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Selektive Inhibition von MRP4 in Thrombozyten und der Effekt antiinflammatorischer Wirkstoffe auf die Expression des Transporters
Get PDFMRP4 (ABCC4) ist ein in menschlichen Geweben nahezu ubiquitär exprimierter Effluxtransporter mit breitem Substratspektrum. Dieses umfasst endogene Signalmoleküle wie den Sekundärbotenstoff cAMP und Lipidmediatoren (PGE2, Leukotriene, Sphingosin-1-phosphat etc.), welche neben ihrem Einfluss auf Entzündungsprozesse auch die Thrombozytenaggregation modulieren. Aus Beobachtungen einer Acetylsalicylsäure (ASS)- induzierten Steigerung der MRP4-Expression in Thrombozyten, die mit einer Plättchenhyperreagibilität einherging, entwickelte sich die Intention der vorliegenden Arbeit: Es sollte der Effekt weiterer Cyclooxygenase (COX)-Inhibitoren auf die MRP4- Expression in megakaryoblastären Zellen charakterisiert und mit Blick auf die potenzielle Nutzung des Transporters als pharmakologische Zielstruktur der Einfluss einer selektiven MRP4-Hemmung auf die Thrombozytenaggregation untersucht werden.
In Bezug auf die MRP4-Regulation konnte im ersten Teil der Arbeit mittels rt-qPCR und Western Blots in der Zellkultur (M07-Zellen) eine Induktion der MRP4-Expression auf der mRNA- und Proteinebene um den Faktor 1,2 bis 2 durch verschiedene Substanzen (ASS, Natrium-Salicylat, Ibuprofen, Diclofenac, Indometacin, Celecoxib) nachgewiesen werden. Luciferase-Reportergenassays zeigten, dass die transkriptionelle Aktivierung des MRP4- Gens daran entscheidend beteiligt ist. Der Einfluss der COX-Inhibitoren wurde mithilfe von MRP4-Promotorkonstrukten verschiedener Länge in der proximalen Region des MRP4- Promotors zwischen den Positionen -69 und -34 vor dem Transkriptionsstartpunkt lokalisiert, sodass primär die Transkriptionsfaktoren c-Ets-1, Elk-1 und Sp1 als Vermittler des Induktionseffekts infrage kommen. In zusätzlichen Versuchen stellte sich die MRP4- Regulation als komplexes, substanz-, dosis- und kontextabhängiges Geschehen dar, das durch verschiedene Prostaglandine und deren Analoga (PGE2, PGE1/ Alprostadil, PGI2/ Ilomedin), H2O2 als oxidativen Stressor sowie die Antioxidanzien -Tocopherolsuccinat und Natriumascorbat moduliert wird.
MRP4 ist in Thrombozyten und Vorläuferzellen der megakaryozytären Linie hoch exprimiert. Eine Schwäche vorausgegangener Arbeiten zur Bedeutung des Transporters für die Thrombozytenaggregation lag in der Verwendung nicht-selektiver MRP4-Inhibitoren wie MK571, welches mehrere Transporter beeinflusst, oder Dipyridamol, das u.a. auch Phosphodiesterasen hemmt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Substanz Ceefourin-1 eingesetzt, der In-vitro-Transportversuche eine hohe Selektivität für MRP4 attestiert hatten. Zum Ausschluss MRP4-unabhängiger Effekte in Thrombozyten wurden lichttransmissionsaggregometrische Versuche mit plättchenreichem Plasma (PRP) von Wildtyp- und Mrp4-defizienten Mäusen durchgeführt, die keine signifikanten Zusatzeffekte der Substanz bei Abwesenheit von Mrp4 zeigten. Im PRP gesunder Blutspender reduzierte Ceefourin-1 die Aggregation um bis zu 35 %, wobei insbesondere die Kollagen- und ADP-induzierten Aktivierungswege gehemmt wurden. Auch in Mrp4-Knockout-Tieren war die Kollagen-induzierte Aggregation gegenüber dem Wildtyp auf etwa 70 % reduziert. Der schwächere Effekt auf die durch PAR1-aktivierendes Peptid, Arachidonsäure und den Thromboxanrezeptor-Agonisten U46619 ausgelöste Aggregation erreichte mit einer 10 - 15 %-igen Reduktion zum Teil nicht das statistische Signifikanzniveau. Bei intensiver Plättchenstimulation zeigte Ceefourin-1 eine Tendenz zur Verstärkung der ASS-induzierten Aggregationshemmung. Der MRP4-Inhibitor reduzierte außerdem die durchflusszytometrisch bestimmte Expression von P-Selectin an der Thrombozytenoberfläche als Marker der Plättchenaktivierung um bis zu 40 %.
In Summe zeigt die vorliegende Arbeit auf, dass die pharmakologische Hemmung von MRP4 ex vivo eine milde Thrombozytenaggregationshemmung erlaubt. Sie erscheint folglich als vielversprechende Option für die klinische Anwendung in Monotherapie oder ergänzend zu etablierten antiaggregatorischen Wirkprinzipien, auch mit Blick auf eine mögliche Plättchenhyperreagibilität und Thrombozyten-induzierte Inflammation. Dass COX-Inhibitoren durch die MRP4-Expressionssteigerung in Thrombozyten-Progenitoren die Ausbildung eines hyperreagiblen Plättchenphänotyps begünstigen können, ist im Zusammenhang mit der Erhöhung des kardiovaskulären Risikos durch die Substanzen und dem Phänomen der ASS-Resistenz von Interesse
Investigating the consequences of not performing a prepared action in a dual task
Get PDFDie gleichzeitige Ausführung zweier Aufgaben führt zu Dual-Task-Kosten. Eine Art von Dual-Task-Kosten, die aufgrund von Interaktionen bei der Verarbeitung zwischen den Aufgaben entsteht, wird als Crosstalk bezeichnet. Insbesondere dann, wenn die Merkmale von Aufgabe 2 die Verarbeitung von Aufgabe 1 beeinträchtigen, wird ein backward crosstalk effect (BCE) beobachtet. Eine dimensionale Überschneidung zwischen den Aufgaben führt zu einem kompatibilitätsbasiertem BCE, während eine Go/No-go-Charakteristik in Aufgabe 2 zu einem No-go BCE führt. Der kompatibilitätsbasierte BCE ist auf eine automatische Aktivierung der Reaktion auf Aufgabe 2 zurückzuführen, die die Reaktionsauswahl in Aufgabe 1 beeinträchtigt. Der No-go BCE hingegen ist auf das Übergreifen der Antwortinhibition von Aufgabe 2 auf Aufgabe 1 zurückzuführen.
In dieser Dissertation wurden die Mechanismen und die Anpassungsfähigkeit des weniger erforschten No-go BCE untersucht. Studie 1 untersuchte die affektiven Konsequenzen der Reaktionsinhibition auf den No-go BCE. Dafür wurden affektive Reize in Aufgabe 1 eingeführt. Die Ergebnisse zeigten einen starken Einfluss der negativen affektiven Konsequenzen von Aufgabe 2 auf die Verarbeitung von Aufgabe 1. Ein großer No-go BCE wurde beobachtet, wenn Aufgabe 1 positiv war; er blieb jedoch aus oder kehrte sich sogar um, wenn Aufgabe 1 negativ war. Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur die Reaktionsinhibition, sondern auch die jeweiligen affektiven Konsequenzen für den No-go BCE von zentraler Bedeutung sind, was auf unterschiedliche Interferenzmechanismen hinweist. Die zweite Studie untersuchte die Spezifität dieses Interferenzmechanismus, insbesondere in Gegenwart einer anderen Art des BCE. Hierfür wurde ein Dual-Task-Paradigma entwickelt, das sowohl den kompatibilitätsbasierten als auch den No-go BCE berücksichtigte. Eine starke dimensionale Überlappung und eine fortgeschrittene Vorbereitung auf Aufgabe 2 waren entscheidend für die Koexistenz beider BCEs. Darüber hinaus deuteten die Ergebnisse daraufhin, dass jeder BCE seine eigenen Interferenzverarbeitungsmechanismen in einer konfliktspezifischen Weise rekrutiert. Diese Ergebnisse grenzen den No-go BCE zusätzlich vom kompatibilitätsbasierten BCE ab und bestätigen die Rolle der Reaktionsinhibition und der fortgeschrittenen Vorbereitung auf Aufgabe 2 bei der Auslösung des No-go BCE.
Die folgenden beiden Studien untersuchten die Anpassungsfähigkeit dieser Mechanismen, die zu einer Leistungsoptimierung führen, indem für Crosstalk kontrolliert wurde. Studie 3 analysierte den Einfluss einer voraussichtlichen Belohnung auf den No-go BCE. Überraschenderweise wurde der No-go BCE nicht moduliert, obwohl die Teilnehmenden bei Belohnung schneller auf Aufgabe 1 und Aufgabe 2 reagierten. Darüber hinaus führte die Belohnung zu einer erhöhten Fehlerrate in Aufgabe 2. Diese Ergebnisse deuten auf ein komplexes Zusammenspiel von Reaktionsauslösung und Inhibition bei der Entstehung des No-go BCE hin. Selbst starke Motivatoren wie Belohnungen scheinen somit nicht immer geeignet, um Verhalten zu optimieren. Daher könnte es sich lohnen, andere Methoden, wie z. B. Neuromodulationstechniken, zwecks Verhaltensbeeinflussung zu untersuchen. In Studie 4 wurde ein solches Verfahren, die transkranielle Gleichstromstimulation (tDCS), eingesetzt, um die Dual-Task-Leistung zu optimieren, während für den BCE kontrolliert wurde. Da das derzeitige Verständnis des No-go BCE den Einsatz von tDCS nicht zulässt, wurde in der Studie der Einfluss von tDCS auf den kompatibilitätsbasierten BCE untersucht. Anodale tDCS am linken dorsolateralen präfrontalen Kortex (dlPFC) erhöhte die Abschirmung von Aufgabe 1, was zu einem geringeren kompatibilitätsbasierten BCE führte, insbesondere bei hoher zeitlicher Überlappung beider Aufgaben. Zur Kontrolle des No-go BCE ist eine anodale tDCS-Stimulation des rechten inferioren frontalen Gyrus geplant.
Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Auslösung der Reaktion zusammen mit der Inhibition eine wichtige Rolle bei der Steuerung des No-go BCE spielen. Folglich ist der zugrundeliegende Mechanismus dieses BCE recht einzigartig, was Auswirkungen auf seine Anpassungsfähigkeit und Verarbeitungsstrategien hat. Die Ergebnisse dieser Dissertation stellen zwei wichtige Aspekte des Mechanismus in Frage: die Lokalisation und den bisherigen Ansatz, der zur Erklärung des No-go BCE verwendet wird. Angeregt durch die vorliegenden Ergebnisse wird ein neuartiges Modell präsentiert, das eine dynamische Fluktuation von Reaktionsauslösung und -inhibition zur Erklärung des No-go BCE berücksichtigt. Schließlich erfordert die Einzigartigkeit des No-go BCE Vorsicht, wenn es um die Verallgemeinerung von Erkenntnissen über andere Arten des BCEs geht.Performing two tasks at the same time leads to dual-task costs. One kind of dual-task cost that arises due to processing interactions between the tasks is referred to as crosstalk. Specifically, when the characteristics of Task 2 interfere with the processing of Task 1, a backward crosstalk effect is observed (BCE). A dimensional overlap between the tasks leads to compatibility-based BCE, whereas a go/no-go in Task 2 leads to no-go BCE. The compatibility-based BCE is due to an automatic activation of Task 2 response interfering with Task 1 response selection. Whereas, no-go BCE is due to the spillover of response inhibition from Task 2 to Task 1.
This dissertation investigated the mechanisms and adaptability of the less explored no-go BCE. Study 1 examined the affective consequences of response inhibition on no-go BCE. To this end, affective stimuli were introduced in Task 1, and the results revealed a strong influence of Task 2 negative affective consequences on Task 1 processing. A large no-go BCE was observed when Task 1 was positive, which was absent or even inversed when Task 1 was negative. These findings show that not only response inhibition but also the respective affective consequences are central to no-go BCE, indicating distinct interference mechanisms. The second study investigated the specificity of this interference mechanism, particularly in the presence of another kind of BCE. For this, a dual-task paradigm was designed to accommodate compatibility-based and no-go BCE. A strong dimensional overlap and advanced Task 2 preparation were crucial for both BCEs to co-exist. Further, the results showed that each BCE recruited its own conflict processing mechanisms in a conflict-specific manner. These findings additionally dissociate no-go BCE from compatibility-based BCE and further confirm the role of response inhibition and advanced Task 2 preparation in triggering a no-go BCE.
The next two studies examined the adaptability of these mechanisms leading up to the prospect of performance optimization by controlling for crosstalk. For this, Study 3 investigated the influence of prospective reward on no-go BCE. Surprisingly, even though participants were faster in responding to Task 1 and Task 2 with reward, the no-go BCE was not modulated. In addition, reward also led to increased Task 2 commission errors. These results hint at a complex interplay of response initiation along with inhibition in triggering the no-go BCE. Thus, even potent motivators, such as rewards, are not always beneficial to optimize behavior. Therefore it could be worthwhile to explore other methods, such as neuromodulation techniques, to modulate behavior. Study 4 employed one such technique, transcranial direct current stimulation (tDCS), to optimize dual-task performance by controlling for BCE. Limitations in the current understanding of no-go BCE prevent tDCS implementation and therefore, the study investigated the influence of tDCS on compatibility-based BCE. Anodal tDCS on the left dorsolateral prefrontal cortex (dlPFC) upregulated Task 1 shielding resulting in a smaller compatibility-based BCE, especially at high temporal overlap between the tasks. To control for no-go BCE, anodal tDCS stimulation of the right inferior frontal gyrus is planned.
Taken together, these results reveal that response initiation along with inhibition plays an important role in driving the no-go BCE. Consequently, the underlying mechanism of this BCE is quite distinct, which has consequences on its adaptability and processing strategies. Furthermore, the results of this dissertation raise two important concerns regarding its mechanism: the locus and the simplistic approach employed towards explaining the no-go BCE. Inspired by the findings from this dissertation, a novel approach is introduced which accounts for a dynamic fluctuation of response initiation and inhibition to explain the no-go BCE. Thus, the unique stature of no-go BCE invites caution when generalizing findings from other kinds of BCEs and therefore requires special consideration
Untangling regional development traps through narratives
Get PDFBased on two case studies in Germany, this study disentangles development traps by focusing on the role of narratives and imaginaries in peripheral regions. Drawing on 43 interviews and two focus groups, it shows how regions move towards development traps despite putative new opportunities through green transitions. The study highlights different narrative dimensions and how they serve as indicators for regional development trajectories. It expands the understanding of development traps and peripheral regions by showing how stories and imaginaries held by key actors materialise and become regional realities and calls for more place sensitivity
Comparison of a Single Assessment Numeric Evaluation Method and the Banff Patella Instability Instrument 2.0 for Patients With Patellofemoral Instability
Get PDFBackground: The concept of Single Assessment Numeric Evaluation (SANE) has been introduced for several clinical entities; however, a validated SANE focusing on patients with patellofemoral instability has not been described. Purpose/Hypothesis: The purpose of this study was to investigate the expressiveness of SANE questions (SQs) for the assessment of patients experiencing patellofemoral instability. It was hypothesized that the complexity of patellofemoral instability cannot be demonstrated by a single question. Study Design: Cohort study (diagnosis); Level of evidence, 2. Methods: Between October 2022 and March 2023, 120 consecutive patients (male/female, 50/70; mean age, 23.9 ± 8.0 years; mean body mass index, 25.3 ± 5.1 kg/m2) with patellofemoral instability were assessed with the Banff Patella Instability Instrument 2.0 (BPII 2.0). Patients were randomized into 3 groups (40 patients each) and asked to answer 1 of 3 SQs: “How do you rate your knee joint if a completely stable kneecap means 100%?” (SQ 1), “How do you rate your knee joint if complete satisfaction means 100%?” (SQ 2), and “How do you rate your knee joint if complete normal function means 100%?” (SQ 3). Means ± standard deviations were compared using 1-way analysis of variance, the correlation between BPII 2.0 and each SQ was assessed by Pearson correlation, and Bland-Altmann analysis was performed to investigate biases of each SQ in comparison with BPII 2.0. Results: The mean BPII 2.0 score was 40.5 ± 16.8 points, and the mean results of SQ 1, SQ 2, and SQ 3 were 44.2% ± 26.0%, 42.6% ± 25.4%, and 44.2% ± 18.9%, respectively, without significant differences between the groups (all P .05). The correlations between BPII 2.0 and SQ 1, SQ 2, and SQ 3 were high ( r = 0.75; 95% CI, 0.58 to 0.86; P < .0001), low ( r = 0.35; 95% CI, –0.05 to 0.6; P = .02), and low ( r = 0.31; 95% CI, –0.002 to 0.56; P = .051), respectively. Bland-Altman analysis between BPII 2.0 and SQ 1, SQ 2, and SQ 3 revealed biases of −0.12 (SD, 17.1), –1.45 (SD, 24.4), and −8.0 (SD, 19.4), respectively. Conclusion: The SQ “How do you rate your knee joint if a completely stable kneecap means 100%?” demonstrated concurrent validity with the BPII 2.0 and may serve as a helpful tool to quickly assess patients with recurrent patellofemoral instability in a preoperative setting
Efficacy of 233 nm LED far UV-C-radiation against clinically relevant bacterial strains in the phase 2/ step 2 in vitro test on basis of EN 14561 and on an epidermis cell model
Get PDFIntroduction
Healthcare-acquired infections and overuse of antibiotics are a common problem. Rising emergence of antibiotic and antiseptic resistances requires new methods of microbial decontamination or decolonization as the use of far-UV-C radiation.
Methods
The microbicidal efficacy of UV-C radiation (222 nm, 233 nm, 254 nm) was determined in a quantitative carrier test and on 3D-epidermis models against Staphylococcus (S.) aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis, Klebsiella pneumoniae, and Pseudomonas aeruginosa. To mimic realistic conditions, sodium chloride solution, mucin, albumin, artificial saliva, artificial wound exudate and artificial sweat were used.
Results
In sodium chloride solution, irradiation with a dose of 40 mJ/cm2 (233 nm) was sufficient to achieve 5 lg reduction independent of bacteria genus or species. In artificial sweat, albumin and artificial wound exudate, a reduction >3 lg was reached for most of the bacteria. Mucin and artificial saliva decreased the reduction to <2 lg. On 3D epidermis models, reduction was lower than in the carrier test.
Conclusion
UV-C radiation at 233 nm was proven to be efficient in bacteria inactivation independent of genus or species thus being a promising candidate for clinical use in the presence of humans and on skin/mucosa
OCT-Telematik in der interdisziplinären medizinischen Diagnostik
Get PDFDie vorliegende Arbeit untersuchte die Anwendung von OCT-Telematik in der interdisziplinären Diagnostik. Hierzu wurden im Rahmen einer Querschnittsstudie stationäre Patienten auf den internistischen Stationen des Krankenhauses in Wolgast von April bis August 2014 als Probanden rekrutiert. Mit allen Teilnehmern wurde anhand eines standardisierten Bogens die Eigenanamnese erhoben. An beiden Augen wurde im Anschluss als nicht-invasives Bildgebungsverfahren ein Makula-OCT und ein zentrales Fundusfoto, ohne Notwendigkeit einer medikamentös induzierten Mydriasis, angefertigt und über einen gesicherten VPN-Tunnel an ein baugleiches Gerät in die Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde der Universitätsmedizin Greifswald versandt. Von 292 rekrutierten Teilnehmern wurden insgesamt 598 Datensätze erhoben; hiervon konnten 580 Makula-OCTs und 486 Fundusfotos hinsichtlich morphologischer Auffälligkeiten beurteilt sowie einer Diagnose aus einem definierten Spektrum zugeordnet werden. Die nicht beurteilbaren Datensätze (0,9% der Makula-OCTs und 16,9% der Fundusfotos) waren in Einzelfällen durch Systemfehler, in der überwiegenden Anzahl jedoch durch unzureichende Aufnahmequalität bedingt. Mögliche Gründe hierfür können die Erhebung der Befunde bei neutraler Pupille, eine erhöhte Rate an Trübungen der optischen Medien wie der Katarakt als auch die Aufnahmeerhebung durch nichtaugenärztliches Personal sein. Die Datensätze wurden im Jahr 2014 durch einen Studenten der Humanmedizin im sechsten Semester und im Jahr 2020 durch einen Assistenzarzt der Augenheilkunde im dritten Weiterbildungsjahr mit einjähriger Erfahrung in der retinologischen Sprechstunde ausgewertet. Zudem wurden alle Datensätze durch einen augenärztlichen Oberarzt in den Jahren 2020 und 2021 reevaluiert, um die medizinische Plausibilität der Befunderhebung zu überprüfen.
Es konnte gezeigt werden, dass sich die untersuchten Probanden in epidemiologischen Aspekten deutlich von der Durchschnittsbevölkerung unterschieden. Das Alter der untersuchten Teilnehmer lag im Durchschnitt 17 Jahre über dem der Gesamtbevölkerung im Jahr 2014. Die Studienteilnehmer zeigten im Gegensatz zu typischerweise stichprobenartig ermittelten Teilnehmern aus anderen populationsbasierten Studien neben dem höheren Alter auch erhöhte Prävalenzen für allgemeinmedizinsch-internistische Erkrankungsbilder. So fanden sich für Diabetes mellitus, Adipositas und arteriellem Hypertonus teils um ein Vielfaches höhere Prävalenzen im Vergleich zu großen epidemiologischen Studien.
Die häufigsten Auffälligkeiten der Makula-OCTs und Fundusfotos bezogen sich auf Veränderungen im Rahmen einer AMD und DRP. Ein deutlicher Anstieg der Prävalenz der AMD mit zunehmendem Alter war erkennbar. Die Häufigkeit AMD-typischer Veränderungen deckte sich mit denen aus epidemiologischen Studien, wobei ein direkter Vergleich durch unterschiedliche Untersuchungsverfahren und Zusammenstellung der untersuchten Teilnehmer nicht ohne weiteres auf anderen Studien übertragbar war. Ähnliches gilt für die festgestellten Veränderungen der DRP. Limitierend für die Interpretation der Befunde war das Vorliegen von jeweils nur einem Makula-OCT und einem zentralen Fundusfoto. Die in zahlreichen Studien parallel eingesetzten Untersuchungsmodalitäten wie Weitwinkelaufnahmen in Miosis, Aufnahmen nach dem ETDRS-Schema in sieben Feldern in medikamentöser Mydriasis oder eine Spaltlampenuntersuchung in medikamentöser Mydriasis durch einen Augenarzt zur Validierung sind an den Teilnehmern der Wolgaster Querschnittsstudie nicht erfolgt. Viele Aspekte sprechen dafür, dass die Prävalenzen der festgestellten Veränderungen durch Hinzunahme weiterer Untersuchungstechniken höher liegen könnten. Von den Fachgesellschaften und vielen Studien wird daher aus nachvollziehbaren Beweggründen eine alleinige Befundung der bildgebenden Verfahren nicht als Ersatz für eine augenärztliche Untersuchung unter Einhaltung des Facharztstandards empfohlen. Hier bietet sich Potenzial für weitere Forschung, um kosteneffektiv, patientenfreundlich und sicher medizinische Befunde erheben und einordnen zu können.
Interessant ist die Fragestellung, wer im Rahmen eines derartigen telemedizinischen Konzeptes die medizinischen Befunde auswertet. In der Befundung der erhobenen Datensätze der vorliegenden Studie konnte kein signifikanter Unterschied zwischen der Diagnostik durch einen Assistenzarzt im dritten Weiterbildungsjahr und einem Oberarzt mit langjähriger Berufserfahrung ermittelt werden. In vielen Studien ist nur unzureichend formuliert und ersichtlich, welche Voraussetzungen die befundenden Personen erfüllen müssen, um eine ausreichend hohe Validität zu erbringen. In Anbetracht der Ressourcenknappheit – insbesondere der personellen Ressourcen – stellt sich daher die Frage, ob eingearbeitetes assistenzärztliches Personal diesen Anforderungen gerecht werden kann. Die Etablierung telemedizinischer ophthalmologischer Standards und transparenter vollumfänglicher Rahmenbedingungen für denjenigen, der telemedizinische Leistungen anbietet, sind sowohl von den Fachgesellschaften als auch dem Gesetzgeber notwendig, um Patientensicherheit und haftungsrechtliche Aspekte für den jeweiligen Augenarzt zu gewährleisten
Charakterisierung von Membranvesikeln aus Gram-negativen und Gram-positiven pathogenen Bakterien
Get PDFBakterielle Pathogene können in ihren Wirten Infektionen auslösen, die gesundheitsgefährdend sind oder sogar zum Tod führen können. Zu diesen Pathogenen zählen auch das Gram-negative Bakterium Aeromonas salmonicida (A. salmonicida) und die Gram-positiven Bakterien Renibacterium salmoninarum (R. salmoninarum) und Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae). Während R. salmoninarum und A. salmonicida Fischpathogene sind, die in Salmoniden die bakterielle Nierenkrankheit (bacterial kidney disease) (BKD) (R. salmoninarum) bzw. die Fischfurunkulose (A. salmonicida) auslösen können, ist S. pneumoniae ein humaner Pathogen, der den oberen Atemwegstrakt und andere Gewebe kolonisieren und Krankheiten wie Sepsis, Meningitidis und Pneumonie auslösen kann. Gegen alle diese Pathogene existieren Vakzin-Strategien bestehend aus Kapselpolysacchariden oder inaktivierten Bakterien, um einer Infektion und deren Folgen vorzubeugen. Allerdings wirken diese Vakzine oft nur gegen bestimmte Serotypen (S. pneumoniae) oder sind mit hohem Stress und Nebenwirkungen für den Wirt verbunden (A. salmonicida, R. salmoninarum). Aus diesem Grund wird aktiv an alternativen Strategien zur Vakzinierung geforscht. Eine mögliche Route sind bakterielle Membranvesikel (MV), die sich von der bakteriellen Oberfläche Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien abschnüren und viele potenziell immunogene Proteine auf ihrer Oberfläche tragen.
In dieser Arbeit wurde das Proteinrepertoire der bakteriellen MV von R. salmoninarum, A. salmonicida und S. pneumoniae mittels Massenspektrometrie untersucht. In der aufgereinigten MV Fraktion von R. salmoninarum wurden die immunsupprimierenden Proteine P57/Msa und P22, die wichtige Virulenzfaktoren von R. salmoninarum sind, in hoher Abundanz detektiert. Weiterhin wurden neues Lipoprotein C/Protein von 60 kDa (NlpC/P60) Hydrolasen und weitere Zellwand-modifizierende Proteine in der MV Fraktion gefunden, was einen Hinweis darauf darstellen könnte, dass diese Proteinklasse eine Relevanz bei der Entstehung von MV in Gram-positiven Bakterien hat. Bei der Untersuchung der MV von A. salmonicida wurde analysiert, inwieweit sich das MV Proteinrepertoire durch Kultivierungsbedingungen beeinflussen lässt. Die MV, die unter Bedingungen mit geringer Eisenverfügbarkeit aufgereinigt wurden, hatten eine ähnliche Größe und Konzentration im Vergleich zu der Kontrollbedingung. Allerdings wurden zahlreiche Proteine in der MV Fraktion detektiert, die bei geringer Eisenverfügbarkeit signifikant in ihrer Abundanz erhöht waren. Hierzu zählten vor allem TonB-abhängige Eisen- und Siderophoretransporter, aber auch Hemolysin und Lipasen. Eine erhöhte Kultivierungstemperatur resultierte in einer geringeren Vesikelkonzentration verglichen mit der Kontrollbedingung. Allerdings führte die erhöhte Kultivierungstemperatur zu einer signifikant gesteigerten Hemolysin Abundanz. Bei der Kultivierung von A. salmonicida mit dem Antibiotika Florfenicol waren die MV in ihrer Größe deutlich verringert. Weiterhin wurden viele ribosomale Proteine in der MV Fraktion gefunden, was auf bakterielle Lyse hinweisen könnte. Der Vergleich zwischen dem Erntezeitpunkt der MV in der stationären Wachstumsphase und der Sterbephase von S. pneumoniae zeigte, dass Vesikel aus der Sterbephase im Durchschnitt leicht vergrößert und in der Konzentration 10-fach erhöht waren. Zusätzlich war Autolysin in den MV, die in der Sterbephase geerntet wurden, signifikant in der Abundanz erhöht.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass sich das Proteinrepertoire der MV durch Faktoren wie die Wachstumsphase oder Kultivierungsbedingungen drastisch beeinflussen lässt. Es wurden putativ immunogene Proteine (Eisentransporter, Lipoproteine) in den MV aller untersuchten Pathogenen gefunden, was das Potenzial der MV als Vakzin-Plattform zeigt. Besonders eine Kultivierung bei Bedingungen mit geringer Eisenverfügbarkeit könnte durch die hohe Anzahl an Eisen-regulierten Membranproteinen bei einer Vakzinentwicklung von Vorteil sein.Bacterial pathogens can trigger infections in their hosts that can be harmful to health
or even lead to death. These pathogens include the Gram-negative bacterium
A. salmonicida and the Gram-positive bacteria R. salmoninarum and S. pneumoniae.
While R. salmoninarum and A. salmonicida are fish pathogens that cause the
bacterial kidney disease (R. salmoninarum) or furunculosis (A. salmonicida) in salmonids,
S. pneumoniae can cause infections in the upper respiratory tract and other
tissues of humans which can lead to sepsis, meningitidis and pneumonia. There are
vaccination strategies based on polysaccharide of the capsule or inactivated bacteria
to prevent an infections and its consequences. However, these vaccines are often only
effective against certain serotypes (S. pneumoniae) or are associated with high stress
and side effects for the host (A. salmonicida, R. salmoninarum). Because of these limitations,
there are ongoing efforts to find alternative vaccination routes. One possible
approach are bacterial MV which detach from the bacterial surface of Gram-positive
and Gram-negative bacteria and carry many potentially immunogenic proteins on
their surface.
In this work, the protein repertoire of the bacterial MVs of R. salmoninarum, A. salmonicida
and S. pneumoniae were analyzed by mass spectrometry. In the enriched
MV fraction of R. salmoninarum the immunosuppressive proteins P57/Msa and P22,
which are important virulence factors of the bacterium, were detected with high abundace.
Further, NlpC/P60 hydrolases and other cell-wall modifying proteins were found
in the MV fraction, indicating that this protein class may be of importance during the
biogenesis of MV in Gram-positive bacteria. The analysis of the MV of A. salmonicida
harvested during different cultivation conditions revealed that cultivation in an environment with low iron availability resulted in MV that have a comparable size and
concentration to the control condition. However, quantitative analysis of the proteins
identified in the MV of A. salmonicida showed that several proteins where significantly
increased in their abundance. These proteins were mainly TonB-dependent ironand
siderophore transporters, but also hemolysin and lipases were upregulated. An
increased cultivation temperature lead to a lower MV concentration compared to the
control condition. Hemolysin was also signficantly upregulated when the bacterium
was cultivated with an increased temperature. When A. salmonicida was cultivated
with the antibiotic florfenicol, the MV size was reduced drastically. Further, many
ribosomal proteins were identified in the MV fraction indicating bacterial lysis. The
comparison between the stationary growth phase and the death phase of S. pneumoniae
revealed that vesicles harvested during the death-phase were slightly increased
in size and their concentration was increased 10-fold. Additionally, autolysin was significantly
increased in its abundance in MV harvest during the death phase.
Taken together, this work emphasized how the MV protein repertoire is changing
with external conditions like the growth phase and other cultivation conditions like
iron availability, temperature and presence of an antibiotic. Several putative immunogenic
proteins (iron transporters, lipoproteins) were found in the MV of all examined
pathogens, showing the potential of bacterial MV as a vaccine platform. Especially
the cultivation in iron-limiting conditions may be beneficial for further vaccine
development efforts due to the high number of iron regulated membrane proteins
Impact of gadolinium-based MRI contrast agent and local anesthetics co-administration on chondrogenic gadolinium uptake and cytotoxicity
Get PDFThe gadolinium-based contrast agent DOTA-Gd is clinically used in combination with local anesthetics for direct magnetic resonance arthrography. It remains unclear whether gadolinium uptake into cartilage is influenced by co-administration of bupivacaine or ropivacaine and whether DOTA-Gd alters their chondrotoxicity. Gadolinium quantification of chondrogenic spheroids revealed enhanced gadolinium uptake after simultaneous exposure to local anesthetics. Analyses of the spatial gadolinium distribution using synchrotron X-ray-fluorescence scanning indicates gadolinium exposed chondrocytes. In vitro exposure to DOTA-Gd does not alter viability and proliferation of human chondrocytes and the chondrotoxic potential of the anesthetics. Reduced viability induced by ropivacaine was found to be reversible, while exposure to bupivacaine leads to irreversible cell death. Our data suggest that ropivacaine is more tolerable than bupivacaine and that DOTA-Gd exposure does not alter the cytotoxicity of both anesthetics. Enhanced gadolinium uptake into cartilage due to co-administration of anesthetics should find attention
Functional Analysis of SusD-like Glycan Binding Proteins Involved in Marine Polysaccharide Utilization
Get PDFKnowing that oceans display a highly diffusive environment, saccharide uptake and processing as a source of energy plays a crucial role for marine Bacteroidetes. However, the specificity of their sugar processing proteins is largely unexplored and seems to be highly diverse among distinct saccharide uptake systems (Sus). In this work, we investigated the ligand preference of selected binding proteins to shed light on substrate specificity and help to understand adaptions towards distinct algal sugars. Using affinity gel electrophoresis (AGE) and microscale thermophoresis (MST), we found that so-called SusD-like proteins from distinct types of polysaccharide utilization loci (PUL) have different specificities towards poly- and oligomeric laminarins. Furthermore, mutagenesis studies attributed specificities of GMSusD towards distinct polysaccharides to key residues. Moreover, we optimized different methods to express genes encoding these peripheral membrane proteins and analyse their binding specificity. In addition, putative xylan-binding SusD-like proteins encoded in two distinct Flavimarina sp. PULs were investigated.Vor dem Hintergrund einer höchst diffusen Umgebung in Ozeanen spielt die Saccharidaufnahme und -verwertung eine entscheidende Rolle als Energiequelle in marinen Bacteroideten. Die Substratspezifität ihrer zuckerverwertenden Proteine ist jedoch weitesgehend unerforscht und scheint bei verschiedenen saccharid-verwertenden Systemen (engl.: saccharide uptake system, Sus) stark unterschiedlich zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit untersuchten wir die Ligandenpräferenz ausgewählter Bindeproteine mariner Bacteroideten, um Schlussfolgerungen auf die Substratspezifität und Anpassungen an verschiedenartige Saccharide aus Algen zu ziehen. Mithilfe von Affinitätsgelelektrophorese (engl.: affinity gel electrophoresis, AGE) und Mikroskaliger Thermophorese (engl: microscale thermophoresis, MST) konnte gezeigt werden, dass sogenannte SusDähnliche Proteine aus verschiedenen Typen von Polysaccharidverwertungsloci (engl: polysaccharide utilization loci, PUL) unterschiedliche Spezifitäten gegenüber poly- und oligomeren Laminarinen besitzen. Zusätzliche Mutagenesestudien konnten Spezifitäten von GMSusD gegenüber bestimmten Polysacchariden auf Schlüsselreste zurückführen. Zuvor wurden verschiedene Analysemethoden für diese peripheren Membranproteine und Expressionsansätze ihrer Gene getestet und optimiert. Darüber hinaus wurden vermutlich xylan-bindende SusD-ähnliche Proteine zweier PULs aus Flavimarina sp. untersucht
Kaudruckableitung an ersten permanenten Molaren: Methodenvergleich der Finite Elemente-Methode (FEM) versus konventionellen Drucksensoren (Dehnungsmessstreifen)
Get PDFAufgrund der steigenden Prävalenz der Molaren-Inzisiven-Hypomineralisation,
nehmen die Relevanz an Prävention und Therapieentscheidung ebenfalls zu. Die
Forschung am ersten permanenten Molar bekam somit stätig eine größere Bedeutung.
Nach Extraktion des 6-Jahr-Molars erfolgt in der Regel der Lückenschluss über den 12
Jahr-Molar. Da allerdings der 6-Jahr-Molar in der Kauableitung eine entscheidende
Rolle spielt, stellt sich die Frage, ob es Veränderungen in der Kauableitung gibt. Zur
Beurteilung der Kauableitung wird zunehmend die Finite Elemente-Methode
durchgeführt. Dennoch fehlt in vielen Publikationen der Bezug zur konventionellen
Kraftmessung, beispielsweise über Dehnungsmessstreifen.
Die Frage, welche in der vorliegenden Studie gestellt wurde, ist, ob die konventionelle
Kraftmessung und die Finite Elemente-Methode (FEM) vergleichbare Ergebnisse
erzielen und somit lediglich eine FEM für die Aussagekraft einer Studie angewendet
werden kann.
Gegenstand der Untersuchungen war ein anatomisches Modell eines humanen Schädels.
Dieser wurde zur konventionellen Messung in einer Halteapparatur fixiert und mit
einem manuellen Kraftmessgerät belastet. Die sechs Dehnungsmessstreifen wurden
entlang der Kaudruckpfeiler platziert. Dieser Versuchsaufbau wurde in einer FEM
Software reproduziert, wobei ein CT-Scan des Modells die Grundlage bildet.
Mit vorliegenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Force Sensing
Resistoren ungeeignet für die Messungen von Kraftableitungen sind. Im Vergleich dazu
zeigten Dehnungsmessstreifen eine sehr gute Reliabilität (ICC 0,938) auf. Es wurde
festgestellt, dass die Messungen mit Dehnungsmessstreifen und der Finite Elemente
Methode vergleichbare Ergebnisse lieferten. Anhand des Korrelationskoeffizienten
nach Pearson von über 0,80 zeigten vier Messpunkte einen starken Zusammenhang.
Lediglich zwei Messpunkte wiesen mit Werten von 0,70 und 0,73 nur einen moderaten
Zusammenhang auf. Aus den vorliegenden Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass
eine Finite Elemente-Methode ebenfalls ohne konventionelle Kraftmessung
aussagekräftig ist. Diese Methode kann in weiteren Studien effizient genutzt werden,
um beispielsweise die Kauableitung oder die funktionelle Wirkung von
kieferorthopädischen Apparaturen zu untersuchen