BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment (E-Journal) / БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение
Not a member yet
340 research outputs found
Sort by
Применение количественного иммуноферментного анализа для определения концентрации S-антигена в цельновирионных инактивированных адсорбированных коронавирусных вакцинах
Get PDFThe severe consequences and high mortality of COVID-19 prompted the development of a wide range of preventive vaccines. The first vaccines to be tested were developed in China and formulated as inactivated SARS-CoV-2 adsorbed on aluminium hydroxide. One of the quality indicators for inactivated adsorbed vaccines is the degree of adsorption, which can be used to control the content not only of non-adsorbed antigen, but also of specific antigen in one dose of a vaccine.The aim of the study was to investigate the possibility of desorbing SARS-CoV-2 antigen from formulated adsorbed vaccines and the possibility of measuring its concentration using the BioScan-SARS-CoV-2 (S) ELISA kit for SARS-CoV-2 S-protein content determination.Materials and methods: the study used four batches of BBIBP-CorV by CNBG, Sinopharm (China) and three batches of CoronaVac by Sinovac Biotech (China). The authors desorbed SARS-CoV-2 S antigen in accordance with monograph FS.3.3.1.0029.15 of the State Pharmacopoeia of the Russian Federation (Ph. Rus.), edition XIV, and quantified it using the BioScan-SARS-CoV-2 (S) ELISA kit by Bioservice Biotechnology Co. Ltd. (Russia).Results: mean S-antigen concentrations in the desorbed samples ranged from 61 to 129 ng/mL for BBIBP-CorV and from 461 to 533 ng/mL for CoronaVac.Conclusions: the study demonstrated the possibility of specific SARS-CoV-2 antigen desorption from the surface of aluminium hydroxide using the Ph. Rus. method, as well as the possibility of S-antigen quantification in desorbed medicinal products and supernatants using the BioScan-SARS-CoV-2 (S) ELISA kit. The authors observed 3.6- to 8.7-fold difference between the S-antigen concentrations of the desorbed preparations by the two manufacturers.Тяжелые последствия заболевания, вызываемые вирусом SARS-CoV-2, а также большое количество случаев заболевания с летальным исходом, обусловили разработку целого ряда профилактических вакцин. Первые вакцины, об испытаниях которых было заявлено, были разработаны в Китае и представляли собой инактивированный вирус SARS-CoV-2, адсорбированный на гидроокиси алюминия. Для инактивированных адсорбированных вакцин одним из показателей качества является полнота сорбции. Определение этого параметра позволяет не только контролировать количество несорбированного антигена, но и количество специфического антигена в дозе.Цель работы: изучение возможности проведения десорбции антигена вируса SARS-CoV-2 в готовых лекарственных формах адсорбированных вакцин и определение концентрации антигена вируса с использованием набора реагентов «БиоСкан-SARS-CoV-2 (S)» для количественного определения S-белка вируса SARS-CoV-2 методом иммуноферментного анализа (ИФА).Материалы и методы: в работе были использованы образцы четырех серий вакцины BBIBP-CorV (CNBG, Sinopharm, Китай) и трех серий вакцины CoronaVac (Sinovac Biotech, Китай). Десорбцию антигена проводили в соответствии с ФС.3.3.1.0029.15 Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV издания (ГФ РФ XIV), а количественное определение S-антигена вируса SARS-CoV-2 – с использованием набора реагентов для ИФА «БиоСкан-SARS-CoV-2 (S)» (АО БТК «Биосервис», Россия).Результаты: в исследованных образцах четырех серий вакцины BBIBP-CorV концентрация S-антигена в десорбированных образцах варьировала в среднем от 61 до 129 нг/мл, а в образцах трех серий вакцины CoronaVac – от 461 до 533 нг/мл.Выводы: была показана возможность десорбции специфического антигена вируса SARS-CoV-2 с гидроокиси алюминия по методике ФС.3.3.1.0029.15 ГФ РФ XIV. Показана возможность количественной оценки содержания S-антигена в десорбированном препарате и в супернатанте с использованием набора реагентов для ИФА «БиоСкан-SARS-CoV-2 (S)». Разница в концентрациях S-антигена в десорбированных препаратах между двумя разными производителями составляла от 3,6 до 8,7 раза
Разработка стандартного образца предприятия активности антирабического иммуноглобулина для применения в реакции нейтрализации вируса на культуре клеток Vero
Get PDFThe development and use of new methods of quality control of medicines involve the use of a lot of reference materials in quality control testing. Specialists of the Russian Research Antiplague Institute “Microbe” have proposed an alternative methodological approach to determination of potency of anti-rabies immunoglobulin in cell culture, which requires the development of an in-house reference standard (RS) certified against the biological reference preparation (BRP) of the European Pharmacopoeia human rabies immunoglobulin. The aim of the study was to develop and evaluate the metrological characteristics of an in-house RS for anti-rabies immunoglobulin potency, to be used in the virus neutralisation test in a Vero cell culture. Materials and methods: The following materials were used in the study: equine rabies immunoglobulin, Vero continuous cell culture, fixed rabies virus (Moscow 3253Vero strain), human rabies immunoglobulin BRP of the European Pharmacopoeia. The potencies of the candidate in-house RS and rabies immunoglobulin samples were determined in the neutralisation test in cell culture. The results were recorded using a fluorescent microscope. Statistical processing was carried out in accordance with general chapter 1.1.0014.15 of the State Pharmacopoeia of the Russian Federation, 14th edition. Results: the certified value of the in-house RS potency was 180.8±18.8 IU/mL. The confidence limits were determined at the 0.95 probability level. The shelf life of the in-house RS is 1.5 years (when stored according to the sanitary regulation SanPiN 3.3686-21). The certified in-house RS was assigned with the number 41-01-20. A set of technical and operational documentation was developed and approved for the in-house RS. The developed in-house RS can be used for in vitro determination of anti-rabies immunoglobulin potency, expressed in international units, to confirm its compliance with the product specification file. Conclusions: the authors developed an in-house RS for anti-rabies immunoglobulin potency, to be used in the virus neutralisation test in cell culture, certified against the human rabies immunoglobulin BRP of the European Pharmacopoeia.Разработка и применение новых методов контроля качества лекарственных средств предполагает использование большого количества референтного материала для контрольных исследований. Специалистами ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора предложен альтернативный методический подход для определения активности антирабического иммуноглобулина на культуре клеток, внедрение которого в практику диктует необходимость разработки стандартного образца предприятия, аттестованного относительно стандартного образца активности антирабического иммуноглобулина человека Европейской фармакопеи.Цель работы: разработка и оценка метрологических характеристик стандартного образца предприятия (СОП) специфической активности антирабического иммуноглобулина для применения в реакции нейтрализации вируса на культуре клеток Vero. Материалы и методы: иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади; перевиваемая клеточная культура Vero; фиксированный вирус бешенства (штамм Москва 3253Vero); стандартный образец активности антирабического иммуноглобулина человека Европейской фармакопеи. Специфическую активность кандидата в СОП и образцов антирабического иммуноглобулина определяли в реакции нейтрализации на культуре клеток. Учет результатов осуществляли с помощью флуоресцентного микроскопа. Статистическую обработку проводили в соответствии с общей фармакопейной статьей 1.1.0014.15 Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV издания. Результаты: в ходе испытаний установлена аттестуемая характеристика СОП по показателю «Специфическая активность», соответствующая значению 180,8±18,8 МЕ/мл. Граничные значения доверительного интервала определены при уровне вероятности 0,95. Установлен срок годности СОП – 1,5 года при хранении в соответствии с СанПиН 3.3686-21. По итогам аттестации образцу присвоен номер 41-01-20, разработан и утвержден комплект технической и эксплуатационной документации. Применение разработанного СОП позволяет проводить анализ специфической активности антирабического иммуноглобулина in vitro, выраженной в международных единицах, для подтверждения соответствия требованиям нормативной документации. Выводы: разработан стандартный образец предприятия специфической активности антирабического иммуноглобулина для применения в реакции нейтрализации вируса на клеточной культуре, аттестованный относительно стандартного образца активности антирабического иммуноглобулина человека Европейской фармакопеи
Разработка критериев приемлемости оценки результатов количественного определения анти-D-антител IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rhо(D) иммуноферментным методом
Get PDFThe competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) used for the quantification of specific antibodies, anti-D (Rho) IgGs, in human anti-D (Rho) immunoglobulin preparations relies upon the competition between anti-D antibodies in the preparation and anti-D monoclonal antibodies (mAbs) for immunochemical binding to D-antigen epitopes of the immunosorbent, human erythrocytes of the ccDEE phenotype immobilised on a solid support. The immunosorbent is prepared in-house under laboratory conditions. The certification of the International Standard (IS) for anti-D immunoglobulin included attempts to use the CCDee phenotype, which is more common (16.01%) than the ccDEE phenotype (2.16%). It is possible to use the CCDee phenotype, as long as the user adheres to the acceptance criteria for the results, developed during method validation. The aim of this study was to develop the acceptance criteria for the results of anti-D IgG quantification in human anti-D immunoglobulin preparations by the ELISA method that would allow using CCDee erythrocytes to prepare the immunosorbent should there be no erythrocytes of the ccDEE phenotype available. Materials and methods: the study used human anti-D immunoglobulin preparations; anti-D IgG–spiked samples; the IS for anti-D immunoglobulin; the reference standard (RS) for anti-D IgG–free immunoglobulin; anti-D mAbs; and erythrocytes of the CCDee, ccDEE, and ccddee phenotypes. The authors quantified anti-D IgG antibodies by the competitive ELISA. The statistical analysis used parametric and nonpar ametric tests. Results: the study demonstrated the possibility of using CCDee erythrocytes for competitive immunochemical binding with anti-D mAbs and anti-D IgG of various human anti-D immunoglobulin preparations. The suitability of the analytical procedure with the CCDee phenotype was confirmed by validation parameters: trueness, intermediate precision, linearity, selectivity, specificity, and robustness of the method and comparability of the results obtained when using the CCDee and ccDEE phenotypes. The authors developed the acceptance criteria: the relative values of anti-D IgG content in the test sample should range within ±20% of the nominal value; the coefficient of determination (R2) should be at least 0.9; the relative standard deviation (RSD, %) of three absorbance values for each concentration should not exceed 20%. Conclusions: these acceptance criteria guarantee the reliability of assay results of anti-D IgG quantification by the ELISA, which allows them to be used by specialists of control and analytical laboratories to assess the quality of human anti-D immunoglobulin preparations.Метод конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения специфических антител (Ат) — анти-D-Ат IgG, в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) (ИГЧА) основан на конкурентном иммунохимическом связывании между анти-D-Ат в препарате ИГЧА и моноклональными анти-D-Ат к эпитопу D-антигенов иммуносорбента — эритроцитов человека фенотипа ccDEE, иммобилизированных на твердой фазе. Приготовление иммуносорбента проводится в условиях лаборатории самостоятельно. При аттестации Международного стандартного образца (МСО) анти-D иммуноглобулина предприняты попытки использования и фенотипа ССDee как наиболее часто встречаемого (16,01%) в сравнении с фенотипом ccDEE (2,16%). Использование фенотипа CCDee возможно при условии соблюдения критериев приемлемости оценки результатов, разработанных при валидации методики. Цель работы: разработать критерии приемлемости оценки результатов количественного определения анти-D-Ат IgG в препаратах ИГЧА методом ИФА, в котором для приготовления иммуносорбента, в случае отсутствия эритроцитов фенотипа ccDEE, могут быть использованы эритроциты фенотипа CCDee. Материалы и методы: препараты ИГЧА, модельные образцы с известным содержанием анти-D-Ат IgG, МСО анти-D иммуноглобулина, стандартный образец (СО) иммуноглобулина, не содержащий анти-D-Ат IgG, моноклональные анти-D-Ат, эритроциты фенотипов CCDee, ccDEE и ccddee. Определение анти-D-Ат IgG проводили методом конкурентного ИФА. Применяли параметрические и непараметрические методы статистики. Результаты: показано, что применение эритроцитов фенотипа CCDee позволяет использовать их для конкурентного иммунохимического связывания с моноклональными анти-D-Ат и антиD-Ат IgG различных препаратов ИГЧА. Подтверждена пригодность методики с применением фенотипа CCDee по валидационным характеристикам: правильность, промежуточная прецизионность, линейность, селективность, специфичность, устойчивость методики и сопоставимость результатов при использовании эритроцитов фенотипов CCDee и ccDEE. Разработаны критерии приемлемости: относительные значения содержания анти-D-Ат IgG в испытуемом образце должны быть в интервале ±20% от номинального значения; коэффициент детерминации (R2) должен быть не менее 0,9; относительное стандартное отклонение (RSD, %) трех значений оптической плотности для каждой концентрации не должно превышать 20%. Выводы: разработанные критерии приемлемости гарантируют достоверность получаемых результатов количественного определения анти-D-Ат IgG методом ИФА, что позволяет их использовать специалистами контрольно-аналитических лабораторий для оценки качества препаратов ИГЧА
Стандартизация метода определения содержания активатора прекалликреина в лекарственных препаратах иммуноглобулинов и альбумина человека
Get PDFAssessment of prekallikrein content is essential for safety control of human immunoglobulin and albumin products. The inherent variability of human prekallikrein reagents and chromogenic substrates indicates the need for standardisation of the chromogenic assay, using the components of a reference standard (RS) not only for construction of calibration curves, but also for confirmation of validity, consistency, and reproducibility of results within different established ranges. The aim of the study was to improve the quality control of human plasma products in terms of prekallikrein activator content. Materials and methods: prekallikrein activator content was determined by the chromogenic assay according to the procedure described in General Monograph 1.8.2.0013.18 of the Russian Pharmacopoeia, using various prekallikrein reagents. An RS was developed in a spiking test, using human albumin solution and Hageman factor beta-fragment reagent. Shewhart control charts were prepared based on the results of determination of prekallikrein activator content in the RS control component.Results: a two-component RS for prekallikrein activator content with an assigned Hageman factor beta fragment content was developed using the spiking test. The authors substantiated the necessity of using a Russian-produced prekallikrein reagent as the RS component. The in-house reference standard IRS 42-28-445 was certified using all available human prekallikrein reagents, and the IRS 42-28-446 was certified using the prekallikrein reagent included in the kit. The certified prekallikrein activator content is: 51 IU in the batches 1 of IRS components intended for prekallikrein determination; 8.3–11.9 IU/mL in the IRS 42-28-445 control component, after reconstitution in 1.0 mL of purified water, and 5.4–6.6 IU/mL after reconstitution in 2.0 mL of purified water; and 9.1–11.1 IU/mL and 5.6–6.4 IU/mL in the IRS 42-28-446 control component after reconstitution in 1.0 mL and 2.0 mL of purified water, respectively. The IRS component intended for prekallikrein determination is designed for calibration curve construction, while the IRS control component is designed for assessing the validity of test results and preparation of control charts. The analysis of the control charts for the control component made it possible to evaluate the consistency of the analytical process. Conclusions: the components of the developed RSs in combination with Shewhart control charts allow for both determination of prekallikrein activator content, and control of the analytical process, as well as assessment of changes related to the replacement of the reagent batch. The RS control component allows for assessment of analytical process consistency and ensures the standardisation of the test procedure.Оценка содержания активатора прекалликреина является необходимой составляющей контроля специфической безопасности лекарственных препаратов иммуноглобулинов и альбумина человека. Вариабельность свойств биологических реагентов прекалликреина человека, хромогенного субстрата указывает на необходимость стандартизации хромогенного метода использованием компонентов стандартного образца (СО) не только для построения калибровочного графика, но и для подтверждения достоверности, стабильности и воспроизводимости полученных результатов в различных диапазонах значений в пределах регламентированных. Цель работы: совершенствование процедуры контроля качества препаратов из плазмы крови человека по содержанию активатора прекалликреина. Материалы и методы: содержание активатора прекалликреина определяли хромогенным методом по общей фармакопейной статье 1.8.2.0013.18 Государственной фармакопеи Российской Федерации с использованием реагентов прекалликреина различных производителей. СО разрабатывали на основе метода добавок с использованием раствора альбумина человека и реагента ß-фрагмента фактора Хагемана. По результатам определения содержания активатора прекалликреина в компоненте контроля строили контрольные карты Шухарта. Результаты: методом добавок разработан двухкомпонентный СО содержания активатора прекалликреина с регламентированным количеством ß-фрагмента фактора Хагемана; обоснована необходимость комплектации СО реагентом прекалликреина отечественного производства; отраслевой стандартный образец (ОСО) 42-28-445 аттестован с использованием всех доступных реагентов прекалликреина человека, ОСО 42-28-446 – с использованием реагента прекалликреина, входящего в состав набора. Аттестованное значение содержания активатора прекалликреина составило: в компоненте для оценки содержания активатора прекалликреина серии 1 обоих ОСО – 51 МЕ; в компоненте контроля ОСО 42-28-445 при восстановлении в 1,0 мл воды очищенной – 8,3–11,9 МЕ/мл, при восстановлении в 2,0 мл воды очищенной – 5,4–6,6 МЕ/мл; в компоненте контроля ОСО 42-28-446 – 9,1–11,1 и 5,6–6,4 МЕ/мл соответственно. Компонент для оценки содержания активатора прекалликреина предназначен для построения калибровочного графика, компонент контроля – для оценки достоверности результатов испытаний и построения контрольных карт. Анализ полученных карт для компонента контроля позволил оценить стабильность аналитической работы. Выводы: компоненты разработанных СО в сочетании с контрольными картами Шухарта позволяют не только определять содержание активатора прекалликреина, но и контролировать процесс анализа, оценивать его изменения, связанные со сменой серии реагентов. Компонент контроля позволяет оценивать стабильность аналитической работы и обеспечивает стандартность методики
Увеличение продуктивности клеточной линии-продуцента арилсульфатазы B за счет коэкспрессии формилглицин-генерирующего фермента
Get PDFMucopolysaccharidosis type VI (Maroteaux–Lamy syndrome) is an orphan genetic disease caused by deficiency of the lysosomal enzyme arylsulfatase B (ASB). The need to develop a highly productive cell line for the production of recombinant ASB, is behind the concept and relevance of this study. The most promising approach seems to be the development of CHO producer cell lines coexpressing the target ASB enzyme and an auxiliary formylglycine-generating enzyme (FGE). At the same time, it is important from a practical perspective to have the possibility of cultivating producer cell lines as suspensions free of serum or other components of animal origin. The aim of the study was to develop highly productive cell lines for the production of recombinant ASB by coexpression of the auxiliary FGE. Materials and methods: a suspension CHO cell line was used in the study. CHO cells were transfected by electroporation using the MaxCyte STX system. Monoclonal cell lines were obtained with the help of the Cell Metric system. Enzyme-linked immunosorbent assay was used for determination of ASB concentration in the culture fluid. Culture fluid samples were analysed using polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting. The mRNA level was measured by real-time polymerase chain reaction. Results: producer cell lines coexpressing the target ASB enzyme and auxiliary FGE were obtained. An increase in the yield of the active target ASB enzyme from 2 to 100 mg/L was achieved by selecting the optimal ratio of plasmids during transfection. The highest yield of the target ASB enzyme was achieved at the 90:10 ratio (%) of plasmids encoding the ASB and FGE genes, respectively. Conclusions: the authors developed highly productive cell lines for the production of recombinant ASB, which coexpress the target and auxiliary enzymes. The coexpression of ASB and FGE improves the growth and production characteristics of the cell line, probably due to the modification of the ASB active site. The obtained results will help resolve the problem of low enzyme yield, which is typical of this class of medicines.Мукополисахаридоз VI типа (синдром Марото–Лами) — орфанное генетическое заболевание, которое связано с дефицитом лизосомального фермента арилсульфатазы В. Актуальность исследования связана с необходимостью разработки высокопродуктивной клеточной линии-продуцента рекомбинантного фермента арилсульфатазы В. Наиболее перспективным подходом представляется создание клеточных линий-продуцентов, коэкспрессирующих целевой фермент арилсульфатазу В и вспомогательный формилглицин-генерирующий фермент на основе клеточной линии СНО. При этом большое практическое значение имеет возможность культивирования клеточных линий-продуцентов в виде суспензии, без использования сыворотки или других компонентов животного происхождения. Цель работы: разработка высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов рекомбинантного фермента арилсульфатазы В за счет коэкспрессии вспомогательного формилглицин-генерирующего фермента. Материалы и методы: использовали суспензионную клеточную линию СНО. Трансфекцию клеток СНО проводили методом электропорации с использованием системы MaxCyte STX. Моноклональные клеточные линии получали с использованием системы Cell Metric. Концентрацию арилсульфатазы В в культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа. Образцы культуральной жидкости анализировали с применением электрофореза в полиакриламидном геле и вестерн-блота. Уровень мРНК измеряли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Результаты: получены клеточные линии-продуценты, коэкспрессирующие целевой фермент арилсульфатазу В и вспомогательный формилглицин-генерирующий фермент. Достигнуто увеличение выхода активного целевого фермента арилсульфатазы В с 2 до 100 мг/л за счет подбора оптимального соотношения плазмид во время трансфекции. Наибольший выход целевого фермента арилсульфатазы В наблюдался при соотношении плазмид, кодирующих гены арилсульфатазы В и формилглицин-генерирующего фермента, равном 90:10 (%). Выводы: разработаны высокопродуктивные клеточные линии-продуценты рекомбинантного фермента арилсульфатазы В, коэкспрессирующие целевой и вспомогательный ферменты. Коэкспрессия арилсульфатазы В и формилглицин-генерирующего фермента приводит к улучшению ростовых и продукционных характеристик клеточной линии, что, по-видимому, обусловлено модификацией активного центра целевого фермента арилсульфатазы В. Полученные результаты позволят решить проблему низкого выхода фермента, характерную для препаратов подобного класса
Оптимизация условий культивирования клона-продуцента, коэкспрессирующего арилсульфатазу B и формилглицин-генерирующий фермент, с целью повышения выхода фермента арилсульфатазы B
Get PDFMaroteaux—Lamy syndrome (mucopolysaccharidosis type VI) is an orphan genetic disease caused by mutations in the arylsulfatase B gene (ARSB), which encodes the lysosomal enzyme arylsulfatase B (ASB). The relevance of the study lies in the need of a Russian recombinant ASB product for patients with the disease in the Russian Federation. Previously, the authors have developed producer lines coexpressing the target ASB enzyme with an auxiliary formylglycine-generating enzyme (FGE), based on Chinese hamster ovary (CHO) cells. Further development of the recombinant ASB preparation places priority on increasing the enzyme yield. The aim of this study was to increase the productivity of producer clones by optimising the culture process and adding calcium chloride and copper sulfate to the culture medium. Materials and methods: a suspension-adapted CHO cell line was used. Monoclonal cell lines were developed using Cell Metric and ClonePix FL systems. The concentration of ASB in the culture liquid was determined using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The authors analysed batch culture and/or fed-batch culture in media supplemented with various concentrations of copper sulfate and calcium chloride. Results: the combined addition of copper sulfate and calcium chloride at concentrations of 300 μM during batch culture of producer clones coexpressing ASB and FGE increases viability and specific productivity of the cells up to 4.58±1.62 pg/ (cell×day). The cultivation of the lead producer clone coexpressing ASB and FGE under fed-batch conditions for 12 days and the addition of copper sulfate to the growth medium at the concentration of 300 μM allow for increasing the yield of the active lysosomal enzyme, arylsulfatase B, to 420 mg/L. Conclusions: the cultivation of producer clones coexpressing ASB and FGE under fed-batch conditions with copper sulfate added to the medium significantly improves cell line growth properties and the ASB yield. This approach to the selection of culture conditions for producer cell lines can be applied to other enzymes of the sulfatase family.Синдром Марото—Лами (мукополисахаридоз VI типа) — орфанное генетическое заболевание, вызванное мутациями гена ARSB, который кодирует лизосомальный фермент арилсульфатазу В. Актуальность исследования заключается в необходимости разработки отечественного препарата рекомбинантной арилсульфатазы В для лечения пациентов с данным заболеванием в Российской Федерации. Ранее были получены клеточные линии-продуценты, коэкспрессирующие целевой фермент арилсульфатазу В и вспомогательный формилглицин-генерирующий фермент на основе клеточной линии СНО. Однако для дальнейшей разработки препарата рекомбинантной арилсульфатазы В представляется важным повышение выхода фермента. Цель работы: увеличение продуктивности клонов-продуцентов за счет оптимизации процесса культивирования и добавления в культуральную среду хлорида кальция и сульфата меди. Материалы и методы: использовали суспензионную клеточную линию СНО. Моноклональные клеточные линии получали с использованием систем Cell Metric и Clone Pix FL. Концентрацию арилсульфатазы В в культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа. Использовали периодическое культивирование (batch culture) и/или периодическое культивирование с подпиткой (fedbatch culture) в среде с добавлением различных концентраций сульфата меди и хлорида кальция. Результаты: продемонстрировано, что одновременное добавление сульфата меди и хлорида кальция в концентрации 300 мкM при периодическом культивировании клонов-продуцентов, коэкспрессирующих арилсульфатазу В и формилглицин-генерирующий фермент, увеличивает жизнеспособность культур и повышает удельную продуктивность клеток до 4,58±1,62 пг/(клетка×сут). При культивировании лидерного клона-продуцента, коэкспрессирующего арилсульфатазу В и формилглицин-генерирующий фермент, в условиях периодического культивирования с подпиткой длительностью 12 сут достигнуто увеличение выхода активного лизосомального фермента арилсульфатазы В до 420 мг/л при добавлении в ростовую среду сульфата меди в концентрации 300 мкM. Выводы: культивирование клонов-продуцентов, коэкспрессирующих арилсульфатазу В и формилглицин-генерирующий фермент, в условиях периодического культивирования с подпиткой и с добавлением в среду сульфата меди приводит к значительному улучшению ростовых свойств клеточной линии и выхода целевого фермента. Данный подход в подборе условий культивирования продуцентов можно применять к другим ферментам подкласса сульфатаз
Особенности и проблемы регистрации и применения препаратов для профилактики COVID-19 в период пандемии
Get PDFAt the end of 2019, an outbreak of a new coronavirus began in the city of Wuhan (Hubei Province) in the People's Republic of China. The outbreak turned into a pandemic. In the shortest possible time, national and international manufacturers developed preventive COVID-19 vaccines, and the population was vaccinated. During pandemics, accelerated approval of vaccines is an important factor that shortens the time to market with the aim of mass vaccination. The experience of rapidly developing and introducing vaccines into routine practice is not only important for managing the current pandemic, but also valuable in case of extremely likely future ones. The aim of this study was to analyse the main issues associated with assessing the safety and efficacy of vaccines for COVID-19 prevention during their registration and widespread use amid the pandemic and ongoing SARS-CoV-2 evolution. The vaccines for COVID-19 prevention were developed and introduced into healthcare practice very rapidly and under the circumstances of the pandemic, and the use of these vaccines has surfaced a number of concerns requiring further research. The most important issues identified in the performed analysis include, but are not limited to the need for accelerated assessment of the safety and immunogenicity of new vaccines; the lack of immune correlates of protection against SARS-CoV-2; the waning of antibody immunity over time, motivating the need to determine revaccination and post-recovery vaccination timelines; and the emergence of mutant SARS-CoV-2 variants. One of noteworthy aspects is the need to develop recommendations for updating the strain composition of registered COVID-19 vaccines. According to the conclusions, the level of herd immunity, including vaccine-induced protection, plays a certain role in virus evolution during the pandemic. If COVID-19 becomes seasonal, which is a probable scenario, regular revaccination can be essential.В конце 2019 г. в городе Ухань (провинция Хубэй) в Китае началась вспышка новой коронавирусной инфекции COVID-19, которая переросла в пандемию. В кратчайшие сроки, в том числе отечественными производителями, были разработаны вакцины для профилактики COVID-19 и проведена вакцинация населения. В условиях пандемии ускоренная регистрация вакцин является одним из важных факторов, сокращающих срок их выведения на рынок в целях массовой вакцинации. Опыт быстрой разработки и внедрения вакцинных препаратов в рутинную практику важен не только для управления текущей пандемией, но и окажется ценным в случае будущих пандемий, вероятность которых крайне высока. Цель работы – анализ основных проблем оценки безопасности и эффективности вакцин для профилактики COVID-19 при их регистрации и широком применении в условиях пандемии и продолжающейся эволюции вируса SARS-CoV-2. Учитывая скорость разработки и внедрения в практику здравоохранения вакцин для профилактики COVID-19 в условиях пандемии, в процессе их применения был выявлен ряд проблем, которые требуют дальнейшего исследования. Проведенный анализ показал, что к числу наиболее важных проблем относятся необходимость ускоренной оценки безопасности и иммуногенности новых вакцин; отсутствие иммунологических маркеров эффективности; снижение антительного иммунитета с течением времени и, соответственно, необходимость определения параметров ревакцинации и вакцинации переболевших; появление мутантных вариантов SARS-CoV-2. Отмечено, что одним из важных аспектов является разработка рекомендаций по смене штаммового состава в зарегистрированных вакцинах для профилактики COVID-19. Сделан вывод о том, что в условиях пандемии в эволюции вируса определенную роль играет уровень популяционного иммунитета, в том числе сформировавшийся в результате вакцинации. Регулярная ревакцинация может иметь существенное значение при вероятном переходе COVID-19 к модели сезонного заболевания
Разработка и лабораторное получение вирусоподобных иммуностимулирующих комплексов на основе сапонинов, оценка их адъювантных свойств при иммунизации мышей гриппозными антигенами
Get PDFThe COVID-19 pandemic has exacerbated the public’s need for effective vaccines. Consequently, significant financial support has been provided to developers of a number of innovative vaccines, including the vaccines with saponin-based adjuvants. In 2021, the World Health Organisation recommended Mosquirix, the first malaria vaccine, which contains a saponin adjuvant. An anti-covid vaccine by Novavax is in the approval phase. A promising approach to vaccine development is presented by the use of virus-like immune-stimulating complexes (ISCOMs) containing saponins and by the creation of combinations of ISCOMs with antigens. The aim of the study was to develop, produce and characterise virus-like immune-stimulating complexes based on saponins of Quillaja saponaria, as well as similar saponins of Russian-sourced Polemonium caeruleum. Materials and methods: The ISCOM adjuvants, Matrix-BQ and Matrix-BP, were produced using liquid chromatography and examined using electron microscopy. Balb/c mice were immunised intraperitoneally and intramuscularly with ISCOM-antigen preparations. Afterwards, the immunised animals were challenged with the influenza virus strain, A/California/4/2009(H1N1)pdm09, adapted and lethal to mice. The serum samples were examined using haemagglutination inhibition (HI) tests. Results: The authors produced the ISCOMs containing saponins of Quillaja saponaria and Polemonium caeruleum. After one intramuscular injection of either of the ISCOM-antigen preparations with 1 µg of each of A/Brisbane/02/2018 (H1N1) pdm09, A/Kansas/14/2017 (H3N2), and B/Phuket/3073/2013 haemagglutinin antigens (HAs), HI tests detected serum antibody titres to the corresponding antigens of ≥1:40. Two intramuscular injections of the ISCOM-antigen preparation containing 50 ng of each of the HAs and Matrix-BQ resulted in a protective response. In some animals, two intraperitoneal injections of ISCOM-antigen preparations resulted in the maximum antibody titre to the A/Kansas/14/2017 (H3N2) vaccine strain of 1:20,480. Two intramuscular injections of a test preparation containing 5 µg, 1 µg, 200 ng, or 50 ng of each of the HAs and Matrix-BQ or a control preparation containing 5 µg, 1 µg, or 200 ng of each of the HAs (commercially available vaccines) to the mice that were afterwards infected with the lethal influenza strain protected the experimental animals from death. Conclusions: The ISCOM-based preparations had high immunostimulatory activity in the mouse-model study. The presented results indicate the potential of further studies of ISCOM-based preparations in terms of both vaccine and immunotherapeutic development.Пандемия COVID-19 обострила потребность общества в эффективных вакцинных препаратах. В этих условиях существенную финансовую поддержку получили разработчики ряда инновационных вакцин, в том числе вакцин, в состав которых входят адъюванты на основе сапонинов. В 2021 г. ВОЗ была одобрена первая противомалярийная вакцина Mosquirix, содержащая сапонины. На стадии одобрения находится вакцина Novavax против COVID-19. Перспективным подходом к созданию вакцин является использование вирусоподобных иммуностимулирующих комплексов (ИСКОМ) на основе сапонинов и создание на их основе комплексов с антигеном (ИСКОМ-антиген). Цель работы: получение и изучение вирусоподобных иммуностимулирующих комплексов на основе сапонинов Квиллайи мыльной (Quillaja saponaria), а также аналогов на основе сапонинов Синюхи голубой (Polemonium caeruleum), полученных из отечественного сырья. Материалы и методы: с применением метода жидкостной хроматографии получали препараты ИСКОМ адъювантов — Матрикс-BQ и Матрикс-BP. Проведено электронно-микроскопическое исследование препаратов. Иммунизацию мышей Balb/c препаратами ИСКОМ-антиген проводили интраперитонеально и внутримышечно. Иммунизированных животных заражали адаптированным летальным для мышей штаммом вируса гриппа A/California/4/2009 (H1N1) pdm09. Образцы сыворотки крови иммунизированных животных исследовали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Результаты: получены ИСКОМ, содержащие сапонины Синюхи голубой и Квиллайи мыльной. В образцах сыворотки крови животных, однократно внутримышечно иммунизированных препаратом ИСКОМ-антиген, содержащим по 1 мкг гемагглютинина каждого из штаммов вирусов гриппа A/Brisbane/02/2018 (H1N1) pdm09, A/Kansas/14/2017 (H3N2), B/ Phuket/3073/2013, значения титров антител в РТГА составили более 1:40 к соответствующим антигенам. При двукратном внутримышечном введении препарата ИСКОМ-антиген, содержащего 50 нг каждого антигена, был выявлен протективный ответ. Максимальные значения титров антител в РТГА выявлены при двукратном интраперитонеальном введении препарата ИСКОМ-антиген и составили 1:20480 к гемагглютинину вакцинного штамма A/Kansas/14/2017 (H3N2). Показано, что двукратное внутримышечное введение 5 мкг, 1 мкг, 200 нг, 50 нг препарата ИСКОМ-антиген и 5 мкг, 1 мкг, 200 нг контрольного антигена коммерчески доступной вакцины мышам, впоследствии зараженным летальным штаммом вируса гриппа A/California/4/2009 (H1N1)pdm09, защищает экспериментальных животных от гибели. Выводы: полученные препараты на основе ИСКОМ обладали высокой иммуностимулирующей активностью в исследовании на мышиной модели. Представленные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения препаратов на основе ИСКОМ при разработке как противовирусных, так и иммунокорректирующих препаратов
Этапы стандартизации препаратов антирезусного иммуноглобулина человека по показателю качества «Специфическая активность»
Get PDFHuman anti-D immunoglobulin preparations derived from human immune plasma are much needed and highly effective for specific anti-D prevention of perinatal complications and treatment of primary immune thrombocytopenia. The effectiveness of immune suppression is a direct function of the active ingredient dose received with the medicinal product. To improve the accuracy of anti-D antibody quantification, it is recommended to use certified reference materials with values assigned in international units (IUs). The aim of this study was to analyse the main stages in the development of the international standards (ISs) for human anti-D immunoglobulin potency testing and to substantiate the need for a national standard for anti-Rho(anti-D) antibody quantification. The article describes the creation of the first and subsequent ISs, the procedure for establishing the IU equivalent for the anti-Rho(anti-D) antibody concentration, the characteristics of the raw materials and preparations used, and the anti-Rho(anti-D) antibody assay methods applied to certify the ISs. According to the study conclusions, it is necessary to develop and certify a national standard for the content of anti-Rho(anti-D) antibodies that will meet the requirements of the corresponding Russian regulations.Препараты антирезусного иммуноглобулина человека, получаемые из иммунной плазмы крови человека, являются востребованными и высокоэффективными средствами специфической анти-D профилактики перинатальных осложнений и при лечении первичной иммунной тромбоцитопении. Эффективность предотвращения иммунного ответа напрямую зависит от дозы введенного действующего вещества препарата. Для повышения точности количественного определения анти-D антител рекомендовано использование стандартных образцов (СО), аттестованных в международных единицах. Цель работы — анализ основных этапов разработки международного стандартного образца (МСО) для определения специфической активности антирезусного иммуноглобулина человека и обоснование необходимости создания отечественного СО содержания антирезус Rho(D) антител. В статье описаны процесс создания первого и последующих МСО, процедура установления эквивалента международных единиц для выражения концентрации антирезус Rho(D) антител, приведены характеристики сырья и продуктов, а также методы определения антирезусных антител, используемые при аттестации МСО. Сделан вывод о необходимости разработки и аттестации отечественного СО содержания антирезус Rho(D) антител, соответствующего требованиям нормативных актов Российской Федерации в данной области