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Point-of-Care Procalcitonin-Messungen im Vergleich zur Standardlabormethode im Rahmen der Sepsisdiagnostik
Full text linkEs zeigt sich eine höhere Varianz in den Doppelbestimmungen für die patientennahe Diagnostik und einen höheren Variationskoeffizienten für die Messung in den hergestellten Konzentrationen.
Die Sepsis Diagnostik stützt sich entsprechend der verschiedenen Diagnosekriterien nicht nur auf einen einzigen Laborparameter oder Score und sollte immer im klinischen Zusammenhang betrachtet werden. Als ergänzendes Tool v.a. im ambulanten Setting oder zur Identifizierung von Hochrisiko-Patienten kann das untersuchte POCT-Gerät durchaus Verwendung finden. Das Gerät kann beispielsweise in der Notaufnahme oder in ambulanten Praxen verwendet werden. Besonders in Ländern, in denen kein direkter Kontakt zu einem Zentrallabor besteht, spielen schnell verfügbare Ergebnisse eine wichtige Rolle. Für Therapiemonitoring und Eskalation oder Deeskalation sollte im Rahmen der Sepsisdiagnostik die Standardlabormethode weiterhin verwendet werden.
Es erfolgt eine stetige Weiterentwicklung von medizinischen Geräten, neben den in dieser Arbeit untersuchten POCT-Geräten gibt es auch Geräte von anderen Herstellern, die alle einer fortlaufenden Verbesserung unterzogen werden. Das verwendete Gerät von Samsung wird aktuell unter diesem Namen nicht mehr verwendet.
Die in dieser Arbeit erhobenen Daten der Untersuchungen zeigen ebenfalls die Komplexität und Schwächen von neuen Geräten und Verfahren und deren Etablierung im klinischen Alltag auf. Die Standardlabormethode kann bisher nicht durch das POCT-Gerät von Samsung ersetzt werden, aufgrund der Unterschiede in der Impräzision und resultierenden Unsicherheiten in der Varianz.
Signifikante Unterschiede zwischen ADVIA und LABGEO IB10 konnten nicht aufgezeigt werden, sodass unter kritischer Beurteilung der Indikation für ein POCT-Gerät beide Messmethoden in der Klinik Verwendung finden können.
Weitere prospektive Studien zur Verwendung von POCT- Geräten im Zusammenhang mit der Sepsis-Diagnostik und Therapie sind notwendig
Interaktion zwischen Thrombozyten und verschiedenen Streptococcus pneumoniae Stämmen
Full text linkIn dieser Promotion wurde die Interaktion zwischen Thrombozyten und verschiedenen Streptococcus pneumoniae Stämmen untersucht. Ein besonderes Augenmerk wurde auf die Bedeutung des Pneumolysin gelegt, welches einen bedeutenden Virulenzfaktor der Pneumokokken darstellt. Es wurden vier verschiedene Pneumokokkenstämme untersucht, welche in vivo unterschiedlich häufig invasive Erkrankungen auslösen.
Im Einklang mit der Literatur bestätigt diese Arbeit, dass eine Inkubation von Thrombozyten mit Wildtyp-Pneumokokken zu einer erhöhten Anfärbbarkeit von CD62-P sowie einem Verlust der Reagibilität auf TRAP6 führt. Zugleich wurde durch die Inkubation mit pneumolysindefizienten Mutanten gezeigt, dass dieser Effekt ohne Pneumolysin nicht auftritt. Anschließend wurde durch Pneumolysinantikörper aus Mäusen und Kaninchen sowie durch humane IgG Präparate gezeigt, dass durch Zugabe von Antikörpern ein Schutz der Thrombozyten vor dem Funktionsverlust möglich ist.
Außerdem führt die Inkubation mit Wildtyppneumokokken zu einer Abnahme der Thrombozytenkonzentration. Auch diesem Effekt konnte durch die Zugabe von humanem IgG entgegengewirkt werden.
Beim Einfluss der Thrombozyten auf das Wachstum von Pneumokokken zeigte sich ein heterogenes Bild. Es konnte für den untersuchten Stamm TIGR 4 sowie die pneumolysindefiziente Mutante TIGR4ply ein wachstumshemmender Effekt der Inkubation mit Thrombozyten nachgewiesen werden. Eine genaue Eingrenzung der verantwortlichen Substanz aus den Thrombozyten war nicht möglich. Es wurde jedoch gezeigt, dass es sich um einen hitzeempfindlichen Stoff mit einer Größe von >10 kDa handeln muss.
Diese Arbeit liefert einen weiteren Baustein in der Betrachtung der Interaktion zwischen dem Menschen und Pneumokokken als weit verbreitetem Pathogen. Um die genaue Rolle der Thrombozyten in der Interaktion zu verstehen, sind jedoch noch weitere Untersuchungen notwendig, welche beispielsweise die Interaktion zwischen Thrombozyten und anderen Immunzellen in die Betrachtung einbeziehen. Zugleich liefert die Arbeit weitere Hinweise zur besonderen Bedeutung von Pneumolysin als Serotyp unabhängigem Virulenzfaktor, welcher somit insbesondere für die Entwicklung von Impfstoffen interessant ist
MRT-basierte Normwerte der Akromion- und Klavikula-Anatomie einer gesunden Normalpopulation (Study of Health in Pomerania)
Full text linkSchulterbeschwerden sind ein weit verbreitetes Problem, das oft mit Pathologien wie dem subakromialen Impingement oder Läsionen der Rotatorenmanschette assoziiert ist. Die Rolle des Akromions bei diesen Symptomen bleibt Gegenstand von Diskussionen. Referenzwerte und Klassifikationen bestehen traditionell anhand von Röntgenbildern, wobei das wegweisende Diagnostikum mittlerweile regelhaft das MRT ist.
Diese Dissertation basiert auf zwei Publikationen unserer Arbeitsgruppe, welche mittels retrospektiven Datenanalysen standardisierte Referenzwerte für gängige Akromion- bzw. Klavikula-Dimensionen auf Basis von Ganzkörper-MRTs einer großen und gesunden Population etablieren. Zusätzlich wurden mögliche Korrelationen zwischen der Akromion- bzw. Klaviukulaanatomie und Einflussfaktoren wie Geschlecht, Alter, BMI, dominante Hand und anamnestisch angegebenen Schulterschmerzen untersucht. Im Rahmen der prospektiven, bevölkerungsbasierten "Study of Health in Pomerania" wurden 3371 Ganzkörper-Magnetresonanztomografien (1,5 Tesla) retrospektiv ausgewertet.
Diese Studien liefern erstmals wertvolle Referenzwerte für die MRT bezogen auf häufig verwendete Parameter der Akromion- bzw. Klavikula- und Sternoklavikulargelenk-Anatomie, beschrieben anhand einer großen und gesunden Population. Die Werte hinsichtlich des Akromions zeigen keine signifikanten Korrelationen hinsichtlich des Geschlechts, des Alters, BMI oder der dominanten Hand, was ihre klinische Anwendbarkeit vereinfacht. Im Gegensatz dazu zeigt die Klavikula-Anatomie interessanterweise – trotz unmittelbarer anatomischer Nähe zum Akromion – wesentliche geschlechtsspezifische Unterschiede.
Die Ergebnisse beider Studien tragen zum Verständnis der normalen Anatomie des Akromions sowie der Klavikula bei und bieten eine solide Grundlage für zukünftige Forschungsarbeiten in diesem Bereich. Sie verdeutlichen auch, dass trotz unterschiedlicher Korrelationen ein integrativer Ansatz notwendig ist, um ein umfassendes Verständnis der komplexen Schultergürtelanatomie zu erlangen.
Zukünftige prospektive Untersuchungen sind erforderlich, um bspw. mögliche Zusammenhänge zwischen der Morphologie des Akromions und der Inzidenz von Verletzungen der Rotatorenmanschette näher zu erforschen sowie den Einfluss anthropometrischer Parameter auf die Klavikula-Anatomie weiter zu untersuchen und deren Bedeutung in den klinischen Alltag zu integrieren
Todesnarrative
Full text linkDer Tod ist eine anthropologische Konstante; er prägt die Menschheit seit Anbeginn. Der interdisziplinäre Band widmet sich den historischen Differenzen des gesellschaftlichen Umgangs mit dem Phänomen Tod. Literarische und bildliche Darstellungen, Artefakte sowie historische Quellen bieten Einblicke in narrative Inszenierungen des Sterbens und deren Interpretationsansätze. Dabei wird die Frage, was einen guten bzw. schlechten Tod jeweils ausmacht, exemplarisch mit einem historischen Längsschnitt beantwortet. Die Einzelanalysen fokussieren den kulturhistorischen Wandel von Todes- und Sterbenarrativen einschließlich ihrer heutigen Rolle in Literatur, Kunst und Realität
Leukotriene biosynthesis influenced by natural compounds and pathogenic fungi
Full text linkDurch die enzymatische Oxidation von ungesättigten Fettsäuren entstehen intrinsische Botenstoffe, welche eine Vielzahl von para- und endokrinen Wirkungen vermitteln. Sie können weitläufig unter dem Begriff Lipidmediatoren (LM) zusammengefasst werden. Die Enzyme 5-Lipoxygenase (5-LOX) und Cyclooxygenase-1/2 (COX-1/2) verstoffwechseln die ungesättigte C20:4 Fettsäure Arachidonsäure (AA) vorranging zu den LM Leukotrienen (LT) und Prostaglandinen (PGs). Als AA-Derivate werden diese der Gruppe der Eikosanoide zugeordnet und sind in zahlreiche inflammatorische Erkrankungen involviert. Während PGs mit pro- und antiinflammatorischen Wirkungen assoziiert werden, sind LT hauptsächlich im Verlauf von proentzündlichen Prozessen relevant.
Die Bildung von LM, insbesondere die LT-Biosynthese, ist das Ergebnis eines fein justierten Zusammenspiels zahlreicher Proteine und Enzyme, die durch Umwelteinflüsse wie beispielsweise Ernährung oder eine Infektion mit Pathogenen beeinflusst werden können
Behandlung von Ewings- und Chondrosarkoma mit Chemotherapeutika und kaltem atmosphärischem Plasma als neues Therapieverfahren
Full text linkEwing-Sarkome (ES) sind seltene, aggressive Tumore, die Knochen und Weichteile betreffen und vor allem bei Kindern und Jugendlichen auftreten. Ihre Prognose hängt von Metastasen bei Diagnose, Tumorvolumen, Lokalisation und Histologie ab. Durch adjuvante Chemotherapie, die seit den 1970er Jahren eingesetzt wird, stieg die 5-Jahres-Überlebensrate bei lokalisierten Tumoren auf 70%, während sie bei metastasierten Tumoren unter 30% bleibt. Es gibt keine weltweit standardisierten Therapieprotokolle; Patienten werden oft in Studien mit intensiver Chemotherapie behandelt, die schwere Nebenwirkungen haben kann.
Chondrosarkome (CS) sind die zweithäufigsten bösartigen Knochentumore bei Erwachsenen. Die Prognose variiert stark je nach Tumorgrad, wobei metastasierte CS besonders schwer zu behandeln sind. Dies liegt an ihrer Resistenz gegen klassische Chemo- und Strahlentherapie. Die chirurgische Resektion ist die Haupttherapie, jedoch bei großen oder ungünstig gelegenen Tumoren besonders anspruchsvoll.
Kaltes atmosphärisches Plasma (CAP) bietet eine innovative und vielversprechende Methode zur Behandlung von Krebserkrankungen. Mehrere Studien haben die wachstumshemmende und apoptotische Wirkung von CAP auf verschiedene Malignome nachgewiesen. Diese Wirkung wurde auch auf die Zellen von Ewing- und Chondrosarkomen untersucht. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Untersuchung der Wirkung einer Kombinationstherapie mit CAP und klassischen Chemotherapeutika auf ES- und CS-Zellen.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Kombination von CAP mit klassischen Chemotherapeutika eine stärkere Hemmung der Zellproliferation bei Ewing- und Chondrosarkom Zellen bewirkt als die alleinige Anwendung von Chemotherapeutika. Zudem konnten wir demonstrieren, dass die Kombinationstherapie zu einer signifikanten Reduktion der Zellviabilität und Überlebensfähigkeit der ES- und CS-Zellen führt.
Diese in-vitro-Daten deuten darauf hin, dass die Kombinationstherapie die ES- und CS-Zellen empfindlicher gegenüber Zytostatika macht und deren Wirksamkeit verstärkt. Dies könnte zu verbesserten Behandlungsergebnissen führen, die Nebenwirkungen reduzieren und die bestehenden Therapieoptionen ergänzen
Effekte einer Doxorubicin-Behandlung in H9c2-Zellen nach Renin-Knockdown
Full text linkKrebserkrankungen sind in Deutschland immer noch eine der häufigsten Todesursachen. Das Chemotherapeutikum Doxorubicin kommt im Rahmen der Krebstherapie zum Einsatz, ist jedoch mit bedeutender Nebenwirkung kardiotoxisch. Gleichzeitig werden dem Renin-b, einer verkürzten Transkriptvariante des Renins, welches ursprünglich im Renin-Angiotensinogen-System seine Wirkung zeigt, kardioprotektive Eigenschaften zugesagt. Diesbezüglich galt es näher zu erforschen, ob das endogen wirkende Renin-b, welches in Herzzellen exprimiert und in diesen verbleibt, zum protektiven Einsatz in der Krebstherapie mit Doxorubicin herangezogen werden kann. Die Ergebnisse meiner Arbeit unterstützen die toxische Wirkung von Doxorubicin an Herzzellen auf funktioneller und apoptotischer Ebene, können aber einen veränderten Effekt durch den vorab durchgeführten Renin-Knockdown weder ausschließen noch bestätigen.Cancer remains one of the most common causes of death in Germany. The chemotherapeutic agent Doxorubicin is used as part of cancer therapy but is cardiotoxic with significant side effects. At the same time, renin-b, a shortened transcript variant of renin which originally exerts its effect in the renin-angiotensin system, is attributed with cardioprotective properties. In this context, it was important to investigate whether endogenously acting renin-b, which is expressed in heart cells and remains in them, can be used for protective purposes in cancer therapy with doxorubicin. The results of my work support the toxic effect of doxorubicin on heart cells at a functional and apoptotic level but neither exclude nor confirm a modified effect due to the previously performed renin knockdown
Krankheitsverlauf und Risikofaktoren für einen Krankenhausaufenthalt bei ambulanten Patienten mit einer SARS-CoV-2-Infektion
Full text linkIn dieser Studie wurden die Daten von 710 mit SARS-CoV-2 infizierten Personen in Bezug auf Vorerkrankung und Medikation zu den Symptomen ihrer SARS-CoV-2-Infektion über einen Beobachtungszeitraum von 25 Tagen und eines möglichen Krankenhausaufenthaltes analysiert. Die Erfassung der Daten erfolgte von Mai 2020 bis zum Februar 2021 mittels zweier per Post verschickter papierbasierter Fragebögen. Die Studie stellt dar, dass unspezifische Krankheitssymptome wie Müdigkeit, Kopfschmerzen, Muskel- und Gliederschmerzen sehr häufig bei einer Infektion mit SARS-CoV-2 sind.
Über die Beobachtungszeit von 25 Tagen zeigten sich zwei unterschiedliche Muster von Symptomverläufen. Zum einen berichteten die Teilnehmenden über die Symptome Müdigkeit, Kopfschmerzen, Fieber, Halsschmerzen, Muskel- und Gliederschmerzen sowie trockenen Husten am häufigsten innerhalb der ersten drei Tage. Danach nahm die tägliche Prävalenz ab. Zum anderen zeigen Geruchsverlust und Geschmacksverlust einen stetigen Anstieg der Häufigkeit und erreichen den Höhepunkt an Tag sieben bis neun.
Dyspnoe, Erbrechen sowie Behinderungen im Allgemeinen waren signifikante prädiktive Marker für ein erhöhtes Risiko eines Krankenhausaufenthaltes. Zudem hatten Patienten mit Geschmacksverlust ohne Geruchsverlust das höchste Risiko für eine Krankenhausaufnahme (OR 6.8, 95% CI 2.5–18.1).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Geruchsverlust und Geschmacksverlust aufgrund ihres verspäteten Auftretens nur eine begrenzte Rolle in der frühen Differentialdiagnostik der Krankheit spielen. Eine differenzierte Betrachtung dieser zwei Symptome kann jedoch als Prädiktor für den Schweregrad des Krankheitsverlaufes dienen
Adulte Herzratenvariabilität und Misshandlung in der Kindheit: Eine populationsbasierte Beobachtungsstudie
Full text linkMisshandlung in der Kindheit kann schwerwiegende psychologische und physiologische
Folgen für die gesamte Lebensspanne haben. In dieser bevölkerungsbasierten Studie wurden
die langfristigen Auswirkungen von Kindesmisshandlung auf die Regulierung des autonomen
Nervensystems (ANS) bei Erwachsenen untersucht. Die Teilnehmer waren 3438 Einwohner
Nordostdeutschlands (M = 49.7 Jahre, SD = 14.8; 1882 Frauen und 1556 Männer) aus der
TREND-0-Kohorte der Study of Health in Pomerania (SHIP). Die Regulierung des ANS
wurde anhand der Herzratenvariabilität (HRV) gemessen, während Kindesmisshandlung
retrospektiv mithilfe des Childhood Trauma Questionnaire (CTQ) erfasst wurde. Die
Probanden nahmen an weiteren Interviews und Untersuchungen teil, um Faktoren wie Alter,
Geschlecht, Medikation, Gewicht, Lebensstil, sozioökonomische Umstände und aktuelle
depressive Symptome zu berücksichtigen. Die HRV (logRMSSD) wurde aus
Elektrokardiografie-Aufzeichnungen abgeleitet und mit Skalen des CTQ sowie den genannten
Faktoren analysiert. Es waren negative statistische Assoziationen zwischen
Kindesmisshandlung und der HRV zu beobachten, die hauptsächlich auf Vernachlässigung
zurückzuführen waren. Weiterhin wurde eine altersabhängige Minderung der HRV bei
Teilnehmern festgestellt, die sich einer Polysomnografie (PSG) unterzogen. Die Ergebnisse
stützen die Annahme, dass Kindesmisshandlung auch Jahrzehnte später noch einen negativen
Einfluss auf das ANS haben kann.Childhood maltreatment can lead to significant psychological and physiological consequences
throughout an individual's lifespan. This population-based study aimed to investigate the
long-term effects of childhood maltreatment on the regulation of the autonomic nervous
system (ANS) in adulthood. The study involved 3,438 residents of northeastern Germany
(M = 49.7 years, SD = 14.8; 1,882 women and 1,556 men) from the TREND-0 cohort of the
Study of Health in Pomerania. ANS regulation was assessed through heart rate variability
(HRV), while childhood maltreatment was evaluated retrospectively using the Childhood
Trauma Questionnaire (CTQ). Participants also underwent additional interviews and
assessments to control for variables such as age, gender, medication use, body weight,
lifestyle factors, socioeconomic status, and current depressive symptoms. HRV (logRMSSD)
was derived from electrocardiographic recordings and analyzed in relation to the CTQ scales
and the aforementioned covariates. The analysis revealed significant negative associations
between childhood maltreatment and HRV, with neglect being the primary contributing
factor. Additionally, an age-dependent reduction in HRV was observed in participants who
underwent polysomnography (PSG). These findings support the hypothesis that childhood
maltreatment can exert long-term detrimental effects on the ANS, persisting for decades
The role of serine proteases in the pathophysiology of Streptococcus pneumoniae
Full text linkStreptococcus pneumoniae (pneumococcus) is a major human pathogen that causes otitis media, pneumonia, meningitis, and fatal bloodstream infections. Its ability to asymptomatically colonize the nutrient-limited nasopharynx is central to both transmission and disease. Colonization requires adaptation to environmental pressures, adherence to host surfaces, competition with resident microbes, and evasion of immune clearance. Pneumococci achieve this through adhesins, extracellular matrix (ECM)-binding proteins, and proteases that degrade mucus and ECM components, thereby facilitating adherence, barrier penetration, and immune evasion. Although numerous pneumococcal virulence factors have been studied, the role of extracellular serine proteases in colonization, proteome regulation, and host-pathogen interactions under nutrient-limiting conditions remains incompletely understood.
Pneumococci encode four surface-associated serine proteases in a serotype-dependent manner: HtrA, PrtA, CbpG, and SFP. These trypsin or subtilisin-like enzymes share a conserved Ser-His-Asp catalytic triad. Notably, SFP is absent in the non-invasive serotype 19F strain, EF3030. To investigate their role in the interplay with the host, we first optimized a chemically defined medium (CDM+) that mimics the nutrient limitation in the upper respiratory tract. Compared to previous CDM, CDM+ contained additional iron, manganese, and methionine, enabling robust growth of multiple pneumococcal serotypes and other streptococci. Interestingly, CDM+ induced aggregation in encapsulated strains, suggestive of biofilm initiation. Global proteome profiling of EF3030 cultivated in CDM+ revealed extensive remodeling under nutrient limitation. Proteins involved in fatty acid biosynthesis, nucleotide metabolism, and metal ion homeostasis were enriched, reflecting metabolic flexibility. Zn²⁺ transporters were detected in higher abundance under zinc limited condition in CDM+. Autolysins (CbpD, LytA) were abundant in supernatants, supporting fratricide and DNA release. Competence proteins were highly abundant during the late exponential phase, indicating active DNA uptake. Immunogenic virulence factors including pneumolysin, PspC, PcpA, PrtA, and PhtD were detected in both cytosolic and extracellular fractions. Serine proteases HtrA and PrtA were immediately abundant from early growth, whereas CbpG was not detected despite detectable transcripts.
To probe the serine protease function, proteomes of EF3030, TIGR4Δcps, and their isogenic single or multiple serine protease mutants were analyzed. Deletion of serine proteases increased arginine uptake, indicating metabolic adaptation. In TIGR4Δcps, complete protease deficiency shifted metabolism from homolactic to mixed-acid fermentation. Protease-deficient strains showed an accumulation of several lipoproteins, suggesting that these may serve as direct substrates. Regulation of zinc scavenging proteins differed from strain to strain. In EF3030, proteases promoted zinc uptake systems, whereas in TIGR4Δcps absence of proteases increased the abundance of cytoplasmic zinc-binding proteins, implying a suppressive role. Protease mutants also altered regulatory networks e.g., loss of HtrA resulted in the activation of the CiaRH two-component regulatory system. Surface adhesins (PcpA, PsaA, PsaB) increased in mutants, whereas pili proteins decreased in TIGR4Δcps mutant strains, might correlate with reduced adherence.
Direct host-pathogen experiments such as adherence or ex vivo infection assays implicated a role of serine proteases in the early steps of colonization, which is a prerequisite of invasive infections. Illustrating the adherence to epithelial cells or to mouse lung slices showed a reduction of adherence for the TIGR4Δcps protease mutants. In the Galleria mellonella in vivo infection model using the colonizing strain EF3030, the results suggested that serine proteases mainly contribute to colonization and adaptation rather than virulence as indicated earlier in mouse infection experiments. To identify host interaction targets, heterologously produced serine proteases PrtA2 and SFP were incubated with plasma protein lysates to identify substrate by using N-terminomics (HUNTER). Indeed, both proteases exhibited activity against various host proteins. SFP cleaved e.g., gelsolin, β-parvin, fermitin, actin, fibrinogen, whereas PrtA targets include human thrombospondin. Cleavage of commercial substrates shown in past studies such as thrombospondin, fibronectin, E-cadherin and in this study, vitronectin and fibrinogen confirmed protease activity, linking them to adherence and ECM degradation.
In summary, this study demonstrates that pneumococcal serine proteases influence bacterial metabolism, metal ion homeostasis, surface protein composition, competence, and host interactions. By dynamically shaping the proteome under nutrient-limiting conditions, these enzymes facilitate persistence and colonization. The findings provide new insights into pneumococcal physiology and highlight serine proteases as potential targets for therapeutic strategies against colonization and disease.Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind bedeutende humanpathogene Erreger, die Mittelohrentzündungen, Lungenentzündungen, Meningitis und tödliche Blutstrominfektionen verursachen. Ihre Fähigkeit den nährstoffarmen Nasenrachenraum asymptomatisch zu besiedeln, ist sowohl für die Übertragung als auch für die Krankheitsentstehung von zentraler Bedeutung. Die erfolgreiche Kolonisierung erfordert eine Anpassung an Umweltstress, die Anheftung an Wirtsoberflächen, die Konkurrenz mit residenten Mikroben sowie die Umgehung der Immunabwehr. Pneumokokken nutzen hierzu Adhäsine, extrazelluläre Matrix-(ECM)-bindende Proteine und Proteasen, die die Schleim- und ECM-Komponenten abbauen, wodurch die Adhäsion, Penetration der Lungenbarriere und Immunevasion ermöglicht wird. Obwohl zahlreiche Virulenzfaktoren von Pneumokokken untersucht wurden, ist die Rolle extrazellulärer Serinproteasen bei der Kolonisierung, Proteomregulation und Wirt-Pathogen-Interaktionen unter nährstofflimitierten Bedingungen bislang nicht vollständig geklärt.
Pneumokokken kodieren vier oberflächenassoziierte Serinproteasen in Serotyp-abhängiger Weise: HtrA, PrtA, CbpG und SFP. Diese Trypsin- bzw. Subtilisin-ähnlichen Enzyme besitzen eine konservierte Ser-His-Asp-Katalysetriade. Interessanterweise fehlt das für SFP kodierende Gen im nicht-invasiven Serotyp-19F-Stamm EF3030. Zur Untersuchung der Funktionen der Serinproteasen entwickelten wir ein optimiertes chemisch definiertes Medium (CDM+), das die Nährstofflimitierung der oberen Atemwege nachahmt. Im Vergleich zum bisherigen CDM enthielt das CDM+ zusätzlich Eisen, Mangan und Methionin und unterstützte so ein robustes Wachstum mehrerer Pneumokokken-Serotypen und weiterer Streptokokken. Auffällig war, dass CDM+ in bekapselten Stämmen die bakterielle Aggregation induzierte, was auf eine mögliche Biofilmbildung unter diesen Wachstumsbedingungen hinweist. Eine globale Proteomanalyse von EF3030 unter CDM+-Bedingungen zeigte eine umfassende Anpassung an die limitieren Nährstoffe. Proteine der Fettsäurebiosynthese, des Nukleotidstoffwechsels und der Metallionen-Homöostase waren angereichert, was die metabolische Flexibilität widerspiegelt. Zink-Transporter waren unter Zinkmangel verstärkt exprimiert. Autolysine (CbpD, LytA) fanden sich in erhöhten Mengen in den Überständen und unterstützen den so genannten Brudermord in der Population sowie die DNA-Freisetzung durch abgetötete Pneumokokken. Kompetenzproteine waren stark hochreguliert, was auf aktive DNA-Aufnahme hinweist. Immunogene Virulenzfaktoren wie Pneumolysin, PspC, PcpA, PrtA und PhtD wurden sowohl zytosolisch als auch extrazellulär nachgewiesen. Die Serinproteasen HtrA und PrtA waren bereits im frühen Wachstum hoch exprimiert, während CbpG trotz nachweisbarer Transkripte im Northern-Blot nicht detektiert wurde.
Die vergleichende Proteomanalyse von EF3030, TIGR4Δcps und deren isogenen Serinprotease-Mutanten zeigte, dass der Verlust von Serinproteasen die Argininaufnahme erhöhte, was auf eine metabolische Anpassung hindeutet. In TIGR4Δcps führte eine vollständige Serineproteasedefizienz durch Mutagenese zu einer Verschiebung von homofermentativer zu heterofermentativer Milchsäuregärung. Protease-defiziente Pneumokokken akkumulierten mehrere Lipoproteine, was impliziert, dass Lipoproteine auch direkte Substrate für Serinproteasen sind. Die Regulation von Zink-bindenden Proteinen erwies sich als stammabhängig. In EF3030 förderten die Serinproteasen die Zinkaufnahme, während in TIGR4Δcps der Verlust von Proteasen zu einer Anreicherung zytoplasmatischer Zink-bindender Proteine führte, was auf eine regulierende bzw. unterdrückende Funktion hindeutet. Darüber hinaus veränderten Protease-Mutanten regulatorische Netzwerke. Der Verlust der HtrA-Aktivität aktivierte das CiaRH-Zweikomponentensystem. Die Oberflächenadhäsine (PcpA, PsaA, PsaB) waren in Mutanten verstärkt vertreten, während die Abundanz der Pilus-Proteine in TIGR4Δcps-Mutanten abnahm, was mit verringerter Adhäsion korrelierte.
Funktionelle Untersuchungen bestätigten diese Befunde. In vitro zeigte sich eine reduzierte Adhäsion an Epithelzellen beim TIGR4Δcps Stamm mit fehlenden Serinproteasen, während in vivo im Galleria mellonella-Infektionsmodell EF3030-Proteasen hauptsächlich zur Kolonisierung und Anpassung, nicht jedoch wesentlich zur Virulenz beitrugen. Um Wirtsubstrate zu identifizieren, wurden rekombinante Proteasen PrtA2 und SFP in N-terminellen Proteomanalysen (N-terminomics) mit Plasmaproteinlysaten getestet. Beide Enzyme spalteten zahlreiche Wirtsproteine. SFP spaltete u. a. Gelsolin, β-Parvin, Fermitin, Aktin und Fibrinogen, für PrtA konnte u.a. Thrombospondin als Substrat identifiziert werden. Die Spaltung kommerzieller Substrate wie Vitronektin bestätigte die Proteaseaktivität und verknüpfte sie mit Adhäsion und ECM-Abbau.
Diese Studie zeigt, dass Serinproteasen von Pneumokokken den bakteriellen Stoffwechsel, die Metallionenhomöostase, die Zusammensetzung der Oberflächenproteine, die Kompetenz und die Wechselwirkungen mit dem Wirt beeinflussen. Durch die dynamische Gestaltung des Proteoms unter nährstoffarmen Bedingungen fördern diese Enzyme die Persistenz und Kolonisierung. Die Ergebnisse liefern damit auch neue Erkenntnisse über die Physiologie von Pneumokokken und deuten Serinproteasen als potenzielle Zielstrukturen für therapeutische Strategien gegen die Kolonisierung mit Pneumokokken an