publish.UP (Univ. Potsdam)
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Klotz am Bein oder Kolleg:in in spe?
No full textDer vorliegende Beitrag berichtet die Ergebnisse einer Befragung zur externen klinisch-praktischen Ausbildung in der Sprachtherapie/Logopädie. 115 Personen formulierten aus der Sicht von Praktikant:innen und Praktikumsanleitenden Wünsche an ein Praktikum und benannten Faktoren, die zum Gelingen des Praktikums beitragen. Neben positiven persönlichen Eigenschaften wird von der jeweils anderen Seite ein hohes Engagement erwartet. Betont wird außerdem die Rolle der Ausbildungsstätte, die das Praktikum eng begleiten sollte
Anonymität in den sozialen Medien
No full textDer Aufsatz wurde im Sommersemester 2024 von den Autorinnen aus Interesse an der Thematik erarbeitet.
„Das wird man ja wohl noch sagen dürfen. In Deutschland herrscht Meinungsfreiheit!“ Ein mittlerweile bekannter Satz, den jeder bestimmt schon einmal gehört hat. Die Anonymität im Internet bietet einerseits die Möglichkeit, Meinungen frei zu äußern, ohne Angst vor Repressalien oder Verfolgung haben zu müssen. Andererseits fördert sie jedoch auch den Missbrauch, indem Hassreden und Fehlinformationen leichter verbreitet werden können. Angesichts dieser Gegensätze stellt sich die zentrale Frage, wie mit der Meinungsfreiheit in sozialen Medien umgegangen werden sollte, um sowohl freie Meinungsäußerung zu gewährleisten als auch Missbrauch effektiv zu begrenzen. Dieser Aufsatz befasst sich mit dieser Frage, indem er zunächst den Schutzbereich der Meinungsfreiheit als Grundrecht beleuchtet und anschließend die Bedeutung der Anonymität in diesem Kontext erörtert. Dabei werden sowohl die rechtlichen Rahmenbedingungen als auch die gesellschaftlichen Implikationen betrachtet
Erhöhung der Umweltkomplexität: Schwimmverhalten und Chemotaxis von Pseudomonas putida in strukturierten Umgebungen
No full textThe lophotrichously flagellated bacterium Pseudomonas putida (P. putida) lives in soil, a densely structured habitat. Previous studies have mainly investigated its swimming motility in the uniform fluid. There, it swims in straight runs interrupted by stops and directional reversals. During the runs, the flagellar bundle can rotate counterclockwise (CCW) pushing the cell body or clockwise (CW) pulling the cell body or wrapping around it.
Here, we investigated how complex heterogeneous surroundings influence this swimming motility. Several structures were considered including spherical particles, microfluidic channels, agar, agarose and hydrogel beads. Also the effect of increased viscosity was tested by adding Ficoll. Fluorescence experiments were performed to visualize the flagella and identify the swimming modes.
Bacteria are known to adapt to more complex surroundings where the load on the flagella is higher due to mechanical interactions and increased viscous drag. Under such conditions, stator recruitment to the flagellar motor is increased, allowing higher torques to be generated. It is assumed that an increase in motor torque leads to a transition from pulling to wrapped mode. In this work, the two molecular stators, MotAB and MotCD powering the flagella in P. putida, were knocked-out to investigate the relevance of the stators for wrapped mode formation and for swimming motility in fluids of different viscosity and in agar. Comparing the wrapped mode frequency for the different surroundings, an increased tendency to form wrapped mode was observed for higher viscosity and dense structures. This is thought to be beneficial for escaping from mechanical traps and navigating in confined spaces. Experiments in the microfluidic polydimethylsiloxane (PDMS) channels moreover showed that wrapped mode swimmers tend to escape from the near surface region while the push mode is hydrodynamically attracted.
The experiments with the stator knockout mutants revealed that in aqueous environment the DmotAB mutant swims more than four times slower than the wild-type and is unable to form the wrapped mode. Under increased viscosity conditions the wrapped mode could be partially restored showing that both stators can promote wrapped mode formation. However, a highly motile phenotype, similar to the wild-type, was only found when the swimming motility of the DmotAB mutant was examined in agar. In contrast, the motility of the DmotCD mutant was comparable to the wild-type for all tested conditions, showing a similar swimming mode distribution and swimming speed. However, in agar, the DmotAB mutant outperforms the DmotCD mutant by spreading faster within the dense network. The DmotCD mutant was found to form non-motile clusters, resulting in a fewer amount of spreading cells. Taken together, the MotAB stator is crucial for swimming motility in aqueous environments and the MotCD stator prevents the cells from forming sessile clusters in agar.
In the presence of a chemoattractant gradient, P. putida is known to show a run time bias, such that the run time decreases when swimming away from a nutrient source. In addition to the run time bias, an angle bias was identified in agar. During a turn event, P. putida changes its swimming direction to a larger degree when its previous run was in a downgradient direction.Das lophotrich flagellierte Bakterium P. putida lebt im Erdboden, einem dicht gepackten und strukturierten Habitat. Bisherige Studien haben sich vor allem mit dem Schwimmverhalten von P. putida in homogener, wässriger Umgebung beschäftigt. Dort schwimmt es in geradlinigen Runs, die von Stopps und Reversals unterbrochen werden. Während der Runs kann sich das Flagellenbündel entweder gegen den Uhrzeigersinn drehen und den Zellkörper im Push-Modus nach vorne drücken oder sich im Uhrzeiger drehen, wobei das Flagellenbündel den Zellkörper im Pull-Modus zieht oder sich um den Zellkörper wickelt (Wrapped-Modus).
In dieser Arbeit wurde der Einfluss komplexer, heterogener Umgebungen auf die Schwimmbewegung untersucht. Dazu wurden verschiedene Strukturen getestet, wie sphärische Partikel, mikrofluidische Kanäle, Agar, Agarose und Hydrogelkügelchen. Auch der Einfluss erhöhter Viskosität wurde durch Ficollzugabe untersucht. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurden die Flagellen visualisiert und die Schwimmmodi identifiziert.
Bakterien passen sich an komplexe Umgebungen an, in denen die Last auf das Flagellum durch mechanische Interaktion und Reibungswiderstand erhöht ist. Unter diesen Bedingungen werden mehr Statoren zum Flagellenmotor rekrutiert, wodurch ein höheres Drehmoment generiert werden kann. Es wird vermutet, dass die Erhöhung des Drehmoments zum Übergang vom Pull- zum Wrapped-Modus führt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die zwei molekularen Statoren, MotAB und MotCD, welche die Flagellen in P. putida antreiben, genetisch vollständig ausgeschalten. Dadurch konnte deren Bedeutung für die Ausbildung des Wrapped-Modus und für das Schwimmverhalten in Flüssigkeiten mit unterschiedlicher Viskosität, sowie in Agar, untersucht werden. Es zeigte sich beim Vergleich der Häufigkeit des Wrapped-Modus in verschiedenen Umgebungen, dass unter erhöhter Viskosität und in dichten Strukturen der Wrapped-Modus häufiger auftrat. Das vermehrte Auftreten des Wrapped-Modus könnte von Vorteil sein, da angenommen wird, dass der Wrapped-Modus es den Zellen ermöglicht von mechanischen Fallen zu entkommen und in der dichten Struktur zu navigieren. Weiterhin zeigten Experimente in den mikrofluidischen PDMS Kanälen, dass Zellen im Wrapped-Modus von Oberflächenregionen entkommen, während Zellen im Push-Modus hydrodynamisch angezogen werden.
Die Experimente mit den Stator-Knockout Mutanten zeigen, dass die DmotAB Mutante in wässriger Umgebung mehr als viermal langsamer als der Wildtyp schwimmt und nicht in der Lage ist, den Wrapped Modus zu bilden. Durch die Erhöhung der Viskosität konnte die Bildung des Wrapped-Modus teilweise wieder hergestellt werden. Dies zeigt, dass der Wrapped-Modus unter Verwendung beider Statoren gebildet werden kann. Ein dem Wildtyp ähnliches Schwimmverhalten wurde für die DmotAB Mutante jedoch nur in Agar erreicht. Im Gegensatz dazu ist das Schwimmverhalten der DmotCD Mutante, in Bezug auf die Verteilung der Schwimmmodi und die Schwimmgeschwindigkeit, unter allen getesteten Bedingungen ähnlich wie beim Wildtyp. Dennoch breitet sich die DmotAB Mutante in Agar schneller aus als die DmotCD Mutante. Es zeigte sich, dass die DmotCD Mutante nicht-motile Zellcluster bildet, wodurch nur eine geringere Anzahl von Zellen zur Ausbreitung im Agar beitragen kann. Zusammenfassend ist der MotAB Stator essentiell für das Schwimmen in wässriger Umgebung und der MotCD Stator verhindert die Clusterbildung durch sessile Zellen in Agar.
Nach der detaillierten Analyse wie das Schwimmverhalten durch verschiedene Umgebungen beeinflusst wird, wurde auch die Chemotaxis untersucht. Bisherige Forschungsergebnisse zeigten, dass P. putida den Runtime-Bias nutzt, um zu einer Nährstoffquelle zu schwimmen. Dabei verkürzt es die Dauer des Runs wenn es von einer Nährstoffquelle wegschwimmt. Zusätzlich wurde im Agar neben dem Runtime-Bias noch ein Winkel-Bias festgestellt. Dabei ändert P. putida die Richtung während eines Turnevents mit einem größeren Winkel, wenn es im vorherigen Run den Nährstoffgradienten hinunter geschwommen ist
Analyse und Nutzung von ribosomal synthetisierten und posttranslational modifizierten Peptiden und ihren Stoffwechselwegen in Cyanobakterien
No full textNatural products, small molecules produced by a biological source, have an inestimable value for the pharmaceutical and agriculture industry. The diversity of their chemical structures and the variety of their biological activities is enormous. Therefore, they are capable for the performance of a wide range of various tasks. Cyanobacteria exhibit an enormous pool of structural diverse natural products with a wide range of bioactivities. As the range of structural classes of natural products is wide (e.g., alkaloids, terpenoids, polyketides, peptides), this work only focused on peptides. There are two types of peptides: ribosomally and non-ribosomally biosynthesized peptides. Ribosomal peptides arise from precursor peptides that are post-translationally modified, whereas non-ribosomal peptides (NRPs) are assembled by non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs).
Genome sequencing of plenty of microorganisms revealed that the potential capacity of natural products has not been exhausted in the slightest and the probability that not even all species of existing natural products are discovered is huge. Accordingly, the discovery of new natural products and their characterization as well as the investigation of their functions and biosynthesis are important milestones on the way to the development of new drugs.
In the first part of this work a new method for the exploration of microviridins was developed. Microviridins are tricyclic, N-acetylated depsipeptides, which belong to the RiPP family. Their cage-like structure is derived from two lactone and one lactam ring. Despite the almost complete knowledge of their biosynthesis, little is known about their biological functions as their molecular target and their intra- and extracellular localization. To address this knowledge gap, a method was developed, which produces microviridin chemical probes that can be used for the closer investigation of the microviridins mode of action and the identification of their molecular target. The method uses functional tags that are integrated in the microviridin structure by a chemoenzymatic approach. Using chemically synthesized microviridin core peptides with the attached functional tags for their tricyclization, which was achieved by the processing with heterologously expressed post-translational modification enzymes, created microviridins with natural tricyclic architecture and functional tags. A proof-of-concept experiment could show that those microviridin chemical probes function as diagnostic tools and are therefore capable for the exploration of microviridin biological interaction partners, localization, and function.
The second part of this study dealt with the last unknown part of microviridin biosynthesis: the separation of the leader from the core peptide. A putative candidate, named NosP, was identified in Nostoc punctiforme by structural homology and similarity of the cleavage motif to a recently described RiPP peptidase [1]. NosP is not encoded inside the microviridin biosynthetic gene cluster (BGC) of Nostoc punctiforme. By peptidase assays with the heterologously expressed NosP and natural microviridins isolated from Nostoc punctiforme, its activity in microviridin processing was demonstrated. NosP possesses an aminopeptidase activity and according to bioinformatic analysis also an endopeptidase activity. Bioinformatical analysis further descried a strong correlation between the existence of a microviridin BGC and those of a NosP homolog. However, the presence of NosP homologs in strains without microviridin BGCs suggests that NosP has additional, more general functions than only the processing of microviridin precursors. Nevertheless, the results of this study clearly show its involvement in microviridin processing and therefore illuminate the last missing part of microviridin biosynthesis.
In the third part of this survey, the discovery of so far uncharacterized BGCs and the from them arising new peptides is addressed. A new class of peptide BGCs was identified, which combine genes of a RiPP precursor and an NRPS. This combination of genes leads to a to date unknown, new class, whose chemical properties are completely unexplored. Correspondingly, approaches to investigate this new hybrid BGC are needed. In this work the use of co-expression of the precursor and the PTM enzymes is discussed as a potential method. Although the co-expression study did not reveal the structure of the final natural product, it provides a platform that with some adaption may characterize new peptide modifications. The closer inspection of the PTM enzymes GNAT and NRPS led to the assumption that the peptide of the NRPS/RiPP hybrid cluster is a membrane-bound lipopeptide, which contains presumably a poly-lysine side chain.
This study contributes significantly to the further investigation of microviridins. The method developed here retool the microviridin research for their further investigations. Moreover, the identification and characterization of NosP fills the knowledge gap in microviridin biosynthesis. Additionally, it suggests that NosP homologs can also process their respective microviridin precursor. Therefore, the present study contributes to the further characterization of microviridin biosynthesis and expands the toolkit. The studies on co-expression also highlight the challenges in characterizing novel RiPPs from cyanobacteria.Naturstoffe, kleine Moleküle, die aus biologischen Quellen stammen, haben einen unschätzbaren Wert für die pharmazeutische und landwirtschaftliche Industrie. Die Vielfalt ihrer chemischen Strukturen und ihrer biologischen Aktivitäten ist enorm. Deswegen sind sie in der Lage, ein breites Spektrum unterschiedlicher Aufgaben zu erfüllen. Cyanobakterien verfügen über einen enormen Pool an strukturell vielfältigen Naturstoffen mit einem breiten Spektrum an Bioaktivitäten. Da die Bandbreite der Strukturklassen von Naturstoffen groß ist (z. B. Alkaloide, Terpenoide, Polyketide, Peptide), konzentrierte sich diese Arbeit nur auf Peptide. Es gibt zwei Arten von Peptiden: ribosomale und nicht ribosomale Peptide. Ribosomale Peptide entstehen aus Vorläuferpeptiden, die posttranslational modifiziert werden, während nicht-ribosomale Peptide (NRPs) von nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) zusammengesetzt werden.
Die Genomsequenzierung zahlreicher Mikroorganismen hat gezeigt, dass die potenzielle Kapazität der Naturstoffe noch lange nicht ausgeschöpft ist und dass die Wahrscheinlichkeit, dass nicht einmal alle Arten der vorhandenen Naturstoffe entdeckt wurden, enorm ist. Dementsprechend sind die Entdeckung neuer Naturstoffe und ihre Charakterisierung sowie die Untersuchung ihrer Funktionen und Biosynthese wichtige Meilensteine auf dem Weg zur Entwicklung neuer Arzneimittel.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine neue Methode für die Erforschung von Microviridinen entwickelt. Microviridine sind trizyklische, N-acetylierte Depsipeptide, die zur Familie der RiPPs gehören. Ihre käfigartige Struktur entsteht durch zwei Lacton- und einen Lactamring. Trotz der fast vollständigen Kenntnis ihrer Biosynthese, ist wenig über ihre biologischen Funktionen, ihr molekulares Ziel und ihre intra- und extrazelluläre Lokalisierung bekannt. Um diese Wissenslücke zu schließen, wurde eine Methode entwickelt, mit der chemische Microviridin-Sonden hergestellt werden können, die für die nähere Untersuchung der Wirkungsweise der Microviridine und die Identifizierung ihres molekularen Ziels verwendet werden können. Die Methode verwendet funktionelle Markierungen, die durch einen chemoenzymatischen Ansatz in die Microviridinstruktur integriert werden. Durch die Verwendung von chemisch synthetisierten Microviridin-Corepeptiden mit den angehängten funktionellen Tags und deren Trizyklisierung, die durch die Verarbeitung mit heterogen exprimierten posttranslationalen Modifikationsenzymen erreicht wurde, entstanden Microviridine mit natürlicher, trizyklischer Architektur und funktionellen Tags. Ein Proof-of-Concept-Experiment konnte zeigen, dass diese chemischen Microviridin-Sonden als Diagnoseinstrumente fungieren und somit für die Erforschung der biologischen Interaktionspartner, der Lokalisierung und der Funktion von Microviridinen geeignet sind.
Der zweite Teil dieser Studie befasste sich mit dem letzten unbekannten Teil der Microviridin-Biosynthese: der Abtrennung des Leitpeptids vom Corepeptid. Ein möglicher Kandidat mit dem Namen NosP wurde in Nostoc punctiforme durch strukturelle Homologie und Ähnlichkeit des Spaltmotivs mit einer kürzlich beschriebenen RiPP-Peptidase identifiziert [1]. NosP wird nicht im biosynthetischen Microviridin Gencluster (Microviridin BGC) von Nostoc punctiforme kodiert. Durch Peptidase-Assays mit der heterolog exprimierten NosP und natürlichen Microviridinen, die aus Nostoc punctiforme isoliert wurden, wurde ihre Aktivität bei der Microviridin-Verarbeitung gezeigt. NosP besitzt eine Aminopeptidase-Aktivität, wobei bioinformatische Studien auch eine Endopeptidase-Aktivität nahelegen. Die bioinformatische Analyse ergab außerdem eine starke Korrelation zwischen dem Vorhandensein eines Microviridin-BGC und dem eines NosP-Homologs. Das Vorhandensein von NosP-Homologen in Stämmen ohne Microviridin-BGCs deutet jedoch darauf hin, dass NosP zusätzliche, allgemeinere Funktionen hat als nur die Verarbeitung von Microviridin-Vorläufern. Gleichwohl zeigen die Ergebnisse dieser Studie deutlich, dass NosP höchstwahrscheinlich an der Verarbeitung von Microviridin beteiligt ist, und beleuchten somit den letzten fehlenden Teil der Microviridin-Biosynthese.
Im dritten Teil dieser Studie geht es um die Entdeckung bislang uncharakterisierter BGCs und die daraus entstehenden neuen Peptide. Es wurde eine neue Klasse von Peptid-BGCs identifiziert, die einen RiPP-Vorläufer mit einem NRPS-Gen kombinieren. Diese Kombination von Genen führt zu einer bisher unbekannten, neuen Klasse, deren chemische Eigenschaften noch völlig unerforscht sind. Dementsprechend werden Ansätze zur Untersuchung dieser neuen hybriden BGCs benötigt. In dieser Arbeit wird die Koexpression des Vorläufers und der PTM-Enzyme als mögliche Methode diskutiert. Obwohl die Koexpressionsstudie die Struktur des endgültigen Naturprodukts nicht aufdeckte, bietet sie eine Plattform, die mit einigen Anpassungen neue Peptidmodifikationen charakterisieren kann. Die nähere Betrachtung der PTM-Enzyme GNAT und NRPS führt zu der Annahme, dass es sich bei dem Peptid des NRPS/RiPP-Hybridclusters um ein membrangebundenes Lipopeptid handelt, das vermutlich eine Polylysin-Seitenkette enthält.
Diese Studie leistet einen wichtigen Beitrag zur weiteren Untersuchung von Microviridinen. Die hier entwickelte Methode stellt der Microviridin-Forschung für ihre weiteren Untersuchungen ein neues Tool zur Verfügung. Darüber hinaus füllt die Identifizierung und Charakterisierung von NosP die Wissenslücke in der Microviridin-Biosynthese und deutet darauf hin, dass NosP-Homologe auch ihren jeweiligen Microviridin-Vorläufer verarbeiten können. Daher trägt die vorliegende Studie zur weiteren Charakterisierung der Microviridin-Biosynthese bei und erweitert das Instrumentarium. Die Studien zur Koexpression zeigen auch die Herausforderungen bei der Charakterisierung neuer RiPPs aus Cyanobakterien
The Exteriority of Thinking: Hegel and Heidegger
No full textIn The Culmination, Robert Pippin offers a stunning reassessment of the achievements of absolute idealism. Having developed some of the most persuasive defenses of Hegel's absolute idealism to date, Pippin now argues that Heidegger's trenchant critique of Hegel has revealed a dogmatism at the very heart of absolute idealism: an unwarranted identification of what is with what is discursively knowable. This dogmatic identification leads to a distorted understanding of the meaning of Being, a reifying account of beings, and a neglect of our own finitude. In this article, I defend Hegel against these charges. The upshot of this discussion is twofold. Rather than evading the question of the exteriority of being, I argue, Hegel in fact aims to reveal that this exteriority is internal to thinking itself. And rather than identifying the meaning of being with discursive knowability, Hegel shows that the meaning of being resides in a form of freedom that goes beyond the self-transparency of knowing
Effects of a moderate Western diet based on an animal model
No full textIn der westlichen Gesellschaft begünstigt eine unausgewogene Ernährung in Kombination mit einer hohen Lebenserwartung die Entstehung von Erkrankungen wie Diabetes, Adipositas oder nichtalkoholischer Fettleber. Eine Ursache für die Entwicklung und Progression solcher alters-und ernährungsbedingter Erkrankungen kann auf molekularer Ebene eine Beeinflussung der Redoxhomöostase zugunsten oxidativer Prozesse sein. Ein besseres Verständnis des Redox-Proteoms ist dabei eine Voraussetzung, um zukünftig für therapeutische Ansätze gezielt das Redox-Sensor-System zu modulieren. In dieser Arbeit wurde systematisch der exogene Einfluss der Ernährung und des Alters durch Erhebung klinischer Daten auf das Proteom der Leber als zentrales Stoffwechselorgan im Tiermodell dargestellt. Dafür wurden weiblichen und männlichen Wistar-und SHHF-Ratten in einem Langzeitversuch über insgesamt 78 Wochen eine Westerndiät (WD) oder Standarddiät (SD) gefüttert, in vivo verschiedene Untersuchungen (oGTT, Aktivität, MRT, Blutdruck) durchgeführt und zu definierten Zeitpunkten ein Teil der Tiere für die Organentnahme seziert. Die explorative Untersuchung des Leberproteoms erfolgte sowohl auf Gesamtproteomebene, als auch auf Ebene der nicht reversibel oxidierten Cysteinpeptide (NEM-sites) mittels hochauflösender LC-MS/MS-Analyse TMT-markierter Proben, ausschließlich für die Wistarratten. Es hat sich gezeigt, dass eine moderate WD nach menschlichem Vorbild nicht im erwateten Ausmaß zu Veränderungen des Kohlenhydrat-und Fettstoffwechsels der untersuchten Parameter führt. Lediglich die männlichen Tiere zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe eine deutliche Gewichtszunahme unter der WD. Auf Proteomebene waren allerdings für beide Geschlechter bereits siginifikante Unterschiede zwischen den Diäten zu verzeichnen, die für eine Adaption und Veränderung des Stoffwechsels vor klinischer Manifestation sprechen. So gibt es z.B. Hinweise einer kompensatorischen Hochregulierung der Fettsäureoxidation bei gleichzeitiger Erniedrigung der Fettsynthese unter der WD. In Korrelation mit den klinisch erhobenen Daten war insbesondere ein deutlicher Geschlechtsunterschied auffällig, der die Vermutung nahelegt, dass die weiblichen Tiere im Laufe des Alters besser an eine fett-und kohlenhydratreiche Diät adaptieren, als die männlichen Tiere. Diese Erkenntnisse bieten einen ersten Überblick in frühzeitige Veränderungen und mögliche Adaptionsmechansimen einer der menschlichen Ernährungsweise nachempfundenen Diät. Dabei könnte insbesondere das geschlechtsspezifische Leberproteomprofil ein Ansatz für die unterschiedliche Prävalenz und Ausprägung diät-und altersbedingter Pathologien sein und zukünftig eine Rolle bei gezielten individualisierten Therapien spielen. Zur weiteren Evaluation möglicher Adaptionsmechanismen wäre weiterführend die Messung der Enzymaktivität auf Basis dieser Arbeit ausgewählter Kandidaten von besonderem Interesse.In Western society, an unbalanced diet in combination with a long life expectancy favors the development of diseases such as diabetes, obesity or non-alcoholic fatty liver disease. One potential cause for the development and progression of these age-and nutrition-related diseases may be an influence on redox homeostasis in favor of oxidative processes at the molecular level. A better understanding of the redox proteome is a prerequisite for the targeted modulation of the redox sensor system for future therapeutic approaches. In this study, the exogenous influence of diet and age on the proteome of the liver as a central metabolic organ was systematically presented in an animal model. Therefore female and male Wistar and SHHF rats were fed a western diet (WD) or standard diet (SD) in a long-term experiment over a total of 78 weeks, various in vivo examinations (oGTT, activity, MRI, blood pressure) were performed and the animals were dissected for organ removal at defined time points. The explorative examination of the liver proteome was accomplished both at the total proteome level and at the level of non-reversibly oxidized cysteine peptides (NEM sites) via high-resolution LC-MS/MS analysis of TMT-labelled samples, exclusively for the Wistar rats. It has been shown that a moderate WD based on the human model does not lead to changes in the carbohydrate and fat metabolism of the investigated parameters to the extent expected. Only the male animals showed a significant weight gain under WD compared to the control group. At the proteome level, however, significant differences were already observed between the diets for both sexes, which indicate an adaptation and change in metabolism before clinical manifestation. For example, there is evidence of a compensatory upregulation of fatty acid oxidation with a simultaneous reduction in fat synthesis under the WD. In correlation with the clinically collected data, a clear sex difference was particularly noticeable, which suggests that the female animals adapt better to a high-fat and high-carbohydrate diet as they age than the male animals. These findings provide an initial overview of early changes and possible adaptation mechanisms of a diet that emulates the human nutrition. In particular, the sex-specific liver proteome profile could be an approach for the different prevalence and expression of diet- and age-related pathologies and could play a role in targeted individualized therapies in the future. For further evaluation of possible adaptation mechanisms, the measurement of enzyme activity of selected candidates on the basis of this work would be of particular interest
Integration von MST, NMR und Negativfärbung-EM zur Charakterisierung der Struktur und der Interaktionen des Ceramid-Transfer-Proteins (CERT)
No full textCeramide, a pivotal molecule in sphingolipid metabolism, exerts critical regulatory functions in cell proliferation and apoptosis [1]. Following its synthesis at the cytosolic surface of the endoplasmic reticulum (ER), ceramide undergoes both vesicular and non-vesicular transport processes [2]. Within the non-vesicular pathway, ceramide is specifically converted into sphingomyelins and glycosphingolipids within the Golgi apparatus [3]. Facilitating this transport is the ceramide transfer protein (CERT), which encompasses peptidic motifs and multiple domains [3]. Of particular significance is the C-terminal (StAR)-related lipid transfer (START) domain, which exhibits an exceptional ability to selectively bind and transport ceramide within its hydrophobic cavity [3]. The involvement of CERT in various pathological processes, including Alzheimer's disease, infectious diseases, and cancer, positions it as an intriguing target for pharmacological interventions [4,5]. N-(3-hydroxy-1-hydroxymethyl-3-phenylpropyl) dodecanamide (HPA-12) has emerged as a well-known antagonist of CERT [6]. Nevertheless, our understanding of the structure-activity relationship (SAR) for this antagonist remains limited. Therefore, a comprehensive investigation into the SAR of HPA-12 and its interactions with the START domain is imperative to uncover profound insights into its pharmacological potential and foster the development of novel therapeutic strategies.
The main goal of this project was to gain comprehensive insight into the interaction between the CERT-START domain and small compounds acting as protein inhibitors. To achieve this, a combination of microscale thermophoresis (MST) and nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) was employed as complementary techniques, allowing these molecular interactions to be characterized carefully. By delving into the intricacies of these interactions, the long-term goal was to enhance the inhibitory activity of the ligands, thereby paving the way for their potential application in future drug design endeavors.
To achieve the objectives, an active START domain was obtained through the initial establishment of an efficient expression and purification protocol for subsequent MST and NMR experiments. Furthermore, a biophysical assay using MST was developed to quantify the interaction and evaluate the inhibitory potency of each ligand. However, the stability of the protein posed challenges for NMR experiments. Thus, various optimization strategies were employed to improve the stability and activity of the START domain, allowing for its long-term functionality and potential utilization in NMR resonance assignments of the target protein. In this regard, the utilization of HPA-12 and sequence modifications, including truncation, proved beneficial in improving NMR results and extending the stability of the START domain. In addition to the expression and purification protocol previously established, a specific labeling strategy was implemented using ILV- and LV-labeling approaches to prepare the [15N-uniform and 13C-methyl] truncated- START (t-START) domain for receptor-based NMR investigations of the target protein. Thus, the labeled t-START domain monomers, both in the presence and absence of ligands, exhibited promising results in the initial [1H,15N]-TROSY and [1H,13C]-HMQC NMR spectra, enabling the characterization of their interactions with ligands. Furthermore, the binding constants for each compound were determined utilizing the microscale thermophoresis (MST) technique, providing valuable insights into the strength of the ligand-protein interactions.
Simultaneously, an optimized protocol was developed to generate a highly active full-length CERT protein. Due to the absence of a resolved structure for the full-length CERT protein, attempts were made to utilize cryo-electron microscopy (cryo-EM) as a powerful tool to reveal its intricate structure. Consequently, the successful preparation of the CERT protein in its biologically relevant tetrameric form was achieved, and the negative stain electron microscopy (EM) technique was employed to gain insights into its structural characteristics. However, to acquire a high-quality data set necessary for constructing the initial 3D model of the target protein, extensive optimization work was imperative to ensure the suitability of the protein sample for subsequent data collection using the negative stain EM technique. In this regard, our study provides comprehensive and systematic sample optimization steps and initial data processing steps, crucial for constructing the initial 3D model of the protein. Therefore, these are rather preliminary steps on the way toward an experimentally determined structure. Moreover, initial models were generated by combining electron densities from negative stain EM with extensive modeling efforts employing AlphaFold.Ceramid, ein zentrales Molekül des Sphingolipid-Stoffwechsels, übt entscheidende regulatorische Funktionen bei der Zellteilung oder Zellvermehrung und Apoptose aus [2]. Nach seiner Synthese an der zytosolischen Oberfläche des endoplasmatischen Retikulums (ER) durchläuft Ceramid sowohl vesikuläre als auch nichtvesikuläre Transportprozesse [3]. Innerhalb des nichtvesikulären Weges wird Ceramid im Golgi-Apparat spezifisch in Sphingomyeline und Glycosphingolipide umgewandelt [4]. Erleichtert wird dieser Transport durch das Ceramid-Transferprotein (CERT), das peptidische Motive und mehrere Domänen umfasst. Von besonderer Bedeutung ist die C-terminale (StAR)-verwandte Lipidtransfer-Domäne (START), die eine außergewöhnliche Fähigkeit zur selektiven Bindung und zum Transport von Ceramid innerhalb eines hydrophoben Hohlraums aufweist [4]. Die Beteiligung von CERT an verschiedenen pathologischen Prozessen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, Infektionskrankheiten und Krebs, macht es zu einem interessanten Ziel für pharmakologische Untersuchungen [1,5]. N-(3-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-phenylpropyl) Dodecanamid (HPA-12) ist ein bekannter Antagonist von CERT [6]. Dennoch ist unser Verständnis der Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) für diesen Antagonisten noch begrenzt. Daher ist eine umfassende Untersuchung der SAR von HPA-12 und seiner Wechselwirkungen mit der START-Domäne unerlässlich, um tiefgreifende Erkenntnisse über sein pharmakologisches Potenzial zu gewinnen und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu ermöglichen.
Das Hauptziel dieses Projekts bestand darin, einen umfassenden Einblick in die Wechselwirkung zwischen der CERT-START-Domäne und kleinen Verbindungen zu gewinnen, die als Proteininhibitoren wirken. Um dies zu erreichen, wurde eine Kombination aus Microscale Thermophorese (MST) und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) als sich ergänzende Techniken eingesetzt, die eine gründliche Charakterisierung dieser molekularen Wechselwirkungen ermöglichten. Durch die Erforschung der Feinheiten dieser Wechselwirkungen sollte langfristig die hemmende Wirkung der Liganden verstärkt werden können, um so den Weg für potenzielle Anwendungen bei der Entwicklung künftiger Arzneimittel zu ebnen.
Um die Ziele zu erreichen, wurde eine aktive START-Domäne durch die anfängliche Etablierung eines effizienten Expressions- und Reinigungsprotokolls für nachfolgende MST- und NMR-Experimente gewonnen. Darüber hinaus wurde ein biophysikalischer Test unter Verwendung der MST entwickelt, um die Interaktion zu quantifizieren und die hemmende Wirkung der einzelnen Liganden zu bewerten. Allerdings stellte die geringe Stabilität des Proteins eine Herausforderung für NMR-Experimente dar. Daher wurden verschiedene Optimierungsstrategien angewandt, um die Stabilität und Aktivität der START-Domäne zu verbessern, so dass sie langfristig funktionstüchtig ist und für NMR-Resonanzzuordnungen des Zielproteins verwendet werden kann. In diesem Zusammenhang erwiesen sich die Verwendung von HPA-12 und Sequenzmodifikationen, einschließlich Trunkierung, sowohl vorteilhaft für die Verbesserung der NMR-Ergebnisse als auch für die Verlängerung der Stabilität der START-Domäne, aus. Zusätzlich zu dem zuvor etablierten Expressions- und Reinigungsprotokoll wurde eine spezifische Markierungsstrategie unter Verwendung von ILV- und LV-Markierungsansätzen implementiert, um die um [15N-Uniform und 13C-Methyl] verkürzte START-Domäne (t-START) für rezeptorbasierte NMR-Untersuchungen des Zielproteins herzustellen. So zeigten die 1H und 13C markierten t-START-Domänenmonomere sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von Liganden aussagekräftige Ergebnisse in den ersten [1H,15N]-TROSY- und [1H,13C]-HMQC-NMR-Spektren, wodurch die Charakterisierung der Wechselwirkungen mit Liganden ermöglichte wurde. Darüber hinaus wurden die Bindungskonstanten für jede Verbindung mit Hilfe der Microscale Thermophoresetechnik (MST) bestimmt, was wertvolle Einblicke in die Stärke der Ligand-Protein-Wechselwirkungen ermöglicht.
Gleichzeitig wurde ein optimiertes Protokoll entwickelt, um ein hochaktives CERT-Protein in voller Länge zu erzeugen. Da für das CERT-Protein in voller Länge keine 3D Struktur vorlag, wurde versucht, die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) als leistungsfähiges Werkzeug zur Aufdeckung seiner komplizierten Struktur einzusetzen. Infolgedessen gelang es, das CERT-Protein in seiner biologisch relevanten tetrameren Form zu präparieren. Die Negativfärbungs-Elektronenmikroskopie (EM) wurde eingesetzt, um Einblicke in seine strukturellen Eigenschaften zu gewinnen. Um jedoch einen qualitativ hochwertigen Datensatz zu erhalten, der für die Konstruktion des ersten 3D-Modells des Zielproteins erforderlich ist, waren umfangreiche Optimierungsarbeiten erforderlich, damit sich die Proteinprobe für die anschließende Datenerfassung mit der Negative Stain (oder Negativ-Fleck) EM-Technik eignet. In dieser Hinsicht bietet unsere Studie umfassende und systematische Probenoptimierungsschritte und erste Datenverarbeitungsschritte, die für die Erstellung des ersten 3D-Modells des Proteins entscheidend sind. Es handelt sich also eher um vorläufige Schritte auf dem Weg zu einer experimentell bestimmten Struktur. Darüber hinaus wurden die ersten Modelle erstellt, die durch die Kombination von Elektronendichten aus der Negativ-Fleck-EM mit umfangreichen Modellierungsbemühungen unter Verwendung von AlphaFold erhalten wurden
Motivations of people to adapt to urban pluvial flooding
No full textThe population in Germany has repeatedly incurred significant financial losses due to fluvial flooding, flash floods, and urban pluvial flooding. The increasing frequency of urban pluvial floods in the past decade, exacerbated by climate change and urbanization, has prompted a shift in integrated flood risk management practices, which previously focused primarily on fluvial floods. A crucial component of this integrated management is the cooperation of all stakeholders to minimize risk, with households playing a key role in implementing Property-level flood risk adaptation measures, despite often bearing the costs themselves. Risk communication is a tool that stakeholders can use to inform households about flood risk and Property-level flood risk adaptation measures.
Effective risk communication must be preceded by a comprehensive analysis of the current situation, including an understanding of the adaptive behavior of the affected households. Previous research using behavioral psychology models such as Protection Motivation Theory (PMT) has examined the adaptive behavior of those affected by flooding. It highlights the importance of the appraisal of threat and coping in influencing individual protection motivation. Understanding households’ attitudes towards responsibilities is also essential, as part of integrated risk management involves the shared responsibility of all parties.
Urban pluvial floods differ from fluvial floods and flash floods in aspects such as lower flood water levels, shorter durations, and varying damage extents. Research has shown that, furthermore, the adaptive behavior of households affected by urban pluvial floods differs from those affected by other types of flooding. However, the adaptive behavior of those affected by urban pluvial flooding has yet to be investigated comprehensively and with a focus on how risk communication strategies can benefit from those findings. To address this gap this dissertation employs a hybrid model based on PMT and its aspects of threat and coping appraisal, which is extended by the aspects of responsibility appraisal and the concept of framing factors from the "Protection Action Decision Model" (PADM), and used to discuss households' adaptive behavior with a focus on urban pluvial flooding.
I present results based on data from household surveys conducted between 2014 and 2022, involving over 3,000 households across Germany. Among these, 37 % (n = 1,203) experienced urban pluvial flooding, 39 % (n = 1,258) experienced fluvial flooding, and 24 % (n = 762) experienced flash flooding. Additionally, 209 risk communication materials were analyzed regarding structure and content. The study aims to (a) investigate which Property-level flood risk adaptation measures have been implemented by households, (b) investigate how the Property-level flood risk adaptation measures are perceived by households, (c) discuss the drivers of adaptive behavior, (d) investigate the extent to which these drivers are conveyed in existing risk communication materials, and (e) determine the influence of flood type on individual adaptive behavior.
Surveys revealed that households are rather willing to implement low- and medium-cost Property-level flood risk adaptation measures. Those surveys further showed that households affected by urban pluvial flooding feel able (82 % of households) and responsible (41 % of households) for implementing Property-level flood risk adaptation measures. However, many households stated that Property-level flood risk adaptation measures were not effective (41 %), too expensive (34 %), and that there were not enough support programs (87 %). The analysis of risk communication materials revealed that 78 % of risk communication materials addressed risk, 93 % discussed Property-level flood risk adaptation measures, but only 54 % covered responsibilities. Households found the information provided generally sufficient but felt inadequately informed by their municipalities on the local level. In fact, the results suggest that the perceived risk is often not linked to the individual situation. Compared to those affected by other flood types, households affected by urban pluvial floods were less prepared and had a lower risk perception. However, the perception of adaptation measures and responsibilities was less dependent on the flood type.
This dissertation reveals the dynamic nature of threat appraisal, underscoring the need for panel studies to better understand adaptive behavior. Future research should separately analyze sub-aspects of threat appraisal, such as the perceived severity and probability of future events, and coping appraisal, such as the appraisal of self-efficacy and response costs. The extension of PMT with framing factors and responsibility perception is a practical approach for discussing and understanding household adaptive behavior. Hence, future research should address the perception of self-responsibility and the government's responsibility. It is therefore recommended that risk communication addresses the above-mentioned aspects of threat, coping and responsibility assessment, that communities and municipalities are involved in risk communication strategies, and that such strategies are tailored to the locally relevant flood type.Die Bevölkerung in Deutschland hat wiederholt erhebliche finanzielle Verluste durch Hochwasser erlitten. Die zunehmende Häufigkeit von urbanen Sturzfluten in den letzten zehn Jahren, welche durch den Klimawandel und Verstädterung noch verschärft wurde, hat dazu geführt, dass das Konzept des integrierten Hochwasserrisikomanagements, welches zuvor hauptsächlich auf Flusshochwasser angewandt wurde, zunehmend auch im Kontext von urbanen Sturzfluten diskutiert wird. Eine entscheidende Komponente des integrierten Hochwasserrisikomanagements ist die Zusammenarbeit aller Beteiligten, um das Hochwasserrisiko zu minimieren. Dabei spielen Haushalte eine Schlüsselrolle bei der Umsetzung von privaten Vorsorgemaßnahmen. Jedoch müssen sie die Kosten für die Implementierung solcher Maßnahmen häufig selbst tragen. Risikokommunikation ist ein Werkzeug, mit dem die öffentliche Hand Haushalte über das Hochwasserrisiko und private Vorsorgemaßnahmen informieren kann.
Einer wirksamen Risikokommunikation muss eine umfassende Analyze der aktuellen Situation vorausgehen, die auch ein Verständnis des Anpassungsverhaltens der betroffenen Haushalte beinhaltet. Bisherige Forschungen bediente sich verhaltenspsychologischer Modelle wie der „Protection Motivation Theorie“ (PMT), um das Anpassungsverhalten der von Überflutungen Betroffenen zu untersuchen. Hierdurch wurde die Rolle der Bewertung einer Gefahr und die Bewertung von Möglichkeiten der Gefahrenbewältigung für die individuelle Schutzmotivation diskutiert. Wie Haushalte Verantwortungen wahrnehmen ist ebenfalls von wesentlicher Bedeutung, da ein wesentlicher Teil des integrierten Risikomanagements die gemeinsame Verantwortung aller Parteien ist. Zudem sollten rahmengebende Faktoren berücksichtigt werden.
Urbane Sturzfluten unterscheiden sich von Flusshochwassern und Sturzfluten durch z.B. niedrigere Wasserstände, kürzere Überflutungsdauern und ein unterschiedliches Ausmaß der Schäden. Forschung hat gezeigt, dass sich das Anpassungsverhalten von Haushalten, die von urbanen Sturzfluten betroffen waren von dem anderer Hochwasserarten unterscheidet. Jedoch fehlt bisher eine umfangreiche Untersuchung des Anpassungsverhaltens der von urbanen Sturzfluten betroffenen Haushalten. Der Schwerpunkt sollte hierbei darauf liegen, wie Risikokommunikationsstrategien von diesen Erkenntnissen profitieren können. Um diese Lücke zu schließen, wird in der hier präsentierten Studie ein hybrides Model basierend auf der PMT und ihren Aspekten der Bedrohungs- und Bewältigungsbewertung eingesetzt, das um die Aspekte der Verantwortungsbewertung und ein Verständnis von rahmengebenden Faktoren aus dem "Protection Action Decision Model" (PADM) erweitert und zur Erörterung des Anpassungsverhaltens von Haushalten mit dem Schwerpunkt auf urbane Sturzfluten verwendet wird.
In dieser Dissertation werden Daten aus Haushaltsbefragungen analysiert, die zwischen 2014 und 2022 durchgeführt wurden und an denen über 3.000 Haushalte in ganz Deutschland teilnahmen. Davon waren 37 % (n = 1.203) von urbanen Sturzfluten, 39 % (n = 1.258) von Flusshochwassern und 24 % (n = 762) von Sturzfluten betroffen. Zusätzlich wurden 209 Informationsmaterialien der Risikokommunikation strukturell und inhaltlich untersucht. Ziel der dieser Dissertation ist es, (a) zu untersuchen, welche Vorsorgemaßnahmen von den Haushalten umgesetzt wurden, (b) zu untersuchen, wie die Vorsorgemaßnahmen von den Haushalten wahrgenommen werden, (c) die Driver des Anpassungsverhaltens zu diskutieren, (d) zu untersuchen, inwieweit diese Driver in den vorhandenen Risikokommunikationsmaterialien vermittelt werden, und (e) den Einfluss des Hochwassertyps auf das Vorsorgeverhalten zu untersuchen.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Haushalte eher bereit sind, private Vorsorgemaßnahmen mit niedrigen und mittleren Kosten durchzuführen. Die Umfragen ergaben, dass sich die von urbanen Sturzfluten betroffenen Haushalte in der Lage (82 % der Haushalte) und verantwortlich (41 % der Haushalte) fühlen, Anpassungsmaßnahmen durchzuführen. Viele Haushalte gaben jedoch an, dass die Maßnahmen nicht wirksam (41 %) oder zu teuer (34 %) seien und dass es nicht genügend Unterstützungsprogramme gäbe (87 %). Die Analyse der Risikokommunikationsmaterialien ergab, dass 78 % der Risikoinformationsmaterialien das Risiko ansprachen, 93 % die Anpassungsmaßnahmen, aber nur 54 % die Verantwortlichkeiten adressierten. Die Haushalte hielten die Informationen im Allgemeinen für ausreichend, fühlten sich aber von ihren Gemeinden nicht ausreichend informiert. Zudem hat die aktuelle Forschung zu diesem Thema gezeigt, dass das Risiko von urbanen Sturzfluten häufig zwar generell erkannt wird, jedoch oft nicht mit der lokalen Situation in Verbindung gebracht. Im Vergleich zu den von anderen Hochwasserarten betroffenen Haushalten waren die von urbanen Sturzfluten betroffenen Haushalte weniger gut vorbereitet und hatten eine geringere Risikowahrnehmung. Die Wahrnehmung von Anpassungsmaßnahmen und Verantwortlichkeiten war hingegen weniger abhängig von der Hochwasserart.
Diese Dissertation zeigt den dynamischen Charakter der Gefahreneinschätzung und unterstreicht die Notwendigkeit von Panelstudien, um das Anpassungsverhalten besser zu verstehen. Zukünftige Forschung sollte Teilaspekte der Risikowahrnehmung, wie die Einschätzung der Schwere und der Eintrittswahrscheinlichkeit zukünftiger Ereignisse, und der Einschätzung von Bewältigungsmöglichkeiten, wie die Einschätzung der Selbstwirksamkeit und der Umsetzungskosten, separat analysieren. Die Erweiterung der PMT um rahmengebende Faktoren und die Wahrnehmung von Verantwortung fördert die Diskussion und das Verständnis des individuellen Anpassungsverhaltens von Haushalten. Künftige Forschungen sollten sich mit der Wahrnehmung der Eigenverantwortung und der Verantwortung der öffentlichen Hand befassen. Es wird empfohlen, dass die Risikokommunikation die oben genannten Aspekte der Gefahren-, Bewältigungs- und Verantwortungseinschätzung berücksichtigt, dass Gemeinden und Kommunen in Risikokommunikationsstrategien einbezogen werden und dass solche Strategien auf den lokal relevanten Hochwassertyp zugeschnitten sind
