 1778) 1
Trochosa terricola (Thor el l , 1856) 21 4
Pisauridae
Pisaura mirabilis (Cl er ck, 1757) juv. 7 3
Gnaphosidae
Zelotes latreillei (Simon, 1878) 1 1
Zelotes petrensis (C.L. Koch, 1839) 1 1
Drassyllus pusillus (C. L. Koch, 1833) 1
Philodromidae
Thanatus formicinus (Cl erck, 1757) 2
Thomisidae
Ozyptila scabricula (West r ing, 1851) 1
Xysticus acerbus Thor el l , 1872 1
Xysticus audax (Schr a nk, 1803) 1
Xysticus bifasciatus C.L. Koch, 1837 1 8
Xysticus cristatus (Cl er ck, 1757) 1
Xysticus kochi Thor el l , 1872 1
Összesen: 90 93
69
Irodalomjegyzék
Dr . Do r n y a i, B. (1944): - A Nógrád megyei Kazár helynevei. Keszthely.
Fe k e t e , G., Mo l n á r , Zs ., Ho r v á t h , F. (1997): Nemzeti Biodiverzitás-monitorozó 
Rendszer II. A magyarországi élőhelyek leírása, határozója és a Nemzeti Élőhely-
osztályozási Rendszer. Budapest, Magyar Természettudományi Múzeum 
La n t o s , I. (2003): Nógrádi Értékekért. II. évf. 1. füzet -  A Karancs-Medves Tájvédelmi 
Körzet védett ízeltlábú fajai. Salgótarján
Lo s k a , I. (1969, 1972): Pókok I-II. Araneae I-II. -  In: Magyarország Állatvilága (Fauna 
Hungariae), 18. (ed.): (3). Akadémia Kiadó. Budapest.
Ne n t w ig , W., Ha n g ii, A., Kr o pf , C.,Bl ic k , T.(2003): Spinnen Mitteleuropas. Version 
8.12.2003 http://www. araneae.unibe.ch
Pl a t n ic k , N. I. (2009): The World Spider Catalog, Version 9.5. The American Museum 
of Natural History, online at
http://research.amnh.org/entomology/spiders/catalog/index. html 
Sr a m k ó , G. (2006): Nógrádi Értékekért. III. évf. 2. füzet -  Képek a Mátra hegység Nóg-
rád megyei részének növényvilágából. Salgótarján
70


Adatok a Kazári Vízvölgy pókfaunájához

Vajda, Zoltán

Sentimental Ambiguities and the American Founding

Müller, Anetta

Széles-Kovács, Gyula

Seres, János

Bocz, Árpád

Hajdu, Pál

Sütő, László

Szalay, Gábor

Szabó, Béla

Juhász, Imre

A sporttáborok szerepe az Eszterházy Károly Főiskolán

Étkezési szokások az Eszterházy Károly Főiskola sportszakos hallgatói körében

Szalay, Zsófia

Honfi, László

A kétciklusú testnevelő tanárképzés előzményei és tapasztalatai az Eszterházy Károly Főiskolán

Bíró, Melinda

Hidvégi, Péter

Váczi, Péter

Plachy, Judit

Fitnesz trendek a rekreációban

Mosolygó, László

Budapest földhasznosítási szerkezetének történeti földrajzi vizsgálata

Vida, József

Természettudományos varázsterem az egri líceumban

Balogh, Béláné

A tanárképző főiskola könyvtárának nevelési lehetőségei és feladatai egy olvasófelmérés tükrében

Eszterházy Károly College

Not a member yet