Ehime University Institutional Repository

市川, 克明

Japanese

復古王政・七月王政下(1814年～1848年)のパリの音楽界 ～ サロンコンサートから楽器製造まで ～

中曽, 久雄

夫婦同氏規定と憲法

岡田, 英作

加藤, 匡宏

「宗教に関する一般的な教養」についての一考察 -インバウンド対応ガイドブックを参考として-

梶原, 克彦

奈良岡, 聰智

第一次世界大戦と在独日本人の抑留問題(三)

諸田, 龍美

元稹「才識兼茂明於体用策一道」訳注(下)

杉田,, 郁代

大学教育におけるクラス担任制度の実態と課題について -相談支援の頻度が高い教員に着目して-

奈須, 悠樹

向, 平和

隅田, 学

小林, 直人

上田, 敏子

医療従事に関するキャリアデザインの実態調査 -愛媛大学医学部生の調査結果について-

Ehime University (愛媛大学)博士(農学)thesi

赤澤, 隆志

AKAZAWA, Takashi

（様式５）(Style5) 
学位論文全文に代わる要約 
Extended Summary in Lieu of Dissertation 
 
 
氏名： 
Name 
赤澤隆志 
 
学位論文題目： 
Title of Dissertation 
Structural and functional analyses of egg white protein ovalbumin-related protein 
X in chicken embryo 
（鶏卵白タンパク質ovalbumin-related protein Xの胚発生における構造と機
能の解析） 
 
 
学位論文要約： 
Dissertation Summary 
 
Egg white, seen in avian and reptile eggs, is located in the space between egg yolk and egg shell. 
Physiological roles of egg white in embryo development have been well-documented in chicken egg. Egg white 
provides nutrition for developing embryo and protects egg yolk against physical shock and microbial infections. 
Protein is a key component to the above-mentioned chemical and physical properties of egg white (nutrition 
supply, physical shock absorption, and antimicrobial action). There exist 148 kinds of proteins in chicken egg 
white. Egg white proteins play a role in serving amino acids for development of chick embryo. Some egg white 
proteins, ovotransferrin (OTF) and lysozyme (LYZ), exert antimicrobial action to protect egg yolk harboring an 
embryo from microbial infection. In addition to the roles in assisting the growth of embryo, more direct 
involvement in embryo development has been proposed for ovalbumin (OVA). It has been reported that small 
amount of OVA existing in egg white is incorporated in its intact form into the chick embryo. This fact suggests 
that OVA may have more direct functions in developing embryo, in addition to contributing as the storage protein 
to serve amino acids into embryo. Besides OVA, some other proteins, such as OTF and LYZ, were detected in 
embryonic organs and/or blood system. However, there is yet little information on these proteins’ functions 
involved in embryo development. 
In major egg white proteins such as OVA, OTF, and LYZ, numerous studies have been conducted to 
characterize physicochemical and structural properties of these molecules. On the other hand, few studied have 
focused on minor egg white protein due to the difficulty of purification. Ovalbumin-related protein X (OVAX) is 
one of the minor egg white protein and its functions remain unclear. OVAX is a glycoprotein with molecular 
weight 45430 Da and pI 6.29. Recently, OVAX was reported to interact with heparin, a negatively charged 
glycosaminoglycan. Heparin and its analog heparan sulfate (HS) play crucial roles in multiple biological 
processes, such as cell proliferation, cell migration, and cell differentiation during embryogenesis. This raises the 
possibility that the heparin-binding protein OVAX participates in embryo development through binding to 
heparin and HS.  
The aim of this study is to figure out OVAX’s biological functions during embryo development. The 
first study was to investigate whether OVAX migrates from egg white into embryo and whether OVAX is 
localized in embryonic organs. The second study was to estimate heparin-binding affinity of OVAX in embryonic 
stages by monitoring the change of heparin-binding affinity of the protein in egg white during incubation of egg 
at 37°C. The third study was to investigate the participation of OVAX in chondrogenic activity of a growth factor 
bone morphogenetic protein 2 (BMP2) as a model system for the exploration of OVAX’s functions in embryo 
development. 
Firstly, whether egg white OVAX migrates into chick embryo was investigated by immunological methods. No 
cross-reacted protein was detected in egg yolk of egg before incubation (0d-egg); while a 50kDa protein band 
（様式５）(Style5) 
was observed in egg yolk of egg incubated at 37 ºC for 10 days (10d-egg) and egg incubated under the same 
conditions for 16 days (16d-egg). The 50kDa protein band was thicker in 16d-egg yolk than in 10d-egg yolk. The 
increase in OVAX level during incubation implies that OVAX, although it does not exist in yolk in early 
incubation stage (0d-egg), accumulates in yolk in middle and later stages (10d- and 16d-egg). Thus, OVAX was 
localized in the yolk of egg incubated for 10 days or longer. These results demonstrate that egg white OVAX 
moves into yolk during the embryo development. Immunohistochemical analysis of embryo resided in 
10day-incubated eggs showed that OVAX was detected in most of the organs, including brain, eye, heart, liver 
and stomach. These suggest that OVAX is incorporated from egg white into the embryo through egg yolk. 
Secondly, heparin-binding affinity of OVAX in egg white of fertilized egg was assessed. Each of egg white 
separated from 0d-egg and 10d-egg was subjected to heparin sepharose chromatography. Elution profile of egg 
white protein separated from 0d-egg showed that a broad shoulder appeared in the NaCl concentration range of 
0.10 – 0.23 mM, donated as P-1, and three discrete peaks were observed in the concentration range of 0.24 – 0.39 
mM, 0.40 – 0.49 mM, and 0.50 – 0.60 mM which is denoted as P-2, P-3, and P-4, respectively. The elution 
profile of 10d-egg showed that four discrete peaks which were observed at the same salt elution positions as P-1 
to P-4 of the 0d-egg’s profile. As compared with the 0d-egg’s profile, the peak area of P-4 peak was diminished in 
the 10d-egg’s prolife. On the contrary, the three peaks of P-1, P-2, and P-3 were greatly expanded in the 
10d-egg’s profile. The abundance ratio of OVAX in each peak was determined by ELISA. In 0d-egg, OVAX was 
mainly eluted at P-3 and P-4, of which their abundance ratios were 55.7±2.3% and 33.3±3.1%, respectively. In 
10d-egg, OVAX eluted at P-4 was a minor protein as indicated by its small amount (9.6±0.4%). Alternatively, 
OVAX eluted at P-2 was dominant, accounting for 61.5±3.0%. These results indicate that elution of OVAX 
partially shifted from P-3 and P-4 to P-2 after incubation for 10 days.  
Here, OVAX eluted at P-1, P-2, P-3 and P-4 were denoted as OVAX1, OVAX2, OVAX3 and OVAX4, 
respectively. OVAX4 residing mainly in 0d-egg and OVAX2 residing dominantly in 10d-egg were used for a 
stoichiometric analysis of heparin-binding affinity. The stoichiometric analysis of the two OVAX molecular 
species was carried out by isothermal titrating calorimetry (ITC) using fondaparinux (a low molecular weight 
heparin) as a ligand. Dissociation constant value (Kd) of OVAX2 was 0.185 µM, which is two times higher than 
that of OVAX4 (0.096 µM). The difference in Kd value was subtle, but the data clearly support the results of 
heparin sepharose chromatography that OVAX2 has weaker heparin-binding affinity than OVAX4. In contrast, the 
number of fondaparinux bound to OVAX2 was ca.3, which is nearly identical to the number for OVAX4. In sum, 
ITC results showed that OVAX2 has equal number of heparin-binding domain with OVAX4, but has slightly 
weaker heparin affinity than OVAX4 dose.  
 To elucidate why OVAX2 has weaker heparin-binding affinity than OVAX4 does, structural properties of 
OVAX4 and OVAX2 were investigated by measuring tryptophan fluorescence and circular dichroism (CD) 
spectra. The fluorescence and near-UV CD results suggest that tertiary structure of OVAX2 is not significantly 
different from OVAX4. The far-UV CD spectra showed that the OVAX2 spectrum was highly similar to the 
OVAX4 spectrum. However, secondary structure predicted from the far-UV CD spectra showed that OVAX2 had 
3.6% less α-helix and 1.9% more β-sheet than OVAX4 does. These results suggest that the change in secondary 
structure of OVAX causes in decline in heparin-binding affinity of the protein. Protein surface charge of the two 
proteins was characterized by zeta potential measurement. The zeta potential of OVAX2 at pH 7.0 was -8.79 mV 
which was significantly lower (P<0.05) than that of OVAX4 (-5.17 mV); suggesting that OVAX2 has more 
negative surface charge than OVAX4. These results suggest that the change in secondary structure might be 
closely related to the acidification of protein surface charge. The transition from OVAX4 to OVAX2 that occurred 
during the incubation of fertilized egg was accompanied with acidification of OVAX surface charge, which might 
have resulted in weakening the heparin-binding affinity of OVAX.  
 
（様式５）(Style5) 
Biochemical analyses of OVAX contained in egg white showed that there exist four OVAX types that 
differ in heparin-binding affinity (in descending order, OVAX4, OVAX3, OVAX2, and OVAX1). After incubation 
of egg for 10 days, OVAX2 became the dominant OVAX in egg white. Thus, OVAX4 is altered to a low 
heparin-affinity OVAX2 via OVAX3 during embryo development. The spontaneous transformation of OVAX 
might be concerned with the control of functions of heparin and HS during embryogenesis. Heparin and HS can 
interact with growth factors (e.g. bone morphogenetic proteins (BMPs), fibroblast growth factors (FGFs) and 
hedgehogs) which play significant roles in organogenesis of embryo. Especially in the HS, there are numerous 
reports on controlling the function of the growth factors in organogenesis. HS regulates organogenesis by 
controlling distribution, bio-availability and action on target cells of the growth factors during organogenesis. 
These facts suggest a possibility that OVAX could participate in organ development thorough binding to HS 
during embryogenesis.  
One of the events regulated by HS during embryo development is chondrocyte differentiation. HS 
regulates chondrocyte differentiation through binding to BMP2 that is known to be a potent promoter of cartilage 
differentiation in embryo development. The participation of OVAX in the control of BMP2 activity during 
chondrogenesis was investigated using micromass culture system which supports chondrocyte differentiation of 
mesenchymal cells. In micromass culture, cartilage nodules that differentiated from mesenchymal cells can be 
stained with alcian blue. The amount of cartilage matrix was quantified by measuring the optical density (600 
nm) of dye extracted from alcian bule stained culture. The intensity of micromass culture treated with 100 ng/ml 
BMP2 (BMP2-culture) was 3.0 times higher than that of control culture (micromass culture treated with neither 
BMP2 nor OVAX), clearly indicating that BMP2 induced chondrocyte differentiation. Micromass culture treated 
with BMP2 plus OVAX4 showed higher intensity than BMP2-culture did. The intensities of cultures treated with 
100 ng/ml BMP2 plus 10 µg/ml OVAX4 and 100 ng/ml BMP2 plus 100 µg/ml OVAX4 were 1.6 and 1.7 times 
higher than that of BMP2-culture. These results suggest that OVAX4 enhanced the chondrogenic activity of 
BMP2. On the other hand, OVAX2 did not affect the BMP2 activity. The BMP2-promoted chondrogenic 
differentiation is regulated by phosphorylation of smad, the transcriptional mediators of BMP signaling. Whether 
OVAX4 affects BMP2-mediated phosphorylation of smad was examined by using immunostaining with an 
anti-phospho-smad1/smad5/smad9 antibody. Immunostaining of phospho-smads was more intense in the culture 
treated with BMP2 plus OVAX4 than in BMP2-culture. These results demonstrate that OVAX4 increases in the 
level of BMP2-mediated smad phosphorylation. 
Analysis with micromass culture system showed that OVAX4 enhanced the chondrogenic activity of 
BMP2 by increasing in the level of BMP2-mediated smad phosphorylation. On the other hand, OVAX2 did not 
affect the BMP2 activity. Taken together with the fact that OVAX4 was spontaneously altered to OVAX2 during 
embryo development, it is suggested that the alternation in heparin-binding affinity of OVAX modulates the 
BMP2 activity during embryogenesis. This is the first report showing that egg white protein might be involved in 
organogenesis during embryonic development. 
 
 
 
 
 
 


English

Structural and functional analyses of egg white protein ovalbumin-related protein X in chicken embryo

富井, 春幸

TOMII, Haruyuki

（第３号様式）(Form No. 3) 
学  位  論  文  要  旨  
Dissertation Abstract 
 
 
氏名：  
Name 
富井 春幸  
 
学位論文題目：  
Title of Dissertation 
 
 
土壌特性がトマトの塩害に与える影響および微生物による
塩害緩和効果  
 
 
 
学位論文要旨：  
Dissertation Abstract 
 
 
 
 
 塩類集積は世界の作物生産に深刻な影響を与える主要な環境要因の一つである．
世界人口が増加を続けるなか食糧の安定供給を維持するためには，塩類土壌にお
いても作物生産を持続し生産性を高める必要がある。そこで本研究では，塩害土
壌に関する研究を行うにあたり，供試する国内土壌の性質が塩害に及ぼす影響に
ついて基礎的な知見を得た．また，塩害対策として，微生物の施用効果について
検討を行った．  
 
1. 塩ストレス下のトマトの生育に土壌や環境要因が及ぼす影響  
(1) マサ土（花崗岩質土壌）を塩害土壌の研究に用いるために，塩の添加が土
壌やトマト（Solanum lycopersicum）の生育に及ぼす影響について検討した．  
供試した土壌は腐植含量やCECが極めて小さく，典型的なマサ土の性状を示し
た．土壌飽和抽出液の電気伝導度（ECe）はマサ土にわずかな塩を添加すること
で大幅に上昇し，EC(1:5)のおよそ20倍の値を示した．マサ土にトマトを定植し，
EC(1:5)が0.3，0.6，0.8 dS m -1になるように塩を施用したところ，0.3 dS m -1で地上
部のK/Na比が有意に低い値を示し，0.6 dS m -1で明らかな塩類障害が観察され，0.8 
dS m -1では枯死した．このときのECe換算値は5.8，11.6，15.4 dS m -1であり，トマ
トにあらわれた塩害の症状はECeを用いた指標に近いものであった．  
(2) 土壌の性質がトマトの塩害に及ぼす影響について調べるために，腐植を多
量に含む黒ボク土と，Caを高濃度に含むジャーガル，およびマサ土の3種の土壌を
供試し，塩の添加が土壌やトマトの生育に及ぼす影響を比較した．  
 マサ土は塩の添加量が増加するにつれて，土壌に由来するCaとMg濃度が飽和抽
出液中で上昇し，ジャーガルも同様の傾向を示した．一方，黒ボク土では無機塩
の溶出はわずかで，添加した塩の回収率はもっとも高かった．マサ土と黒ボク土，
ジャーガルにEC(1:5)が0.75 dS m -1となるように塩を施用したとき，ECeはそれぞれ
14.2，5.8，4.9 dS m -1であった．トマトは，塩の施用後にマサ土でただちに枯死し
たのに対し，黒ボク土とジャーガルでは抑制されつつも生育を維持した．トマト
の地上部に蓄積された無機成分は，マサ土でK濃度が低くNaの蓄積が顕著であり，
K/Na比は0.4であった．黒ボク土ではK濃度が高くNaの吸収は抑制的であり，ジャ
ーガルではCaの蓄積が顕著であった．これらのことから，土壌特性が作物の塩害
に及ぼす影響は大きく，腐植やCaの塩害に対する緩和効果が示された．  
(3) 塩ストレス下におけるトマトの栽培試験を高温期と低温期に行ったところ，
高温期ではより低い塩濃度で顕著な障害が見られ，気象条件が塩害の程度に大き
く影響した．そのため，塩ストレスを対象とした試験を実施するには，栽培適期
に試験を行うか，気象条件に左右されない環境が必要であった．  
 
2. 微生物の施用が塩ストレス下のトマトの生育に及ぼす影響  
（第３号様式）(Form No. 3) 
塩害対策として，アーバスキュラー菌根菌（AMF）や植物生育促進根圏細菌
（PGPR）を用いた研究が特に海外で盛んに行われている．本研究では，微生物資
材に由来する乳酸菌と酵母，およびそれらの混合培養液を供試し，土壌施用や灌
水時の添加が，トマトの生育や塩害，土壌に及ぼす影響について検討した．  
(1) 乳酸菌2種と酵母，およびそれらの混合培養液について耐塩性を比較したと
ころ，単独での培養に比べて混合培養液でより高い耐塩性を示した．混合培養液
の酵素活性を調べたところ，脱リン酸化酵素やタンパク質分解酵素で強い活性が
見られ，土壌施用によるリン酸可溶化や有機物の分解促進の可能性が推察された． 
(2) 乳酸菌酵母混合培養液を異なる濃度に希釈し，トマト栽培の灌水に用いた
ところ，通常の土壌では500~1000倍，塩施用土壌では1000倍に希釈したときに地
上部と根の乾物重が最大となった．  
(3) 乳酸菌酵母混合培養液の灌水施用は，培養液から分画した上清や菌液でも
生育を促進する傾向がみられ，微生物としての機能に加え，代謝産物や可溶成分
による効果が推察された．このとき培養液だけでなく，上清や菌液においても土
壌の基質資化性や土壌微生物の群集構造に影響を及ぼしていることが確認された．
また，各微生物の単独培養液でも生育が促進されたが，通常の土壌と塩施用土壌
の両方で果実収量が増加したのは混合培養液であった．   
(4) 塩を添加したマサ土に鶏糞と稲わらを加え，各乳酸菌や酵母，および混合
培養液の希釈液を週に1度施用して1ヶ月間インキュベーションしたところ，すべ
ての微生物施用区で無施用区に比べて硝化が促進し，乳酸菌の種類によっては土
壌のリン酸濃度が増加した．  
 本研究の結果，マサ土を塩害土壌の研究に用いる際の基礎的な知見が得られ，
黒ボク土やジャーガルを用いた研究を通して，土壌に含まれる腐植やCaによる塩
害の緩和効果が確認された．土壌への乳酸菌や酵母の施用は硝化やリン酸可溶化
を促進したほか，トマト栽培への灌水利用では生育の促進や果実収量の増加，果
実中のアスコルビン酸含量の増加などが確認され，乳酸菌や酵母を含む微生物資
材のトマトに対する生育促進および塩害緩和について有効性が示唆された．  


土壌特性がトマトの塩害に与える影響および微生物による塩害緩和効果

Sinumporn, Punpaka

 
 
（第５号様式）  
                        学位論文審査の結果の要旨 
 
    氏    名 Sinumporn Punpaka 
審 査 委 員 
      主  査  深井誠一                       
      副  査  高村武二郎                     
      副  査 島崎一彦                       
      副  査  羽藤堅治                       
      副  査  奥田延幸                      
 
         論  文  名 
     Habenaria as genetic resources of floriculture 
       （花き遺伝資源としての Habenaria） 
         審査結果の要旨 
 
本論文は、ラン科ハベナリア属植物の内、日本に自生するサギソウと東南アジアに自生す
るロドケイラ種を取り上げ、種間交雑種を作り出すことを最終目標として、２種の形質の調
査、in vitro繁殖、種間交雑、遺伝資源の保存について検討したものである。 
Habenaria radiata（サギソウ）は、日本及び朝鮮半島に自生する小型のランで、開花期
は初夏、唇弁は純白で側部片に細かな切れ込みを有し、そのユニークな花の形が鳥の羽根を
広げた形に似て居ることからサギソウという和名が与えられている。一方 H.rhodocheila は
東南アジアを中心とした熱帯地方に自生し、多様な花色が特徴である。従来これら花色の異
なる近縁種にそれぞれ学名が与えられて来たが、それらは遺伝的に近縁であり、この研究で
は H.rhodocheila complex として扱い、花色のみで遺伝子型を区別することとした。
H.rhodocheila complex は多様な花色を有しているが、唇弁に含まれる花色素情報はほとん
どない。H.rhodocheila complex の唇弁横断切片を観察したところ、表皮細胞の形態は遺伝
子型により異なるとともにいずれにも顆粒状の色素体が観察された。色素の抽出液を分光光
度計で分析したとことカロチノイド、フラボノイド、アントシアニンと推定されるピークが
確認された。ところが HPLC ではアントシアニンのピークは確認されず、また緩衝液の pH に
よる色変化も認められず、通常のアントシアニンとは異なる化学的特性を持つ色素であると
推察された。 
ラン科植物の種子は胚乳を欠くシンプルな構造をしており、自然界ではラン菌の助けを借
りて発芽するが、人工培地でも発芽させることができる。ところが H.rhodocheila complex
の人工培地上での種子発芽は不安定であることが知られている。そこで本研究では、まず
H.radiata を用いてこれまでラン種子の無菌播種に用いられて来た Murashige & Skoog(MS)
培地、Vacin & Went(VW)培地、Kudson C(KC)培地、Malmagern Modified Terestrial Orchid 
Medium (MM)培地を比較検討した．いずれの培地でも H.radiata 種子は発芽したが、MM 培地
でもっと発芽率が高く、かつ実生苗の生育も良かった。このため MM 培地を用いて
 
 
H.rhodocheila complex 種子を播種したところ良好な発芽が認められ、以降の実験では MM
培地を使用することとした。交配からから発芽までの期間短縮を目的に、子房培養を行った
ところ、交配後４週以降に採取した子房から発芽が認められ、花粉管の観察と合わせて考え
ると交配後４週以降に受精が起こることが推察された。子房培養により交配からから発芽ま
での期間が大幅に短縮できることが明らかとなった。次に発芽後の H.rhodocheila complex
プロトコームを MS 及び MM 培地の無機態窒素濃度を変更した培地に移植してその後の生育を
比較したが、一定の傾向が認められず、H.rhodocheila complex プロトコームは有機態、無
機態いずれの窒素を含む培地でも発育できることが確認された。 
次に H.rhodocheila complex と H.radiata の相互交雑を行い、雑種の獲得を検討した。着
果率と得られた種子の発芽程度は交配組み合わせにより異なった。得られた植物の交雑性を
検定するため rRNA 遺伝子をターゲットにして PCR-RFLP 分析を行った。その結果、
H.radiata  X H.rhodocheila complex(orange) で は 真 の 交 雑 種 を 、 H.radiata  X 
H.rhodocheila complex(pink)ではアポミクトのみを、 H.radiata  X H.rhodocheila 
complex(yellow)では交雑種とアポミクトの両方を、H.rhodocheila complex(yellow) X 
H.radiata ではアポミクトのみを産出した。H.radiata  X H.rhodocheila complex(orange)
の組み合わせによる雑種の獲得の成功は、本研究が初の報告である。得られた交雑種は、草
姿、花形、花色、葉、地下部形態において両親の中間型の形質を示した。 
最後に H.radiata と H.rhodocheila complex の遺伝資源の保存について cryo-plate 
vitirification 法を用いて検討した。H.radiata 種子は脱水処理なしに凍結保存可能であっ
たが，H.rhodocheila complex 種子は PVS2 で 20-30 程度の脱水処理により凍結保存が可能
であった。H.rhodocheila complex プロトコームについては、PVS3 による脱水時間と生存の
間に一定の傾向は認められなかったが、十分脱水できればプロトコームの凍結保存が可能で
あることを示した。 
以上本研究で得られた成果は、Habenaria の園芸植物としての発展に大いに貢献するもの
であると判断された。 
 
本論文に関する公開審査会は，令和２年 2 月８日に愛媛大学農学部において開催され，申
請者の論文発表とこれに関する質疑応答が行われた。引き続き開催された学位論文審査会に
おいて，学位論文の内容について審査した結果，審査員全員一致して本論文は博士（農学）
の学位を授与するに値すると判定した。 
 
 
 


Habenaria as genetic resources of floriculture

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