National Institute of Health Dr. Ricardo Jorge
Repositório Científico do Instituto Nacional de SaúdeNot a member yet
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The human mTOR transcript allows cap-independent translation that insures its expression and function during inhibition of global translation
No full textThe mammalian target of rapamycin (mTOR) is a conserved serine/threonine kinase that integrates signals from the cellular nutrient- and energy-status, acting namely on the protein synthesis machinery. Deregulation of mTOR signaling is implicated in major diseases, such as cancer, mainly due to its role in regulating protein synthesis. Major advances are emerging regarding the regulators and effects of mTOR signaling pathway; however, regulation of mTOR gene expression is not well known. Here, we show that the 5’ untranslated region of the human mTOR transcript forms a highly folded RNA scaffold capable of binding directly to the 40S ribosomal subunit. We further demonstrate that this cis-acting RNA regulon is active both in normal and stress conditions, and that its activation status in response to translational adverse conditions parallels mTOR protein levels. Moreover, our data reveal that the cap-independent translation of mTOR is necessary for its ability to induce cell cycle progression into S-phase. These results suggest a novel regulatory mechanism of mTOR gene expression that integrates the protein profile rearrangement triggered by global translation inhibitory conditions.This work was partially supported by Fundação Merck Sharp and Dohme and Fundação para a Ciência e a Tecnologia
(FCT) through center grant UID/MULTI/04046/2013 (to BioISI) and research grant PTDC/BIM-ONC/4890/2014.
Ana Marques-Ramos, Juliane Menezes, and Rafaela Lacerda were supported by Fellowships from FCT
[SFRH/BD/33462/2008 to A.M.-R., FCT/SFRH/BPD/98360/2013 to J.M., and SFRH/BD/74778/2010 to R.L.].
Marco Marques Candeias was supported by fellowships from the Japan Society for the Promotion of Science
(JSPS/FF1/184) and AXA Research Fund and JSPS Grant-in-Aid for Young Scientists (B) (16K21111).N/
Brand New World of Translation
No full textIn recent years, non-canonical translation initiation mechanisms have been recognized as key factors in the development of different diseases such as cancer, as they present a survival answer during stress conditions by ensuring the expression of vital proteins.
Internal Ribosome Entry Sites (IRESes) were first discovered on viruses, and later in eukaryotes, as mRNA secondary structures capable of recruiting the ribosome to the vicinities of an initiation codon.
One of the most studied cancer-related genes, the p53 tumor suppressor gene, was found to possess on its mRNA an IRES capable of regulating the expression of the full length isoform, p53FL, and one of its isoforms, Δ40p53 differently by the interaction with MDM2 protein, an IRES trans-acting factor (ITAF) of p53.
Our aim is to study a shorter p53 protein isoform that lacks tumor suppressor behaviour acting instead as a cancer promoter (Candeias et al., 2016). One of our goals is to characterize the IRES associated with its expression. For that we will try to perform a sequencing reaction variant where the fragments to be sequenced result from uncomplete reverse transcription due to nucleotide-specific modification. Additionally, we will try to unveil new ITAFs by pulling-down the IRES and, consequently, associated factors, using two different methods: IRES biotinylation and MS2 tagging. Furthermore, we intend to find new IRESes by pulling-down MDM2 and possible bounded mRNAs followed by RNA-sequencing in order to identify them.This work is financed by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (PTDC/BIMONC/4890/2014 to MMC and UID/MULTI/04046/2013 to BioISI from FCT/MCTES/PIDDAC.N/
Translational regulation of human erythropoietin (EPO) by an upstream open reading frame (uORF) and its impact on myocardial ischemia
No full textFunctional upstream open reading frames (uORFs) are cis-acting regulatory elements of gene expression located upstream of the main initiation codon [usually, located in the 5’ untranslated region (5’UTR)] that repress mRNA translation (protein synthesis) of the main ORF in physiological conditions. Under stress conditions, uORFs alleviate their repressive effect, as a response to the cellular environmental change. About half of the human mRNAs (mainly, transcripts encoding growth factors or hormones) present uORFs. However, for the vast majority of the cases, the principles by which uORFs participate in translational control are still poorly understood. The fact that mutations that introduce or disrupt a uORF can cause human diseases illustrates their role in translational regulation. Identifying when and how they function is essential to understand the etiology of many human disease-associated uORFs and establish their therapies.
In its classical hormonal role, human erythropoietin (EPO) is a glycoprotein synthesized and released mainly from the kidney, which has a key role in hematopoiesis. However, recent studies have revealed that EPO is a multifunctional molecule produced and utilized by many tissues (e.g. brain, heart and liver) that rapidly responds to different cell stress stimuli and tissue injuries. For example, EPO is upregulated in the brain and heart after injury and shows a tissue protective effect due to its antiapoptotic, anti-inflammatory, antioxidative and angiogenetic properties. Thus, it has the potential to be used as a therapeutic target/strategy for the treatment of several human disorders, including ischemic injuries in brain or heart. Understanding the EPO translational control mechanisms will be valuable in the determination of these therapies.
EPO is a 165 amino acid protein encoded by 1340 nucleotides (nts) transcript (NM_000799) that presents a 5’UTR with 181 nts containing a uORF with 14 codons that terminates 22 nts upstream of the EPO initiation codon. However, the role of this uORF is unknown. The aim of this project was to study the role of the EPO uORF in its translational control.N/
Gene-environment interactions in Autism Spectrum Disorder (ASD)
No full textTese de Doutoramento em Biologia, na especialidade de Biologia de Sistemas, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2023.Tese submetida a 8 de julho de 2022 e defendida e aprovada com Distinção e Louvor a 26 de janeiro de 2023.Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças Não Transmissíveis do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP - Grupo de Neurogenética e Saúde Mental.Autism Spectrum Disorder (ASD) is a heterogeneous neurodevelopmental disorder
characterized by deficits in social communication and interaction and repetitive and restricted
behaviors. While heritability estimates support a role for gene-environment interactions in ASD
etiology, there is a paucity of strategies that integrate both components. The objective of this
work was to identify gene-environment interactions involved in ASD risk.
Through a systematic literature review we identified neurotoxic xenobiotics previously
implicated in ASD, including air pollutants and endocrine disruptors. Using a school-based
screening strategy we provide an updated prevalence estimate for 7-9 years old children from
Centro Region of Portugal, of 0.5% (95% CI: 0.3-0.7). Leveraging public air quality monitoring
data we estimated early-life exposure to criteria air pollutants in 217 ASD-subjects, and show
that exposure to particulate matter during critical neurodevelopmental windows is associated
with a higher clinical severity of ASD. In silico inspection of large genetic datasets (N=6224)
showed that ASD-subjects carry predicted-damaging variants in a panel of 77 genes involved
in the regulation of detoxification and physiological barriers (blood-brain barrier and placenta)
permeability (XenoReg genes). Database query indicates that these genes interact with ASD implicated xenobiotics. Through biochemical analyses of neonatal dried blood spots and the
piloting of an early-life exposures assessment questionnaire we retrospectively collected
environmental data for 70 ASD-children. The integration of environmental and sequencing data
revealed a group of 13 patients for whom gene-environment interactions likely contributed to
disease etiology.
We present evidence that genetically-susceptible subjects might be at higher risk of
ASD due to an increased vulnerability to early-life exposures. Possible underlying
neuropathological mechanisms, including neuroinflammation, oxidative stress, endocrine
disruption and epigenetics, warrant experimental validation. This work reinforces the need for
clinical stratification and for monitoring early-life exposures, providing knowledge that,
prospectively, may be translated to personalized medicine strategies applied in clinical practice.A Perturbação do Espetro do Autismo (PEA) é uma doença do neurodesenvolvimento
clinicamente heterogénea, caraterizada por dificuldades na comunicação e interação social,
associadas a comportamentos repetitivos e estereotipados e padrões de interesse marcados por
objetos ou temas específicos. A PEA tem uma prevalência de 65 casos por 10 000 indivíduos
(0.65%) a nível global, com variações regionais, e afeta 3 a 4 vezes mais indivíduos do sexo
masculino, tendo um enorme impacto individual, familiar e social. O diagnóstico é
observacional, e não existem biomarcadores universais e validados para a perturbação. É
conhecido que a PEA tem uma grande componente genética, e estudos de Sequenciação de
Nova Geração (NGS) já detetaram várias variantes genéticas associadas à doença, incluindo
Variações de Nucleótido Único (SNVs) e Variações no Número de Cópias (CNVs). No entanto,
fatores de risco genéticos não são suficientes para explicar a heterogeneidade clínica da doença,
e muitos casos são considerados idiopáticos. Estimativas de heritabilidade recentes, obtidas
através de estudos que calculam a concordância no diagnóstico de PEA entre pares de
indivíduos da mesma família, sugerem um papel de interações gene-ambiente na etiologia desta
perturbação. Contudo, não é frequente observar estudos desenvolvidos com base em estratégias
integrativas que consideram fatores de risco genéticos e ambientais como componentes que
interagem para modular o risco de PEA. O principal objetivo desta dissertação é identificar
interações gene-ambiente associadas com o risco de PEA, usando uma abordagem integrativa
e multidisciplinar.
A partir de uma revisão sistemática da literatura identificámos xenobióticos (isto é,
compostos naturais ou sintéticos estranhos ao organismo) previamente associados à PEA,
incluindo poluentes atmosféricos, bisfenol A, ftalatos, éteres de difenila polibromados
(PBDEs), bifenilos policlorados (PCBs), pesticidas, metais pesados e antidepressivos. Estes
xenobióticos têm propriedades neurotóxicas, são disruptores endócrinos e são capazes de
atravessar barreiras fisiológicas e, consequentemente, podem causar efeitos adversos durante o
neurodesenvolvimento, quando o cérebro é particularmente vulnerável a fatores exógenos.
Adicionalmente, a evidência atual aponta para que suplementação pré-natal com ácido fólico
ou vitamina D diminua o risco de PEA. Esta revisão sistemática relevou também que, até à data,
poucos pares de interação gene-ambiente foram associados à PEA.
Um dos temas de maior debate atualmente na investigação da PEA é se o aumento da
prevalência consistentemente reportado se deve a fatores etiológicos ou não-etiológicos. No
âmbito do projeto Autism Spectrum Disorders in the European Union (ASDEU) foi adotada uma abordagem harmonizada para a identificação de indivíduos com PEA, numa população
alvo composta por crianças com idades compreendidas entre os 7 e os 9 anos a frequentar o
ensino básico no ano escolar de 2016/2017, na região Centro de Portugal. Foi estimada uma
prevalência de 0.5% (95% IC: 0.3-0.7) para a região, o que representa um aumento
relativamente à última estimativa de 0.125% (95% IC: 0.095-0.15), obtida para o ano escolar
de 1999-2000. Este estudo não se debruçou sobre as eventuais causas que explicam este
aumento, mas uma potencial influência de fatores ambientais não pode ser excluída,
nomeadamente o de efeitos transgeracionais causados pela acumulação de exposições
ambientais e transmissão de alterações epigenéticas consequentes ao longo de várias gerações.
Adicionalmente, estes dados são importantes do ponto de vista da saúde pública, pois revelaram
que crianças diagnosticadas com PEA frequentam, na sua maioria, escolas com unidades
especializadas, capazes de lhes fornecer uma educação e acompanhamento adequados às suas
necessidades.
De seguida, tirámos proveito de dados de monitorização da qualidade do ar,
publicamente acessíveis através da plataforma da Agência Portuguesa do Ambiente. Estes
dados foram integrados com dados de georreferenciação para 217 indivíduos com PEA,
incluindo aqueles que participaram no estudo epidemiológico. Através destes dados estimámos
retrospetivamente a exposição individualizada a poluentes atmosféricos, incluindo material
particulado com dimensão <10µm e <2.5µm, dióxido de nitrogénio, dióxido de enxofre e ozono
nos 217 indivíduos, com maior e menor gravidade clínica de PEA de acordo com a Escala de
Observação para o Diagnóstico do Autismo (ADOS). Testes não paramétricos e de regressão
logística revelaram associações estatisticamente significativas (α<0.05) entre uma elevada
exposição a material particulado durante o primeiro e terceiro trimestres da gravidez e durante
toda a gravidez e uma maior gravidade clínica. Estes resultados estão de acordo com dados
anteriores que mostram um maior risco de PEA em populações com elevada exposição a
matéria particulada, e reforçam a necessidade de métodos de estratificação clínica para a
identificação de fatores de risco associados a subgrupos clínicos.
Ao interrogar grandes bases de dados oriundas de projetos como o Autism Sequencing
Consortium (n=2674), o Autism Genome Project (n=2446) e o Simons Simplex Collection
(n=1124) identificámos SNVs e CNVs potencialmente patogénicos em 77 genes que codificam
enzimas de destoxificação e proteínas envolvidas na regulação da permeabilidade e
morfogénese de barreiras fisiológicas como a barreira hematoencefálica, placenta e cílios das
vias respiratórias (genes XenoReg), em indivíduos com PEA. Uma análise da Comparative
Toxicogenomics Database mostrou que os genes XenoReg interagem com xenobióticos implicados na PEA. As cascatas de destoxificação e as barreiras fisiológicas constituem uma
primeira linha de defesa do organismo em desenvolvimento contra xenobióticos, pelo que
variantes nos genes XenoReg podem aumentar a suscetibilidade à neurotoxicidade imposta por
exposições ambientais. Estes resultados foram valiosos na identificação de novos pares de
interação gene-ambiente potencialmente envolvidos na PEA.
Numa última abordagem integrativa, foram aplicadas duas estratégias para a colheita de
dados individualizados de exposição ambiental no início de vida, de forma retrospetiva, para
70 indivíduos com PEA. Níveis de xenobióticos, incluindo bisfenol A, PCBs, PBDEs e
glifosato, previamente implicados na PEA, foram quantificados em amostras de gotas de sangue
recolhidas no âmbito do Programa Nacional de Rastreio Neonatal de doenças metabólicas,
através de Cromatografia Líquida acoplada a Espetrometria de Massa. Foi aplicado um
questionário detalhado que avalia a exposição a vários fatores ambientais desde os 3 meses
antes da gravidez até ao primeiro aniversário da criança para reunir informação acerca de
suplementação pré-natal com ácido fólico e ocorrência de condições maternas e ingestão de
medicamentos durante a gravidez. Estes dados ambientais foram integrados com dados obtidos
por NGS, nos quais procurámos por variantes potencialmente patogénicas nos 77 genes
XenoReg previamente identificados. A identificação de 13 indivíduos com concentrações
elevadas de xenobióticos nas gotas de sangue e com variantes potencialmente patogénicas nos
genes XenoReg é um forte indicador que, nestes indivíduos geneticamente suscetíveis,
exposições durante o neurodesenvolvimento podem ter contribuído para o risco de PEA.
Durante esta dissertação são discutidos os mecanismos neuropatológicos que podem
explicar a contribuição de interações gene-ambiente no risco da PEA. Tais mecanismos incluem
alterações epigenéticas, neuroinflamação, stress oxidativo e desequilíbrios hormonais causados
por disruptores endócrinos. No entanto, estes mecanismos requerem validação experimental,
nomeadamente através de organoides cerebrais, de forma a fornecer uma explicação mais
completa sobre os processos biológicos envolvidos nesta doença.
O trabalho apresentado nesta dissertação respondeu ao objetivo definido inicialmente e
reforça o papel que interações gene-ambiente podem ter na etiologia da PEA, particularmente
em indivíduos geneticamente suscetíveis. Estes resultados foram possíveis devido a uma
estratégia multidisciplinar, que envolveu a aplicação de métodos bioinformáticos e
experimentais para a integração de dados clínicos, genéticos e ambientais. Estes resultados
mostram também a importância da obtenção e utilização de dados individualizados e da
aplicação de métodos de estratificação clínica, pois a complexidade da doença aponta para que
casos diferentes tenham etiologias diferentes. Exposições ambientais durante o início de vida são uma reconhecida causa de
morbilidade e mortalidade infantil, devido à extrema vulnerabilidade do cérebro imaturo a
fatores neurotóxicos. Assim, são urgentes medidas de monitorização e regulação ambiental que
permitam identificar grupos de risco. Resultados como os aqui apresentados poderão, no futuro,
contribuir para a descoberta de biomarcadores para subgrupos clínicos e consequente
implementação de estratégias de Medicina Personalizada para a prevenção da PEA.Funding: Fundação para a Ciência e a Tecnologia do Ministério da Educação e Ciência,
PD/BD/114386/2016N/
Functional networks of DIS3L2 in cancer and NMD
No full textIn the flow of information from DNA to mRNA to proteins, mRNAs undergo a number of processing steps, since they are synthesized in the nucleus, until they are translated in the cytoplasm. Eukaryotic cells tightly control the fidelity of this process, via quality control pathways, among them, the nonsense-mediated mRNA decay (NMD). NMD recognizes and degrades mRNAs harboring premature translation-termination codons (PTCs), protecting the cell from potentially harmful truncated proteins. However, NMD can also regulate normal and fully functional mRNA levels, arising as a surveillance and a gene expression regulation pathway. A new branch of the NMD pathway is starting to be revealed, which is characterized by the involvement of the DIS3L2 3’ to 5’ exoribonuclease. This protein, has special relevance, given its exosome-independent action and its uridylation-mediated decay. In addition, mutations on this ribonuclease, induce deregulation of cell-cycle genes leading to a faster cell growth and decreased chromosome stability, while DIS3L2 downregulation enhances cancer stem cell properties.
Several lines of evidence point to an oncogenic role of DIS3L2 and its mediated decay over a number of NMD targets, however further research is needed to unveil the mechanism by which this nuclease is involved in NMD and how it mediates cancer related processes. In this project, we aim to analyze how DIS3L2 and uridylation regulate the human transcriptome, in order to shed light on how this ribonuclease is related to NMD and how its deregulation contributes to tumorigenesis. For this purpose, high-throughput mRNA sequencing has been performed in the SW480 colorectal cancer cell line depleted of DIS3L2 or DIS3L2 plus terminal uridylyl transferases (TUTases), TUT4 and TUT7. Preliminary results show gene ontology enrichment in molecular functions and biological processes related with cancer.FCT - PTFC/BIM-MEC/3749/2014info:eu-repo/semantics/publishedVersio
The PERK mRNA: an unexpected non-NMD-target
No full textNonsense-mediated mRNA decay (NMD) was firstly described as a surveillance pathway that recognizes and rapidly degrades mRNAs carrying premature translation-termination codons (PTCs) resulted from mutations or errors in RNA processing. Many transcriptome-wide studies demonstrated that NMD also targets mRNAs transcribed from a large subset of wild-type genes, thus arising as a post-transcriptional regulatory mechanism of gene expression. Hence, NMD contributes to the regulation of many essential biological processes, including stress responses. Recent reports revealed that NMD is capable of regulating the Unfolded Protein Response (UPR) that is induced in conditions of endoplasmic reticulum (ER) stress. This is achieved, at least in part, by the degradation of the IRE1α mRNA, a natural NMD-target and one of the three primary factors of the UPR. The other two factors are ATF6 and PERK, and there are evidences suggesting that the PERK-branch can also be involved in the NMD-mediated regulation of the UPR. In this work, we intended to test if the PERK mRNA is a natural NMD-target and, if so, determine the role and relevance of NMD to the PERK-mediated response during the UPR.
By using 5’/3’ rapid amplification of cDNA ends (RACE) we have confirmed the sequences and lengths of the annotated 5’ and 3’ untranslated regions (UTRs) of the PERK mRNA. This allowed us to confirm the presence of two possible NMD-inducing features: upstream open reading frames (uORFs) in the 5’UTR and a long 3’UTR (~100bp). To test if PERK mRNA is a direct NMD-target, we have assessed its mRNA levels and stability in conditions of impaired NMD by UPF1 (NMD central factor) siRNA-mediated knockdown in HeLa cells. Surprisingly, the UPF1 knockdown did not induce the upregulation of PERK mRNA and neither stabilize it, suggesting that PERK mRNA is not a natural NMD-target.
Our data suggests that NMD does not regulate the UPR through degradation of the PERK mRNA as it does with the IRE1α mRNA. However, we cannot rule out the hypothesis of NMD acting in the PERK-branch, for instance, by degrading downstream targets of PERK.Partially supported by UID/MULTI/04046/2013 center grant from FCT to BioISI. RF is
recipient of a fellowship from BioSys PhD programme (SFRH/BD/114392/2016) from FCTinfo:eu-repo/semantics/publishedVersio
The interplay between nonsense-mediated mRNA decay and the unfolded protein response: implications for physiology and myocardial infarction
No full textNonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a surveillance pathway that recognizes and degrades mRNAs carrying premature translation-termination codons (PTCs), protecting the cell from potentially harmful truncated proteins (1). Recent studies demonstrated that NMD also targets mRNAs transcribed from a large subset of wild-type genes, arising as a mechanism of gene expression regulation (2,3). This raised the possibility that NMD is a controlled mechanism, an idea that was confirmed by recent studies, where NMD activity was seen to be modulated in specific cell types (4) and auto regulated through its intrinsic mechanism of mRNA degradation (5). Cellular stress, such as endoplasmic reticulum (ER) stress, hypoxia, reactive oxygen species, and nutrient deprivation were also seen to modulate the magnitude of NMD by mechanisms that are beginning to be understood (6). For example, the activation of kinases, as part of the cell-stress corrective pathways, induces the phosphorylation of the eukaryotic initiation factor 2 alpha (eIF2α), reducing protein translation and thus impairing NMD activity (7,8). In contrast, this eIF2α phosphorylation-dependent inhibition of NMD in stress conditions is responsible for the upregulation of many stress-related transcripts that are responsible for allowing the cell to cope with stress (7,9–11).
There is currently great interest in decoding the mechanisms that couple stress signaling to human pathology. Only recently has ER stress been considered a potential contributor to cardiac and vascular diseases (12). Myocardial infarction is a pathological state that occurs during ischemia, where there is nutrient and oxygen deprivation in the heart, causing aggregation of proteins in the ER. This aggregation triggers ER stress and the three arms (ATF6, IRE1α and PERK) of the unfolded protein response (UPR), to mitigate or eliminate the stress (12). Ultimately, if the stimulus is continued, cell death is activated (13,14). NMD plays a role in the regulation of the UPR, establishing a threshold for its activation and its time-dependent attenuation, that is accomplished, in part, through degradation of the IRE1α mRNA (9). NMD also protects the cell from death in response to stress, but the mechanism for this remains unclear (9).
Despite being a very well-studied mechanism, NMD and its role in cell physiology needs to be further explored. Given this and the all above-mentioned, the main goal of this project is to understand the role of NMD in the PERK-mediated response to ER stress induced by ischemia during myocardial infarction, and its impact to the pathophysiology of this disease. For this purpose, H9C2 cell line will be used as a model of cardiomyocytes, which will help us to dissect the crosstalk communication between NMD and UPR, through the PERK pathway, in myocardial infarction-mimicking conditions.N/
Regulation of nonsense-mediated mRNA decay (NMD) and the transcriptome: implications for physiology and myocardial infarction
No full textNonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a surveillance pathway that recognizes and selectively degrades mRNAs carrying premature translation termination codons (PTCs) that would otherwise lead to the production of potentially harmful truncated proteins (1). Recent studies demonstrated that NMD also targets physiologic mRNAs transcribed from a large subset of wild-type genes, being responsible for the regulation of up to 10% of the mammalian transcriptome (2,3). This raises the possibility that NMD itself is under regulatory control. Indeed, recent studies have shown that NMD activity is modulated in specific cell types and that key components of the NMD pathway are regulated by several pathways, including NMD itself (4). Cellular stress, such as endoplasmic reticulum (ER) stress, hypoxia, reactive oxygen species, and nutrient deprivation also modulates the magnitude of NMD by mechanisms that are beginning to be understood (5). For example, the activation of kinases, as part of the cell-stress corrective pathways, induces the phosphorylation of the eukaryotic initiation factor 2 alpha (eIF2α), reducing protein translation and thus impairing NMD activity (6,7).
There is currently great interest in decoding the mechanisms that couple stress signaling to human pathology. Only recently has ER stress been considered a potential contributor to cardiac and vascular diseases (8). Myocardial infarction is a pathological state that occurs during ischemia, where there is nutrient and oxygen deprivation in the heart, causing aggregation of proteins in the ER. This aggregation triggers ER stress and the three arms of the unfolded protein response (UPR), to mitigate or eliminate the stress (8).
Given that NMD can respond to ER stress (6), here we aim to study 1) how NMD is regulated in cardiomyocytes under stress conditions, and 2) what is the influence of NMD on the transcriptome of cardiomyocytes and how it is involved in the cell-stress corrective strategies.
So far, we have built a database that contains around 149 transcripts which are natural NMD-targets and are dysregulated under stress conditions, based on data from transcriptomic and UPF1-silencing studies. Using bioinformatics and gene ontology analysis we have classified the transcripts by biological function, and we intend to choose a few molecular targets for further studies in cardiomyocytes cultured cells in order to accomplish the objectives proposed.N/
NMD-associated proteins predicted by an integrative network approach
No full textThe mechanism of nonsense-mediated decay (NMD) selectively degrades mRNAs carrying a premature translation-termination codon and regulates the abundance of a large number of physiological mRNAs that encode full-length proteins. Although this complex process has been extensively studied along the years, the interactions and connectivity among NMD players is not completely understood. Additionally, some NMD mechanistical aspects suggest missing roles that can be played by proteins still not reported as involved in this pathway.
To tackle this hypothesis, we developed a network-based approach to predict new proteins involved in NMD. Our approach explores the ability of proteins to bridge related processes, while integrating data regarding protein-protein interactions, co-expression and co-regulation by miRNAs and transcription factors.
We found that known NMD-factors have physical, regulatory and co-expression interaction signatures with related processes (mRNA translation, mRNA splicing, mRNA degradation and mRNA transport), which can be used to distinguish them from other proteins. We computed a scoring algorithm to rank NMD-neighbors according to the similarity to these signatures, generating a list of NMD candidates, that we aim to validate experimentally. Interestingly, some candidates were recently studied in NMD context and showed promising results. Furthermore, a cross-validation analysis indicated the robustness of the predictions provided by our method.
We propose that such approach can be applied to find molecular bridges between related biological processes and generate novel hypotheses about the molecular mechanisms co-regulating these phenomena.Partially supported by UID/MULTI/04046/2019 center grant from FCT to BioISI
Gonçalo Nogueira is recipient of a fellowship from BioSys PhD programme (PD/BD/130959/2017) from FCTinfo:eu-repo/semantics/publishedVersio
The human mRNA decay machinery: an unexpected role for DIS3L2 over nonsense-mediated decay targets
No full textTese de doutoramento em Biologia (Biologia de Sistemas), apresentado à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2018Throughout its complex life, eukaryotic messenger RNAs (mRNAs) go through several processes both in the nucleus and the cytoplasm, from the moment they are transcribed until they are degraded. As during these process errors can occur, cells have several surveillance mechanisms that detect and degrade abnormal transcripts. Among these, we can find the nonsense-mediated mRNA decay (NMD), which is a surveillance mechanism that detects and degrades mRNAs carrying a premature translationtermination codon (PTC). However, it is known that NMD also regulates the abundance of a large number of physiological RNAs that encode full-length proteins. In human cells, NMD-targeted mRNAs are degraded by endonucleolytic cleavage and exonucleolytic degradation from both 5’ and 3’ ends. This is done by a process not yet completely understood that recruits decapping and 5’-to-3’ exonuclease activities, as well as deadenylating and 3’-to-5’ exonuclease exosome activities. The main objective of this PhD project was to unveil the role of the eukaryotic ribonucleases in the translation-dependent mRNA surveillance mechanisms of NMD and non-stop decay (NSD), and in normal mRNA turnover, with special focus in NMD. In this thesis, we studied the role of the exosome-associated DIS3, DIS3L1 and PM/Scl100, the major cytoplasmic 5’-to-3’ exoribonuclease XRN1, the endoribonuclease SMG6, and the exosome-independent 3’-to-5’ exoribonuclease DIS3L2. With this aim in mind, we divided this work in 3 sections. In the first section, the research goal was to unveil the role of ribonucleases in the different mRNA decay mechanisms. For that, we knockeddown distinct ribonucleases (endo- and exo-) in HeLa cells. In addition, cells were transiently transfected with constructs containing different human β-globin variants. The β-globin variants used in this study includes: the wild-type β-globin gene (βWT), a β-globin gene with a nonsense mutation at codon 15 (β15), which is NMD-resistant, two NMD-sensitive variants with nonsense mutations at codon 26 or 39 (β26 and β39) and a NSD-sensitive (βNS) variant. Then, we assessed by Reverse-transcription coupled with quantitative Polymerase chain reaction (RT-qPCR) the changes on the mRNA levels upon the different ribonucleases knockdown (KD). Our results show that in eukaryotic cells ribonucleases are not exclusive of any mRNA decay pathway. Also, we performed the ribonucleases KD and accessed by RT-qPCR the changes in the mRNA levels of several endogenous NMD targets. Our results point to a target specificity of ribonucleases in the regulation of NMD targets. Interestingly, we showed, for the first time, that DIS3L2 is implicated in the NMD targets degradation. In the second section, the research goal was to investigate how DIS3L2 functions in NMD. Here, we showed that DIS3L2 function in the same pathway as the canonical NMD factor UPF1. Moreover, we observed that DIS3L2 directly degrades several NMD targets independently of any other ribonuclease. Furthermore, the DIS3L2 degradation of NMD targets depends on the activity of the terminal uridyl transferases (TUTases) 4 and 7. Together, our findings establish a role for DIS3L2 and uridylation in NMD. In the third section, the research goal was to elucidate how DIS3L2 modulates the eukaryotic transcriptome. We performed a high-throughput total RNA sequencing in SW480 colorectal cancer (CRC) cell line. Considering the results we obtained in the previous sections, we perform a single DIS3L2 KD and a triple DIS3L2+TUT4+TUT7 KD, in the SW480 CRC cell line. This will allow to unveil how DIS3L2 and uridylation by TUT4-TUT7 modulates the transcriptome in a CRC cell line context. Together this work shed light on how ribonucleases are involved in general mRNA turnover, NMD and NSD. Our results emphasize that eukaryotic ribonucleases are target specific rather than pathway specific. This work also shows, for the first time, the involvement of DIS3L2 in NMD and, consequently in the gene expression regulation of NMD targets. Also, our results set, for the first time, uridylation as a mechanism involved in NMD. Together, our data unveil (possibly) a new branch of the NMD pathway. Thus, we place DIS3L2 “on the tail” of NMD targets. Taking into account that NMD pathway is involved in the expression regulation of several genes involved in many diseases (e.g. cancer), understanding how DIS3L2 regulates a subset of NMD targets could unveil new ways to address these diseases.A expressão génica nos organismos eucariotas é um processo complexo,
composto por inúmeros passos altamente regulados. A expressão génica depende muito
da regulação feita ao nível do ácido ribonucleico mensageiro (mRNA, do inglês
messenger RNA). Em organismos eucariotas, o mRNA é a molécula responsável pela
transferência de informação, desde o ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês
deoxyribonucleic acid) que se encontra no núcleo, até a produção de proteínas no
citoplasma.
O mRNA eucariótico passa por vários processos, tanto no núcleo como no
citoplasma, desde o momento em que é transcrito até ser degradado. Durante esses
processos o mRNA adquire algumas características/estruturas que lhe conferem mais
estabilidade, protegendo-o da degradação por enzimas capazes de degradar o mRNA,
as ribonucleases. Entre essas características/estruturas encontram-se a adição da
estrutura cap na extremidade 5’ e a adição de até 200 adeninas (A), denominada cauda
poli(A), na extremidade 3’. A estrutura cap e a cauda poli(A) protegem os mRNAs da
degradação de 5’-3’ e de 3’-5’, respetivamente. Como durante todos esses processos
podem ocorrer erros, as células têm vários mecanismos de vigilância, também
denominados mecanismos de controlo de qualidade, que detetam e degradam mRNAs
não-funcionais ou anómalos. Entre estes mecanismos de controlo de qualidade,
destaca-se o decaimento de mRNA mediado por codões nonsense (NMD, do inglês
nonsense mediated mRNA decay). Um codão nonsense é um codão que induz a
terminação da tradução do mRNA. O NMD é um mecanismo de vigilância que deteta e
degrada mRNAs que contêm um codão de terminação da tradução prematuro (PTC, do
inglês premature translation-termination codon). Se não forem degradados, os mRNAs
que contenham PTC levam a produção de proteínas truncadas, que para além de
poderem não ser funcionais, podem ser prejudiciais para as células. No entanto, para
além do papel do NMD como mecanismo de controlo da qualidade, sabe-se que o NMD
também regula a abundância de um grande número de mRNAs fisiológicos, que
codificam proteínas inteiras e funcionais. Em células humanas, sabe-se que os mRNAs
degradados pelo NMD são degradados por clivagem endonucleolítica e/ou degradação
exonucleolítica a partir de ambas as extremidades (5' e/ou 3'). Este processo ainda não é totalmente conhecido, sabendo-se que o NMD recruta, entre outras, as proteínas
responsáveis por retirar a estrutura cap (processo denominado decapping) e pela
degradação da cauda poli(A) (processo denominado desadenilação). Para além destas,
o NMD também recruta as ribonucleases responsáveis por degradar os mRNAs de 5’-3’
e de 3’-5’.
Tal como referido anteriormente, existem outros mecanismos de controlo de
qualidade do mRNA. É o caso do mecanismo de controlo da qualidade do mRNA
mediado pela ausência de um codão de terminação da tradução (NSD, do inglês nonstop decay). O NSD deteta e degrada mRNAs que não possuem qualquer codão de
terminação da tradução.
Este trabalho teve como principal objetivo desvendar o papel das ribonucleases
eucarióticas no NMD e NSD, assim como na degradação do mRNA normal. Assim sendo,
estudámos o papel das exoribonucleases DIS3, DIS3L1, DIS3L2 e PM/Scl100, que atuam
de 3’-5’, XRN1, que atua de 5’-3’ e a endoribonuclease SMG6, que cliva o mRNA no
interior da molécula.
Com o objetivo de identificar o papel das ribonucleases nos diferentes
mecanismos de degradação do mRNA,silenciaram-se as diferentes ribonucleases (endoe exo-) em células HeLa. Estas células foram também transfetadas transientemente com
construções contendo diferentes variantes do gene da beta(β)-globina humana. Nas
variantes do gene da β-globina utilizadas neste estudo incluem-se: β-globina normal
(βWT, do inglês β-globin wild-type), β-globina com uma mutação nonsense no codão 15
(β15), que é resistente ao NMD, duas variantes sensíveis ao NMD com mutações
nonsense no codão 26 ou 39 (β26 e β39) e uma variante sem qualquer codão nonsense,
sensível ao NSD (βNS). Em seguida, avaliou-se por transcriptase-reversa, seguida de
reação em cadeia da polimerase (RT-qPCR, do inglês reverse-transcription followed by
polymerase chain reaction) as alterações nos níveis de mRNA. Os nossos resultados
mostram que em células eucarióticas as ribonucleases não são exclusivas de qualquer
mecanismo de degradação do mRNA.
Com o intuito de perceber de que maneira cada uma das ribonucleases estaria envolvida no NMD, realizámos o silenciamento (KD, do inglês knockdown) de cada uma das ribonucleases e medimos por RT-qPCR as alterações nos níveis de mRNA de alvos endógenos de NMD. Os nossos resultados apontam para que a atuação das ribonucleases varie consoante as características de cada um dos alvos de NMD. Curiosamente, mostrámos, pela primeira vez, que DIS3L2 está envolvida na degradação de alvos naturais do NMD. Com o intuito de perceber qual o mecanismo pelo qual a DIS3L2 atua na degradação de alvos naturais do de NMD, realizou-se o KD da DIS3L2 e da UPF1, fator essencial para o NMD, em separado e em conjunto. Verificou-se que o KD duplo não produzia um efeito aditivo, indicando que a degradação pela DIS3L2 não é independente da degradação promovida pela UPF1. Seguidamente, testou-se o tempo de meia-vida de alguns alvos endógenos de NMD com e sem o KD da DIS3L2, o que nos permitiu concluir que a DIS3L2 atua diretamente sobre os alvos do NMD. Recentemente foi descrito que a degradação de mRNAs pela DIS3L2 depende da adição de uridinas (U) por proteínas denominadas terminal urydil transferases (TUTases), mais particularmente as TUTases 4 (TUT4) e 7 (TUT7). Neste mecanismo as TUT4-TUT7, ao uridilar os mRNAs marcam-nos para degradação pela DIS3L2. Considerando estes dados, testámos a hipótese de os alvos de NMD poderem ser uridilados. Os nossos dados mostram que a acumulação dos alvos naturais de NMD observada após o KD da DIS3L2 é dependente da atividade das TUT4+TUT7, estabelecendo um papel para a uridilação na degradação de alvos do NMD pela DIS3L2. Com base nestes resultados estabelecemos como terceiro objetivo elucidar como a DIS3L2 modula o transcriptoma eucariótico. Com este objetivo, realizou-se sequenciação do RNA total (RNA-seq, do inglês RNA sequencing) na linha celular derivada de cancro colorretal (CRC, do inglês colorectal cancer) SW480. Para tal, efetuámos o KD da DIS3L2 e o KD triplo das DIS3L2+TUT4+TUT7. Isso permitirá descobrir como a DIS3L2, assim como a uridilação pelas TUT4-TUT7, modula(m) o transcriptoma num contexto de uma linha celular de CRC. Em suma, esta dissertação cumpriu os objectivos propostos, dado que demonstra de que maneira as ribonucleases estão envolvidas no turnover normal do mRNA, e nos mecanismos de controlo de qualidade NMD e NSD. Para além disso, este trabalho também mostra, pela primeira vez, o envolvimento da DIS3L2 no NMD e na
regulação da expressão génica de alvos naturais do NMD. Ademais, mostra-se que a
degradação dos alvos de NMD pela DIS3L2 é dependente da atividade das TUTases.
Assim, este trabalho abre novos caminhos de investigação e revela (possivelmente) um
novo ramo do mecanismo do NMD. Tendo em vista que o mecanismo do NMD está
envolvido na regulação da expressão génica de vários genes envolvidos em diversas
doenças (como o cancro, por exemplo), compreender o mecanismo pelo qual a DIS3L2
regula a expressão de um subconjunto de alvos naturais do NMD poderá revelar novas
maneiras de abordar essas doenças.Bolsa de doutoramento no âmbito do Programa doutoral BioSys em Sistemas Biológicos, Genómica Funcional & Integrativa (FCT/PD/00065/2012) da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, financiado
pela Fundação para a Ciência e Tecnologia do Ministério da Educação e Ciência, Bolsa SFRH/BD/52495/2014.N/