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INTERAZIONE IN CIS DI NOTCH3 E JAGGED1: IDENTIFICAZIONE DI UN NUOVO MECCANISMO MOLECOLARE COINVOLTO NELLA PROGRESSIONE DELLA LEUCEMIA LINFOBLASTICA ACUTA A CELLULE T
No full textLa via di segnalazione dei recettori di membrana appartenenti alla famiglia Notch è estremamente conservata dagli Invertebrati ai Vertebrati e regola numerosi eventi quali proliferazione, sopravvivenza, differenziamento e morte cellulare (Artavanis-Tsakonas 1999; Bray S.J., 2006; Miele I., 2006). Il modello classico di attivazione della via di segnalazione di Notch prevede il legame tra i recettori Notch, espressi sulle cellule riceventi il segnale, e i loro specifici ligandi DSL espressi sulla superficie delle cellule segnalanti adiacenti. La specifica interazione recettore/ligando determina cambiamenti conformazionali nella struttura delle proteine Notch, che le rendono suscettibili ad un processamento proteolitico mediato prima dalla famiglia delle metalloproteasi ADAM e successivamente dal complesso delle PS/γ-secretasi (Kopan R., 1998; Brou C., 2000; Jarriault S., 1995). Tali eventi sono necessari per attivare il recettore Notch, espresso nella cellula ricevente, e liberare un frammento intracitoplasmatico solubile Notch-IC, in grado di traslocare nel nucleo e di influenzare la regolazione trascrizionale di numerosi geni bersaglio tra cui i membri della famiglia hairy and enhancer of split (Hes) e pTα (Bellavia D. 2000).
Le proteine transmembrana DSL (Delta1-3-4, Jagged1-2) sono state identificate come i principali ligandi dei recettori Notch espressi sulle cellule adiacenti. Solo di recente è stato dimostrato che similmente ai recettori Notch anche il ligando Jagged1 è un substrato dell’azione proteolitica mediata dalla metalloproteasi ADAM17/TACE. Il risultato di questo taglio proteolitico è il rilascio di un frammento extracellulare solubile (shedding) e la formazione di un frammento ancorato alla membrana (Jag1 TMIC), corrispondente al dominio C-terminale. Il frammento Jag1 TMIC è oggetto di un secondo taglio proteolitico mediato dal complesso delle PS/γ-secretasi, liberando così un frammento solubile intracitoplasmatico Jag1ICD, in grado di traslocare nel nucleo (LaVoie M.J. 2003). Recentemente è stata ipotizzata l’esistenza di una via di segnalazione bidirezionale che coinvolge non solo la cellula esprimente il recettore, ma anche la cellula esprimente il ligando. Dati di letteratura suggeriscono, infatti, che Jagged1 è in grado di innescare una via di segnalazione intrinseca per mezzo del suo dominio solubile intracellulare Jag1ICD, liberato successivamente all’azione del complesso delle PS/γ-secretasi, che è in grado di controllare l’espressione trascrizionale di Notch3 e dello stesso ligando, in cellule over-esprimenti Jagged1. Inoltre, è stato suggerito che la presenza costitutiva del dominio intracitoplasmatico di Jagged1, contenente un dominio PDZ-ligand, è fortemente associata a processi di trasformazione neoplastica in cellule esprimenti il ligando Jagged1 (Ascano J.M. 2003). Recentemente evidenze sperimentali dimostrano che l’alterata espressione dei ligandi DSL, in particolar modo Jagged1 e Delta1, correla strettamente con la comparsa di tumori solidi. In particolare, è stato mostrato che un’ espressione deregolata del ligando Jagged1, nonché la specifica interazione Jagged1/Notch è strettamente associata con l’insorgenza di tumori solidi dell’ovaio (Jung-Hye Choi et al., 2008) e del colon (Gao J., 2010).
Nel nostro laboratorio, è stato precedentemente osservato che l’attivazione costitutiva del “signaling” di Notch3 determina l’insorgenza di una forma di leucemia linfoblastica acuta a cellule T (T-ALL) mediante la realizzazione del modello animale transgenico lck-Notch3-IC. La leucemia a cellule T che si sviluppa nel topo Notch3-IC transgenico ricorda come decorso clinico la leucemia T-ALL umana, caratteristica dell’età pediatrica (Bellavia D., 2000). Inoltre, è stato dimostrato che la forzata attivazione della via di segnalazione del recettore Notch3 determina una persistente
espressione della catena invariante pTα del preTCR, sia nei timociti sia nelle cellule T periferiche, infatti, la mancata regolazione del gene pTα sembra essere direttamente coinvolta nell’insorgenza della leucemia T-ALL indotta da Notch3. A questo proposito, la realizzazione di topi doppi mutanti Notch3IC TG/ pTα -/- ha permesso di dimostrare che la combinata espressione di Notch3 e pTα è necessaria per l’insorgenza della T-ALL (Bellavia D., 2002).
In questa tesi si dimostra che esiste una specifica ed unica relazione tra il recettore Notch3 e il suo specifico ligando Jagged1 nella progressione della leucemia linfoblastica acuta a cellula T, caratterizzata da un’attivazione persistente del dominio intracellulare di Notch3-IC. Abbiamo osservato, infatti, sia in vitro che in vivo, che cellule T linfomatose caratterizzate dall’attivazione costitutiva di Notch3-IC co-esprimono all’interno della stessa cellula oltre al recettore Notch3 full- lenght anche il ligando specifico Jagged1 (cis-espressione). Tale cis-espressione è il risultato della forzata attivazione del signalling di Notch3, che per la prima volta in questa tesi è stato dimostrato essere in grado di attivare direttamente il promotore del ligando Jagged1 e regolarne la sua trascrizione. Inoltre, è stata dimostrata, in cellule di leucemia/linfoma a cellule T rappresentate da una linea cellulare immortalizzata derivante dai timociti di topo trasgenico Notch3-IC, N3-232T, l’esistenza di un costitutivo processamento del ligando Jagged1, identificabile nei frammenti rilasciati a valle dei tagli proteolitici mediati dalla metalloproteasi ADAM17/TACE e dal complesso delle PS/γ-secretasi: Jagged1 ECD e Jagged1ICD. E’ interessante notare che per la prima volta è stato osservato che tali eventi che sostengono il processamento di Jagged1 sono dipendenti dalla presenza di microdomini lipidici di membrana (raft). In aggiunta, l’osservazione dell’espressione contestuale di ligando e recettore all’interno delle stesse cellule e della loro costitutiva attivazione ci ha indotti ad ipotizzare e dimostrare l’esistenza di un’interazione specifica tra Notch3 e Jagged1 “in cis”. Si è quindi definito il ruolo funzionale di questa cis-interazione ed è stato identificato il meccanismo molecolare in grado di sostenere una più rapida progressione del processo di leuchemogenesi indotto da Notch3. In questa tesi abbiamo messo in evidenza che l’espressione del ligando Jagged1 in cis con il recettore Notch3 svolge un ruolo significativo nel potenziare la via di trasduzione indotta in maniera specifica da Notch3, poiché da un lato è in grado di sostenere e aumentare l’attivazione di specifici bersagli di Notch3, quali pTα, prendendo parte al complesso trascrizionale composto da RBP-Jk, MAML1 e Notch3-IC, e dall’altro lato è in grado di potenziare l’attivazione trascrizionale dello stesso ligando Jagged1. Inoltre, in questa tesi si dimostra in vivo che il frammento solubile Jagged1ECD, risultante dal clivaggio costitutivo del ligando, è in grado di determinare l’attivazione della via di segnalazione del recettore Notch3 espresso sulle cellule adiacenti (effetto paracrino).
L’insieme di questi dati supporta l’esistenza di un loop autocrino e pacrino associato al ligando Jagged1 in grado di interferire con la via di segnalazione del recettore Notch3 e di determinare la progressione della leucemia linfoblastica acuta a cellule T indotta da Notch3
Microbicidal machanisms of human macrophages against Pseudomonas aeruginosa in healty subjects and cystic fibrosis patients
No full textAntibody Modeling and Structure Analysis. Application to biomedical problems.
No full textBackground
The usefulness of antibodies and antibody derived artificial constructs in various medical and biochemical applications has made them a prime target for protein engineering, modelling, and structure analysis. The huge number of known antibody sequences, that far outpaces the number of solved structures, raises the need for reliable automatic methods of antibody structure prediction.
Antibodies have a very characteristic molecular structure that is reflected in their modelling technique. Currently, the most accurate models are produced using a quite peculiar modelling strategy, developed among others by our group: the framework regions are modelled with a standard comparative modelling approach, whereas the hypervariable loops are predicted using the ad-hoc “canonical structure method”, historically based on expert analysis of the available antibody solved structures. More than thirty years passed since this modelling method was initially developed, nonetheless there is still a huge effort in the academic and pharmaceutical communities to improve its accuracy. The reason for this lies in several error sources in the current modelling process. First of all, given the large amount of available structures, it was impossible to manually update “canonical structure” classes and rules. Moreover, the lack of specific studies on the packing between the VL and the VH domains and on possible conformational changes occurring upon antigen binding was impairing the integration in the modelling techniques of such factors.
Aim
The general aim of this study is to carry out an extensive characterization and annotation of immunoglobulin molecules i.e. to deepen our understanding of the molecular basis of their specificity using a combination of bioinformatics sequence- and structure-based analysis. I carried out improvements to the antibody modelling protocols by revising the canonical structure definitions and by minimizing the errors arising from VL and the VH domain packing at the same time by taking care of the conformational changes occurring upon antigen binding.
Results
During the past years, we successfully improved the description of the structural repertoire of immunoglobulins with lambda light chains, which has both practical (design, engineering and humanization) and theoretical applications (improvement of the antibody modelling)[1]. Our large-scale analysis of the association of heavy and light chain variable domains in antibodies showed that there are essentially two different modes of interaction that can be identified by the presence of key amino acids in specific positions of the antibody sequences [2]. Interestingly, we also found that the different packing modes are related to the volume and type of recognized antigen. These findings are clearly relevant for the design of antibodies and of antibody libraries. The investigation of the antibody conformational changes upon antigen binding allowed us to identify sections on variable and constant regions that show significant flexibility when comparing the antigen bound/unbound forms of immunoglobulins. The results of all the above-mentioned analyses have been implemented in our in-house immunoglobulin structure prediction server (PIGS, automatic Prediction of ImmunoGlobulin Structure), thus helping to minimize the sources of errors in the current modelling process. Consequent to our results, we were asked to write a chapter in Encyclopaedia of Biophysics on antibody modelling [3].
A further step in the direction of improving the understanding of antibody recognition mechanisms was to put together all the annotations of immunoglobulins in a publicly available database. To this aim, we constructed a database of immunoglobulin sequences and integrated tools (DIGIT) [4], which is becoming an extensively used resource by the community. DIGIT stores sequences of annotated immunoglobulin variable domains and offers to the user several tools for searching and analysing them.
Our experience in antibody modelling allowed us to approach two biomedical problems in collaboration with Prof. Arcaini (University of Pavia) and Prof. Fabio Ghiotto (University of Genova). More specifically, by applying the tools we developed and all our theoretical knowledge we successfully analysed the immunoglobulin repertoires of SMZL (splenic marginal zone lymphoma) and CLL (chronic lymphocytic leukaemia) patient data. Both the CLL and SMZL patients are known to have a biased usage of immunoglobulin (IG) heavy variable (IGHV) genes and stereotyped B-cell receptors (BCRs), used as a marker in disease prognosis. We extended these analyses by taking into account VL germlines, VL-VH pairing and structural information, thus giving a more detailed view of the immunoglobulin repertoire in terms of sequence, structure and function. Analysing the immunoglobulins of patients with CLL, we discovered statistically significant differences among immunoglobulins in patients with favourable and unfavourable prognosis. A paper describing this work has been submitted [5]. The poster describing the results of SMZL repertoire analysis was accepted at the 2012 American Society of Haematology (ASH) meeting and published as an abstract [6].
Reference:
1. Chailyan, A., P. Marcatili, et al. (2011). "Structural repertoire of immunoglobulin lambda light chains." Proteins 79(5): 1513-1524.
2. Chailyan, A., P. Marcatili, et al. (2011). "The association of heavy and light chain variable domains in antibodies: implications for antigen specificity." FEBS J 278(16): 2858-2866.
3. Marcatili P., A. Chailyan, D. Cirillo and A. Tramontano. Modelling of antibody structures. Encyclopaedia of Biophysics. Springer (2012).
4. Chailyan, A., A. Tramontano, et al. (2012). "A database of immunoglobulins with integrated tools: DIGIT." Nucleic Acids Res. doi:10.1093/nar/gkr806.
5. Marcatili P., F. Ghiotto, C. Tenca, A. Chailyan, A. N. Mazzarello, X. Yan, M. Colombo, E. Albesiano, D. Bagnara, G. Cutrona, F. Morabito, S. Bruno, M. Ferrarini, N. Chiorazzi, A. Tramontano, F. Fais. "Immunoglobulins produced by chronic lymphocytic leukaemia B cells show limited binding site structure variability." submitted
6. Marcatili P., S. Zibellini, S. Rattotti, A. Chailyan, M. Varettoni, L. Morello, E. Boveri, M. Lucioni, M. Bonfichi, M. Gotti, V. Fiaccadori, M. Paulli, A. Tramontano, L. Arcaini. "Hierarchical Clustering of B-Cell Receptor Structures in Splenic Marginal Zone Lymphoma", abstract, American Society of Haematology (ASH) meeting
RIVESTIMENTI TERMOSPRUZZATI PER LA PROTEZIONE DALL’OSSIDAZIONE AD ALTA TEMPERATURA DI PALETTE DI TURBINA
No full textI rivestimenti utilizzati per la realizzazione delle palette di turbine a gas sono dei sistemi multilayer composti da uno strato più esterno in materiale ceramico (top coat) e da uno strato intermedio in lega metallica (bond coat) finalizzati, rispettivamente, alla protezione del componente dalle elevate temperature di esercizio e dall’ossidazione. Il ceramico inoltre protegge la paletta da fenomeni di erosione superficiale.
Il presente elaborato è finalizzato allo studio del comportamento all’ossidazione di questi sistemi. In particolare si vuole proporre l’aggiunta di un nuovo strato interposto tra bond coat ed top coat analizzando, tramite uno studio sperimentale, come varia la cinetica d’ossidazione del componente. Nella parte finale del lavoro è presentato inoltre lo sviluppo di un modello agli elementi finiti in grado di simulare, in funzione dei diversi comportamenti all’ossidazione, lo stato tensionale che si genera nella paletta.
Il lavoro è stato organizzato secondo la struttura di seguito descritta:
Fase 1:
1. Definizione dello stato dell’arte nel campo dei rivestimenti protettivi per palette di turbina (TBC - Thermal Barrier Coatings);
2. Selezione e deposizione di cinque rivestimenti antiossidanti MCrAlY commerciali;
3. Studio delle cinetiche di ossidazione ad alta temperatura e dell’evoluzione microstrutturale dei rivestimenti MCrAlY depositati;
4. Selezione del rivestimento con le migliori prestazioni in termini di resistenza all’ossidzione.
Fase 2:
5. Modifica superficiale del rivestimento selezionato tramite deposizione di un film di allumina PVD volto a migliorarne il comportamento in ossidazione;
6. Studio delle cinetiche di ossidazione ad alta temperatura e dell’evoluzione microstrutturale del rivestimento MCrAlY modificato.
Fase 3:
7. Studio delle proprietà meccaniche in temperatura del rivestimento selezionato;
8. Sviluppo di un modello agli elementi finiti di paletta di turbina rivestita con TBC: analisi delle sollecitazioni indotte dall’ossidazione del sistema MCrAlY
Synthesis and biological evaluation of new potential co-adjuvants for the treatment of Parkinson’s disease and a new catalytic, asymmetric approach to the synthesis of fused heterocycles of biological interest.
No full textMedicinal chemistry and pure organic chemistry were merged in this thesis as two faces of the same coin. In the first part, more than a hundred hydrazothiazole derivatives were synthesized and tested as human monoamine oxidase B selective inhibitors in order to define accurate structure activity relationships. Our knowledge on human MAO-B inhibition was then applied to the synthesis of purine derivatives as potential dual human MAO-B inhibitors and adenosine A2A receptor antagonists. In the second part, the search for a new catalytic, asymmetric route to the synthesis of poly(hetero)cyclic compounds of biological interest led to the development of a new enantioselective approach to the phase transfer catalyzed cyclization of pyrrole derived substrates
La frammentazione della piattaforma carbonatica dei Monti Simbruini settentrionali nel Miocene superiore
No full textSistemi integrati LED-PV per l'illuminazione sostenibile di gallerie e pregallerie stradali
No full textCaratterizzazione microstrutturale e meccanica di rivestimenti colorati innovativi ottenuti tramite bagni di zincatura con l'aggiunta di titanio
No full textL’uso di rivestimenti in zinco e leghe di zinco sugli acciai è una delle tecniche commercialmente più importanti usate per proteggere i componenti esposti all’ambiente esterno.
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di studiare l’effetto del titanio sui rivestimenti zincati, in quanto l’aggiunta di questo elemento comporta una colorazione della superficie.
Si è cercato così di unire l’effetto protettivo della zincatura alla bellezza di una colorazione resa solidale al ricoprimento grazie alla formazione di ossidi superficiali, e ovviare così ai problemi
dei sistemi duplex zincatura‐verniciatura.
I rivestimenti così ottenuti sono stati caratterizzati dal punto di vista strutturale e meccanico, per poterne valutare l’affidabilità e il campo di applicazioni
