Ehime University Institutional Repository

石橋, 弘志

 
 
23 
 
愛媛大学農学部紀要 67 号：23–26（2022） 
Memoirs of the Faculty of Agriculture, Ehime University, 67: 23–26 (2022) 
 
学会賞受賞研究 
動物福祉に配慮したメダカ胚および仔魚を用いた 
内分泌かく乱化学物質のエストロジェン様作用の評価に関する研究 
 
石橋 弘志* 
Hiroshi ISHIBASHI 
Choriogenin in Medaka Embryos and Larvae as an Alternative Model 
for Screening Estrogenic Endocrine-Disrupting Chemicals 
 
Abstract 
The present study assessed the mRNA expression levels of choriogenins (ChgL and ChgH), vitellogenins 
(Vtg1 and Vtg2), cytochrome P450 aromatase (CYP19a1b), and ER subtypes (ERα, ERβ1, and ERβ2) in 
embryos and larvae of medaka (Oryzias latipes) exposed to estrogenic endocrine-disrupting chemicals 
(EDCs), such as 17β-estradiol (E2), p-n-nonylphenol (NP), and bisphenol A (BPA). In E2 (0.10–222 
nM)-treated 7 days-post-fertilization (dpf) embryos and 9 or 12 dpf larvae, ChgL and ChgH expression was 
up-regulated in a concentration-dependent manner. By contrast, interestingly, Vtg1 and Vtg2 expression was 
not induced in E2-treated 7 dpf embryos but was significantly induced in 9 and 12 dpf larvae, suggesting a 
developmental-stage-specific regulatory mechanism underlying Vtg expression. The exposure of maximum 
concentrations of NP (0.09–1.5 μM) and BPA (1.8–30 μM) up-regulated Chg expression in 9 or 12 dpf larvae. 
The relative estrogenic potencies (REPs) of E2, NP, and BPA were 1, 2.1 × 10−
4
, and 1.0 × 10−
5
, respectively. 
These results suggest that Chg transcription in medaka embryos and larvae can be used as a sensitive 
biomarker for screening potential estrogenic EDCs. Our assay system using independent feeding stages (e.g., 
embryonic and early larval stages) can be used as an in vivo suitable alternative model for evaluating EDCs. 
Key words: choriogenin, vitellogenin, endocrine-disrupting chemicals (EDCs), embryos, larvae, Oryzias latipes 
 
 
1. 日本水環境学会中国・四国支部研究奨励賞受賞の
経緯 
令和 3 年 5 月 28 日に開催された日本水環境学会中
国・四国支部総会において「令和 2 年度日本水環境学
会中国・四国支部研究奨励賞」を受賞した．本賞は，
水環境に関する優れた研究・調査成果を発表し，将来
が期待される個人に贈呈される．受賞対象となった論
文「Choriogenin transcription in medaka embryos and 
larvae as an alternative model for screening estrogenic 
endocrine-disrupting chemicals」（Ishibashi et al., 2020）
は，本学農学部の天満柚来氏，有明工業高等専門学校
の内田雅也先生・冨永伸明先生，熊本高等専門学校（現 
東海大学）の平野将司先生，熊本県立大学（現 熊本大
学）の有薗幸司先生との共同研究により実施したもの
である．ここでは，その受賞対象となった論文の研究
内容について紹介する． 
2. 内分泌かく乱化学物質とその評価の現状 
内分泌かく乱化学物質（EDCs）は，ヒトや野生生物
などの生体内に微量取り込まれ，ホルモン疑似作用や
ホルモンかく乱作用などを引き起こすことにより，生
殖系や免疫系などへの影響，発がん，肥満および心血
管疾患など疾患への関与，さらに次世代影響などが指
2022 年 12 月 23 日受領 
*愛媛大学農学部生態系保全学教育分野（責任著者） 
 
 
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摘されている（Colborn et al., 1993; Stone, 1994）．EDCs
は，我々の生活環境中において微量かつ複合して存在
するため，ヒトや野生生物は慢性的に曝露される．そ
のため，EDCs の健康・環境リスクを適切に評価し，必
要に応じて管理していくことが重要である．我が国で
は，EDCs 問題の提起された 1990 年後半から，世界で
もいち早く研究が実施されてきた（環境省，2022）． 
生体内に取り込まれた EDCs は，エストロジェン（女
性ホルモン）受容体（ER），アンドロジェン（男性ホ
ルモン）受容体（AR），甲状腺ホルモン受容体，レチ
ノイド受容体などの核内受容体を介して作用・影響す
ると考えられている（Diamanti-Kandarakis et al., 2009）．
そこで，核内受容体に対する EDCs の直接的な結合親
和性や転写活性化能をスクリーニングするため，環境
省などを中心に，受容体結合試験やレポーター遺伝子
アッセイなどの試験管内試験（in vitro 試験）が開発さ
れている．また，ER や AR などを介したエストロジェ
ン／アンドロジェン様作用などの関与した生殖・繁殖
影響などを評価するための短期曝露の生物試験（ in 
vivo 試験）や，より長期曝露（1 世代／多世代）の生
物影響を評価するための in vivo 試験も開発されている．
環境省は，これら開発した試験法を用いた EDCs の作
用・影響の評価に加えて，EDCs の環境中濃度の実態把
握および曝露評価，化学物質の内分泌かく乱作用に関
する知見の収集などからリスク評価およびリスク管理
を実施している．また，開発された試験法の一部は経
済協力開発機構（OECD）テストガイドライン（TG）
にも採用され，国際協力および情報発信の推進にも貢
献している．なお，これらの取組は「化学物質の内分
泌かく乱作用に関する今後の対応-EXTEND2022-」と
して公表されているので，そちらも参照いただきたい
（環境省，2022）． 
3. EDCs 評価のための魚類バイオマーカー 
我々が生産・使用・廃棄した EDCs の多くは，産業
排水や生活排水に含まれ，河川を通じて湖沼や海洋に
広がるため，特に水圏の野生生物に影響を及ぼす可能
性がある．環境省では，メダカ（Oryzias latipes）やゼ
ブラフィッシュ（Danio rerio）など魚類の核内受容体
を介して引き起こされる EDCs の生体影響を評価して
おり，特に ER を介したエストロジェン様作用に関す
る生体影響評価については多くの研究がある（環境省，
2022）．魚類 ER は，核内受容体スーパーファミリーに
属し，3 種類のサブタイプ（ERα，ERβ1，ERβ2）が同
定されている（Boyce-Derricott et al., 2009; Chakraborty 
et al., 2011）．ER はリガンドと結合し活性化され ER 二
量体となり，卵黄タンパク質前駆体のビテロジェニン
（Vtg）や卵膜タンパク質前駆体のコリオジェニン
（Chg）などの発現を制御する（原，2013）．魚類を含
めた卵生脊椎動物では，これら雌特異タンパク質は女
性ホルモンである 17β-エストラジオール（E2）の作用
により肝臓で合成され，血液中に分泌されるが，未熟
魚や雄魚ではほとんど検出されない．しかし，エスト
ロジェン様作用を持つ EDCs の曝露によって，雄魚や
未成熟魚で発現誘導されることから（図 1），Vtg や Chg
は EDCs 曝露に対する有用なバイオマーカーと考えら
れている（Sumpter and Jobling, 1995）．我々の研究グル
ープでは，これまで Vtg や Chg をバイオマーカーとし
て，様々な化学物質のエストロジェン様作用を明らか
にした（Ishibashi et al., 2004; 2006; 2018, Yamaguchi et al., 
2015）．また，エストロジェン様作用を示した一部の化
学物質は，繁殖阻害（産卵数の減少や受精率の低下な
ど）や次世代胚の孵化率の低下・奇形発生なども引き
起こし，これら有害影響におけるエストロジェン様作
用の関与を示唆した（Ishibashi et al., 2006; 2018）． 
4. 魚類の胚および仔魚を用いた EDCs の評価 
前述のように，魚類に対する EDCs のエストロジェ
ン様作用の評価において，雌特異タンパク質であるVtg
や Chg は有効なバイオマーカーとして用いられてきた．
また，これらバイオマーカーの発現解析は，主に未熟
魚や雄魚を対象に行われてきたが，胚ではほとんど知
見がない．一方，近年 3R の原則のような動物福祉・
倫理問題の観点から，実験動物の削減や代替試験法の
開発が求められている．3R の原則とは「Replacement
（代替法の利用）」，「Reduction（使用動物数の削減）」，
「Refinement（苦痛の軽減）」である．「化学物質の審
査及び製造等の規制に関する法律」（化審法）などでは，
藻類，甲殻類および魚類などの水生生物を用いた生態
毒性試験が実施されており，例えば，魚類急性毒性試
・・・・・
・・・・・
・・・・・
・・・・・
Liver
Liver
Estrogens
(e.g., 17β-estradiol)
Endocrine-disrupting chemicals
(e.g., Nonylphenol, Bisphenol A)
Estrogen receptor
(ER)
Transcription
DNA
RNA
Protein synthesis
(e.g., Vtg and Chg)
Nucleus
Cytoplasm
図 1 EDCs による Vtg および Chg 発現制御の模式図 
 
 
25 
 
験（OECD TG203）では化学物質に 96 時間曝露した際
の魚類に及ぼす影響を半数致死濃度（LC50）として評
価している．供試魚としてゼブラフィッシュやメダカ
などの小型魚類のモデル生物の使用が推奨されている．
しかし，OECD は EU 指針の動物保護に規制されない
（化学的目的で用いる動物の保護において卵や胚など
の摂餌前ステージは規制外）魚類胚急性毒性試験（Fish 
embryo toxicity test: FET 試験）を OECD TG236 として
開発している．FET 試験では，供試魚としてゼブラフ
ィッシュを推奨しているが，ゼブラフィッシュ以外の
魚種を適用した例は少ない．また，FET 試験では急性
毒性を評価しており，エストロジェン様作用は評価対
象としていない．そこで，FET 試験にメダカを適用し，
急性毒性に加えてエストロジェン様作用の評価も可能
な試験系の確立を試みた。モデル化合物として，E2，
p-n-ノニルフェノール（NP），ビスフェノール A（BPA）
を用いた。 
4.1. FET 試験による評価 
メダカ FET 試験において，4.6 および 9.2 μM E2，2.8
および 5.7 μM NP，54.8 μM BPA に 14 日間曝露した受
精卵では，孵化率の有意な減少が見られた．また，4.6
および 9.2 μM E2 曝露区では，孵化までの時間が有意
に遅延した．18.4 μM E2，11.3 および 22.7 μM NP，110
および 220 μM BPA に 14 日間曝露した受精卵は，発生
遅延のため孵化できず，すべての胚は 14 dpf（受精後
の日数）以内に死亡した．2.3 μM 以上の E2，2.8 μM
以上の NP，110 μM の BPA を曝露した 7 dpf 胚の心拍
数は有意に減少した．胚の生存率，孵化率および心拍
数に対する E2，NP および BPA の LC50および最小影響
濃度（LOEC）を表 1 に示した．一方，仔魚（孵化後
24 時間以内を供試）に対する E2，NP および BPA の
96時間 LC50値は，それぞれ 9.4 μM（95％信頼区間［CI］
=8.5−10.4 μM），2.0 μM（95％CI=1.9−2.1 μM），58 μM
（95％CI=53−64 μM）であった（表 1）． 
4.2. エストロジェン様作用の評価 
発生段階におけるバイオマーカー遺伝子の発現変動
を明らかにするため，E2（2 µM）を受精卵（<受精後 5
時間）に受精後 1〜8 日後（dpf）まで曝露し，各 dpf
胚の Vtg1, Vtg2, ChgL, ChgH, アロマターゼ（CYP19a1b）
および ER サブタイプ（ERα, ERβ1, ERβ2）遺伝子の発
現をリアルタイム RT-PCR で測定した．その結果，2 µM 
E2 を曝露した 3〜8 dpf 胚の ChgL および ChgH の発現
は対照区と比較して有意に増加した．しかし，Vtg な
ど他の遺伝子の発現に変化は見られなかった． 
 
 
表 1 メダカ胚および仔魚に対する EDCs の影響濃度 
 影響濃度（µM） 
E2 NP BPA 
生存率    
14 日間 LC50（胚） 3.4 2.7 60 
96 時間 LC50（仔魚） 9.4 2.0 58 
孵化率    
LOEC（14 dpf 胚） 4.6 2.8 55 
心拍数    
LOEC（14 dpf 胚） 2.3 2.8 110 
エストロジェン様作用    
LOEC（7 dpf 胚） ≤0.00091 > 1.5 > 30 
LOEC（9 dpf 仔魚） ≤0.00031 1.5 30 
LOEC（12 dpf 仔魚） 0.00031 > 1.5 30 
REP 1 2.1 × 10-4 1.0 × 10-5 
E2，17β-エストラジオール；NP，p-n-ノニルフェノール；BPA，ビ
スフェノール A；LC50，半数致死濃度；LOEC，最小影響濃度；REP，
エストロジェン様作用の相対値． 
 
次に，受精卵に各濃度の E2，NP，BPA をそれぞれ
曝露し，7 dpf 胚，9 および 12 dpf 仔魚について遺伝子
発現解析を行った．その結果，E2（0.10−222 nM）に曝
露した 7 dpf 胚，9 および 12 dpf 仔魚では，ChgL およ
びChgH遺伝子の発現は濃度依存的に増加した．一方，
Vtg1 および Vtg2 遺伝子の発現は，E2 曝露した 7 dpf
胚では変化が見らなかったものの，9 および 12 dpf 仔
魚では有意な増加が見られ，Vtg の発生段階特異的な
発現制御機構が示唆された．また，NP（0.09−1.5 μM）
および BPA（1.8−30 μM）の最大濃度を曝露した 9 およ
び12 dpf仔魚では，Chg遺伝子発現の増加が見られた．
これらの結果から，E2，NP および BPA の各遺伝子発
現応答に及ぼす LOEC の最小値と，エストロジェン様
作用の相対値（REP）を算出したところ，それぞれ 1，
2.1 × 10
-4，1.0 × 10-5となった（表 1）．これら REP は，
既報（Yamaguchi et al., 2005; Ishibashi et al., 2016）の雄
メダカ成魚と同等であった． 
以上のことから，メダカ胚および仔魚の FET 試験を
用いて，EDCs の急性毒性に加えエストロジェン様作用
も評価できる試験系を確立することができた． 
5. おわりに 
本稿では，エストロジェン様作用を示す EDCs の評
価におけるメダカ胚および仔魚の Chg の有用性につい
て紹介した．我々の最近の研究では，本評価系を妊馬
由来で医薬品原料に使用されているエクインエストロ
ジェン類に適用し，エクイリン，エクイレニンおよび
 
 
26 
 
それら代謝物はメダカ胚 Chg 遺伝子発現を増加させ，
エストロジェン様作用を示すことを明らかにした
（Ishibashi et al., 2021）．これらの研究成果は，水環境
中に存在する EDCs を含めた化学物質のエストロジェ
ン様作用のスクリーニング評価系の高度化に加え，非
摂食発達段階である胚／仔魚の適用により毒性試験に
おける動物愛護・福祉にも貢献することが期待される． 
最後に，共同研究者の皆様および本受賞の選考にあ
たられた日本水環境学会中国・四国支部の関係各位に
この場をお借りして深く感謝申し上げます． 
本研究は科研費（17H01914, 18K19884）の助成を受
けたものである． 
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