Yamagata University Academic Repository

山形大学博士(医学)学位論文（Thesis)学位論文要

後藤, 崇成

論 文 内 容 要 約 
論文題目 
 
The effect of the phosphorylation of the CM2 protein on influenza C virus replication 
 
責任講座：耳鼻咽喉・頭頸部外科学講座 
氏  名：   後藤 崇成      
【要約】 
CM2は C型インフルエンザウイルスの膜タンパク質の一つで、N
末端側より細胞外領域 (1-23位)、膜貫通領域 (24-46位)及び細胞質
領域 (47-115位) から構成される。CM2はウイルスの増殖に必須で
あり、ウイルスゲノムのパッケージングや脱殻に関与する。CM2は
N 結合型糖鎖の付加、リン酸化及びパルミチン酸化等の翻訳後修飾
を受けることが明らかになっているが、リン酸化のウイルス増殖に
及ぼす影響は明らかになっていない。本研究は CM2のリン酸化が C
型インフルエンザウイルスの増殖過程に及ぼす影響を明らかにする
ことを目的とした。 
 CM2 のリン酸化候補部位を置換した CM2 変異体を作製した。こ
れらのタンパク質の発現はウェスタンブロッティング及びメタボリ
ックラベリングにより解析した。野生型及び CM2変異体のリン酸化
の解析は、[32P]を用いたラベル実験により行った。野生型 CM2また
は変異 CM2発現プラスミド、8種のウイルスタンパク質発現プラス
ミドと GFP-vRNA発現プラスミドを 293T細胞に導入し、ウイルス
様粒子を作製した。ウイルス様粒子中の vRNA 量を、リアルタイム
PCR法を用いて定量した。ウイルス様粒子を HMV-Ⅱ細胞に感染さ
せ、GFPタンパク質の発現を蛍光顕微鏡及びウェスタンブロッティ
ングにより解析した。 
以上の方法により、CM2のリン酸化が C型インフルエンザウイル
スの増殖過程に影響を及ぼすか否かを解析した。 
 


The effect of the phosphorylation of the CM2 protein on influenza C virus replication

山形大学博士(看護学)学位論文（Thesis)学位論文要

佐藤, 志保

論 文 内 容 要 約 
 
論文題目  採血を受ける 3-6歳の子どもの対処能力を予測するアセスメント・ 
アルゴリズムの開発 
（Development of an assessment algorithm in predicting the coping skills of  
3- to 6-year-old children undergoing blood sampling） 
 
教育・研究領域：生涯生活支援看護学 
氏     名：  佐藤 志保     
 
【内容要旨】 
 採血を受ける子どもの対処能力を予測するアセスメント・アルゴリズムの開発を目
的に研究を行った。Minds 診療ガイドライン作成の手引きに基づき文献検討を行い，
アルゴリズムに必要な項目を抽出し，項目の妥当性と評価区分の検討からアセスメン
ト・アルゴリズムを作成した。さらに，信頼性，予測妥当性，感度を検討した。関連
要因を扱った文献から，アルゴリズムに必要な項目を抽出した上で評価区分を検討し，
対処能力を 4 段階に区分するアルゴリズムを作成した。アルゴリズムの評価は一致し
ており，予測妥当性においても有意な相関があった。採血を受ける子どもの対処能力
を予測するアセスメント・アルゴリズムを開発することができた。 
 


Development of an assessment algorithm in predicting the coping skills of 3-to 6-year-old children undergoing blood sampling

山形大学博士（医学）学位論文（Thesis)学位論文要

三輪, 弥沙子

論 文 内 容 要 約 
論文題目 
胃原発悪性リンパ腫の放射線治療における適正な標的体積の検討 
 
 
 
責任講座： 放射線腫瘍学 講座 
氏  名： 三輪 弥沙子        
【要約】 
 限局型胃原発悪性リンパ腫に対する全胃照射は現在の治療法の中
で重要な位置を占めている。放射線治療において標的体積の再現性
は重要な要素であるが、それに大きく関わる要素として臓器移動・
変形がある。胃はこの臓器移動・変形を構成する要素が他臓器に比
べて多く複雑な臓器である。放射線治療では照射中の臓器移動・変
形(体内標的体積：ITV)と照射期間中のセットアップ・機械の誤差(計
画標的体積：PTV)を含めて標的体積とするが、これまでに胃に関し
てITVとPTVを分割して詳細に検討した報告はない。本研究では胃に
対する適正な標的体積を算出するため、ITVとPTVに対する推奨マー
ジンを決定した。 
 


胃原発悪性リンパ腫の放射線治療における適正な標的体積の検討

山形大学博士(医学)学位論文(Thesis)学位論文要

岩渕, 雅洋

論 文 内 容 要 約 
 
論文題目 
 
 
一過性前脳虚血により誘導されるユビキチン化たんぱく質
の解析 
 
 
指導（紹介）教授： 川前 金幸  
              氏 名 ： 岩渕 雅洋 
 
【 要 約 】 
 ユビキチン化は、たんぱく質の分解や DNA 損傷の修復など細胞のさまざま
な重要過程を調節するたんぱく質翻訳後修飾の１つである。これまでの研究に
より、一過性脳虚血後にユビキチン化たんぱく質が界面活性剤である
TritonX-100 不溶性画分内に蓄積されることが報告されている。これは、ユビ
キチン化たんぱく質の立体構造が変化し不溶性となるために起こると考えられ
ている。この過程により、虚血後の神経細胞死が誘発されるが、Triton不溶性
画分内のユビキチン化たんぱく質の詳細な解析は未だ報告されていない。 
 本研究では一過性脳虚血後の Triton 不溶性画分内のユビキチン化たんぱく
質を同定するために、プロテオミクス解析を行った。マウスに対して 10 分間
の前脳虚血と４時間の再還流を行った後、海馬のホモジネートから Triton不溶
性画分を分離した。トリプシン処理の後、ユビキチン化されたペプチドを免疫
沈降し、質量分析を行った。 
 一過性脳虚血後にはユビキチン化たんぱく質の増加が認められた。とりわけ、
Triton不溶性画分内のユビキチン化たんぱく質の増加が著明であった。これら
のたんぱく質は、リシン 48 のポリユビキチン化を豊富に含むことから、ユビ
キチン・プロテアソーム系で分解されるものと考えられた。質量分析の結果、
１箇所以上のユビキチン化を受けるたんぱく質が 520種類同定され、その中で
66 種類のたんぱく質は 10 箇所以上のユビキチン化部位を含むことが明らかと
なった。一過性脳虚血後の Triton不溶性画分のユビキチン化たんぱく質におい
て、272 種類のたんぱく質がコントロール群と比較して５倍以上の増加を示し
ていた。これらのたんぱく質には、虚血後に障害されるたんぱく翻訳やシナプ
ス可塑性、また神経情報伝達関連分子が含まれていた。さらに、ユビキチン化
部位のアミノ酸配列を詳細に検討することにより、一過性脳虚血後のユビキチ
ン化に関わるアミノ酸配列モチーフを同定した。 
 これまで、ユビキチン化たんぱく質の解析は高いバックグラウンドが原因と
なり詳細な解析が妨げられてきたが、本研究ではトリプシン処理と免疫沈降法
を組み合わせた質量分析を用いることにより、一過性脳虚血により誘導される
ユビキチン化たんぱく質の包括的解析に初めて成功した。本研究で同定された
ユビキチン化たんぱく質をさらに詳細に解析することにより、虚血後の神経細
胞障害の原因の解明と有効な治療法の開発が進展すると思われる。 
 
 


Characterization of the ubiquitin-modified proteome regulated by transient forebrain ischemia

山形大学博士（医学）学位論文（Thesis

加藤, 幸成

ポドプラニンを標的としたがん特異的抗体の開発

榎戸, 正則

論 文 内 容 要 約 
論文題目 
 
Parental care influences leukocyte telomere length with gender specificity in 
parents and offsprings 
（両親の養育態度は子供の白血球テロメア長に性特異的に影響を与える） 
 
責任講座：       精神医学講座 
氏  名：   榎戸 正則      
【要約】 
緒言：テロメアは染色体末端に位置する（TTAGGG）n の繰り返
し配列であり、染色体の融解阻害や遺伝子の安定性に重要な役割を
果たしている。テロメア長はほとんどの体細胞で細胞分裂のたびに
短くなり、一定の長さより短くなると細胞死が引き起こされる。従
って、テロメア長は細胞老化の生物学的な指標とされる。近年、テ
ロメア長の短縮に関与する心理的要因として、生活上のストレスや
悲観的で攻撃的な人格傾向が報告されている。また、幼少時期の虐
待や長期間の施設入所などの不幸な体験はテロメア長の短縮と関連
すると報告されている。しかしながら、幼少時期に受けた両親の養
育態度を正から負まで連続的に捉えて、これとテロメア長との関連
を検討した研究はこれまでに報告されていない。従って本研究では、
健常人における両親の養育態度と白血球テロメア長との関連を検討
した。 
方法：対象は健常日本人 581 人であった。男性 340 人、女性 241
人であり、平均年齢±SDは 23.4±1.7 才であった。養育態度は愛情
と過保護の 2 因子からなる日本語版 Parental Bonding Instrument
（PBI）により評価した。白血球のテロメア長は定量的 PCR 法を用
いて、テロメアと単一コピー遺伝子の割合を指標として評価した。
統計解析は、男性と女性それぞれにおいて、テロメア長を従属変数
とし、PBI 得点、年齢を独立変数とした重回帰分析を用いて行い、
p<0.05を有意とした。なお、本研究は山形大学医学部の倫理委員会
の承認を得ており、対象全例から文書にて同意を得て行った。 
結果：男性において、テロメア長の短縮は父親からの愛情の低得
点と有意に関連（β=0.139、p=0.010）していた。一方、女性におい
ては、テロメア長の短縮と母親からの愛情の低得点の有意な関連（β
=0.195、p=0.002）が認められた。 
結論：以上より本研究により、両親の愛情とテロメア長には直線
的な関連が認められ、この関係は性特異的であることが示された。 


Parental care influences leukocyte telomere length with gender specificity in parents and offsprings

田中, 賢

論	 文	 内	 容	 要	 約 
論文題目 
新規 DGK ゼータ結合蛋白 DEAD-box protein 5 (DDX5) による NF-κB
制御機構の解析 
 
 
責任講座：	 	 	 	 整形外科学	 	 講座 
氏	 	 名：	 	 	 	 田中	 賢	 	 	 	 	  
【要約】 
背景 
	 ジアシルグリセロールキナーゼ (DGK) は、イノシトールリン脂質代謝系で産生されるジアシ
ルグリセロールの代謝を介して細胞内情報伝達機構の制御に関与する。近年、ゼータ型 DGK 
(DGKζ) の機能解析を目的に質量分析法を用いて結合蛋白の検索が行われているが、本研究では、
新規 DGKζ結合蛋白として DEAD-box protein 5 (DDX5) を同定した。DDX5 は当初、RNA ヘリカ
ーゼ活性を持つ分子として単離され、種々の転写因子に対する調節因子としての役割が報告され
ているが、未だ不明な点が多い。また最近の研究により DGKζは、炎症応答に主要な役割を果た
す NF-κB 経路を抑制的に制御することが明らかにされたことを踏まえ、本研究では DDX5 によ
る NF-κB 制御機構について解析を行った。 
方法 
	 HeLa 細胞および HEK293 細胞における DDX5 の細胞内局在や DDX5 ノックダウン細胞におけ
る NF-κB p65 サブユニットの細胞内動態を形態学的に解析した。また IκB と p65 サブユニット
の発現およびリン酸化をウェスタンブロット法を用いて、そして NF-κB 転写活性をルシフェラ
ーゼアッセイ法を用いて検討した。 
結果 
	 HeLa 細胞において、内在性 DDX5 は DGKζとともに主として核内に認められたが、その他細
胞質にも検出された。TNF-α刺激による p65 サブユニットの経時的な細胞内動態は、DDX5 ノッ
クダウン細胞とコントロール細胞において、大きな変化を示さなかった。TNF-α刺激による IκB
の発現にも、大きな変化は認められなかった。これらの結果から、DDX5 の発現減少は IκB およ
び p65 サブユニットの細胞内発現局在動態に影響を及ぼさないと考えられた。次に DDX5 ノッ
クダウン細胞における p65 サブユニットのリン酸化レベルを解析すると、Ser 311 において大き
く減少することが明らかとなった。DDX5 ノックダウン細胞の NF-κB 転写活性は、コントロー
ル細胞に比べて約 50%減少した。この結果、DDX5 の発現低下によって、p65 サブユニットのリ
ン酸化を介する転写活性が抑制されることが示唆された。また TNF-α刺激下での蛋白間結合を
解析すると、p65 サブユニット、DGKζ、DDX5 の間に顕著な変化は認められなかった。 
考察 
これまでの報告により、TNF-α刺激によるNF-κB活性化機構においてDGKζノックダウンは、
p65 サブユニットの核内移行とリン酸化を促進することにより、NF-κB 転写活性を亢進させるこ
とが示されている。本研究では、DDX5 ノックダウンが p65 サブユニットのリン酸化を抑制する
ことにより、NF-κB 転写活性を低下させることが明らかになった。すなわち、DGKζと DDX5
は NF-κB 経路に対して相反する作用を及ぼす可能性が示唆される。 
 


新規DGKゼータ結合蛋白DEAD-box protein 5 (DDX5) によるNF-KB制御機構の解析

山内, 敬子

論 文 内 容 要 約 
論文題目 
卵巣癌におけるWT1 variantが腫瘍形成能に与える影響について 
 
 
責任講座：   産科婦人科講座 
氏  名：  山内 敬子         
【要約】 
Wilms’ tumor 1 (WT1)遺伝子は、卵巣癌において 80%以上で発現している。WT1
は RNA splicingを受け、exon5 (17AA)と exon9, 10間の 3つの amino acids (KTS)
の有無によって 4 つの variant [-17AA/-KTS (WT1A), +17AA/-KTS (WT1B), 
-17AA/+KTS (WT1C), +17AA/+KTS (WT1D)]があり、variantにより apoptosis誘導
や細胞増殖能が異なると報告されている。しかし、卵巣癌における variant の腫
瘍形成における役割はわかっていない。本研究では、卵巣癌において、WT1 
variant の腫瘍形成における役割とメカニズムを検討することを目的とした。は
じめに、WT1未発現細胞株である SKOV3ip1細胞に lentiviral vectorを導入して、
4つのWT1 variantをそれぞれ過剰発現させた細胞株を作成した。対照細胞株は
empty vector導入細胞とした。作成した細胞株におけるWT1の発現はwestern blot
法で確認した。5-7週齢のメスヌードマウスにそれぞれの細胞株を腹腔内接種し、
腫瘍重量と腹水量を検討した。また、それぞれの細胞株を接種させたマウスに
おける生存率を Kaplan-Meier法で検討した。WT1A過剰発現させた細胞株を接
種させたマウスでは対照と比較して腫瘍重量と腹水量は有意に増加した。さら
に、WT1A を過剰発現させた細胞株を接種させたマウスでは対照群に比較して
生存期間は有意に短縮した。以上の結果より、WT1A では腫瘍重量と腹水量が
増加し、そのため生存率が優位に低下した。さらに、この機序について検討す
るため、WT1A とコントロールを過剰発現させた細胞株を接種したマウスから
摘出した腫瘍組織において、WT1 が発現調節を行う 5 つの遺伝子 (PCNA, 
IGFBP5, EGR-1, CCND2, VEGF)の発現をRT-PCR法とwestern blot法で検討
した。WT1Aによって VEGFの発現が対照と比較して増強した。さらに、形成
された腫瘍内における新生血管数を抗 CD31 抗体による免疫染色法で検討した
ところ、WT1Aによって新生血管数が対照と比較して増加した。さらに、WT1A
での腫瘍増加に VEGF が関与するかを検討するため、抗 VEGF 抗体 
(bevacizumab)によって WT1A の発現による腫瘍重量と腹水量が抑制されるか
否かを検討した。Bevacizumab投与により、WT1Aによる腫瘍重量と腹水量の
増加は有意に抑制された。これらの結果から、卵巣癌においてWT1 variantの
中でWT1Aが腫瘍増殖、腹水産生と生存期間に関連していた。また、VEGFの
発現亢進がWT1Aの腫瘍形成に関与していた 
 


The Wilms' tumor gene WT1-17AA/-KTS splice variant increases tumorigenic activity through up-regulation of vascular endothelial growth factor in an in vivo ovarian cancer model

山形大学博士（医科学）学位論文（Thesis)学位論文要

佐藤, 秀則

 
 
論 文 内 容 要 約 
 
論文題目 
Segmental copy number loss of the PCSK6 gene in sporadic     
amyotrophic lateral sclerosis 
 
（孤発性筋萎縮性側索硬化症における Proprotein convertase  subtilisin/     
kinesin type 6遺伝子の部分的コピー数欠失） 
 
所属部門： 生命環境医科学   部門 
所属講座： 内科学第三     講座 
氏  名： 佐藤 秀則        
【要約】 
孤発性筋萎縮性側索硬化症 (SALS)の病因・病態には遺伝的要因や環境因子が複
雑に関与していると推測されている。我々は SALS の遺伝的リスクを明らかに
するため、SALS 患者と健常対照例（Control）の末梢血由来 DNA(以下、DNA)
を用いてコピー数多型(CNV)をゲノムワイドに解析した。  最初のステップと
して、SALS 11例、Control 104例の DNAを deCODE 57K CNVチップを用いて
ゲノムワイドに解析した。その結果、第 15 番染色体長腕のサブテロメア領域
15p26.3 に位置する cnv4347PP5において、SALSで高頻度(11例中 8例)にコピー
数欠失が認められたが、Control 例ではそのような変化は認められなかった 
(p=5.5x10-6)。次に、この領域をさらに詳細に検討するため、SALS 50例と Control 
20例の DNAを Agilent 400K CGHアレイを用いて解析を行った。その結果、こ
の領域に存在する proprotein convertase subtilisin/kinesin type 6 (PCSK6)遺伝子の
エクソンを含む下流領域において 1.1-5.5 Kb の部分的コピー数欠失が SALS の
30% (15例)で認められた (p=0.006, OR 17.9, 95%CI 1.02-315.2)。最後に、SALS 36
例と Control 51例の DNA を quantitative PCR法 で解析した。その結果、SALS
において PCSK6 遺伝子の部分的コピー数欠失が有意に高頻度で認められた
(p=0.0015, OR 6.63, 95%CI 1.89-25.72)。尚、疾患対照として孤発性パーキンソン
病 100例のDNAを解析したが、上記の部分的コピー数欠失は認められなかった。 
PCSK6 は神経成長因子の前駆体から活性体への変換を行うプロプロテイン変換
酵素として機能している。また、SALSの病態に神経成長因子が関与しているこ
とが報告されている。したがって、本研究で明らかとなった PCSK6遺伝子の部
分的コピー数欠失により、SALS患者では神経成長因子の成熟・活性化が障害さ
れ、その結果、運動神経細胞の脆弱性が惹起される可能性が示唆された。 


Sebmental copy number loss of the PCSK6 gene in sporadic amyotrophic lateral sclerosis

本多, 勇希

論 文 内 容 要 約 
論文題目 
成長因子ミッドカインは上皮成長因子受容体シグナルを介し慢性腎臓病におけ
る心リモデリングを増悪する 
 
 
責任講座： 内科学第一講座 
氏  名： 本 多  勇 希        
 
【内容要約】（1,200字以内） 
【背景】慢性腎臓病(Chronic kidney disease: CKD)は心肥大発症の危険因子である。
CKD では種々の機序で心リモデリングが生じることが知られているが、近年 CKD 患
者では心リモデリングの初期病変が心肥大であることが示されており、心肥大抑制は重
要な治療戦略と考えられる。ミッドカイン(Midkine: MK)は CKD患者の腎臓において
発現亢進し血中に放出される成長因子であり、最近我々は MK が心肥大増悪と関連が
あることを見出した。しかし、CKD患者の左室肥大形成におけるMKの役割について
は未だ解明されていない。 
【目的】CKD における心肥大・心リモデリングにおいて、MK が果たす役割・機序を
検討する。 
【方法】MK 欠損マウス(KO)と野生型マウス(WT)に腎亜全摘術により CKD モデルを
作成し、左室肥大の程度・生存率を比較した。また、MKによる心肥大形成の分子生物
学的機序を、新生児仔ラット心筋細胞を MK で刺激し、ウェスタンブロット法やルシ
フェラーゼアッセイを用いて検討した。さらに、成長因子のインヒビターを用いた検討
も行った。 
【結果】定常状態において、KOとWT間に体重・心機能・生存率の差は認めなかった。
腎摘 WT においては血中 MK 濃度が腎摘 KO と比較し上昇していた。腎摘 KO は腎摘
WT に比べ腎摘後の心肥大形成が有意に抑制され、生存率も腎摘 WT と比較して腎摘
KOで有意に良好であった。心臓抽出蛋白で Receptor tyrosine kinase Arrayを行うと、
上皮成長因子受容体(Epidermal growth factor receptor: EGFR)のリン酸化が腎摘WT
において亢進していた。心肥大シグナルである ERK1/2, AKTのリン酸化は腎摘WTに
おいて亢進していたが、腎摘 KOでは ERK1/2, AKTのリン酸化が抑制されていた。新
生児仔ラット心筋細胞をMKで刺激したところ、EGFR, ERK1/2, AKTのリン酸化が
亢進していた。また、ルシフェラーゼアッセイでは、心肥大のマーカーである胎児型遺
伝子 BNPの発現がMK刺激により亢進していた。形態学的にもMK 刺激により心筋細
胞の肥大が観察されたが、EGFRインヒビターの前投与または EGFR siRNAの前処置
により MK 刺激による BNP の発現・心肥大は有意に抑制された。また、EGFR 
transactivation のインヒビターである TAPI-2を前投与したが、MK による BNPの発
現・心肥大には変化がなかった。 
【考察】CKDにおいてMKは EGFRシグナルを介して心筋細胞に作用し、ERK1/2・
AKT のリン酸化を介し心肥大形成に関与することが示唆された。MK 抑制は CKD に
おける心肥大、さらには心リモデリング抑制のための新たな治療ターゲットと成り得る。 
 


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