Yamagata University Academic Repository

山形大学博士（看護学）学位論文(Thesis)学位論文要

赤間, 由美

論 文 内 容 要 約 
論文題目 
 生活保護現業員の自己効力感の情報源に働きかける介入 
プログラムの評価 
教育・研究領域：生涯生活支援看護学 
氏  名：赤間 由美 
【要約】 
本研究は生活保護現業員のメンタルヘルス向上のために自己効力感の情報源に働き
かける介入プログラムを作成し評価することを目的とした。 
対象は A 県内の 3 市の生活保護現業員で、B 市・C 市を介入群、D 市を対照群とした。 
介入群には自己効力感の情報源である自己の成功経験、代理的経験、言語的説得を強化し
た事例検討を実施し、自己効力感の情報源等の変化を群間で比較し評価した。 
B 市では中間時点で自己の成功経験と言語的説得で、介入終了後では代理的経験で正
の関連を認め介入効果を確認できた。C 市では介入終了後に自己の成功経験と言語的説得
で負の関連を認めたが、介入効果を示す肯定的な意見感想が多く、一定の介入効果を確認
できた。 
生活保護現業員の自己効力感の情報源に働きかける介入プログラムは効果が認められた
が、実施の際には生活保護率増加等の業務状況を考慮する必要性が示唆された。 


生活保護現業員の自己効力感の情報源に働きかける介入プログラムの評価

山形大学博士(理学)学位論文(Thesis

西, 勇樹

蔵王火山、五色岳の噴火推移とマグマ供給系の変遷

山形大学博士（医学）学位論文(Thesis)学位論文要

豊島, 拓

論 文 内 容 要 約 
論文題目 
 
Inhibition of microRNA-34a suppresses aortic valve calcification via 
Notch1-Runx2 signaling pathway 
(MicroRNA-34aの抑制はNotch1-Runx2経路を介して大動脈弁の石灰化を抑制
する) 
 
責任講座：内科学第一講座 
氏  名：豊島 拓 
 
【要約】 
【背景】石灰化大動脈弁狭窄症（CAVS）は最も多い弁膜症であり、高齢人口の
増加に伴い増加している。CAVSの治療は外科的弁置換術が基本である。CAVS
は動脈硬化と危険因子を共有するが、スタチンや ACE 阻害薬は無効であり、
CAVS の進行を抑制する有効な薬物治療は未だ確立されていない。また近年、
標的遺伝子の発現を抑制する microRNA（miR）が注目され、癌や消化器疾患
への臨床応用が試みられている。しかし、CAVS 発生における miR の役割につ
いては十分に検討されていない。 
【方法・結果】ヒト大動脈弁標本、ブタ大動脈弁間質細胞、ワイヤー傷害 CAVS
マウスを用いて CAVS とmiRの関連について検討した。CAVS患者と大動脈弁
逆流（AR）患者の大動脈弁標本を用いて、石灰化への関与が報告されている 10
個のmiRの発現を qRT-PCRを用いて調べた。CAVS群においてmiR-34aを含
む 6個の miRの発現が亢進し、2個の miR の発現が低下していた。CAVS群で
は石灰化を促進する Runt-related transcription factor 2 (Runx2) の発現が亢
進し、Runx2 の発現を抑制する Notch1 の発現が低下していた。ブタ大動脈弁
間質細胞を石灰化誘導培地で刺激すると、miR-34a の発現は有意に亢進した。
また、Runx2の発現亢進と、Notch1の発現低下を認めた。ブタ大動脈弁間質細
胞に miR-34a を過剰発現させたところ、Notch1 の発現が低下し、Runx2 の発
現および石灰沈着が亢進した。miR-34aを抑制すると、Notch1の発現が亢進し、
Runx2の発現および石灰沈着が抑制された。また Notch1 mRNAを用いたルシ
フェラーゼアッセイおよびプルダウンアッセイにより、ブタ大動脈弁間質細胞
においてmiR-34aはNotch1の発現を直接調節していることが示された。CAVS
マウスへの Locked Nucleic Acid (LNA) miR-34a inhibitorの投与により、術後
8週での大動脈弁の肥厚および石灰化が有意に抑制され、心肥大と左室収縮能が
改善した。免疫染色では LNA miR-34a inhibitorの投与によりマウス大動脈弁
の Runx2の発現が低下しており、miR-34aの抑制は大動脈弁石灰化を抑制する
ことが示された。 
【結論】CAVS患者の大動脈弁で miR-34aの発現が亢進していた。miR-34aは
大動脈弁間質細胞の Notch1 の発現を抑制し、石灰化を亢進すると考えられた。
miR-34a の抑制により、CAVS の進展および病的心臓リモデリングが抑制され
た。miR-34a抑制は CAVSに対する新たな治療標的になることが示唆された。 


Inhibition of microRNA-34a suppresses aortic valve calcification via Notch1-Runx2 signaling pathway

MD YEASHIN, GAZI

論 文 内 容 要 約 
論文題目 
A disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 
(ADAM17) regulates IL-12p40 secretion and type 1 helper T cell 
differentiation. 
（A disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 はイン
ターロイキン 12p40の分泌とタイプ１ヘルパーT細胞分化を制御する） 
 
責任講座： 免疫学       講座 
氏  名： Md Yeashin Gazi       
 
【内容要約】（1,200字以内） 
【背景】 インターロイキン 12 (IL-12) は病原微生物感染時にマクロファージや樹状細
胞（DC）などの抗原提示細胞から産生されるサイトカインである。IL-12はNK細胞を活
性化させるとともに、ナイーブ T 細胞をタイプ１ヘルパーT 細胞へ分化させることから、
自然免疫と獲得免疫の橋渡しを行っている。IL-12 の産生と分泌は異なる機構により
制御されており、分泌の機構については不明である。 
【方法・結果】 ADAM17 は膜型の蛋白分解酵素であるが、この機能を特異的薬剤に
より阻害すると、DC からの IL-12 分泌が抑制されることを見出した。この時、細胞内で
の IL-12産生については変化していなかった。IL-12は、IL-12p35 と IL-12p40の２つ
のサブユニットからなるヘテロ２量体  (IL-12p70) であるが、ADAM17 の阻害は
IL-12p40 の分泌を抑制することを確認した。 IL-12p40 は IL-12 だけではなく、
IL-23p19とともに IL-23のサブユニットとしても使われている。そこで IL-23の分泌も調
べた結果、ADAM17 の阻害は IL-23 分泌も抑制することが分かった。また、IL-12p40
を恒常的に発現するマウスマクロファージ細胞株 RAW12b-3 細胞の ADAM17 を
CRISPR/Cas9 法によりノックアウトすると、IL-12p40 の分泌は完全に抑制された。これ
らの結果は、ADAM17が IL-12p40を細胞膜上で切断し、分泌させることを示唆してい
る。次にADAM17の阻害がTh1細胞分化にどのような影響を与えるのかを卵白アルブ
ミン（OVA）抗原特異的ナイーブ CD4 陽性 T 細胞（OT-II 細胞）を用いて検討した。
ADAM17阻害薬存在下に OVAペプチドを投与した DCを用意し、薬剤を除去した後
にOT-II細胞と共培養を行った。その結果、ADAM17を阻害したDCはOT-II細胞の
Th1 分化を促進し、IFN-γ産生を亢進させることがわかった。ADAM17 阻害により
IL-12 分泌が低下するものの、DC 表面に発現する膜型 IL-12 がより強く Th1 分化を
誘導する可能性が示された。 
【考察・展望】 以上の結果は、ADAM17が IL-12p40の細胞表面からの分泌を制御す
ることにより、Th1 分化をコントロールしている可能性を示唆している。Th1 細胞は感染
防御免疫やがん免疫など非常に大切な役割を担っている。したがって、ADAM17 によ
る IL-12p40 の制御機構を明らかにすることにより、Th1 誘導について新たな調節機構
の解明が期待される。 


A disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 (ADAM17)  regulates IL-12p40 secretion and type 1 helper T cell differentiation.

宇都宮, 文

論 文 内 容 要 約 
論文題目 
 
肝内胆管癌における樹状細胞浸潤と癌幹細胞マーカー陽性細胞との関連 
 
 
責任講座：  病理診断学講座 
氏  名：    宇都宮 文 
 
【要約】（1,200字以内） 
 
【背景と目的】未熟樹状細胞が腫瘍組織中に遊走し、腫瘍抗原を取り込むと所属リンパ節で抗原特異的な T細胞
を誘導する。この T細胞は腫瘍内に遊走して抗腫瘍免疫を発揮する。固形癌における癌幹細胞（cancer stem cell; 
CSC）は、自己複製能と多分化能を持つ細胞集団である。CSC のマーカーを抗原として樹状細胞に抗原捕捉さ
せ、その抗腫瘍効果を検討する報告もなされている。しかし、ヒトの腫瘍組織内で樹状細胞が CSC の腫瘍抗原
をどれ程に認識できるかは不明で、肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma; ICC）において組織学的
に CSC と樹状細胞の関連性を検討した報告はない。本研究では、CSC マーカーの中でも ICC の予後と関連す
るとされている EpCAM と Sox9、および他の固形癌で予後と関係する CD44v9 を選択し、CSC マーカー陽性
腫瘍細胞と樹状細胞の局在的な関連性や予後について検討した。 
【材料および方法】ICC 23例のパラフィン包埋切片を用いて免疫組織化学的染色を行い、①未熟樹状細胞、成
熟・活性化樹状細胞、形質細胞様樹状細胞の腫瘍内局在を、②CD44v9 陽性群と陰性群の間で、また EpCAM
と Sox9のそれぞれの高発現群と低発現群の間での CD1a+樹状細胞数の比較を、③CD44v9、EpCAM と Sox9
の陽性群と陰性群の間あるいは高発現群と低発現群の間における Kaplan-Meier法（log-rank test）での無増悪
生存期間（progression-free survival; PFS）と全生存期間（overall survival; OS）の比較を、④生存期間に対
する臨床病理学的因子の影響に関して Cox 比例ハザードモデルで単変量解析あるいは多変量解析を行なった。
また、⑤逆転写ポリメラーゼ連鎖反応で腫瘍における CSCマーカーのmRNA 発現についても検討した。 
【結果】ICC の腫瘍胞巣には CD1a+未熟樹状細胞が多く、成熟・活性化樹状細胞や形質細胞様樹状細胞は少な
かった。CD44v9の陽性群より陰性群で、EpCAM 低発現群より高発現群で CD1a+樹状細胞の浸潤が多かった。
Kaplan-Meier法で、CD44v9の陽性群と陰性群間で PFS やOS に有意差はなかったが、Sox9高発現群より低
発現群で PFS と OS が共に短かった。Cox 比例ハザードモデルを用いた単変量解析と多変量解析で Sox9 は独
立した危険因子であることが示された。また、ICCで CSCマーカーのmRNA 発現が確認された。 
【結論】CSCマーカーを発現する癌胞巣に浸潤する CD1a+樹状細胞数は、CSCマーカーの種類で異なることが
示唆された。特に、CD44v9を発現する ICCの腫瘍胞巣は CD1a+樹状細胞と接触しにくく、抗腫瘍免疫から回
避する可能性が示唆された。また、ICCにおけるSox9は独立した予後評価因子になり得る可能性が示唆された。 


肝内胆管癌における樹状細胞浸潤と癌幹細胞マーカー陽性細胞との関連

東海林, 悠

論 文 内 容 要 約 
論文題目 
グルコース欠乏負荷条件下におけるζ型ジアシルグリセロールキナーゼの機能解析 
 
責任講座：耳鼻咽喉・頭頸部外科学講座 
氏  名：東海林 悠              
【要約】 
〔背景・目的〕 
ジアシルグリセロールキナーゼ（DGK）は、イノシトールリン脂質代謝系における二
次伝達物質ジアシルグリセロールの代謝を介して細胞内情報伝達を調節する。これま
で、DGK アイソザイムの 1 つであるゼータ型 DGK (DGKζ）は、虚血や低酸素、DNA
ダメージ等のストレス応答に関与することが報告されている。本研究では、グルコース
除去培地によるエネルギーストレス負荷条件下における DGKζの機能的役割を解析
した。 
〔方法〕 
DGKζノックアウト（DGKζ-KO）マウス由来のマウス胎児線維芽細胞（MEF）をグル
コース不含培地で培養し、実験を行った。アポトーシス関連タンパクであるカスパーゼ
と apoptosis inducing factor (AIF) の発現をウエスタンブロット法および免疫細胞化学
法を用いて解析した。また ATP 量およびミトコンドリアにおける ATP 産生の指標となる
NAD+/NADHの測定を行った。  
〔結果〕 
実験の結果、野生型 MEF をグルコース不含培地に置換すると 10 時間以内にほと
んどの細胞が培養上清中に浮遊しているのが観察された。一方、DGKζ-KO 細胞は
グルコース欠乏条件下でも 10 時間後に約 90％の細胞が接着し生存していた。アポト
ーシス関連タンパクの発現をウエスタンブロット法により解析したところ、グルコース欠
乏負荷によって野生型および DGKζ-KO 細胞のいずれにおいても、活性型 cleaved 
caspase3 と cleaved caspase７の発現は認められなかった。免疫細胞化学法を用いて
AIF の発現を解析すると、野生型 MEF では DGKζ-KO MEF よりも強い AIF 免疫反
応が観察された。AIF は通常ミトコンドリア膜間腔内に存在するが、ストレスに応答し細
胞質に放出され、核に移行した後 DNA を断片化そして凝集させアポトーシスを誘導
することが知られている。グルコース欠乏条件下において AIF 発現が亢進している野
生型 MEFでは、核の縮小化と凝縮像が見られた。DGKζ-KO細胞では ATP量が野
生型細胞に比較して約 1.2 倍に増加していることから、AIF の局在するミトコンドリア電
子伝達系での NAD＋および NADH を測定したところ、DGKζ-KO 細胞においては還
元型 NADHが顕著に増加することが判明した。 
〔考察〕 
これまでの研究により、DGKζ-KO 細胞は DNA ダメージによるアポトーシス刺激に
脆弱性を示すことが報告されているが、今回の研究により、グルコース単独欠乏による
エネルギーストレスに対しては耐性を示すことが明らかになった。このメカニズムとして、
DGKζ-KO 細胞では、グルコース欠乏負荷に応答する AIF発現が抑制されているこ
と、ATP 量が増大しているため短期間のエネルギー欠乏に耐性を持つこと、AIF は
NADH増加によって二量体を形成し、ミトコンドリア膜間腔からの放出が阻害されること
等により、AIFを介するアポトーシスに抵抗性を示すと考えられた。 
 


グルコース欠乏負荷条件下におけるζ型ジアシルグリセロールキナーゼの機能解析

本間, 龍介

論 文 内 容 要 約 
論文題目 
 
ウサギポドプラニンに対する特異的モノクローナル抗体の樹立と応用 
 
責任講座：   整形外科学   講座 
氏  名：   本間龍介       
【要約】 
 
【背景】ポドプラニン（PDPN）はⅠ型膜貫通型タンパク質で，リンパ管内皮細胞や腎糸
球体上皮細胞，肺 I型肺胞上皮細胞などの正常組織に発現している．また，多くの悪性
腫瘍や関節リウマチの滑膜組織にもその発現が報告され，PDPN の機能解明はこれら疾
患の病態解明や治療につながる可能性がある．ウサギは動物実験で最も頻繁に使用され
る動物の一つであるが，これまでウサギ PDPN（rabPDPN）に対するモノクローナル抗体
は存在しなかった． 
【目的・方法】本研究では，rabPDPNに対するモノクローナル抗体を作製し，リポポリ
サッカライド誘発性ウサギ関節炎モデルおよびウサギ膝関節骨軟骨移植モデルを用い
て，樹立抗体による組織評価を行った. 
【結果・考察】まず，rabPDPN リコンビナントタンパク質でマウスを免疫し，rabPDPN
に対するモノクローナル抗体である PMab-32を樹立した．次に，PMab-32のエピトープ
を解析した．1アミノ酸ずつアラニンに置換した変異型 rabPDPNを作製し，Western blot
法と flow cytometry にて PMab-32 との反応性を確認した．Western blot 法では S61A，
G65A，T67A，A68G に反応せず，flow cytometry では G65A に反応しなかった．PMab-32
のエピトープは Ser61から Ala68で，Gly65が重要なアミノ酸と考えられた． 
関節炎モデルでは，ウサギ膝関節内にリポポリサッカライドを投与して関節炎を誘発
し，滑膜組織を PMab-32による免疫組織化学にて評価した．注射後 2週では，滑膜細胞
層の重層化が認められ，滑膜細胞に PDPN が強陽性であった．注射後 6 週と 12 週では，
滑膜細胞層の重層化が軽減し，著明な PDPN 陽性像は認められなかった．炎症が沈静化
するにつれて PDPN発現が減少したと考えられ，炎症強度と PDPN発現量が相関している
可能性が示唆された． 
軟骨移植モデルでは，ウサギ膝関節に骨軟骨欠損を作製し，自家骨軟骨移植片を偏心
性に移植後，軟骨組織を PMab-32による免疫組織化学にて評価した．正常軟骨組織の軟
骨細胞には PDPN は弱陽性であったが，術後 3 週の骨軟骨移植片と母床部の軟骨細胞に
は PDPNが陽性で，骨軟骨欠損領域は非軟骨組織で埋まり，PDPN陽性細胞は認められな
かった．術後 6 週，12 週でも同様の結果であった．PDPN 発現は，手術侵襲による炎症
や組織修復のための軟骨細胞の活性化を反映している可能性が考えられた． 
以上より，新規に樹立した rabPDPNに対するモノクローナル抗体である PMab-32は，種々
のウサギを使用した動物実験に使用可能であり，今後の機能解析に有用な抗体であると
考えられた． 


ウサギポドプラニンに対する特異的モノクローナル抗体の樹立と応用

渡部, 紗由美

論 文 内 容 要 約 
論文題目 
地域住民の推定 24時間尿中ナトリウム排泄量（塩分摂取量）と 
血圧との関連に与える背景因子の影響について 山形（高畠）研究 
 
責任講座：   内科学第一 講座 
氏  名：    渡部 紗由美    
 
【要約】 
【背景・目的】塩分摂取過多は、高血圧症の主要な原因の一つであり、塩分制限により
血圧が改善するとされる。既存の研究では、塩分摂取量と血圧は正の相関を示すという
報告が多数ある一方で、地域や塩分摂取量の違いにより、その関係性は異なることが指
摘されている。また、年齢・高血圧の有無といった背景因子によっても、塩分摂取量と
血圧との関連は異なり、特に、高齢群・高血圧群では塩分による血圧の影響を受けやす
いと指摘されている。しかしながら、日本人を対象として、これらの関係性を検討した
報告は少ない。今回、日本人一般住民において、推定 24 時間尿中ナトリウム (Na) 排
泄量 (塩分摂取量) と血圧との関連に与える背景因子の影響を検討した。 
【方法】山形県高畠町の健康診断受診者で 40 歳以上、降圧剤を内服していない 2,297
名 (男性 1,060 名、女性 1,237 名) を対象として、受診時の推定 24 時間尿中 Na 排泄量
と、収縮期・拡張期血圧との関連について背景因子毎に横断的に検討した。推定 24 時
間尿中 Na排泄量は、随時尿中 Na値をもとに、「川崎の式」を用いて求めた。 
【結果】対象者の推定 24 時間尿中 Na 排泄量の平均は 203.5 ± 52.8 mEq/日、NaCl換算
にて 12.0 ± 3.1 g/日であった。推定 24時間尿中Na排泄量と収縮期血圧 (r = 0.11, P < 0.01)、
拡張期血圧 (r = 0.09, P < 0.01) は有意に正の相関を示した。年齢、性別、BMI、腎機能、
推定 24時間尿中 K排泄量、糖尿病、高コレステロール血症、飲酒、喫煙に関して補正
した重回帰分析にて、推定 24 時間尿中 Na 排泄量と収縮期・拡張期血圧は有意に正の
相関を示した (P < 0.01)。多変量解析にて、推定 24時間尿中 Na排泄量が 1SD  (53 mEq/
日) 増加による回帰係数は、収縮期血圧で + 1.91、拡張期血圧で + 0.94 であった。サブグ
ループ解析では、収縮期血圧は、高齢・糖尿病・腎機能低下群でより影響を受けやすいことが
わかった。また、腎機能正常群では推定 24時間尿中Na排泄量と収縮期血圧との間に有意な
関連を認めなかったが、腎機能障害がより進行する程、有意差をもって、より強い正の相関を
示した。 
【考察】本研究結果から、これまでの既存研究と同様に、塩分摂取量は血圧と正の相関
を示すこと、また背景因子によりその関連は修飾されることが示された。高血圧群・高
齢群で食塩摂取が血圧に与える影響が強いことは既存研究で示されているが、eGFR < 
60 ml/min/1.73m²の腎機能低下群で、より影響を受けやすいということは、本研究で初
めて示された。その機序については、塩分感受性高血圧では食塩摂取に対する腎尿細管
の反応が正常と異なることが提唱されており、腎機能障害群でも、同様の機序が生じて
いる可能性が考えられるが、まだ明らかではない。 
【結論】日本人一般住民において、推定 24 時間尿中 Na 排泄量と血圧は正の相関を示し、そ
の関連は背景因子の影響を受けるということが明らかとなった。一般診療において、特に高齢
群・糖尿病群・腎機能低下群では、血圧コントロールに減塩指導がより有用であると考える。 
 


地域住民の推定24時間尿中ナトリウム排泄量（塩分摂取量）と血圧との関連に与える背景因子の影響について　山形（高畠）研究

山木, 哲

論 文 内 容 要 約 
論文題目 
 
膠芽腫における再発形式予測の為のMRIおよび分子マーカーを用いた統合解
析 
 
 
責任講座：   内科学第一  講座 
氏  名：   山木 哲       
【要約】 
目的：膠芽腫は予後不良の疾患で、摘出術、放射線化学療法を組み合わせた集学
的治療が行われるものの、多くが 9 ヶ月以内に再発を来し平均生存期間は約 1
年半に過ぎない。再発形式には局所再発と遠隔再発があり、多くは局所再発を来
すが、近年摘出率の向上や局所再発予防の治療法開発により、局所再発のみなら
ず遠隔再発が問題となってきている。しかし現時点では遠隔再発を予測できる
分子マーカーは確立されていない。 
他の癌腫において治療抵抗性や再発の原因として腫瘍幹細胞が注目されている。
膠芽腫においても腫瘍幹細胞の存在が実証され、そのマーカーである CD133 の
発現が再発形式に関与しているという報告がなされている。一方で腫瘍の局在
が subventricular zone（SVZ） に関与しているものに遠隔再発が多いという報
告もある。成人において神経幹細胞は SVZに存在することから、SVZに腫瘍幹
細胞が存在しているものと推察されているが、CD133と SVZ、両者の関係及び
何れが遠隔再発により関与しているかは明らかになっていない。今回 CD133 の
発現と腫瘍の局在が SVZに関与しているか否かを統合し解析することで、再発
形式の予測因子を検討した。 
対象と方法：2009年 1月 1日～2018年 1月 31日山形大学医学部付属病院脳神
経外科にて治療を行い、病理組織診断にて膠芽腫と診断がついた 87例、および
東北大学医学部附属病院脳神経外科にて治療を行った膠芽腫 80例、計 167例
を対象とした。MRI にて腫瘍本体が SVZ に関与しているかで、関与あり
（ SVZ(＋)）、関与なし（ SVZ(－)）の 2型に分類した。経時的に撮像したMRI
で再発の有無、再発形式（局所再発、遠隔再発）を確認した。パラフィン包埋し
た摘出標本を CD133抗体で免疫組織化学染色し、陽性細胞を面積比で算出し発
現率を計測した。 
結果：腫瘍の局在が SVZ(+) 86例の CD133発現率は 14.8%で SVZ(－) 81例の
CD133発現率は 10.8%であり、有意に SVZ(+)で高かった。遠隔再発は SVZ(+)
の 15.1%、SVZ(－)の 27.2%に生じたが有意差は認めなかった。再発形式毎に
CD133 発現率を見ると、SVZ(+)の局所再発例が 12.5%、遠隔再発例が 26.8%、
SVZ(－)の局所再発例が 9.4%、遠隔再発例が 16.3%と、いずれも SVZに関係な
く遠隔再発例が局所再発例に比し CD133発現率が有意に高値であった。 
結論：CD133の発現率は SVZに関与するか否かに依存してくるものの、遠隔再
発に関与する因子は腫瘍の局在が SVZに関与しているか否かよりも、CD133 発
現率高値が危険因子であり、遠隔再発を予測し得るマーカーになる可能性があ
ると考えられた。 
 


膠芽腫における再発形式予測の為のMRIおよび分子マーカーを用いた統合解析

山形大学博士（医学）学位論文（Thesis）学位論文要

榊, 宏諭

論 文 内 容 要 約 
論文題目 
ヒストンメチル化の制御に着目した卵巣がん幹細胞標的治療開発に関する研究 
 
 
指導（紹介）教授： 永瀬 智 
              氏 名 ： 榊 宏諭 
【要 約】 
 近年の報告で、卵巣がんの再発や転移にがん幹細胞の存在が関与していることが示唆さ
れている。そのため、卵巣がんの再発や転移を克服し、長期予後を改善するためには卵巣
がん幹細胞を標的とした治療の開発が必要とされている。以前より正常幹細胞から分化し
た細胞ではヒストン H3K27 のトリメチル化が多く認められ、ヘテロクロマチンを介した幹
細胞性維持遺伝子の発現抑制で、分化を制御している可能性が報告されていた。そこで、
正常幹細胞と同様にがん幹細胞においても、ヒストン H3K27 のトリメチル量を増加させる
ことで、がん幹細胞を分化させることが出来るのではないかと考えた。そのために、ヒス
トン脱メチル化酵素阻害薬 GSKJ4 を用いて、ヒストンのトリメチル化量の増加が卵巣がん
幹細胞に与える影響および卵巣がん幹細胞標的治療薬としての GSKJ4 の可能性について検
討を行った。 
方法として、卵巣がん細胞株A2780より樹立したがん幹細胞であるA2780CSCを用いて、
GSKJ4 処理による卵巣がん幹細胞の特徴である自己複製能や腫瘍創始能の変化を検討した。
具体的にはまずは実験に用いるため初めに GSKJ4 の正常細胞に対する安全性の確認を色素
排除法による細胞死アッセイで行った。次に、正常細胞に影響を与えない濃度で A2780CSC
でも同様に細胞死アッセイを行い、GSKJ4 が A2780CSC の生細胞率や死細胞数に耐える影
響を検討した。次に、GSKJ4 が自己複製能や腫瘍創始能に与える影響を検討した。自己複
製能の指標としては幹細胞マーカーの発現と Sphere 形成能がある。幹細胞マーカーの発現
は Western blot法と Flow cytometry法で評価した。Sphere形成能に関しては Sphere形成実験
で評価した。腫瘍創始能に関してはヌードマウスへの腫瘍細胞移植実験にて評価を行った。 
初めに、正常細胞株として人胎児由来正常肺繊維芽細胞である IMR90を用いて GSKJ4処
理を行い、3 日間培養し、回収後 Trypan-blue による色素排除法により生細胞数及び死細胞
数を計数した。結果として、GSKJ4 10μM で生細胞率の有意な減少があり、15μMで死細胞
数の有意な増加が見られた。以上の結果より GSKJ4 は 5 μM 以下であれば正常細胞に影響
を与えないことが明らかとなった。以後の実験では正常細胞に影響を与えない 5μM 以下の
濃度で実験をおこなっていくこととした。次に同様の条件で A2780CSCに対する GSKJ4 の
影響を検討した。この結果は全くの予想外だったが、僅か 1 uM の GSKJ4 でも A2780CSC
の生細胞率は有意に減少し死細胞数が有意に増加した。以上より GSKJ4 は正常細胞に影響
を与えない濃度で A2780CSCの細胞死を誘導することが示された。一方、GSKJ4処理後も、
少数の A2780CSC は残存していた。癌幹細胞の特性上、少数でも残存していれば、自己複
製し、腫瘍を創始する可能性があり、当初の予定通り残存している細胞の自己複製能と腫
瘍創始能が GSKJ4 処理により喪失しているか検討を行った。初めに、ウェスタンブロッテ
ィング法にて細胞内に発現する幹細胞マーカーの GSKJ4 処理による変化を確認した。結果
として GSKJ4 処理群において、幹細胞マーカーである SOX2、NANOG、BMI1、OCT4A の
発現が抑制された。また、GSKJ4 の標的分子である、脱メチル化酵素 JMJD3の発現も抑制
された。さらに、上皮分化マーカーである E-cadherinの発現が亢進していた。次に、GSKJ4
処理による A2780CSCの細胞表面幹細胞マーカーの 1つである CD133 の陽性率の変化をフ
ローサイトメトリーで検討した。結果として GSKJ4 処理により CD133陽性細胞の割合は低
下した。次に、Sphere 形成能について検討を行った。結果として、コントロール群と比較
して Sphere を形成していた Wellの割合は GSKJ4群で有意に低下していた。次に GSKJ4 処
理によって実際に卵巣がん幹細胞内の H3K27 のトリメチル化量が増加しているのかウェス
タンブロッティング分析で確認を行った。結果として GSKJ4 処理により A2780CSC の
H3K27 におけるトリメチル化量が増加していた。次に、腫瘍創始能について検討を行った。
GSKJ4およびコントロールとしてDMSOで処理したA2780CSCを生細胞数が同数となるよ
うに調整した後、各群 5 匹ずつヌードマウスの腹腔へ同数移植し、生存期間を検討した。
結果としてコントロール群は 70日までに全 5匹が腹部膨満を来した後に死亡したのに対し
て、GSKJ4 処理群では移植後 80日目に 1匹が死亡したがその後も 4匹は生存し、GSKJ4群
で有意に生存期間が延長した。 
GSKJ4 処理により、当初の想定からは全くの予想外の結果となったが、GSKJ4 は IMR90
に影響を与えない濃度で卵巣がん幹細胞株 A2780CSC の細胞増殖の抑制および細胞死を誘
導することが示された。さらに GSKJ4 処理により自己複製能の指標である幹細胞マーカー
の発現や Sphere 形成能は抑制されることが示され、卵巣がん幹細胞における自己複製能が
抑制されたことが示唆された。また、GSKJ4 処理によりヌードマウスにおける腫瘍増殖が
抑制され、卵巣がん幹細胞の腫瘍創始能が抑制されているも示された。さらに、その過程
において細胞内の H3K27のトリメチル化量が増加していることも示された。 
結語として、本研究により世界で初めて H3K27 のトリメチル化はがん幹細胞の分化にお
いても重要な役割を果たし、ヒストン脱メチル化酵素阻害薬 GSKJ4 は卵巣がん幹細胞標的
治療薬となり得ることが示された。 


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