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Aplicativo móvel sobre primeiros socorros em crianças para profissionais de escolas: adaptação semântica, validade e usabilidade em Portugal
Get PDFRelatório apresentado ao Conselho Científico da Escola Superior de Saúde da Universidade Trás-os-Montes e Alto Douro, para apreciação, levando em consideração as atividades desenvolvidas no período do pós doutoramento, como requisito para obtenção do título de Pós doutorad
New fluorescence-based biosensor for Eutypa detection in Vitis vinifera L.
No full textThe viticulture sector has an extremely relevant impact on the economy of grapeproducing countries, capable of generating significant revenues. Therefore, any type of alteration that results in a reduction in crop yield is considerably negative, as it will be reflected in the commercial value of this sector, directly influencing the producers’ profits. Within the large number of factors that can affect harvest yield, grape trunk diseases are found amongst the most important, that is are a result of a set of fungal infections contributing significantly to productivity lost in the sector. The aforementioned infections are originated by a wide range of fungi from different families that colonize grapevines, generating various symptoms that result eventualy in plant death. Due to the large number of infection types, this work focuses on the development of Eutypiose. Eutypiose results from the infection of various fungi from different families, being the infection by Eutypa lata the major cause. E. lata spores are released from previously infected trunks,infecting new grapevines through existing "wounds", mostly result of pruning management. Infection detection is difficult as the development of symptoms (E. lata infection stands out for developing foliar symptoms) since infection is normally very long , taking up to one to eight years, approximately. Therefore, the inability to rapidly detect the infection means that the damage caused to the crops can be quite considerable. Current diagnostic methods, although functional, are limited, as they are typically applied to grapevines presenting some symptoms (which means that many more vines may already be infected), and most of the methods are not suitable for mass diagnosis (request when dealing with vineyards with large areas). Thus, an early diagnosis is required to minimize the time between detection and intervention of an infected grapevine. A biosensor platform (efficient device that converts biological responses into measurable signals) capable of identifying Eutypiose on a large scale, stands out as a possible solution. This work aimed to develop a DNA-based biosensor for the early diagnosis of E. lata infections without destroying the plant. For this purpose, specific probes for the fungal species E. lata were designed based on two sequences used to discriminate fungi, Internal Transcribed Spacer (ITS) and the βTubulin gene (Tub2). These were functionalized with nanoparticles (Carbon Dots - CDots) to create the detection element of the device. The different probes were tested for their specificity using synthetic probes and various isolates of fungi involved in Grapevine Trunk Diseases and spontaneous contaminations. Their specificity for E. lata was confirmed. The detection and quantification limits were 3,12 pM and 9,48 pM, respectively, for the ITS probe and 1.32E-5 pM and 3.99E-5 pM for the Tub2 probe. When the system was applied to samples of infected and non-infected wood samples (sawdust of grapevine), the biosensor obtained a response in accordance to the infection level of the sample without destroying the plant. Thus, the development of a new method for detecting Eutypiose was successful, and this could positively impact the viticulture sector, as it allows early disease diagnosis, enabling the grower to apply infection mitigation measures, preventing its widespread dissemination.O setor da vitivinicultura apresenta um impacto extremamente relevante na economia de países produtores de videiras, sendo capaz de gerar receitas significativas. Desta forma, qualquer tipo de alteração que gere uma redução do rendimento da colheita é consideravelmente negativa, já que será espelhada no valor comercial deste setor, influenciando diretamente o lucro dos produtores. Dentro do grande número de fatores que pode afetar uma colheita, encontram-se as doenças do lenho da videira, um conjunto de infeções fúngicas que contribuem em grande escala para perdas de produtividade no setor. As infeções anteriormente mencionadas são originadas por uma vasta gama de fungos de diferentes famílias que colonizam as videiras, gerando diversos sintomas que resultam na eventual morte da planta. Devido ao grande número de tipos de infeções este trabalho foca-se no desenvolvimento de eutipiose. A eutipiose é originada devido a diversos fungos de diferentes famílias, mas advém maioritariamente da infeção pelo fungo Eutypa lata. Esporos de E. lata são libertados a partir de madeira previamente infetada e infetarão novas videiras através de “feridas” existentes nas mesmas (na sua maioria produzidas durante a poda). A dificuldade associada à deteção da infeção baseia-se no largo período de tempo existente entre a contaminação e o desenvolvimento de sintomas (a infeção por E. lata destaca-se por desenvolver sintomas foliares), já que pode levar entre um a oito anos, aproximadamente. Assim sendo, a incapacidade de detetar rapidamente a infeção faz com que os danos provocados nas colheitas possam vir a ser bastante consideráveis. Os métodos de diagnóstico atuais, apesar de funcionais, são limitados, já que, normalmente, são aplicados em videiras que apresentam sintomas (o que significa que muitas mais já poderão estar infetadas) e a maioria não é adequada para efetuar o diagnóstico em massa (critério necessário em vinhas com grandes áreas). Desta forma, surge a necessidade de criar uma forma de diagnóstico precoce que reduza ao máximo o tempo de intervenção sobre uma videira infetada. Uma possível solução para o problema é a criação de um biossensor (dispositivo eficiente que converte respostas biológicas em sinais mensuráveis) capaz de identificar em grande escala a eutipiose. Este trabalho teve como objetivo desenvolver um biossensor baseado em DNA para o diagnóstico precoce de infeções de E. lata sem destruir o material vegetal. Para isso, foram desenhadas sondas específicas para a espécie fúngica, E. lata, baseadas em duas sequências utilizadas para discriminar fungos, “Internal Transcribed Spacer” (ITS) e o gene da βTubulina (Tub2). Estas foram funcionalizadas com nanopartículas (Carbon Dots - CDots) para criar o elemento de deteção do dispositivo. As diferentes sondas foram testadas para a sua especificidade utilizando sondas sintéticas e vários isolados de fungos envolvidos na Doenças do Tronco da Videira e em contaminações espontâneas. Comprovou-se a sua especificidade para a E. lata. O limite de deteção e de quantificação foram de 3,12 pM e 9,48 pM, respetivamente, para a sonda ITS e 1,32E-5 pM e 3,99E-5 pM para a sonda Tub2. Quando o sistema foi aplicado em amostras de madeiras (videira) infetadas e não infetadas verificou-se que o biossensor permitia obter uma resposta correspondente ao nível de infeção, sem a destruição da videira. Deste modo, o desenvolvimento de um novo método de deteção da eutipiose foi bem sucedido, e este poderá impactar positivamente o setor vitivinícola, uma vez que permite diagnosticar precocemente a doença, permitindo ao viticultor tomar medidas de mitigação da infeção, impedindo a sua disseminação generalizada
Multiple Shades from the Same Mirror: Femicide Representations in the Portuguese and Turkish Media
Get PDFThis study aims to analyze and compare the media coverage of femicide cases in Portugal and Türkiye, as well as the comments posted by social media users on femicide news stories, to understand the dynamics at play. Therefore, a sample from the Portuguese and Turkish media was collected, and a one-year analysis of the mainstream news sources was performed. The authors observed significant differences between the two countries. The Portuguese media tends to provide little coverage on femicide, not including victims’ age and marital status and only offering a brief description of the crimes. In contrast, Turkish media provide more thorough coverage by incorporating detailed information, including emotional descriptions, and engaging more in sensationalism. Facebook comments show that users from both countries reveal their real identities, while Turkish comments tend to exhibit greater aggression and more spelling mistakes
Fine Boundary Continuity for Degenerate Double-Phase Diffusion
Get PDFWe study the boundary behavior of solutions to parabolic double-phase equations through the celebrated Wiener’s sufficiency criterion. The analysis is conducted for cylindrical domains and the regularity up to the lateral boundary is shown in terms of either its p or q capacity, depending on whether the phase vanishes at the boundary or not. Eventually we obtain a fine boundary estimate that, when considering uniform geometric conditions as density or fatness, leads us to the boundary Hölder continuity of solutions. In particular, the double-phase elicits new questions on the definition of an adapted capacity
Estudo de anomalias e desequilíbrios genómicos numa coorte de indivíduos com infertilidade, dismorfias e/ou défice auditivo
Get PDFDissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e TecnológicaA perda auditiva é a deficiência sensorial mais comum em humanos, pelo que afeta em todo o mundo cerca de 466 milhões de pessoas. Relativamente à sua etiologia, é uma condição que pode ser causada pela idade e por fatores genéticos ou ambientais. A perda auditiva genética ocorre maioritariamente em formas não-sindrómicas, apesar de vários síndromes estarem associados ao seu aparecimento. Estão descritos centenas de genes associados à patologia, e muitos deles podem causar formas dominantes e/ou recessivas de perda auditiva. Para além disso, algumas mutações apenas num gene podem levar a vários fenótipos diferentes, pelo que esta condição apresenta uma expressividade variável. Dada a sua elevada prevalência, e as consequências adversas que representa na vida dos seus portadores, a perda auditiva é uma condição que pode ser beneficiada com uma deteção e diagnóstico molecular precoces, permitindo um acompanhamento e tratamento clínico mais direcionados. Por este motivo, este trabalho teve como principal objetivo a implementação de um método de diagnóstico de perda auditiva num laboratório clínico, pelo que simultaneamente, representou uma análise populacional relativamente às variantes genéticas mais prevalentes nos pacientes testados. No total, foram analisadas 23 amostras de sangue provenientes de probandos com perda auditiva. Para a genotipagem destes pacientes todas as amostras foram analisadas através do painel SALSA® MLPA® Probemix P163-E1 GJB-WFS1-POU3F4. Dos probandos analisados, cinco (21,7%) mostraram a presença de anomalias genéticas associadas à patologia, sendo que em quatro deles foi possível estabelecer uma etiologia genética para o aparecimento da condição. Dois probandos apresentaram no seu genoma a presença da mutação c.35delG no exão 2 do gene GJB2 em homozigotia, sendo esta a variante mais frequentemente reportada em casos de perda auditiva autossómica recessiva em todo o mundo. Num outro probando, foi detetada a mesma variante em heterozigotia, pelo que não ficou estabelecida a etiologia da sua perda auditiva, uma vez que esta mutação apenas está associada a casos autossómicos recessivos. Esta variante foi também encontrada em heterozigotia composta com uma deleção dos genes GJB6 e CRYL1. Foi também detetado um alelo GJB2 mutado com a variante c.101T>C no exão 2 do gene em heterozigotia, que foi considerada como a causadora da patologia no probando, uma vez que a sua presença monoalélica está reportada em casos autossómicos dominantes. Em resumo, 90% dos alelos mutados detetados neste estudo dizem respeito ao gene GJB2, e a variante c.35delG mostrou ser a mais frequente. Apesar da pequena amostragem utilizada neste estudo, os resultados obtidos com este trabalho permitiram concluir que o painel de MLPA utilizado é eficaz na deteção de anomalias associadas à perda auditiva. Para além disso, deste trabalho resultaram dados que contribuem para uma melhor caraterização da população portuguesa, relativamente às causas genéticas para o aparecimento de perda auditiva.Hearing loss is the most common sensory impairment in humans, affecting around 466 million people worldwide. Regarding its etiology, it is a condition that can be caused by age and genetic or environmental factors. Genetic hearing loss occurs mostly in non-syndromic forms, although several syndromes are associated with its emergence. Hundreds of genes associated with the pathology are described, and many of them can cause dominant and/or recessive forms of hearing loss. Furthermore, some mutations in just one gene can lead to several different phenotypes, which gives variable expressiveness to this condition. Given its high prevalence, and the adverse consequences it represents in the patients’ lives, hearing loss is a condition that can benefit from early detection and molecular diagnosis, allowing for more targeted clinical follow-up and treatment. For this reason, the main goal of this work was the implementation of a method for diagnosing hearing loss in a clinical laboratory, which simultaneously represented a population analysis regarding the most prevalent genetic variants in the patients tested. In total, 23 blood samples from probands with hearing loss were analyzed. For the genotyping of these patients, all samples were analyzed using the SALSA® MLPA® Probemix P163-E1 GJB-WFS1-POU3F4 panel. Of the analyzed probands, five (21.7%) showed the presence of genetic anomalies associated with the pathology, and in four of them it was possible to establish a genetic etiology for the onset of the condition. Two probands showed in their genome the presence of the c.35delG mutation in exon 2 of the GJB2 gene in homozygosity, which is the most frequently reported variant in cases of autosomal recessive hearing loss worldwide. In another proband, the same variant was detected in heterozygosity, so the etiology of its hearing loss has not been established, since this mutation is only associated with autosomal recessive cases. This variant was also found in compound heterozygosity with a deletion of the GJB6 and CRYL1 genes. A mutated GJB2 allele with the c.101T>C variant in exon 2 of the gene was also detected in heterozygosity, which was considered to cause the pathology in the proband, since its monoallelic presence is reported in autosomal dominant cases. In summary, 90% of the mutated alleles detected in this study concern the GJB2 gene, and the c.35delG variant proved to be the most frequent. Despite the small sampling used in this study, the results obtained with this study allowed us to conclude that the MLPA panel used is effective in detecting anomalies associated with hearing loss. In addition, this work resulted in data that contribute to a better characterization of the portuguese population, regarding the genetic causes for the appearance of hearing loss
Relatório da Prática de Ensino Supervisionada
Get PDFO presente Relatório é o resultado de todo o trabalho da Prática de Ensino Supervisionada, integrada no plano de estudos da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, cuja finalidade é a obtenção do Grau de Mestre em Ensino da Educação Física nos Ensinos Básico e Secundário. É precisamente este o meu objetivo e para o qual trabalhei todo este tempo. No presente documento é realizada uma sinopse e uma reflexão sobre um ano muito cansativo, mas bastante produtivo e compensador, porque, para além das experiências de aprendizagens constantes que me ofereceu, também proporcionou um constante convívio com alunos e professores experientes. Com a elaboração do relatório, pretendendo realizar uma auto-observação acerca do trabalho efetivado, reconhecendo e descrevendo tanto os aspetos positivos como os aspetos menos positivos, conseguindo, assim, tornar as minhas futuras prestações mais eficazes e eficientes; serão apresentados os vários objetivos sugeridos no princípio e ao longo do ano letivo, bem como os obstáculos e as dificuldades, estratégias pedagógicas, metas atingidas e os momentos reflexivos que resultaram e fizeram parte de todo o processo de evolução e formação, enquanto professor-estagiário.Sendo também possível verificar todo o processo de desenvolvimento do ano letivo, assim como o envolvimento do estagiário no seio da comunidade educativa. O Estágio Curricular foi realizado na cidade de Viseu, na Escola Básica Doutor Azeredo Perdigão, com duas turmas do 9º ano de escolaridade, mais concretamente as turmas A e B. Este decorreu com a supervisão e orientação de dois professores, um Professor Orientador da UTAD e um Professor Orientador Cooperante da Escola. Ao longo do ano fez parte das minhas atividades letivas a elaboração das unidades didáticas assim como, os respetivos planos de aula e avaliações e 2 atividades não curriculares, a organização do Corta-Mato e o Estudo de turma, aplicado na turma do 9ºA.This Report is the result of all the work of the Supervised Teaching Practice, integrated in the study plan of the University of Trás-os-Montes and Alto Douro, whose purpose is to obtain the Master’s Degree in Physical Education Teaching in Basic and Secondary Education. This is precisely my goal and for which I have worked all this time. In this document is made a synopsis and a reflection on a very tiring year, but quite productive and rewarding, because, in addition to the experiences of constant learning that offered me, provided a constant interaction with students and experienced teachers. With the preparation of the report, intending to carry out a self-observation about the work carried out, recognizing and describing both the positive and the less positive aspects, thus managing to make my future performances more effective and efficient; will be presented the various objectives suggested at the beginning and throughout the school year, as well as the obstacles and difficulties, pedagogical strategies, goals achieved and the reflective moments that resulted and were part of the entire process of evolution and training, as a trainee teacher. It is also possible to verify the entire process of development of the school year, as well as the involvement of the trainee within the educational community. The curricular internship was carried out in the city of Viseu, in the school Básica Doutor Azeredo Perdigão, with two classes of the 9th grade, more specifically classes A and B. This took place with the supervision and guidance of two teachers, a Guiding Teacher of UTAD and a Cooperating Guiding Teacher of the School. Throughout the year, part of my teaching activities was the preparation of teaching units as well as the respective lesson plans and assessments and two noncontentional activities, the Cross-Mato and the Class Study, applied in the class of 9ºA
A importância de um A: a Literatura infantil e a Matemática, promovendo competências que são basilares no desenvolvimento do raciocínio matemático
Get PDFUncovering the variability and regulation of PRNP gene and their relevance in chronic wasting disease susceptibility and transmission
Get PDFTransmissible spongiform encephalopathies (TSEs), more commonly referred to as prion diseases, constitute a group of neurodegenerative and fatal disorders that impact various mammalian species. The pathogenic isoform responsible for these diseases is PrPSc, derived from the cellular prion protein, PrPC. The conversion of PrPC into PrPSc can manifest spontaneously or through induction by an external agent, leading to acquired cases. Notably, amino acid substitutions or polymorphisms in the PrP protein play a pivotal role in influencing the misfolding process. The intricate landscape of PrP polymorphisms is marked by their association with spontaneous misfolding and their link to the development of familial or hereditary forms of prion diseases. In cases of acquired prion diseases, variations in amino acids between the PrPC in the host and the PrPSc in the donor contribute to modifying prion strain characteristics during transmission. This alteration impacts the transmission barrier, thereby influencing the host range. Heightened concerns revolve around the potential emergence of novel cervid prion strains capable of surmounting transmission barriers and infecting humans. Chronic wasting disease (CWD), a prion disorder affecting cervids, has attained widespread prevalence in the USA and Canada. Notably, cases have been documented in South Korea, and the disease has recently been identified in Norway, Finland, and Sweden. The considerable horizontal transmission capacity of CWD, combined with the diverse polymorphisms present in cervid PrP, heightens the prospect of new prion strain emergence, as evidenced by strains identified in Northern Europe. Vigilant monitoring and a nuanced understanding of these dynamic processes are imperative for effectively addressing the evolving challenges posed by prion diseases. This study aims to characterize the prevalent polymorphisms and identify novel variants within the coding sequence of the prion protein gene (PRNP) in the Portuguese deer population, encompassing red deer (Cervus elaphus), fallow deer (Dama dama), and roe deer (Capreolus capreolus). The primary objective was to unveil distinctive polymorphic variants intricately linked to susceptibility to CWD. In red deer, specific amino acid variants, p.98T>A, p.138S>N, and p.226Q>E, have been identified. These findings contribute to a nuanced understanding of the intricate genetic landscape underlying the susceptibility profile of the studied cervid population, shedding light on potential factors influencing CWD susceptibility in this specific context. Simultaneously, a lack of sequence variation was observed in fallow deer. However, unexpectedly, the results from roe deer population confirmed a new genetic variant in PRNP gene coding sequence, denoted as p.85G>E and , at same time, unveiled 10 haplotypes through mitochondrial DNA molecular analysis, proving the variability of this group. Running parallel to this path, this research incorporated the application of real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) assays to evaluate prion infection. Traditionally, recombinant hamster and bank vole prion proteins have demonstrated efficacy as substrates for North American strains. However, our investigation extended beyond convention to assess the adaptability of these substrates to novel European CWD strains. We compared their performance with potential alternative substrates for RT-QuIC assays, using diverse genetic variants of cervid prion proteins. The outcomes of our study unveiled a more robust and efficient substrate for conducting RT-QuIC assays, enabling the identification of both European and North American CWD strains. This advancement represents a notable enhancement in the methodology, promising increased accuracy, and reliability in the detection of infected animals with different strains. Furthermore, this research project successfully established a transgenic mouse model, providing a platform to investigate the spontaneous or acquired aspects of CWD. This transgenic model was created by integrating cutting-edge methodologies, specifically employing CRISPR-Cas9 technology, which allowed the precise editing of specific genetic sequences. Moreover, this new generated model, along with this technology, will facilitate the introduction of genetic variations associated with CWD susceptibility in a more controlled and efficient manner. Thus, it will enable the establishment of new transgenic models that closely mimic the genetic variations observed in affected species, thereby facilitating the investigation of disease mechanisms and the exploration of potential therapeutic interventions.Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis, mais conhecidas como doenças priónicas, constituem um conjunto de distúrbios neurodegenerativos e fatais que afetam diversas espécies de mamíferos. A isoforma patogénica responsável por estas doenças é a PrPSc, derivada da proteína priónica celular, PrPC. A conversão de PrPC em PrPSc pode ocorrer espontaneamente ou por indução por um agente externo, resultando em casos adquiridos. Importa destacar que variantes aminoacídicas na PrP desempenham um papel crucial na influência do processo de misfolding. A complexidade dos polimorfismos da PrP é marcada pela sua associação com o misfolding espontâneo e ao desenvolvimento de formas familiares ou hereditárias destas doenças. No caso de doenças priónicas adquiridas, as variações nos aminoácidos entre a PrPC do hospedeiro e a PrPSc do doador contribuem para a alteração das características da estirpe priónica durante a sua transmissão. Esta alteração afeta a barreira de transmissão, influenciando a amplitude de hospedeiros. Atualmente, as crescentes preocupações concentram-se na potencial emergência de novas estirpes priónicas cervídeas com a capacidade de superar barreiras de transmissão e infetar seres humanos. A doença emaciante crónica [do inglês, chronic wasting disease (CWD)], uma doença priónica que afeta cervídeos, tornou-se prevalente nos EUA e Canadá, com casos documentados na Coreia do Sul e deteção recente na Noruega, Finlândia e Suécia. A notável capacidade de transmissão horizontal da CWD, aliada aos diversos polimorfismos na PrP cervídea, aumenta a probabilidade de emergência de novas estirpes priónicas, como evidenciado no norte da Europa. A monitorização atenta e a compreensão detalhada destes processos dinâmicos são cruciais para enfrentar eficazmente os desafios em constante evolução colocados pelas doenças priónicas. Em consonância com esta trajetória, este estudo teve como objetivo caracterizar as variantes genéticas prevalentes e identificar novas variantes na sequência codificante do gene da proteína priónica (PRNP) na população de cervídeos portuguesa, incluindo o veadovermelho (Cervus elaphus), o gamo (Dama dama) e o corço (Capreolus capreolus). O principal foco foi revelar variantes intrinsecamente ligadas à suscetibilidade à CWD. No veado- vermelho, foram identificadas três variantes aminoacídicas, p.98T>A, p.138S>N e p.226Q>E. Estes resultados contribuíram para uma compreensão mais detalhada do background genético subjacente ao perfil de suscetibilidade da população de cervídeos estudada, lançando luz sobre os potenciais fatores que influenciam a suscetibilidade à CWD neste contexto específico. Simultaneamente, foi observada uma falta de variabilidade genética de sequência no gamo. No entanto, de forma inesperada, os resultados da população de corços confirmaram uma nova variante genética na sequência codificante do gene PRNP, denominada p.85G>E, e, ao mesmo tempo, revelaram 10 haplótipos através da análise molecular do ADN mitocondrial, comprovando a variabilidade deste grupo. Em paralelo, esta tese incorporou a aplicação de ensaios de conversão induzida em tempo real (RT-QuIC) para identificar possíveis animais infetados. Tradicionalmente, as proteínas priónicas recombinantes de hamster e bank vole demonstraram eficácia como substratos para as estirpes norte-americanas. No entanto, esta investigação estendeu-se para além da convenção para avaliar a adaptabilidade destes substratos a novas estirpes europeias de CWD. Comparámos o desempenho de novos potenciais substratos alternativos para ensaios RT-QuIC, utilizando diversas variantes genéticas de proteínas priónicas cervídeas. Os resultados deste estudo revelaram um substrato mais robusto e eficiente para a realização de ensaios RT-QuIC, permitindo a identificação de estirpes da CWD tanto europeias quanto norteamericanas. Este avanço representa uma melhoria notável na metodologia, prometendo uma precisão e confiabilidade aumentadas na deteção de animais infetados com diferentes estirpes. Adicionalmente, este projeto de pesquisa estabeleceu com sucesso um modelo animal de murganho transgénico, proporcionando uma plataforma para investigar os aspetos espontâneos ou adquiridos da CWD. Este modelo transgénico foi criado integrando metodologias atuais, CRISPR-Cas9, que permitiu a edição precisa de sequências genéticas. Além disso, este novo modelo gerado, juntamente com esta tecnologia, facilitará a introdução de variantes genéticas associadas à suscetibilidade à CWD de uma forma mais controlada e eficiente. Assim, permitirá o estabelecimento de novos modelos transgénicos que reproduzem as variantes genéticas observadas nas espécies afetadas, facilitando a investigação de mecanismos de doença e a exploração de potenciais intervenções terapêuticas
Female fertility decline: addressing the role of cellular senescence
Get PDFIn females, the reproductive system is the first to show signs of ageing, and the ovary plays a major role due to the continuous age-related decay in follicle number and quality. As such, there is an urge for studies addressing the mechanisms underlying ovarian ageing. The most relevant theory concerning ovarian ageing implies that an age-related increase in reactive oxygen species (ROS), due to increased production and/or decreased scavenging, induces oxidative stress (OS) that jeopardizes fertility. ROS can also trigger cellular senescence and contribute to the disruption of tissue function. Previous studies from the group showed the presence of a unique population of multinucleated giant cells in the ovaries of reproductively aged mice. These cells displayed lipofuscin deposits, a known hallmark of senescence. However, it was still unclear how they contribute to the loss of fertility. In this study, it was hypothesized that an age-related redox imbalance and an increase in ovarian senescence disrupt folliculogenesis and contribute to the decline of fertility. Therefore, it was aimed to identify the presence of senescent cells in the ovaries of reproductively aged mice and the mechanisms involved in their formation, and to evaluate the effect of redox imbalance in follicle depletion and ovarian ageing. Ovaries from young and reproductively aged wild-type (WT) and knockout (Nrf2-/- , Hfe-/- and Hamp1 -/- ) mice on C57BL/6J background and Wistar rats were used. Haematoxylin/Eosin and Sudan Black-B staining techniques were performed to study morphology and to determine lipofuscin deposition, respectively. In mice, senescenceassociated β-galactosidase (SA-β-gal) activity and galactosidase β1 (GLB1) expression were used as additional markers of senescence. Picrosirius Red staining was employed to quantify fibrosis. Protein nitration determined by immunohistochemistry techniques was used as a marker of oxidative stress damage. The ovaries of reproductively aged mice and rats displayed the presence of the unique population of giant multinucleated cells in the stroma, and these cells were positive for lipofuscin deposition. In the ovaries of reproductively aged mice, lipofuscin and SA-β-Gal activity positive areas overlapped and showed to be the most accurate markers for the identification of giant multinucleated cells. GLB1 expression colocalized partially with lipofuscin accumulation. Reproductively aged nulliparous mice had decreased number of follicles and increased lipofuscin deposition when compared to nulliparous young mice. Reproductively aged breeders and mice with decreased fertility had an intermediary phenotype with significantly lower values of lipofuscin deposition when compared to age-matched nulliparous. A strong negative correlation was found between follicle pool and lipofuscin deposition (r=-0.6611, p=<0.0001). No changes were observed in fibrosis during reproductive ageing. Although reproductively aged mice had higher values of protein nitration, they did not differ between age-matched groups. This work points to ovulation as a driver for the formation of multinucleated giant cells with features of senescence and unveils their role as an important trigger of follicle depletion. Ongoing studies are being performed aiming to identify multinucleated giant cells in other mammals and to develop a therapeutic strategy capable of delaying/ameliorating ovarian dysfunction. Additionally, other markers of OS damage will also be evaluated.O sistema reprodutor feminino é o primeiro a mostrar sinais de envelhecimento com uma perda precoce da sua função. O envelhecimento do ovário é o principal fator que contribui para a perda de fertilidade devido à contínua diminuição da quantidade e qualidade de folículos. Como tal, são necessários estudos que abordem os mecanismos subjacentes ao seu envelhecimento. A teoria mais relevante sobre o envelhecimento ovárico implica que um aumento de espécies reativas de oxigénio (EROs), devido ao aumento da produção e/ou diminuição da eliminação, cria stress oxidativo que compromete a fertilidade. As EROs podem desencadear senescência celular e contribuir para a disfunção tecidual. Estudos anteriores mostraram a presença de uma população única de células gigantes multinucleadas em ovários de murganhos reprodutivamente envelhecidos. Estas células apresentavam depósitos de lipofuscina (marcador de senescência). No entanto, não é clara a relação entre a presença destas células e a perda de fertilidade. Neste trabalho hipotetizou-se que, em ovários de animais reprodutivamente envelhecidos, um desequilíbrio redox e um aumento da senescência interferem com a foliculogénese e contribuem para o declínio da fertilidade. Como objetivos, definiram-se: a identificação da presença de células senescentes em ovários de murganhos reprodutivamente envelhecidos e mecanismos envolvidos na sua formação; a avaliação do efeito do desequilíbrio redox na depleção folicular e no envelhecimento ovárico. Recolheram-se ovários jovens e reprodutivamente envelhecidos de murganhos C57BL/6J wild-type (WT) e knockout (Nrf2-/- , Hfe-/- e Hamp1-/- ), e de ratos Wistar. Realizou-se coloração com hematoxilina/eosina e Negro de Sudão para estudar a morfologia e determinar a deposição de lipofuscina, respetivamente. Em murganhos, a atividade da β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) e a expressão de galactosidase β1 (GLB1) foram também usadas como marcadores de senescência. A coloração Picrosirius Red foi usada para quantificar a fibrose. A nitração proteica determinada por técnicas de imunohistoquímica foi utilizada como marcador de stress tecidual. Nos ovários de murganho e de ratos reprodutivamente envelhecidos identificou-se a presença de células gigantes multinucleadas com deposição de lipofuscina. Em murganhos, observou-se co-localização da lipofuscina com atividade de SA-β-Gal. A expressão de GLB1 co-localizou parcialmente com a lipofuscina. Murganhos nulíparos reprodutivamente envelhecidos apresentaram diminuição do número de folículos e aumento de lipofuscina, quando comparados com jovens. Reprodutores envelhecidos e murganhos knockout apresentaram um fenótipo intermédio com valores significativamente menores de deposição de lipofuscina, quando comparados com nulíparos da mesma idade. Uma forte correlação negativa foi encontrada entre a reserva folicular e a deposição de lipofuscina (r=-0,6611, p=<0,0001). Não foram observadas alterações na fibrose durante o envelhecimento reprodutivo. Embora os murganhos reprodutivamente envelhecidos tenham valores mais altos de nitração proteica, não se observaram diferenças entre grupos da mesma idade. Este trabalho aponta para a ovulação como um fator determinante para o aparecimento das células gigantes multinucleadas com características de senescência e revela o seu papel como um importante indutor da depleção folicular. Estão a decorrer estudos com o objetivo de identificar células gigantes multinucleadas noutros mamíferos e de desenvolver uma estratégia terapêutica capaz de retardar a disfunção ovárica. Adicionalmente, outros marcadores de dano oxidativo serão avaliados
