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Enzymatic Degradation of Synthetic Polymers
Full text linkThis thesis is structured around six interconnected studies that contribute to advancing enzymatic plastic recycling. The first two articles address the development of (ultra-) high-throughput screening methods, introducing a halo formation assay tailored for thermostable polyester hydrolases (Article I) and a growth selection assay for (poly)amidases (Article II). Such advanced screening methods facilitate the discovery of novel (polymer) hydrolases, such as the urethanases identified through metagenomic mining (Article III), which were shown to break down urethane bonds within polymers, as demonstrated in Articles IV and V. In Articles IV and V, structural insights into two of these urethanases, UMG-SP-1 and UMG-SP-2, respectively, were gained by solving their crystal structures, which guided rational enzyme engineering. Finally, Article VI shifted focus to applying these enzymes in a dual-enzyme system for the simultaneous depolymerization of mixed plastics, producing a feedstock suitable for microbial upcycling
In silico analysis of the early antiviral innate immune response and intracellular replication of Hepatitis C virus
Full text linkThe innate immune response is the first line of defence against invading pathogens as it quickly triggers the expression of antiviral effectors and signalling molecules to prevent the pathogen’s spread throughout the body. This immune response requires precise regulation, as it not only evokes an antiviral cell state in case of viral infection events, but also initiates apoptosis. This regulation includes multiple feedback regulators and viral proteins interfere with its activation.
In the first part of this thesis, we develop an ordinary differential equation (ODE) model that describes the detection of viral RNA (vRNA) by the receptor retinoic acidinducible gene 1 (RIG-I), subsequent immune signalling via the RIG-I and JAK-STAT pathways and the production and expression of interferons (IFNs) and interferon-stimulated genes (ISGs). It combines information from experimental data, literature knowledge, and a published JAK-STAT activation model.
Using the model, we reveal that overexpression of the reported feedback-regulator IRF9 has a low impact on ISG expression in adenocarcinoma human alveolar basal epithelial (A549) cells and confirm a crucial role of RIG-I levels on the sensitivity of immune sensing, especially with only single vRNAs present in a cell. A sensitivity analysis of cellular protein levels further reveals IRF3, STAT2, MAVS and RIG-I levels to be crucial for robust ISG expression, all of which are known to be targeted by viral proteins. When incorporating the inhibitory effect of 4 viral antagonists into our model, we predict that either exclusively JAK-STAT signalling, IRF3 signalling or all parts of the immune response model are targeted. Thereby, the potency of virus-induced immune inhibition is projected to be dependent on vRNA concentrations in the cell.
In the second part of this work, we study hepatitis C virus (HCV) replication under treatment with different classes of anti-HCV drugs. The precise mode of action is unknown for some of these drug classes, especially for HCV NS5A inhibitors that target a protein without enzymatic activity. Therefore, we establish a model-based workflow to not only quantify the effect of drugs on the intracellular HCV replication, but also employ model selection strategies and identify an effect of the HCV NS5A inhibitor Daclatasvir on the translation and RNA synthesis steps of HCV. We subsequently extend an intracellular HCV replication model towards a multi-level model, which accounts for viral spread within a population of cells in addition to the intracellular HCV life cycle. By performing simulations under drug treatment in this setting and comparing them to experimental observations, we validate our findings for Daclatasvir and identify an effect of the HCV NS3/4A inhibitor Telaprevir on the viral assembly in addition to its known effect on polyprotein processing. Stochastic simulations further highlight the importance of clearance events in newly infected cells to rank drug potency.Die angeborene Immunantwort ist die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Krankheitserreger.
Sie führt zu einer schnellen Hochregulation antiviraler Effektoren und Signalmoleküle,
um die Ausbreitung von Erregern im Körper zu verhindern. Diese Immunreaktion
muss präzise gesteuert werden, da sie neben antiviralen Zellzuständen
auch Apoptose einleiten kann. Die Regulierung umfasst daher eine Vielzahl von Feedback-
Regulatoren und auch virale Proteine verändern gezielt die Aktivierung der Signalkaskaden.
Im ersten Teil dieser Arbeit entwickeln wir ein Modell gewöhnlicher Differentialgleichungen,
das die Detektion viraler RNA (vRNA) durch den RIG-I-Rezeptor, die anschließende
Aktivierung der RIG-I- und JAK-STAT-Signalwege und die Produktion und
Expression von Interferonen (IFNs) und Interferon-stimulierten Genen beschreibt. Das
Modell kombiniert Informationen aus experimentellen Daten und Literaturwissen mit
einem veröffentlichten Modell für den JAK-STAT-Signalweg.
Anhand unseres Modells zeigen wir, dass die Überexpression des Feedback-Regulators
IRF9 eine geringe Auswirkung auf die ISG-Expression in A549-Zellen hat, und bestätigen
eine entscheidende Rolle der RIG-I-Konzentration auf die Sensitivität des Immunsystems.
Diese ist vor allem wichtig, wenn nur einzelne vRNAs in einer Zelle vorhanden
sind. Eine Sensitivitätsanalyse zeigt darüber hinaus eine ausschlaggebende Rolle
von IRF3, STAT2, MAVS und RIG-I für eine robuste ISG-Expression auf. All diese
Proteine werden von viralen Proteinen angegriffen und je nach Angriffspunkt in der
Immunkaskade sind entweder nur der JAK-STAT-Signalweg, nur der IRF3-Signalweg,
oder alle Teile der Immunantwort betroffen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit untersuchen wir die Replikation des Hepatitis-C-Virus
(HCV) und den Einfluss von verschiedenen Anti-HCV-Medikamentenklassen. Die genaue
Wirkungsweise ist für einige dieser Medikamentenklassen unbekannt, insbesondere
für HCV-NS5A-Inhibitoren, die mit einem viralen Protein ohne enzymatische Aktivität
interagieren. Deshalb etablieren wir eine modellbasierte Analyse, die nicht nur
die Wirkung von Medikamenten auf die intrazelluläre HCV-Replikation quantifizieren
kann, sondern auch modellbasierte Einschätzungen geben kann welche Schritte im
HCV-Lebenszyklus am wahrscheinlichsten von Medikamenten angegriffen werden. So
identifizieren wir einen Einfluss des HCV-NS5A-Inhibitors Daclatasvir auf die Translation
und RNA-Synthese von HCV. Anschließend erweitern wir das intrazelluläre HCVReplikationsmodell,
damit es auch die Ausbreitung des Virus innerhalb einer Zellpopulation
beschreibt. Wir validieren unsere Ergebnisse für Daclatasvir und stellen fest,
dass der HCV-NS3/4A-Inhibitor Telaprevir zusätzlich zu seiner bekannten Wirkung
auf die Polyproteinverarbeitung auch eine Wirkung auf den viralen Aufbau zu haben
scheint. Stochastische Simulationen unterstreichen außerdem, wie wichtig es ist, direkt
nach der Infektion einer Zelle die Bildung von HCV-Replikationsstrukturen zu
inhibieren. Hierfür sind unterschiedliche Medikamentenklassen unterschiedlich gut
geeignet
Untersuchungen zur Differenzierung von Makrophagen durch indirektes Niedertemperaturplasma mittels Durchflusszytometrie
Full text linkDie vorliegende Arbeit betrachtet die Differenzierung von Makrophagen in die Subtypen M1 und M2 und die Auswirkung von CAP-behandeltem Nährmedium auf diese Zellpopulationen. Makrophagen stellen wichtige Immunzellen im menschlichen Körper mit Auswirkungen auch auf Tumorwachstum und -metastasierung dar. Die immunologischen Effekte werden durch Zytokine an andere Zellen übertragen, deren Sekretion von der Differenzierung und damit der Funktion der Immunzellen abhängt. Im Pankreaskarzinom nehmen dabei auf pro-inflammatorischer Seite IL-6 und IL-8 über die Regulation von Angiogenese und Tumorvaskularisation und die Migration und Invasion von Tumorzellen Einfluss. Tumorzellproliferation und ein erhöhtes Metastasierungspotential werden zudem durch TNF-α ausgelöst. Auf anti-inflammatorischer Seite sind im Pankreaskarzinom insbesondere IL-10 und TGF-β zu nennen, die eine gesteigerte Immunantwort auf den Tumor hemmen und dadurch Überleben und Metastasierung von Tumorzellen ermöglichen. Dadurch entsteht ein Mikromilieu um den Tumor, das Wachstum und Metastasierung zusätzlich beschleunigen kann. Da diese Inflammationsmodulatoren neben Tumorzellen auch auf Immunzellen wirken, bleibt die Differenzierung von Makrophagen im Verlauf plastisch und die Eigenschaften der Zellen ändern sich bei wechselndem Mikromilieu.
CAP hat in der klinischen Anwendung aufgrund der beschriebenen anti-tumorösen Eigenschaften das Potential, in der onkologischen Therapie mehr und mehr Anwendungsbereiche zu erschließen. Zum einen wirkt CAP durch seine physikalischen Eigenschaften, insbesondere der Einbringung reaktiver Spezies, die direkten Einfluss auf Zellstrukturen nehmen. Zum anderen kann CAP durch immunologische Effekte indirekt Einfluss auf das Zellverhalten nehmen und durch Eingriff in den Zellzyklus die Lebensdauer von Zellen steuern. Diese Eigenschaften von CAP lassen sich auch auf Flüssigkeiten übertragen. Um versprengte Tumorzellen im Körper zu erreichen, ist eine plasmabehandelte Flüssigkeit deshalb eine vielversprechende Alternative oder Ergänzung zur manuellen chirurgischen Behandlung. In einigen Studien zeigte sich die Kombination aus indirekter CAP und Chemotherapie als wirksamer und nebenwirkungsärmer als die jeweiligen Therapien allein.
Nach Stimulation der aus Knochenmark der Mäuse gewonnenen Makrophagen konnten durch Analyse der Rezeptoren iNOS und CD206 die Subtypen M1 und M2 voneinander abgegrenzt werden. Das Makrophagennährmedium wurde für unterschiedliche Zeit mit CAP behandelt. Die mit diesem Medium behandelten Zellen wurden anhand der Ausprägung ihrer Rezeptoren mit der Rezeptordichte unbehandelter Makrophagen verglichen. Dabei konnten in dieser Arbeit keine signifikanten Unterschiede in der Rezeptorausprägung der plasmabehandelten Makrophagen im Vergleich zu den unbehandelten Makrophagen gefunden werden. In der Tendenz kam es lediglich zu einer geringen, nicht signifikanten Steigerung der Ausprägung von iNOS, ohne dass sich Phänotyp und Zellfunktion signifikant veränderten. Eine Plasmabehandlung des Nährmediums konnte demnach nicht genutzt werden, um die Makrophagen in ihrer in dieser Arbeit untersuchten Differenzierung zu verändern.
Interessant ist die in einem Teilversuch gefundene Veränderung der mit Plasma behandelten tumorassoziierten Makrophagen: Sowohl die Rezeptordichte von iNOS als auch die Rezeptordichte von CD206 stieg nach Plasmaanwendung an, nur für iNOS war dieser Anstieg jedoch auch signifikant. Eine eindeutige Änderung der Makrophagendifferenzierung konnte damit noch nicht nachgewiesen werden. Auf dem Spektrum der Makrophagendifferenzierung bewegten sich TAM nach CAP-Behandlung jedoch weg vom M2-Phänotyp. Ließe sich dieser Effekt weiter verstärken, könnte das für die klinische Anwendung beispielsweise von CAP-behandelten Spülflüssigkeiten relevant werden
3D-Imaging Based Analysis of Pathogens Distribution in Infected Organs and Tissues
Full text linkTissue optical clearing (TOC) and fluorescence imaging have significantly advanced 3D imaging of biological samples. However, few studies have applied these techniques in infection biology although they provide valuable information that can enhance our understanding of spatiotemporal dynamics in infections and disease progression. This thesis addresses this gap by utilizing these techniques to analyze optically cleared tissue samples from animals experimentally infected with rabies virus (RABV) or severe acute respiratory syndrome corona virus 2 (SARS-CoV-2), in order to gain deeper insights into virus replication and pathogenicity in the brain and lung. To achieve this, image segmentation and quantification pipelines, including the use of AI, for the extraction of comparable data on cell tropism and the spatiotemporal development of infection processes were developed. Previous work demonstrated that intramuscular (i.m) inoculation of mice with highly virulent field RABV strains led to the infection of both neurons and astrocytes in the brain, of which the latter may significantly shape the host response to RABV infection. Accordingly, the first aim was to investigate whether astrocyte tropism of field viruses is a late phase phenotype or whether it already occurs in early phases before the onset of clinical signs. Immunofluorescence imaging of optically cleared mouse brain sections confirmed astrocyte infection at early time points of brain invasion and indicates that astrocyte tropism of RABV indeed could shape host reactions to infection already at those early time points of infection. The second aim was to investigate whether resistance of rRABV DogA to interferon (IFN) response, mediated by the phosphoprotein (P), is a prerequisite for CNS infection from peripheral sites and astrocyte tropism in the brain. Using a recombinant virus mutant, rRABV DogA-IFNmut, which has impaired type I interferon antagonistic activity, age-dependent courses of brain infection following i.m. inoculation were observed. In 4-week-old mice, the infection proved lethal, while older mice recovered despite showing clinical signs. While these data demonstrated insufficient block of the virus by the interferon system in peripheral tissues, they also suggest a significant role of the type I interferon response in restricting virus spread and astrocyte tropism in the brain. The third aim was to explore the effect of increased glycoprotein (G) cell surface expression that was previously observed in cell culture on the virulence of field RABV DogA. Based on the hypothesis that de-regulated G transport to non-synaptic plasma membrane sites results in the release of extracellular virus from neurons and hence recognition by the immune system, the mutant rRABV DogA-NTN, that has three cell culture-adaptive mutations in G was used. Although delayed pathogenesis and requirement of higher viral loads to induce clinical signs were observed, no detectable increase in surface expression of the protein was found in neurons, despite visualized changes in intra-neuronal G distribution. These results indicate that differences in surface transport regulation between standard cell lines and neurons in vivo exist. Involved mechanisms, however, remain unclear.
Finally, to effectively manage SARS CoV-2 infection, a thorough understanding of the immune dynamics within the lungs is needed. Consequently, TOC combined with 3D imaging techniques was used to investigate viral infection and the corresponding immune response in the lungs of experimentally infected hamsters over a 7-day period. This approach enabled high-resolution visualization of cellular interactions, revealing a spatially localized antiviral response. Infected epithelial cells displayed an upregulation of major histocompatibility complex II (MHC II), highlighting immune system activation. Monocyte-derived macrophages played a crucial role in viral clearance; however, their presence was also associated with postinfection endothelial damage, illustrating their dual role in both defending against the virus and contributing to tissue injury. Furthermore, early signs of tissue repair were observed alongside inflammatory and necrotizing processes, potentially laying the groundwork for longterm alterations in lung structure and function. These findings provide valuable insights into the complexities of immune responses in viral infections and may inform future therapeutic strategies
Combining hidden Markov models and deep learning for biological sequences
Full text linkThis cumulative dissertation presents software which enhances state-of-the-art accuracy for two profound bioinformatics problems. The tools combine established mathematical frameworks for biological sequence Analysis and modern deep learning techniques. The cornerstone of this work is a novel hidden Markov model layer, which implements parallelized algorithms for supervised and unsupervised training and inference. It can be combined with other layers and efficiently runs on a GPU.
This thesis contains three research articles in which deep learning is combined with hidden Markov models - a synergy that is driven by pattern detection in large amounts of biological sequence data, but also the incorporation of strong inductive biases.
We pioneered learnMSA, a tool that constructs multiple sequence alignments for families of protein sequences. It is the first aligner for large numbers of sequences to integrate a deep learning model, surpassing the state-of-the-art accuracy of amino acid-based aligners. It offers runtime and accuracy advantages over long-established software when scaling up the number of input proteins and when aligning distantly related sequences. Article I describes the original release of learnMSA and introduces its unique methodology, while Article II features the addition of parameter-rich, pre-trained protein language models, which incorporate rich prior knowledge about proteins.
Furthermore, we developed Tiberius, a deep learning model for ab initio gene prediction in eukaryotic species. The tool is fast and, compared to other ab initio predictors, unprecedentedly accurate, as shown in Article III. Tiberius, receiving only a genome as input, matches the accuracy of Pipelines that additionally require complex extrinsic evidence
Discovery, Enzyme Engineering and Application of Oxidoreductases in Biocatalysis
Full text linkThis thesis aimed at the identification, engineering, and application of NAD(P)H dependent oxidoreductases such as Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs) and enoate reductases (EREDs) due to their importance as biocatalysts in the chemical and pharmaceutical industry. To facilitate the implementation of biocatalysis in industrial processes, improved co-factor regeneration strategies as well as tools for the high-throughput characterization of enzymes are greatly demanded. Therefore, the combination of target biocatalytic reactions with the direct electrochemical regeneration of NAD(P)H co-factors have been investigated herein. Furthermore, the bioinformatic-assisted identification of novel oxidoreductases and their tailoring by
protein engineering not only expands the number of available enzymes, the
presented biocatalysis-based strategies offer promising alternatives to established chemical reaction schemes that are compliant with ‘The 12 Principles of Green Chemistry’.
In Article I, the direct electrochemical NADH regeneration was explored on the
cathode of a carbon electrode, modified with Toray paper sprayed with carbon
nanoparticles. The nicotinamide product distribution was investigated and the
electrochemical flow cell reactor was combined with an enzymatic reduction reaction to validate the method.
Article II focuses on the discovery and characterization of BVMOs, through the
bioinformatic analysis of sequence similarity networks (SSNs). An uncharacterized BVMO from Halopolyspora algeriensis (BVMOHalo) was identified after in silico clustering of protein sequences and characterized biochemically (e.g., pH optimum, organic solvent tolerance). Substrate scope elucidation enabled the annotation of BVMOHalo as aliphatic ketone monooxygenase. Expanding from the findings in Article II, Article III features the first genetically encoded biosensor system to monitor BVMO activity. This biosensor implementation accelerated the screening of a focused library of active site mutants of BVMOHalo and the identification of ester forming variants, overcoming the low-throughput analysis of BVMO reaction products by chromatographic methods. Together, the presented articles address key
challenges in biocatalysis, ranging from the recycling of co-factors and the
identification and evolution of novel enzymes.
Article I: Product distribution of steady-state and pulsed electrochemical regeneration of 1,4-NADH and integration with enzymatic reaction
Mohammed Ali Saif Al-Shaibani , Thaleia Sakoleva , Luka A.
Živković, Harry P. Austin , Mark Dörr , Liane Hilfert , Edgar Haak, Uwe
T. Bornscheuer, Tanja Vidaković-Koch, ChemistryOpen, 2024, e202400064
This article describes the direct electrochemical regeneration of NADH on carbon electrodes, modified with carbon nanoparticles sprayed Toray paper. The product distribution under steady-state and dynamic conditions was investigated and proved that the dynamic operation offered a faster mode, yielding the desired 1,4-NADH isomer. In parallel, side products such as different NAD dimers, the enzymatically inactive isomer 1,6-NADH, and the formation of ADP-ribose represent disadvantages of the investigated electrochemical co-factor recycling method. In addition to this, the different nicotinamide side products are enzymatic inhibitors, negatively impacting product yields.
Article II: Discovery and characterization of a Baeyer-Villiger monooxygenase using sequence similarity network analysis
Thaleia Sakoleva, Harry P. Austin, Chrysoula Tzima, Mark Dörr, Uwe T. Bornscheuer, ChemBioChem, 2023, e202200746
This article describes the discovery of the novel BVMOHalo by SSN analysis. The
sequence was retrieved after protein clustering. The enzyme was successfully
expressed in Escherichia coli (E. coli) and purified. Substrate scope investigation suggested that BVMOHalo prefers linear aliphatic ketones. Optimal reaction conditions were determined in different buffer systems at varying pH, temperatures, and in the presence of commonly used organic co-solvents. Finally, the enzyme remained stable after five days of storage, which is remarkable since BVMOs regularly suffer from short half-lives.
Article III: Biosensor-guided engineering of a Baeyer-Villiger monooxygenase for aliphatic ester production
Thaleia Sakoleva, Florian Vesenmaier, Lena Koch, Jarne E. Schunke, Kay Novak, Sascha Grobe, Mark Dörr, Uwe T. Bornscheuer, Thomas Bayer, ChemBioChem, e202400712.
This article describes the engineering of the catalytic site of BVMOHalo and the detection of active variants using a bioluminescence-based assay. Aliphatic ketones were converted into the corresponding esters by this BVMO. Subsequently, esters are transformed through an artificial enzyme cascade, consisting of an esterase and an alcohol dehydrogenase (ADH), yielding aldehydes as cascade products. The aldehyde is then substrate for a bacterial luciferase (LuxAB), which emits light through the oxidation of aldehydes to the corresponding carboxylates. This biosensor setup was used to guide the selection of ester-forming variants of BVMOHalo – not only representing the first genetically encoded biosensor system to monitor the product formation in BVMO-catalyzed reactions but offering great potential to accelerate protein and metabolic engineering campaigns in the future.Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung, Entwicklung und Anwendung von NAD(P)H-abhängigen Oxidoreduktasen wie Baeyer-Villiger-Monooxygenasen (BVMOs) und Enoatreduktasen (EREDs) aufgrund ihrer Bedeutung als Biokatalysatoren in der chemischen und pharmazeutischen Industrie. Um die Implementierung der Biokatalyse in industrielle Prozesse zu erleichtern, besteht ein großer Bedarf an verbesserten Strategien zur Regeneration von Cofaktoren sowie an Werkzeugen zur Hochdurchsatzcharakterisierung von Enzymen. Daher wurde hier die Kombination gezielter biokatalytischer Reaktionen mit der direkten elektrochemischen Regeneration von NAD(P)H-Cofaktoren untersucht. Darüber hinaus erweitert die bioinformatisch unterstützte Identifizierung neuer Oxidoreduktasen und ihre Anpassung durch Protein-Engineering nicht nur die Anzahl der verfügbaren Enzyme, sondern die vorgestellten biokatalysebasierten Strategien bieten vielversprechende Alternativen zu etablierten chemischen Reaktionsschemata, die den „12 Prinzipien der Grünen Chemie“ entsprechen. In Artikel I wurde die direkte elektrochemische NADH-Regeneration an der Kathode einer Kohlenstoffelektrode untersucht, die mit mit Kohlenstoffnanopartikeln besprühtem Toray-Papier modifiziert wurde. Die Verteilung des Nicotinamidprodukts wurde untersucht und der elektrochemische Durchflusszellenreaktor wurde mit einer enzymatischen Reduktionsreaktion kombiniert, um die Methode zu validieren. Artikel II konzentriert sich auf die Entdeckung und Charakterisierung von BVMOs durch die bioinformatische Analyse von Sequenzähnlichkeitsnetzwerken (SSNs). Ein nicht charakterisiertes BVMO aus Halopolyspora algeriensis (BVMOHalo) wurde nach In-silico-Clusterbildung von Proteinsequenzen identifiziert und biochemisch charakterisiert (z. B. pH-Optimum, Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln). Die Aufklärung des Substratumfangs ermöglichte die Annotation von BVMOHalo als aliphatische Ketonmonooxygenase. Aufbauend auf den Erkenntnissen aus Artikel II präsentiert Artikel III das erste genetisch kodierte Biosensorsystem zur Überwachung der BVMO-Aktivität. Diese Biosensor-Implementierung beschleunigte das Screening einer fokussierten Bibliothek aktiver Mutanten von BVMOHalo und die Identifizierung esterbildender Varianten, wodurch die Niedrigdurchsatzanalyse von BVMO-Reaktionsprodukten mit chromatographischen Methoden überwunden wurde. Gemeinsam befassen sich die vorgestellten Artikel mit den wichtigsten Herausforderungen der Biokatalyse, angefangen beim Recycling von Cofaktoren bis hin zur Identifizierung und Entwicklung neuer Enzyme.
Artikel I: Produktverteilung der stationären und gepulsten elektrochemischen Regeneration von 1,4-NADH und Integration mit enzymatischen Reaktionen Mohammed Ali Saif Al-Shaibani, Thaleia Sakoleva, Luka A. Živković, Harry P. Austin, Mark Dörr, Liane Hilfert, Edgar Haak, Uwe T. Bornscheuer, Tanja Vidaković-Koch, ChemistryOpen, 2024, e202400064
Dieser Artikel beschreibt die direkte elektrochemische Regeneration von NADH auf Kohlenstoffelektroden, die mit mit Kohlenstoffnanopartikeln besprühtem Toray-Papier modifiziert wurden. Die Produktverteilung unter stationären und dynamischen Bedingungen wurde untersucht und es wurde nachgewiesen, dass der dynamische Betrieb einen schnelleren Modus bietet, der das gewünschte 1,4-NADH-Isomer ergibt. Parallel dazu stellen Nebenprodukte wie verschiedene NAD-Dimere, das enzymatisch inaktive Isomer 1,6-NADH und die Bildung von ADP-Ribose Nachteile der untersuchten elektrochemischen Cofaktor-Recyclingmethode dar. Darüber hinaus sind die verschiedenen Nicotinamid-Nebenprodukte enzymatische Inhibitoren, die sich negativ auf die Produktausbeute auswirken.
Artikel II: Entdeckung und Charakterisierung einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase mittels Sequenzähnlichkeitsnetzwerkanalyse
Thaleia Sakoleva, Harry P. Austin, Chrysoula Tzima, Mark Dörr, Uwe T. Bornscheuer, ChemBioChem, 2023, e202200746
Dieser Artikel beschreibt die Entdeckung des neuen BVMOHalo durch SSN-Analyse. Die Sequenz wurde nach Proteinclusterung abgerufen. Das Enzym wurde erfolgreich
in Escherichia coli (E. coli) exprimiert und gereinigt. Untersuchungen des Substratumfangs ergaben, dass BVMOHalo lineare aliphatische Ketone bevorzugt. Optimale Reaktionsbedingungen wurden in verschiedenen Puffersystemen bei unterschiedlichem pH-Wert, unterschiedlichen Temperaturen und in Gegenwart häufig verwendeter organischer Co-Lösungsmittel ermittelt. Schließlich blieb das Enzym nach fünf Tagen Lagerung stabil, was bemerkenswert ist, da BVMOs regelmäßig unter kurzen Halbwertszeiten leiden.
Artikel III: Biosensorgesteuerte Entwicklung einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase zur Produktion aliphatischer Ester
Thaleia Sakoleva, Florian Vesenmaier, Lena Koch, Jarne E. Schunke,
Kay Novak, Sascha Grobe, Mark Dörr, Uwe T. Bornscheuer, Thomas
Bayer, ChemBioChem, e202400712
Dieser Artikel beschreibt die Entwicklung der katalytischen Stelle von BVMOHalo und die Erkennung aktiver Varianten mithilfe eines auf Biolumineszenz basierenden Tests. Aliphatische Ketone wurden durch dieses BVMO in die entsprechenden Ester umgewandelt. Anschließend werden die Ester durch eine künstliche Enzymkaskade, bestehend aus einer Esterase und einer Alkoholdehydrogenase (ADH), umgewandelt, wodurch Aldehyde als Kaskadenprodukte entstehen. Der Aldehyd ist dann Substrat für eine bakterielle Luciferase (LuxAB), die durch die Oxidation von Aldehyden zu den entsprechenden Carboxylaten Licht emittiert. Dieser Biosensor-Aufbau wurde zur Auswahl der esterbildenden Varianten von BVMOHalo verwendet. Er stellt nicht nur das erste genetisch kodierte Biosensorsystem zur Überwachung der Produktbildung in BVMO-katalysierten Reaktionen dar, sondern bietet auch großes Potenzial zur Beschleunigung zukünftiger Protein- und Stoffwechseltechnikkampagnen
Prädiktoren der Inzidenz und Dauer des Post-Stroke-Delirs im klinischen Routine-Setting beim ischämischen Schlaganfall
Full text linkHintergrund:
Das Post-Stroke-Delir (PSD) ist eine akut-fluktuierende neurokognitive Störung, die zu einer Beeinträchtigung der Aufmerksamkeit nach einem Schlaganfall führt. Da es das klinische Outcome negativ beeinflusst, stellt es eine relevante Komplikation dar. Dennoch scheint die Evidenz zur Detektion und Modifikation in Bezug auf Inzidenz und Dauer des PSD bislang noch unzureichend zu sein.
Zielsetzung:
Diese prospektive Beobachtungsstudie untersucht welche soziodemographischen und therapieassoziierten Prädiktoren die Inzidenz und Dauer eines PSD beim ischämischen Schlaganfall beeinflussen. Dabei wurde der Schwerpunkt insbesondere auch auf modifizierbare Faktoren gelegt.
Methoden:
Eingeschlossen wurden Patient*innen mit ischämischem Schlaganfall welche innerhalb von 24h nach dem Ereignis aufgenommen wurden. Diese wurden für maximal eine Woche zweimal täglich auf ein Delir gemäß DSM-5-Standard untersucht. Zudem wurden soziodemographische und therapieassoziierte Faktoren erfasst. Die Auswertung der Daten erfolgte mit SPSS, wobei der Einfluss der Faktoren mittels logistischer und linearer Regression bestimmt wurde.
Ergebnisse:
Insgesamt wurden 141 Patient*innen in die Studie eingeschlossen von welchen 39% ein Delir entwickelten. Als unabhängige Risikofaktoren für das Auftreten eines PSD konnten das Alter, Schmerzen, Infektionen und das Vorhandensein eines Blasenkatheters erfasst werden. Die Länge des PSD wird dagegen von Alter, Geschlecht, periphervenösen Zugängen, Blasenkathetern, Schmerzen und Infektionen beeinflusst. Ein Infarkt mit größerem Volumen führte sowohl zu häufigerem als auch zu prolongiertem Delir. Zudem erhöhten rechtsseitig lokalisierte Läsionen die Inzidenz, während linksseitige zu einem längeren PSD führten.
Schlussfolgerungen/ Limitationen:
Erstmals wurden auch therapieassoziierte Risikofaktoren als modulierbare Größen in die Analysen eingeschlossen. Wir zeigten, dass ein PSD sowohl in seiner Inzidenz als auch in der Dauer mit Fremdkörpern in situ assoziiert ist. An diese Erkenntnisse könnten sich Studien zur Nutzen-Risiko-Analyse solcher Maßnahmen anschließen.
Zudem zeigten Schmerzen und Infektionen einen Einfluss auf Dauer und Inzidenz eines PSD und sollten daher erfasst werden. Hierzu fehlt es bislang an etablierten Schmerzerfassungsskalen im Rahmen eines PSD.
Post-Stroke-Infektionen und größere Infarktvolumina wurden auch in dieser Studie als Risikofaktoren bestätigt, sodass nach ihrer Detektion zielgerichtete Delirpräventionsmaßnahmen eingeleitet werden können.
Als Limitationen dieser Studie sind die geringe Anzahl an MRT-Untersuchungen zu sehen, welche lediglich aus der Routineversorgung bezogen wurden. Nur schwache Effekte sind unter Umständen auf eine begrenzte Fallzahl zurückzuführen, welche zukünftig in größeren Kohorten analysiert werden können. Da zudem keine klinischen Untersuchungen auf Post-Stroke-Infektionen über den beschriebenen Parametern hinaus vorgesehen waren, ist ihr Einfluss in dieser Studie unter Umständen unterschätzt.
Ausblick:
In einer alternden Gesellschaft mit steigenden Inzidenzen von Schlaganfällen sollten auch assoziierte Komplikationen weiter Teil der medizinischen Forschung sein. Diese Arbeit liefert Anknüpfungspunkte für zukünftige Studien zur Vermeidung und Modifikation eines PSD und ist damit ein weiterer Baustein zur Etablierung einer individualisierten Versorgung nach einem ischämischen Schlaganfall
Assoziationen zwischen der glomerulären Filtrationsrate und der niedermolekularen Zusammensetzung von Plasma und Urin innerhalb einer Stichprobe der Allgemeinbevölkerung
Full text linkChronic kidney disease (CKD) represents an increasingly significant global health issue [1, 2]. High prevalence, healthcare costs, and reduced quality of life for affected individuals are factors that necessitate the further development of early CKD detection [3–8]. Therefore, the aim of this study was to identify metabolites associated with kidney function through exploratory analyses of the plasma and urine metabolomes.
The study included data from 920 participants, including 407 men and 513 women, from the baseline examination of the population-based Study of Health in Pomerania-TREND (SHIP-TREND). The participants were aged between 20 and 79 years and lived in the region of Vorpommern. The examinations were conducted between 2008 and 2012. All included participants were kidney-healthy and had no self-reported diabetes mellitus. The estimated glomerular filtration rate (eGFR) based on cystatin C (eGFR cys) was used as a parameter for assessing kidney function. Participants with an eGFR cys > 60 ml/min/1.73m² were defined as kidney-healthy. The plasma and urine metabolomes were measured using liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry at the Helmholtz Zentrum München. The metabolites were subsequently quantified by a commercial provider (Metabolon, Inc.). A total of 474 plasma metabolites and 558 urine metabolites were quantified, of which 200 were found in both blood and urine. Multivariable linear regression analyses were performed with the dependent variable being eGFR cys. Independent variables included all quantified plasma and urine metabolites, as well as the inter- and intra-fluid ratios in all possible combinations. The regression analyses were adjusted for age, sex, waist circumference, triglycerides, smoking, and hypertension. To avoid the accumulation of type I errors, the Bonferroni correction was used to determine the significance level. Intra- and inter-fluid ratios had to additionally exceed a P-gain threshold, allowing the evaluation of the association of a ratio with eGFR cys independent of the significance of a single metabolite.
In total, 72 plasma metabolites and 56 urine metabolites were found to be significantly associated with eGFR cys. Additionally, 26 intra-fluid ratios in plasma, 34 intra-fluid ratios in urine, and 150 inter-fluid ratios were detected, which were significantly associated with eGFR cys. Among the many detected associations, four plasma metabolites stood out, which had not been previously described in relation to kidney function: Gamma-50Butyrobetain, 3-Methylglutarylcarnitine, N4-Acetylcytidine, and 1-Methyl-2-Piperidin-carboxylic acid. Other plasma metabolites, such as pseudouridine and kynurenine, had already been described in previous studies [25–27] as being significantly associated with kidney function or kidney function impairment. In the urine metabolome, N-acetylated amino acids and metabolites from the AS metabolism of leucine, isoleucine, and valine, all of which were positively associated with eGFR cys, were particularly notable. In addition, four inversely associated inter-fluid ratios were detected, which included the same metabolites in both plasma and urine: beta-hydroxyisovalerate, 3-Indoxyl sulfate, N1-Methyl-2-pyridon-5-carboxamide, and an unknown metabolite.
The integration of our results with the findings from previous studies contributed to the validation of the present results. Hypotheses were also developed regarding the pathophysiological relationships between the metabolites or metabolite ratios and eGFR. However, causal relationships cannot be detected with the presented cross-sectional and exploratory analyses. Therefore, it is necessary to further investigate the identified metabolites in future prospective studies and randomized case-control approaches regarding their significance for kidney function. Additionally, experimental research should be conducted on the kidney metabolism of the detected metabolites to determine whether one or more of these substances can serve as laboratory biomarkers for detecting minor impairments in kidney function. This exploratory study thus provides a starting point for further, targeted research.Die chronische Niereninsuffizienz (CKD) stellt weltweit ein immer größer werdendes
Gesundheitsproblem dar [1, 2]. Hohe Prävalenz und Gesundheitskosten sowie eine verminderte
Lebensqualität bei den Betroffenen, sind Faktoren, die eine Weiterentwicklung der Früherkennung
der CKD zwingend erfordern [3–8]. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, mithilfe des Plasmaund
Urinmetaboloms in explorativen Analysen Metabolite zu identifizieren die mit der
Nierenfunktion assoziiert sind.
In die Studie wurden die Daten von 920 Probanden, darunter 407 Männer und 513 Frauen, der
Basisuntersuchung der populationsbasierten Study of Health in Pomerania-TREND (SHIPTREND)
eingeschlossen. Die Probanden waren zwischen 20-79 Jahre alt und lebten in der Region
Vorpommern. Die durchgeführten Untersuchungen fanden zwischen 2008 und 2012 statt. Alle
eingeschlossenen Probanden waren nierengesund und hatten keinen selbstberichteten Diabetes
Mellitus. Als Parameter zur Abschätzung der Nierenfunktion wurde die geschätzte glomeruläre
Filtrationsrate (eGFR) basierend auf Cystatin C (eGFRcys) verwendet. Probanden mit einer
eGFRcys > 60 ml/min/1,73m² wurden als nierengesund definiert. Das Plasma- sowie Urinmetabolom
wurde mittels Flüssigchromatographie (liquid chromatography) kombiniert mit Tandem-
Massenspektrometrie am Helmholtz Zentrum München gemessen. Anschließend wurden die
Metaboliten durch einen kommerziellen Anbieter (Metabolon, Inc.) quantifiziert. Insgesamt konnten
474 Plasmametaboliten und 558 Urinmetaboliten quantifiziert werden, von denen 200 sowohl im
Blut als auch im Urin vorkamen. Es erfolgten multivariable lineare Regressionsanalysen, bei der die
abhängige Variable die eGFRcys darstellte. Unabhängige Variablen waren alle quantifizierten
Plasma- und Urinmetaboliten, sowie die inter- und intra-fluid Ratios in allen möglichen
Kombinationen. Die Regressionsanalysen wurden für Alter, Geschlecht, Taillenumfang,
Triglyceride, Rauchen und Hypertonie adjustiert. Zur Vermeidung einer Kumulierung von
Alphafehlern wurde zur Bestimmung des Signifikanzniveaus die Bonferroni-Korrektur verwendet.
Intra- und inter-fluid Ratios mussten zusätzliche einen P-gain Schwellenwert überschreiten, der es
ermöglicht die Assoziation eines Ratio mit der eGFRcys unabhängig von der Signifikanz eines
Einzelmetaboliten zu bewerten.
Insgesamt zeigten sich in den Analysen im Plasma 72, und im Urin 56 signifikant mit der eGFRcys
assoziierte Metaboliten. Zusätzlich konnten 26 intra-fluid Ratios im Plasma, 34 intra-fluid Ratios im
Urin und 150 inter-fluid Ratios detektiert werden, die signifikant mit der eGFRcys assoziiert waren.
Aus der Vielzahl der detektierten Assoziationen stachen vier Plasmametaboliten hervor, die bisher
in keiner anderen Studie im Zusammenhang mit der Nierenfunktion beschrieben wurden: Gamma-Butyrobetain, 3-Methylglutarylcarnitin, N4-Acetylcytidin und 1-Methyl-2-Piperidin-carboxylsäure.
Andere Plasmametaboliten wie Pseudouridin und Kynurenin wurden bereits in vorherigen Studien
[25–27] als signifikant mit der Nierenfunktion bzw. Nierenfunktions-einschränkungen assoziiert,
beschrieben. Im Urinmetabolom zeigten sich vor allem N-acetylierte Aminosäuren und Metaboliten
des AS-Stoffwechsels von Leucin, Isoleucin und Valin, die alle positiv mit der eGFRcys assoziiert
waren. Zudem gab es vier invers assoziierte inter-fluid Ratios die denselben Metaboliten, sowohl im
Plasma als auch im Urin beinhalteten: Beta-hydroxyisovalerat, 3-Indoxylsulfat, N1-Methyl-2-
pyridon-5-carboxamid und ein unbekannter Metabolit.
Die Einordnung der eigenen Ergebnisse in die Erkenntnisse aus vorherigen Studien trug zur
Validierung der vorliegenden Resultate bei. Dabei wurden auch eigene Hypothesen zu
pathophysiologischen Zusammenhängen zwischen den Metaboliten bzw. den Metabolitenratios und
der eGFR aufgestellt. Jedoch können mit den vorgestellten querschnittlichen und explorativen
Analysen keine kausalen Zusammenhänge detektiert werden. Es ist daher notwendig in zukünftigen
prospektiven Studien sowie randomisierten Fall-Kontroll Ansätzen die herausgearbeiteten
Metaboliten in Bezug auf ihre Bedeutung für die Nierenfunktion genauer zu beleuchten. Zudem
sollte in experimentellen Ansätzen Grundlagenforschung zum Thema Nierenmetabolismus der
detektierten Metaboliten betrieben werden um herauszufinden, ob einer oder mehrere dieser Stoffe
als laborchemische Biomarker zur Detektion geringfügiger Nierenfunktionseinschränkungen
geeignet sind. Die vorliegende, explorative Studie schafft somit einen Ausgangspunkt für weitere,
zielgerichtete Forschung
Analyse von Risikofaktoren für das Auftreten Therapie-assoziierter Komplikationen bei der Drainagetherapie pankreatischer Nekrosen
Full text linkDie akute Pankreatitis ist eine der am häufigsten zu einer Hospitalisierung führenden Erkran-kungen in der Gastroenterologie. Eine häufige und potenziell schwere Komplikation ist das Auftreten von (peri-) pankreatischen Nekrosen, die mit einer erheblichen Morbidität und Mortalität einhergehen. Kommt es durch den nekrotischen Verhalt bedingt zu Komplikationen wie der Verdrängung von Nachbarorganen oder einer Superinfektion, ist im Regelfall die endoskopische transluminale Drainagetherapie mit Metall- oder Plastikstents indiziert. Die Datenlage zu den Risikofaktoren, die zu unerwünschten Ereignissen (UE) während einer Drainagetherapie führen, ist jedoch bislang noch unzureichend.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden in einer retrospektiven Analyse Risikofaktoren für das Auftreten von UE bei der endoskopischen transluminalen Drainagetherapie von (peri-) pankreatischen Nekrosen ermittelt. Hierfür wurden 89 Patientenfälle aus dem Zeitraum zwischen 2009 und 2019 die an der Universitätsmedizin Greifswald behandelt wurden, hinsichtlich der Therapie- und der Patientencharakteristika untersucht. Patienten bei denen ein UE während der endoskopischen Drainagetherapie der Pankreasnekrosen auftrat, wurden mit einer Kontrollgruppe ohne UE verglichen.
Es kam in 58,4 % der Patientenfälle zu einem UE während der endoskopischen Drainagetherapie, hiervon waren allerdings 76,9 % leichte UE in Form von Stentdislokationen, residuellen Läsionen oder Stentobstruktionen. Lediglich ein Todesfall konnte als direktes schweres UE infolge der endoskopischen Drainagetherapie ermittelt werden. Zudem zeigte sich eine signifikant erhöhte Krankenhausverweildauer von im Median 7 Tagen bei Patienten mit UE gegenüber der Kontrollgruppe. Das Vorhandensein einer Superinfektion der Nekrosen und die Grö-ße des Verhalts konnten als die wichtigsten assoziierten Risikofaktoren für das Auftreten von UE während einer endoskopischen Drainagetherapie identifiziert werden. Hinsichtlich der Auswahl von Plastik- oder Metallstents zur Drainage konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Stentsystemen identifiziert werden.
Zusammenfassend nimmt die Anwesenheit von Mikroorganismen in der Nekrose wahrscheinlich einen stark nachteiligen Einfluss auf den Verlauf einer endoskopischen Drainagetherapie. Aus diesem Grund sollten präventive Maßnahmen zur Vermeidung von Infektionen und Therapieoptimierungen in Hinsicht auf Nekroseinfektionen im Fokus der endoskopischen Therapie (peri-) pankreatischer Nekrosen stehen. Ob zukünftig auch antimikrobiell beschichtete Stents eine Behandlungsoption in diesem Patientenkollektiv darstellen könnten, muss noch in weiteren Studien untersucht werden
Characterization of the human antibody repertoire against staphylococcal antigens in the general population
Full text linkStaphylococcus aureus (S. aureus) is a Gram-positive bacterium known to colonize parts of the human population persistently at various niches on the body surface, with the nares as main area of colonization [Wertheim 2004]. In a 19-month longitudinal study at the Statens Serum Institut in 1995, different modes of colonization were described: 14.4% of the 104 persons investigated were characterized as persistent carriers showing detectable amounts of S. aureus in over 90% of swabs, 16.3% as intermittent carriers (over 50% of swabs positive for S. aureus), 52.9% as occasional carriers (over 10% of swabs positive) and 16.3% as non-carriers with not a single culture-positive swab [Eriksen 1995]. With the introduction of more sensitive culture-independent detection technologies, the separation of groups was rephrased in 2009 by van Belkum et al.: only two groups, namely persistent colonization and intermittent carriage should remain due to similar responses of intermittent carriers and non-carriers to artificial inoculation [van Belkum 2009]. Colonization itself can remain unnoticed since no clinical symptoms are triggered, but due to the constant challenge with the bacterium, an increased risk of surgical site infections (SSIs) was described in persistent carriers [Kluytmans 1995]. Additionally, invasive events occur more often, when staphylococci are able to enter the organism e. g. via micro-lesions in the skin [Wertheim 2004]. Due to the persistent challenge in carriers, it was hypothesized that these individuals should reflect these circumstances with higher titers of anti-staphylococcal antibodies together with matching B- and T-cells primed to staphylococcal antigens [Wertheim 2004, Holtfreter 2006]. This idea was addressed in multiple small case-control studies [Verkaik 2009, Dryla 2005, Rigat 2019], but the bigger picture studying the general population was still missing.
The work described in this dissertation focuses on the detection of specific antibodies against a set of 79 staphylococcal antigens in a multiplex bead-based assay format to describe the anti-staphylococcal antibody repertoire in a study population resembling the general population. To achieve this goal, a highly sensitive analysis strategy was designed which is described in the first publication of this thesis “Technical report: xMAPr - High-dynamic-range (HDR) quantification of antigen-specific antibody binding”. This report addresses the challenge of measuring over the wide dynamic range expected in the plasma samples of the Study of Health in Pomerania (SHIP), of which the SHIP-TREND cohort was used as a population-based cohort for the second publication “A Comprehensive View on the Human Antibody Repertoire Against Staphylococcus aureus Antigens in the General Population”. The resulting antibody dataset was added to the multi-factor analyses of the SHIP-TREND cohort allowing a correlation of the individual anti-staphylococcal antibody response to the genetic features of the study subjects in a genome-wide association study (GWAS). The findings concerning one of the included antigens “toxic shock syndrome toxin 1” (TSST-1) are described in the third publication “Toxin exposure and HLA alleles determine serum antibody binding to toxic shock syndrome toxin 1 (TSST-1) of Staphylococcus aureus”. The xMAPr assay setup can be applied to further fields of research where a quantitative antibody detection is needed, e. g. the induction of specific antibodies after vaccination as shown in the fourth publication “Intranasal Vaccination With Lipoproteins Confers Protection Against Pneumococcal Colonisation”, where mice were immunized with antigens derived from Streptococcus pneumoniae