Ehime University Institutional Repository

中曽, 久雄

Japanese

修正1条と動機審査 -Elena Kagan の動機審査理論(4)

同性婚と憲法 (札幌地判令和3年3月17日)

仲道, 雅輝

井口, 梓

桐野, 律子

富永, 真奈美

徳田, 明仁

若林, 良和

大学広報における学生による情報発信の成果と課題 : 「コロナ禍」の中で学生向けプレスリリース研修会を実施して

諸田, 龍美

「山の詩人」白居易〔一〕─生誕から三十四歳まで─

Ehime University (愛媛大学)博士(農学)thesi

大塚, 祐季

学位論文全文に代わる要約 
Extended Summary in Lieu of Dissertation 
 
 
氏名： 
Name 
大塚 祐季 
 
学位論文題目： 
Title of Dissertation 
機能性成分環状ジペプチドの生成機構に関する研究 
 
 
学位論文要約： 
Dissertation Summary 
 
2分子のアミノ酸が脱水縮合したジケトピペラジン構造を基本骨格とする環状ジペプチド (DKP、
図1) は、タンパク質の構成アミノ酸20種類の組合せでD・L体を区別しない場合、210種類が存在する。
従来、DKPはビール等の苦味寄与成分として知られてきたが、近年では、抗ガン作用、抗菌作用、学
習意欲改善効果など、直鎖ペプチドにはない生理活性を示すことが報告され、注目を集めるようにな
った。これまでの研究において、DKPは焙焼食品や発酵食品中に検出されており、その中でも、Pro
含有DKP (cyclo(-X-Pro)) が豊富に含まれることが明らかとなっている。しかし、Pro含有DKP全20種
類の一斉測定法は存在せず、食品中でのPro含有DKPの定性定量的な情報は皆無である。また、DKP
は加熱や発酵に伴い生成するとされてきたが、生成機構の詳細については明らかでない。そこで本研
究では、直鎖ペプチドからのDKPの生成に対する各種反応条件の影響を調べ、生成機構の解明を行っ
た。また、Pro含有DKPのLC-MS/MSによる一斉測定法を開発し、食品へ適用するとともに、実際の
食品中でのDKP生成機構に関する考察を行った。 
直鎖ペプチドからのDKP生成機構: ジペプチド2種類 (Pro-Leu、Leu-Pro)、トリペプチド10種類 (Gl
y-Pro-Leu、Leu-Pro-Gly、Leu-Gly-Pro、Gly-Leu-Pro、Pro-Gly-Leu、Pro-Leu-Gly、Gly-Pro-Gly、Leu-Pro
-Leu、Phe-Pro-Gly、Leu-Pro-Phe)、テトラペプチド1種類 (Gly-Gly-Pro-Leu) を用い、反応温度、反応
時間、反応pHがDKP生成率に及ぼす影響を調べた。その結果、直鎖ペプチドからのDKP生成率は、
温度と時間に依存して増加した。ジペプチド、トリペプチドからのDKP生成率はpH 5.0~7.0で最大と
なり、検出されたDKPは全て直鎖ペプチドのN末端から2分子のアミノ酸が環化したDKPであった。
その生成機構としては、N末端のアミノ基窒素と、N末端から 2 残基目のアミノ酸のカルボニル炭素
とが結合することで、環化反応が生じ、DKPが生成していると推察された (図2)。一方、テトラペプ
チドではpH 6.0で最大となり、N末端のGlyが脱離してトリペプチドが生成し、その後、N末端からの
2分子が環化したDKPが検出された。結果として、N末端の2残基目にProが位置する直鎖ペプチドにお
いて、高いDKP生成率が認められた。原子間距離の算出の結果、N末端の2残基目にProが位置した場
合、DKP生成に関わるアミノ基窒素とカルボニル炭素が求核反応に適した配置となり、環化反応が生
じ易くなることが判明した。このことが、食品中にPro含有DKPが豊富に存在する理由であると考え
られた。 
Pro含有DKPの一斉測定法の開発: Pro含有DKP20種類を測定対象としてLC-MS/MS条件の最適化を
行った後、各種DKP標品の検量線を作成した。その結果、今回分析対象としたPro含有DKP20種類は
保持時間18分以内に検出された (図3)。検量線の相関係数は0.995以上 (n=7)、DKP濃度0.05 mg/Lにお
ける変動係数は6％以下 (n=3) となり、高い直線性と再現性が認められた。二段階発酵茶の碁石茶中
のDKPの定量を試みたところ、各種DKPの検出限界は0.03 mg/L 以下、定量限界は0.06 mg/L 以下 (c
yclo(-Cys-Pro) を除く) であった。DKP標品 (0.05 mg/L) の添加回収試験の回収率は93~117%となり、
定量性の面でも問題がないことを確認した。以上のことから、本法は食品のDKP定量法として実用可
能であると判断した。さらに、碁石茶中には17種類のPro含有DKPが検出され、その総量は3.7 mg/L
であった。 
食品中のDKPの定量と生成機構: ナチュラルチーズ、碁石茶、鰹節を対象として、Pro含有DKP20
種類を含む全42種類のDKPの定量を行うとともに、DKP生成機構に関する考察を行った。その結果、
チーズでは、熟成チーズが未熟成チーズと比べて、DKP含量、種類ともに高い値を示した。また、カ
ゼインのプロテアーゼ (トリプシン、キモトリプシン) 消化物から25種類のDKPが検出され、そのう
ち21種類が実際のチーズで検出されたDKPと一致した。チーズ、及びカゼインの酵素消化物で検出さ
れたDKPは、カゼインの一次構造と良好な一致を示した。以上のことから、チーズ中のDKPの大部分
はカゼインに由来し、DKP生成の主要因はプロテアーゼによるタンパク質分解であることが判明した。
また、碁石茶では、発酵前に13種類のDKPが検出されたのに対し、好気発酵後に15種類、嫌気発酵後
に2種類のDKPが新たに検出された。両発酵段階においてタンパク質分解の進行とpHの低下が認めら
れ、これらの変化がDKPの生成と関連していると考えられた。一次構造との比較からRibulose 1,5-Di
phosphate Carboxylase (RuBiSCO) がDKP生成源の1つであることが判明した。鰹節においても、製造
工程中にDKP含量、種類ともに増加し、カビ付後の本枯節に最も高い値が認められた (20.9 mg/L、2
7種類)。鰹節製造工程中には、タンパク質分解の進行は認められず、焙乾工程の高温加熱とカビ付け
工程の保温による継続的な加熱がDKP生成の主要因であると推察された。以上の結果より、食品中に
含まれるDKPは、発酵に伴うタンパク質分解、あるいは加熱により直鎖ペプチドが生成し、その直鎖
ペプチドのN末端から2分子が環化して生成していることが明らかとなった。同時に、食品中のDKP
は大部分が主要タンパク質由来であることも明らかとなった。 
本研究では、食品中の主要DKPであるPro含有DKPの一斉測定法を開発して実際の食品分析に適用
するとともに、Pro含有DKPの生成機構の解明を行った。DKPは呈味や生理活性に寄与する物質とし
て注目を集めている物質であり、本研究の成果は今後の研究の発展に資するものと期待される。 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
図1: DKPの構造 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
図2: 直鎖ペプチドからのDKP生成機構 
 
 
 
図3: Pro含有DKP20種類のMRMクロマトグラム 
 


機能性成分環状ジペプチドの生成機構に関する研究

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)thesi

飯尾, 浩之

IIO, Hiroyuki

（第３号様式） 
 
 
学 位 論 文 要 旨 
 
 
 
            氏   名 飯尾 浩之 
 
 
 
            論 文 名 筋衛星細胞における DNA 維持メチル化酵素 Dnmt1 は筋再生に必須である 
 
 
 
 
 
 
 
学位論文要旨 
 
【背景】骨格筋量の減少は加齢、廃用症候群、神経疾患など様々な疾患または状態によって引き
起こされ、QOL の低下や健康寿命の短縮にも関与する。また、がんにおける筋肉量の減少を引
き起こすカへシキアは癌患者の QOL 低下のみならず、治療抵抗性や有害事象の増加にも関与し
ているとされる。これら筋肉量減少への治療法や予防法の開発が期待されるものの、現状では有
用な薬剤はない。治療法開発のためにはまず骨格筋の制御メカニズムを明らかにする必要があ
る。骨格筋は筋線維が束となり構成され、筋線維の細胞膜と基底膜の間に筋衛星細胞が存在す
る。骨格筋の筋衛星細胞 Pax7 を特異的に発現しており、筋衛星細胞は刺激がない状態では静止
状態にある。筋肉の炎症や損傷といった刺激により筋衛星細胞は増殖および分化を始める。単核
の筋衛星細胞から筋芽細胞へと分化し、そして筋芽細胞が融合し、多核の筋線維を形成する。一
方で、筋衛星細胞はその静止状態の細胞の数を維持するために、一部の細胞は分化の道から外
れ、再び静止状態となる。最近のマウスの研究では、筋衛星細胞が筋肉の再生に不可欠であるこ
とが明らかになった。また、エピジェネティックな転写制御は、運動の中心臓器である骨や筋肉
を含むすべての細胞種の分化に不可欠である。細胞の分化は、DNA メチル化、ヒストン修飾、
クロマチンリモデリングなどのエピジェネティックな制御とともに転写因子によって統制されて
いる。DNA メチル化については de novo メチル化に関与する DNA メチル化酵素 Dnmt3a と
Dnmt3b、維持メチル化に関与する Dnmt1 が、DNA メチル化反応を触媒する酵素として同定され
ている。Dnmt3a が制御する de novo メチル化と骨格筋再生との関係が報告されているが、維持
DNA メチル化の調節因子と骨格筋再生との関係は明らかではない。本研究では、骨格筋再生に
おける Dnmt1 の役割を解明するために、筋衛星細胞特異的 Dnmt1 ノックアウトマウスを作製
し、筋再生モデルと RNA シークエンスを用いて解析した。 
氏名 飯尾 浩之  
 
【方法】(1) 筋再生とエピジェネティックな変化との関係を解析するため、筋損傷後の野生型
マウスの前脛骨筋をヘビ毒の注射で障害させ、4、7、14 日目に採取した。そのサンプルを用
い、DNA メチル化因子 Dnmt1、Dnmt3a、および Dnmt3b の mRNA 発現を調べた。 
(2) Dnmt1 が筋再生に必要かどうか調べるため、まず Pax7CreERT2; Dnmt1f/fマウスを作出した。こ
のマウスにタモキシフェンを 5 日間連続で腹腔内投与することで、筋衛星細胞に特異的に
Dnmt1 をノックアウトした。Dnmt1f/fマウスにも同様に投与しコントロールとした。投与開始 7
日目に下肢の筋肉を採取し、FACS を用いて筋衛星細胞を単離した。qPCR とウエスタンブロッ
トでノックアウトを確認した。 
 (3) 筋衛星細胞において Dnmt1 が筋再生に必要かどうか調べるため、cKO マウス(タモキシフ
ェンを投与した Pax7CreERT2; Dnmt1f/fマウス)と 2 種類のコントロールマウス Con1 コーンオイルを
投与した Pax7CreERT2; Dnmt1f/fマウス)および Con2（タモキシフェンを投与した Dnmt1f/fマウス）の
2 種類のコントロールマウスを用いて評価した。それぞれの左前脛骨筋(n=5)にヘビ毒を注入し，
筋損傷後 14 日目に採取した。外観の観察と筋重量を測定し、筋再生は筋線維断面積(CSA)を計
測し評価した。 
(4) 骨格筋における Dnmt1 の機能を調べるために、筋衛星細胞を用いて RNA-seq を行った。
Pax7CreERT2; Dnmt1f/fマウスおよび Dnmt1f/fマウスのそれぞれにタモキシフェンを 5 日間連続で投与
し、7 日目に筋衛星細胞を単離し、増殖培地で３日間培養した後に RNA を回収した。また
RNA-Seq により Dnmt1 ノックアウトで有意に発現が上昇した遺伝子群を抽出し、Gene ontology 
(GO) 解析にて発現変動する遺伝子群の機能を分類した。その結果をもとに、筋衛星細胞を同様
に単離後、培養し細胞数を評価した。 
【結果と考察】野生型マウスを用いた筋再生モデルでは mRNA レベルで Dnmt3a、Dnmt3b より
も Dnmt1 の発現が大きく増加していた。Pax7CreERT2; Dnmt1f/fマウスを作出し、筋衛星細胞特異的
な Dnmt1 のノックアウトを qPCR とウエスタンブロットで確認できた。筋衛星細胞特異的
Dnmt1 ノックアウトマウスを用いた筋損傷実験ではコントロールマウスに比べて外観上の筋再
生不良と筋重量の有意な低下を認めた。また CSA も有意に減少しており、Dnmt1 が筋肉の再生
に必須の因子であることが示唆された。RNA-seq の結果、Dnmt1 のノックアウトで 289 個の遺
伝子発現が上昇しており、これらに対する GO 解析ではアポトーシスや細胞接着に関連する遺伝
子群が抽出された。Dnmt1 をノックアウトした筋衛星細胞の培養では細胞数の減少を認めてお
り、Dnmt1 が衛星細胞数の正の調節に関与していることを示唆している。本研究は筋衛星細胞
における Dnmt1 の機能について初めて報告したものである。これらのメカニズムを解明するこ
とで、骨格筋の減少や筋疾患の治療法の開発につながる可能性がある。 
【倫理審査】本研究にて実施した動物実験は愛媛大学動物実験委員会、遺伝子組換え実験は愛
媛大学医学系研究科等遺伝子組換え実験安全委員会により承認されている。 
 
キーワード（３～５） 
 
 
 
Dnmt1 
筋衛星細胞 
エピジェネティクス 
骨格筋 
筋再生 
 


English

筋衛星細胞におけるDNA維持メチル化酵素Dnmt1は筋再生に必須である

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)doctoral thesi

宇佐美, 知香

USAMI, Tomoka

（第７号様式） 
学位論文審査結果の要旨
 氏   名 宇佐美 知香 
 審 査 委 員 
  主 査    
  副 査    
  副 査    
  副 査    
  副 査    
論  文  名 妊娠糖尿病の診断時期別妊娠転帰の比較：国内多施設共同後方視的検討 
審査結果の要旨 
【背景と目的】 
 妊娠糖尿病とは、妊娠中にはじめて発見された糖代謝異常であり、近年増加傾向にある。妊
娠糖尿病による妊娠合併症として、母体側の妊娠高血圧症候群や帝王切開、2 型糖尿病の発症
など、児においては large-for-gestational-age (LGA)、新生児低血糖、新生児黄疸、将来の
生活習慣病発症等が問題となる。妊娠前半に診断された妊娠糖尿病と後半に診断された妊娠糖
尿病では、妊娠合併症リスクへの影響が異なるのかどうかに関する報告はほとんどない。本研
究では Japan Diabetes and Pregnancy Study Group database を用いて、妊娠 24 週未満に妊
娠糖尿病と診断された早期群と 24 週以降に診断された後期群で、妊娠合併症リスクとの関連
を調べた。 
【方法】 
 2003 年から 2009 年まで、全国大学病院等 40 医療機関から収集したデータを用いて、後ろ向
きコホート研究を実施した。各医療機関の倫理委員会の承認を得、研究参加者から書面による同
意を得た。別途、愛媛大学医学部附属病院臨床研究倫理審査委員会（承認番号 2011018）の承認
を得た。本研究に参加した 2691 名のうち、単胎妊娠で妊娠糖尿病と診断された方から、1 型あ
るいは２型糖尿病、自己免疫疾患の既往のある方を除外し、1481 名を対象とした。対象者は妊
三宅　吉博
伊賀瀨　道也
阿部　雅則
髙田　康徳
濱口　直彦
 
 
娠初期と後半期の２回血糖のスクリーニング検査を受け、陽性の場合、75 g OGTT を実施した。
日本産婦人科学会の基準に従い、妊娠糖尿病を判定した。妊娠糖尿病と診断された妊婦は、血
糖自己測定、食事療法、必要に応じてインスリン治療を受けた。統計解析は SAS version 9.4
を用いた。 
 
【結果】 
 早期群 600 名、後期群 881 名の 2 群に分けて解析を行った。2 群間の単変量解析では、分娩
時年齢、妊娠前 BMI、妊娠中体重増加、出生児体重、75 g OGTT の負荷前、負荷後 1 時間血糖
値、妊娠高血圧症候群、帝王切開、LGA で有意差を認めた。経産数、分娩週数、負荷後 2 時間
血糖値、新生児死亡、先天性疾患、small-for-gestational-age、巨大児、新生児低血糖、新
生児黄疸、NICU で有意差は認めなかった。妊娠高血圧症候群をアウトカムとした多変量ロジ
スティック回帰分析では、後期群に比較し早期群では有意な正の関連を認め、分娩時年齢、未
産婦、妊娠前 BMI、妊娠中体重増加、負荷後 2 時間血糖値も有意な正の関連を認めた。負荷後
1 時間血糖値は関連がなかった。LGA をアウトカムとした多変量ロジスティック回帰分析では、
早期群に比較し後期群では有意な関連を認めなかった。また、分娩時年齢とは有意な正の関連
を認めたが、妊娠前 BMI、妊娠中体重増加、負荷後 2 時間血糖値とは関連を認めなかった。 
 
【結論】 
 早期妊娠糖尿病は妊娠高血圧症候群のリスクの高まりと関連したが、LGA のリスクと関連を
認めなかった。今後、妊娠早期に診断された妊娠糖尿病に関する様々なエビデンスが必要であ
る。 
 
 本研究は妊娠糖尿病を妊娠早期に診断された群と妊娠後期に診断された群に分けて妊娠合併
症リスクとの関連を示した本邦初の報告であり、現在、DREAM-Bee study と称する前向きの疾病
登録データベースを構築しているなど、今後のさらなる発展が期待される研究成果である。公開
審査会は、令和３年４月２０日に開催され、申請者は、研究内容を英語で明確に発表し、１）妊
娠 24 週前後で 2 群に分けた理由、２）妊娠糖尿病をスクリーニングするタイミング、３）妊娠
糖尿病による長期的な子供の健康影響、４）早期妊娠糖尿病におけるエストロゲンとインスリン
抵抗性の関連、５）糖尿病家族歴と早期妊娠糖尿病との関連、６）早期妊娠糖尿病における介入
すべき要因、７）本邦と国際的な診断基準の違いよる影響、８）妊娠高血圧症候群の定義の詳
細、９）妊娠前の介入の実行可能性、１０）妊娠糖尿病の重要性の変遷、１１）早期妊娠糖尿
病で帝王切開が多い理由、１２）妊娠高血圧症候群による母体の予後、１３）帝王切開につい
て多変量解析がなかった点、１４）後期妊娠糖尿病と妊娠高血圧症候群の因果関係、１５）負
荷後１時間血糖値と２時間血糖値の相関と多重共線性などに関する多くの質問に対し日本語で
的確に応答した。 
審査委員は、申請者が本論文関連領域に対して学位授与に値する十分な見識と能力を有するこ
とを全員一致で確認し、本論文が学位授与に値すると判定した。 
 
 
 


妊娠糖尿病の診断時期別妊娠転帰の比較:国内多施設共同後方視的検討

秋山, 英治

話し言葉・書き言葉に対する大学生・高校生の認識

信原, 孝司

教育実践総合センターの活動実践と大学院教育について - 臨床心理学の視点から -

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