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常在細菌叢によって操られるヒトや動物の健康・疾患と行動
Get PDF平成26年度 麻布大学附置生物科学総合研究所 ワークショップP(論文)会議録・学会報告メタゲノムからヒト常在菌叢の生態と機能を読み解く常在細菌叢の最新の話題：腸内細菌叢による宿主免疫系への影響や腸脳相関application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape
間歇性跛行に対するシロスタゾールの作用増強候補化合物としてのL-カルニチンの発見とその分子メカニズムの解析
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Cilostazol and L-carnitine have been used as a first-line drug and supplement, respectively, in patients with peripheral arterial disease with intermittent claudication. In this study, the effect of the combination of cilostazol and L-carnitine has been investigated in rats with unilateral hindlimb ischemia. For 28 days, cilostazol and L-carnitine were administrated separately or as a combination. The distance walked before gait disturbance developed was measured using a treadmill for 5 days a week. The capillary density of the ischemic hindlimb was evaluated by immunohistochemical staining at days 7, 14, 21, and 28. Angiogenic, energy metabolic and muscular subtype gene expressions were measured by real-time RT-PCR at days 7 and 28. The greatest increase in the distance was observed in the combination therapy group when compared to the other groups. The capillary density in the adductor muscles of rats treated with cilostazol alone and combination therapy increased at day 28. Angiopoietin-2/Angiopoietin-1 expression ratios were higher, suggesting the promotion of angiogenesis, with cilostazol alone and combination therapy at day 7. Angiopoietin-2/Angiopoietin-1 and platelet-derived growth factor were higher with cilostazol alone at day 28, although these expressions did not change with combination. Isocitrate dehydrogenase α expressions were higher, suggesting the enhancement of energy metabolism, with l-carnitine alone and combination therapy at day 28. This is the first study to show functional improvement of the hind limb following combination therapy with cilostazol and L-carnitine in experimental animals. This study also revealed that cilostazol promotes angiogenesis, and L-carnitine additively contributes to functional improvement via enhancement of energy metabolism.【緒言】
末梢動脈疾患(Peripheral Arterial Disease, PAD)は、動脈硬化などにより主に下肢の血流障害が起こり、間歇性跛行や疼痛、壊死を生じる疾患である。シロスタゾールはPADの間歇性跛行に対して歩行距離を延長させる第一選択治療薬である。しかしながら、過去にはシロスタゾール投与によって歩行距離が1.5倍以上延長する著効患者は全体の約2割しかおらず、約1割の患者では無効であるとの報告があり、また歩行距離は延長するものの有効性が低い患者に対しては重度の頭痛や動悸といった副作用が出現するため、多くの患者ではさらなる歩行距離の延長を目的としたシロスタゾールの増量が困難な点が克服すべき課題として残されている。本研究では、シロスタゾール単剤の薬効を上回る併用候補化合物としてのL-カルニチンの発見とその分子メカニズム解析を目的としてPADモデルラットを用いて研究を行った。
【第1章】候補化合物L-カルニチンのシロスタゾールの歩行機能改善増強作用の発見について
〔目的〕L-カルニチンは生体内で合成されβ酸化において重要な役割を担う化合物であり、代謝改善薬としても様々な疾患に利用されている。また、L-カルニチンは弱いながらも間歇性跛行患者の歩行距離を延長させることが報告されている。臨床応用および安全性の点から、本研究ではシロスタゾールの歩行機能改善作用を増強する候補化合物としてL-カルニチンに着目し、PADモデルラットにおけるシロスタゾールとの併用作用について検討を行った。
〔材料と方法〕9週齢の雄性Sprague Dawleyラットを麻酔下で開腹したのち左側腸骨動脈を結紮してPADモデルラットを作出し、結紮1週間後から溶媒または薬物を28日間投与(経口投与、1日2回)した。対照(溶媒)群、シロスタゾール(30 mg/kg)群、L -カルニチン(300 mg/kg)群、併用群の4群で比較を行った。投与開始日から後肢虚血の程度の指標として歩行距離を測定した。歩行距離はトレッドミルで跛行が生じるまでの距離(Distance before Gait Disturbance, DGD)で評価した。
〔結果と考察〕対照群と比較してシロスタゾール群およびL -カルニチン群のDGDは有意に増加し、シロスタゾールおよびL -カルニチンの併用群では各単剤をさらに上回るDGDの増加が認められた。シロスタゾールおよびL -カルニチンの併用は従来の薬物療法の歩行機能改善作用を上回る併用療法となり得る可能性が見出された。
【第2章】シロスタゾールおよびL-カルニチン併用のメカニズム解明について
[第1項] 血管新生促進作用およびその関連遺伝子の発現解析
〔目的〕シロスタゾールはPAD患者における血中の血管内皮増殖因子(VEGF)の上昇や、PADモデルマウス研究において血管新生促進作用が示唆されており、歩行機能の改善にはこれらの作用が寄与していると考えられる。したがって、前章で認められた歩行機能改善作用について血管新生促進作用の関与に着目して、虚血肢内転筋の血管密度を評価し、L-カルニチンの併用作用の影響を検討することを目的とした。また、主要な血管新生関連遺伝子のmRNA発現量の変化についても比較評価を行った。
〔材料と方法〕各薬物の投与7，14，21および28日目の虚血肢内転筋を採材し、筋重量を測定した。CD31抗体を用いて虚血肢内転筋における血管内皮細胞の免疫組織化学染色を行い、筋線維あたりの血管内皮細胞の割合を血管密度として測定を行った。また、各薬物の投与7および28日目の虚血肢内転筋のmRNAを抽出し、血管新生関連遺伝子として代表的なVEGFおよびAngiopoietin (Ang )1, Ang2
とそれらの受容体の発現量をreal-time RT-PCRの絶対定量法で比較した。また、血管新生促進作用が報告されている肝細胞増殖因子(HGF )、血小板由来増殖因子(PDGF )、線維芽細胞増殖因子(FGF )2、および低酸素誘導因子(HIF )2αの発現量についてもΔΔCt法により評価を行った。
〔結果と考察〕投与7，14および21日目における内転筋重量、血管密度はどの群においても有意な変化は認められなかった。投与28日目において、シロスタゾール群で内転筋重量の有意な増加が認められたものの、体重補正後の内転筋重量では差は認められなかった。また、投与28日目におけるシロスタゾール群およびL -カルニチンとの併用群の血管密度で有意な増加が認められた。シロスタゾール群とL-カルニチン併用群の血管密度の増加は同程度であった。mRNA発現量について、VEGFおよびその受容体であるFlt-1, Flk-1の各群における発現量の変化は認められなかった。血管新生優位の指標となるAng2/Ang1は、投与7日目において、シロスタゾール群およびL-カルニチン併用群で有意な上昇が認められ、投与28日目においてはシロスタゾール群のみで上昇が認められた。Angの受容体であるTie1およびTie2の発現量に変化は認められなかった。また投与28日目のシロスタゾール群でのPDGFの発現量が有意に増加していた。L -カルニチンはシロスタゾールの血管新生促進作用にmRNA発現量レベルで影響を与えていることが示唆された。
[第2項] 筋線維タイプおよびエネルギー代謝関連因子の発現解析について
〔目的〕前項でシロスタゾール群の血管新生促進作用およびL -カルニチン併用群で血管新生関連遺伝子のmRNA発現量の変化が認められたものの、第1章で確認された併用群での大幅な歩行機能改善作用を説明できるものではなかった。そこでL -カルニチンのエネルギー代謝改善作用から筋線維タイプおよびエネルギー代謝因子に着目した。筋線維にはタイプ1線維とタイプ2線維の二種類のタイプが存在し、タイプ2線維はさらに2aと2bに分けられる。タイプ1線維は遅筋線維とも呼ばれ、好気的エネルギー産生に優れているのに対して、タイプ2線維は主に解糖によるエネルギー産生に優れており速筋線維とも呼ばれる。慢性のPAD患者では筋線維のタイプがタイプ1線維へ変化し、また、間歇性跛行患者では好気的エネルギー産生の場であるミトコンドリアの筋肉における含有量が増加していると報告されている。また、筋線維タイプの変化とは別に筋肉内のエネルギー産生系に関わる因子の発現にL -カルニチンが直接作用している可能性も考えられる。実際、間歇性跛行患者の筋肉組織におけるエネルギー産生系に関与する酵素の活性や発現が変化していることが報告されているため、そのような変化にL -カルニチンが影響を与えることは十分に推察される。本項では虚血肢内転筋における筋線維タイプおよび主要なエネルギー代謝関連因子の発現量について比較検討を行うことを目的とした。
〔材料と方法〕材料は前項で用いた投与7および28日目の虚血肢内転筋mRNAサンプルを用いた。筋線維タイプはミオシン重鎖(Myosin heavy chain, MyHC)のサブタイプを指標にMyHC1 (タイプ1)、MyHC2a (タイプ2a)およびMyHC2b (タイプ2b)の発現量を測定した。また、エネルギー代謝関連因子として、細胞内へのグルコースの輸送を担い解糖系の入り口となるGlut1、ピルビン酸がTCA回路へ入る反応を担うピルビン酸脱水素酵素を阻害しTCA回路の律速酵素ともなるPyruvate dehydrogenase kinase (PDK)、電子伝達系に利用されるNADHの産生を担うIsocitrate dehydrogenase (IDH) α、β酸化の指標としては長鎖アシルCoAとカルニチンを基質としてアシルカルニチンとCoAにする反応を触媒するCarnitine palmitoyltransferase 1 (CPT-I)に着目してreal-time RT-PCRのΔΔCt法による検討を行った。
〔結果と考察〕筋線維タイプについては、投与7日目のシロスタゾール群および併用群で、投与28日目の全群(シロスタゾール群、L -カルニチン群および併用群)で対照群と比較してMyHC2bの発現量の低下が認められた。エネルギー代謝関連因子では、L-カルニチン群および併用群での投与28日目のIDHαの発現量の有意な増加が認められた。対照群と比較してどの群に置いても主に解糖系を中心にエネルギー代謝を行うタイプ2bの発現量が低下していたことから、虚血肢内転筋では他の筋線維の発現が優位であることが示唆された。また、L -カルニチン群および併用群でIDHαの発現量が増加していたことから、L -カルニチンが好気的エネルギー代謝を促進していることが示唆された。
【総括】
本研究により、シロスタゾールおよびL -カルニチンの併用はシロスタゾール単剤の歩行機能改善作用を上回る薬物療法になる可能性を見出すことができた。また、シロスタゾールは血管密度およびAng2/Ang1やPDGFのmRNA発現量の増加による血管新生促進作用が歩行機能改善作用に寄与し、L -カルニチンはエネルギー代謝関連因子のひとつであるIDHαの発現量を増加させ歩行機能を改善させることが示唆された。シロスタゾールおよびL -カルニチンの併用療法では、これらの作用が相加相乗的に寄与し、従来の有効性を上回る歩行機能改善作用が発揮されたことが推察された。doctoral thesi
The Study on the Involvement of Periostin in the Pathophysiology of Atopic Canine Skin
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Introduction
Canine atopic dermatitis (cAD) is a common, pruritic and allergic skin disease of dogs that shares several clinicopathological features with human atopic dermatitis (hAD). In hAD, periostin (PO) is assumed to play a critical role in the enhancement and chronicity of allergic skin inflammation; however, the pathogenesis of cAD involved of PO has been unknown. Also, the inducer of PO in the canine skin has not been clarified. Therefore in Chapter 1, the author investigated the expression of the PO protein and mRNA in healthy, atopic, and nonatopic inflamed skin in dogs. In Chapter 2, the author focused on IL-13 and TGF-β1 which were assumed to be inducing factor of PO, using skin tissues of cAD as well as canine cultured keratinocytes and dermal fibroblasts. Next, the function of PO was examined using culture canine keratinocytes by proliferation assay, microarray and real time quantitative RT-PCR.
Chapter 1: Expression of Periostin in Normal, Atopic, and Nonatopic Chronically Inflamed Canine Skin
The aim of this chapter was to examine the expression patterns of PO in healthy, atopic, and nonatopic chronically inflamed canine skin. Biopsy specimens from 47 dogs with skin disease, and normal skin tissue from 5 adult beagles were examined by light microscopy, immunohistochemistry (IHC), and in situ hybridization (ISH). In normal skin, PO was localized just beneath the epidermis and around the hair follicles. In chronically inflamed skin, PO expression was most intense in the dermis with inflammatory cell infiltrates. In contrast, low levels of PO were detected in acutely inflamed and noninflamed skin. Conversely, all cAD tissues characteristically showed the most intense expression of PO in the superficial dermis. ISH showed that PO mRNA was broadly expressed in the basal epidermal keratinocytes, outer root sheath cells, and dermal fibroblasts in normal dog skin. High expression of PO mRNA was observed in fibroblasts in dog skin with chronically inflamed dermatitis. Moreover, in some chronically inflamed skin specimens, PO mRNA expression was increased in basal keratinocytes. The severity score of chronic pathological changes and CD3+ cell number in the dermis were correlated with distribution pattern of PO in the atopic skin. These data suggest that PO is able to play a role in the pathophysiology of chronic dermatitis, including cAD.
Chapter 2: Involvement of IL-13 in the Induction of Periostin, and Effect of Periostin on Keratinocytes
From the results of Chapter 1, it was suggested that PO might be involved in the pathogenesis of chronicity in cAD. Therefore, the author tried to clarify the mechanism of the amplification and chronicity of dermal inflammation by PO in canine atopic skin in this chapter. By double-labeled ISH, IL-13 mRNA positive cells were detected near the keratinocytes and fibroblasts expressing PO mRNA in the dermis of atopic skin. TGF-β1 mRNA positive cell was not seen in all atopic skins. By in vitro assay, IL-13 induced the gene expression of PO in both canine dermal fibroblasts and keratinocytes. PO enhanced in vitro growth of canine keratinocytes. Moreover, among the PO-induced genes in cultured canine keratinocytes detected by microarray, the author identified IL-25 and KDAP as possible mediators in canine atopic skin. Also, real time PCR analysis revealed up-regulation of both IL-25 and KDAP gene expression in PO-stimulated keratinocytes. These data suggest that IL-13 possibly derived from Th2 cells stimulates PO production in both keratinocytes and fibroblasts, and then PO may play a critical role in the pathophysiology of cAD, especially in the enhancement and chronicity of skin lesion via IL-25 and KDAP.
Conclusion
The author proposed a novel hypothesis that PO induced by IL-13 contributes to the enhancement and chronicity of allergic skin inflammation in canine atopic skin. The findings of the present study provide a molecular basis for considering PO and IL-13 as a potential therapeutic targets for cAD.アトピー性皮膚炎（AD）は、ヒトや動物で発症する慢性アレルギー性掻痒性の皮膚疾患で、Th2型免疫反応の増強や皮膚バリアの破綻を特徴とする。ADは一度発症するとアレルゲンの侵入がなくても炎症が持続・慢性化するが、この慢性化機序の詳細は不明であり、このメカニズムの解明はADの根本的治療法開発のために重要である。
イヌのAD（cAD）は高い罹患率（10-15%）を示し、激しい掻痒による生活の質（QOL）の低下を引き起こすことから小動物臨床上重要な疾患である。また、cADはヒトのAD（hAD）と発症時期、病変分布およびTh2を主体とする免疫病態などの点で類似し、またイヌはヒトと生活環境を共にすることから、cADはマウスモデルでは成しえない自然発症のhADモデルとしても有用性が示されている。
ペリオスチン（PO）は細胞外マトリックスの一種である。POはTGF-βやIL-13により誘導され、細胞表面上のαvβ1、αvβ3およびαvβ5インテグリンに結合し、組織の発生、増殖および再構成に関与することが知られている。また、POは細胞増殖やサイトカイン誘導を介してアレルギー性炎症の慢性化機序に関与していることが示唆されており、実験的にはPO欠損マウスは野生型と比較しADや喘息といったアレルギー性の病態が軽減することが報告されている。これらはADや喘息においてPOを軸とした負の連鎖が皮膚の炎症の慢性化に大きく係わっている可能性を示唆している。しかしながら、自然発症AD症例においては、hAD患者の皮膚組織を用いたPO免疫染色と血清PO測定がPOとAD慢性化に関する数少ない先行研究であり、cADの病態におけるPOの関与については不明である。
そこで本研究では、POに着目してcADの慢性化機序を解明することを目的とし、第1章では健常犬およびcADを含めた皮膚疾患罹患犬の皮膚におけるPOのタンパク質の発現解析とPO産生細胞の同定を実施し、第2章ではcAD皮膚組織とイヌの培養細胞を用いてcADにおけるPO誘導因子をIL-13とTGF-β1に着目して検索した。また、POの機能的役割について、特にケラチノサイトに対する細胞増殖およびサイトカイン産生誘導性に着目して解析した。
第1章：健常犬およびcADを含む皮膚疾患犬におけるPO発現解析
当研究室で病理検査を実施したイヌの皮膚疾患生検47例（cAD 9例、他の慢性皮膚炎32例、急性皮膚炎 2例、非炎症性皮膚疾患4例）、並びに比較対象として健常犬5例について検索した。
1-1. 健常犬におけるPO発現解析
健常犬皮膚のPO発現パターンは、これまでの正常マウスやヒトの報告と類似していた。すなわち、免疫染色でPOタンパク質は表皮真皮境界部と毛包周囲に少量沈着し、in situハイブリダイゼーション法（ISH法）で、PO mRNAは表皮のケラチノサイト（角化細胞）、外毛根鞘細胞および真皮の線維芽細胞において発現しており、これらの細胞が健常犬におけるPO産生細胞と考えられた。また、健常犬皮膚組織を用いてPO遺伝子のTAクローニングを実施した。シークエンス解析の結果、predictedイヌPO mRNA（Accession number XM_003433308）との相同性が100%、predictedヒトPO mRNA（Accession number XM_005266231.2）との相同性が約92%であった（DDBJ accession number LC008358）。
1-2. cADを含む皮膚疾患罹患犬におけるPO発現解析
PO免疫染色の結果、慢性皮膚炎の真皮において線維化や炎症細胞浸潤などの炎症性病変部に一致してPOが強く沈着していた。例えば、POは脂腺の破壊を特徴とする脂腺炎では毛包周囲に強く沈着し、真皮深層～皮下組織での炎症を特徴とする無菌性脂肪織炎では同部位への沈着が認められた。一方、急性皮膚炎や非炎症性皮膚疾患では健常犬と比較してPOの発現上昇は認められなかった。またcADでは他の慢性皮膚炎と比較して、真皮により強いPO沈着があり、さらに真皮表皮境界部における強い沈着が特徴的であった。また、cADにおけるPO沈着量は表皮肥厚、真皮線維化およびCD3陽性細胞浸潤数の3項目において組織学的重症度と正相関が認められた。さらにISH法により、cAD病変部の真皮線維芽細胞およびケラチノサイトにPO mRNAの発現を認め、これらがcADにおける主要PO産生細胞であることを明らかにした。
以上、正常犬および皮膚疾患罹患犬の皮膚におけるPOの局在と産生細胞、並びにcADにおける特徴的な分布パターンを明らかにした。cAD罹患犬においてPOは真皮に強く発現しており、そのPO沈着パターンは既報のhADにおけるそれと類似していた。さらに、ISH法により自然発症ADの皮膚におけるPO mRNA発現を初めて明らかにした。これまで主に培養細胞を用いた先行研究から、hADにおけるPO産生細胞は線維芽細胞と考えられていたが、cAD罹患犬においてPO mRNAはケラチノサイトにも高発現しており、またその直下におけるPO沈着が特徴的であった。これらの結果から、cADにおいてはケラチノサイトがPOの主要な産生細胞の一つであり、AD慢性化に中心的な役割を果たしている可能性が示唆された。
第2章：IL-13のPO誘導性およびPOのケラチノサイトに対する効果に関する研究
2-1. PO誘導因子同定
cADの皮膚5検体を用いて、二重ISH法によりPOとIL-13/TGF-β1 mRNA発現を評価した。全例においてケラチノサイトおよび線維芽細胞にPO mRNA発現を認め、その近傍にIL-13 mRNA陽性細胞の浸潤を認めた。このIL-13 mRNA陽性細胞は真皮に浸潤する小型円形細胞であり、一部は表皮内にも浸潤していた。一方、TGF-β1 mRNA陽性細胞はcAD皮膚組織中に認められなかった。
二重ISH法の結果から、cADの皮膚病変におけるPOの誘導因子としてIL-13が想定されたため、健常犬皮膚から遊走法により採材し確立した培養線維芽細胞及びイヌケラチノサイト細胞株（CPEK）を用い、IL-13のPO mRNA誘導性を評価した。Real time PCR法により両細胞におけるrIL-13（50ng/μL）添加によるPO mRNA発現を評価したところ、CPEKでは添加6および24時間後、培養線維芽細胞では24時間後に、PO mRNAの発現上昇が認められた。
2-2. POの機能解析
POのケラチノサイトに対する機能的役割について、特に増殖活性と遺伝子動態の変化に着目して検索した。
細胞増殖アッセイはCCK-8（同仁化学研究所、熊本）を用いて実施し、CPEKへのrPO（4µg/ml）添加24時間後に細胞増殖活性の亢進を認めた。
DNAマイクロアレイ法はCanine (V2) Gene Expression Microarray (4x44k, two-color array)(Agilent Technologies)を用いて実施した。CPEKへのrPO（4µg/ml）添加により発現が増加した遺伝子を網羅的に解析し、その結果IL-25およびケラチノサイト分化関連タンパク質（KDAP）を同定した(GEO Series accession number GSE77041)。マイクロアレイ法の結果を受けて、Real time PCR法を実施したところrPO（2µg/ml）添加により、CPEKにおけるIL-25およびKDAP mRNA発現量は各々36および2時間で有意に上昇した。
以上より、cADにおいては、炎症細胞が産生するIL-13が引き金となりケラチノサイト及び線維芽細胞のPO産生が亢進していることが示唆された。cADの皮膚におけるIL-13 産生細胞はその形態からT細胞、特にTh2細胞と考えられた。IL-13はADモデルマウスにおけるPO誘導因子であると報告されているが、本研究では自然発症ADの皮膚におけるIL-13とPOの関連を初めて明らかにした。
IL-25はTh2誘導性サイトカインの一種であり、hAD患者のケラチノサイトに高発現してフィラグリン遺伝子を減少させ、皮膚バリア機能を低下させることが知られている。本研究より、cADにおいてIL-13により誘導されたPOがケラチノサイトに作用し、IL-25を誘導することが示唆され、このIL-25を介してTh2型免疫反応増強および皮膚バリア破綻などを引き起こし、イヌAD皮膚病変を慢性化させていることが考えられた。
POは細胞増殖と関連する因子であることが示唆されており、PO欠損マウスはハウスダストマイトによるアレルギー刺激によっても表皮肥厚を呈さないことが報告されている。一方、KDAPは近年同定された分泌タンパク質であり、ヒトやイヌの慢性炎症の皮膚において高発現し、ケラチノサイトの分化に関連することが示唆されている。したがって本研究の結果からPOにより誘導されたKDAPがcADの皮膚における表皮肥厚と関連している可能性が示唆された。
【総括】
本研究によりこれまで未知であったcADの慢性化メカニズムの一端が解明された。すなわち、Th2細胞より産生されたと考えられるIL-13の刺激によりケラチノサイトと線維芽細胞によるPO産生が誘導され、このPOはIL-25とKDAPという2つの因子を介してcADの皮膚病変の増悪と慢性化を引き起こしているというカスケードが示唆された。
現在AD症例に対する治療はグルココルチコイドなどの免疫抑制剤が主体であるが、一部のhADおよびcAD症例はステロイド抵抗性を示すことが知られている。イヌは自然発症例、細胞培養、動物実験の3側面からADの病態をとらえることができることから、AD研究の発展には比較医学である獣医学が重要な役割を担うと考えられる。本研究の結果を基盤として、今後はADモデル犬などのin vivo実験系に発展させていくことで、POやPO関連分子として同定したIL-13およびIL-25を標的としたADの新規治療法の開発が期待できると考えられた。
第一章および第二章の一部は、以下の論文に公表した。
Mineshige T, Kamiie J, Sugahara G, Yasuno K, Aihara N, Kawarai S, Yamagishi K, Shirota M, Shirota K.: Expression of Periostin in Normal, Atopic, and Nonatopic Chronically Inflamed Canine Skin. Veterinary Pathology. 52: 1118-26. 2015.doctoral thesi
Study on immunological analysis and immunotherapy for canine food allergy.
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Canine food allergy is an important allergic disease, which is caused by environmental and genetic factors. In humans, improvement of environmental hygiene is a factor of increasing allergic diseases, and it is called “hygiene hypothesis”. Recently, dogs have been living in the same environment as humans. Thus, the canine food allergy could be caused by the improvement of environmental hygiene as well as humans. On the other hand, genetic factors are associated with the development of canine food allergy because dogs of certain breeds frequently develop the canine food allergy. The pathology of canine food allergy is classified into IgE-mediated and non-IgE-mediated, which are intricately associated with the development of canine food allergy. Therefore, it is difficult to elucidate a mechanism of canine food allergy and establish efficient diagnoses and treatments. At present, food elimination therapy is used as common treatment for the canine food allergy. However, curative therapy for the canine food allergy has still not been established in veterinary medicine. If the curative therapy can be established, it will be a benefit for veterinary medicine. This study aimed to perform immunological analysis of canine food allergy and develop the curative therapy.
First, pedigree dogs that have a high prevalence rate of the canine food allergy were examined. In case of single gene disorder, inheritance pattern in the pedigree was supposed to be autosomal dominant inheritance. All the dogs with canine food allergy exhibited non-IgE-mediated food allergy. Causative food allergens in three of the dogs with canine food allergy were determined by food provocation test. Two of the three dogs showed proliferation of causative food allergen-specific lymphocyte in lymphocyte proliferation test. The immunological mechanism of non-IgE-mediated food allergy is still not well understood. The dogs in this pedigree is useful as a model animal of non-IgE-mediated food allergy.
Second, serological analysis was performed in dogs with IgE-mediated food allergy. Levels of specific IgE to crude egg white allergen which is common food allergen were measured. Eight of 82 dogs with cutaneous adverse food reaction showed IgE reactivity to crude egg white allergen. Moreover, IgE reactivity to four purified egg white allergens which are characterized in human studies was investigated in the eight dogs with IgE reactivity to crude egg white allergen. Six of the eight dogs showed IgE reactivity to ovomucoid and ovalbumin, and three of the eight dogs showed IgE reactivity to ovotransferrin. Additionally, the result indicated that ovotransferrin did not have a linear epitope. Thus, it can be considered that ovotransferrin is less important as food allergen. In this study, ovomucoid and ovalbumin appear to be major purified egg white allergens in dogs, and these results provided important data for study on IgE-mediated canine food allergy.
Third, a basis examination of oral immunotherapy using allergen-expressing recombinant lactic acid bacteria was performed in a mouse model. To improve the therapeutic effect of oral immunotherapy as a candidate of curative therapy for food allergy, lactic acid bacteria were used as a transport carrier of allergens in this experiments. Ovalbumin-expressing Lactobacillus casei was orally administrated to mice, and anti-allergic effects of ovalbumin-expressing L. casei were examined. There were no differences in anaphylactic reaction and serum ovalbumin specific IgE levels between ovalbumin-expressing L. casei administration group and other groups. Thus, anti-allergic effect of ovalbumin-expressing L. casei was not confirmed. Further study is needed to develop allergen-expressing L. casei which could demonstrate sufficient anti-allergic effects.
In conclusion, the immunological analysis of IgE-mediated and non-IgE-mediated canine food allergy were performed in this study. Oral immunotherapy using allergen-expressing lactic acid bacteria as a curative therapy for canine food allergy was examined. However, the anti-allergic effect of allergen-expressing recombinant lactic acid bacteria could not be confirmed. Further studies will be needed to identify the immune pathology of canine food allergy and to develop effective and curative therapy for canine food allergy.イヌの食物アレルギーは重要なアレルギー疾患の一つである。食物アレルギーは環境要因と遺伝要因の両方が発症に関連していると考えられている。ヒトでは衛生環境の清浄化がアレルギー疾患の増加の一因だと考えられており、「衛生仮説」が提唱されている。近年、イヌもヒトと同じ環境で生活するようになっており、衛生環境の清浄化がイヌの食物アレルギーの発症にも影響を与えていると考えられる。また、食物アレルギーを発症しやすい犬種が報告されていることから、遺伝要因がイヌの食物アレルギーの発症に関わっていることも推測される。食物アレルギーの病態は大きくIgE依存性とIgE非依存性に分けられる。これらの病態が複雑に影響していることがアレルギーの機序の解明や診断方法・治療法の確立を困難にしている。現在、食物アレルギーの治療は原因食物の摂取を回避することが一般的に行われている。しかしながら、根本的な治療法は確立されていない。イヌの食物アレルギーを正確に診断し、有効な根治療法を適用できるようになれば、獣医療にとって大きなメリットがあると思われる。本研究の目的はイヌの食物アレルギーの免疫学的な解析を行い、それに対する治療法の研究開発を行うことである。
第1章では、高い頻度で食物アレルギーを発症する家系のイヌを調査した。本家系における食物アレルギーは常染色体優性遺伝が推定された。すべての食物アレルギーのイヌはIgE非依存性の食物アレルギーを示した。一部の食物アレルギーのイヌに対して食物負荷試験を実施し、食物負荷試験の前後で抗原特異的リンパ球の増殖能を検討したところ、3頭中2頭は原因食物アレルゲン特異的リンパ球の活性化が認められた。IgE非依存性食物アレルギーについての研究を行う上で、モデル動物として本研究の家系のイヌを用いることは意義があると考えられる。ヒトにおいてもIgE非依存性食物アレルギーの免疫学的機序は未だに不明な点が多く、今後、イヌの分野でも研究を進めて行く必要があると思われる。
第2章では、IgE依存性の食物アレルギーのイヌの血清学的解析を行った。一般的な食物アレルゲンである卵白の粗抗原に対するIgEを測定したところ、食物有害反応犬82頭中8頭（9.8%）が陽性を示した。ヒトにおいて調べられている4つの卵白精製抗原に対するIgE反応性を卵白粗抗原特異的IgE陽性を示した8頭のイヌで調べた結果、8頭中6頭（75.0%）はオボムコイドとオボアルブミンに陽性を示し、8頭中3頭（37.5%）はオボトランスフェリンに陽性を示した。本研究において、ヒトと同様にオボムコイドとオボアルブミンがイヌの主要な卵白精製抗原だということが示唆された。本研究におけるイヌの卵アレルギーはヒトのモデルとしても有用であることが判った。
第3章では、マウスを用いてアレルゲン発現組換え乳酸菌の経口免疫療法の基礎的検討を行った。食物アレルギーの根治療法の候補として研究されている経口免疫療法のさらなる治療効果向上を目的として、プロバイオティクスとして注目されている乳酸菌をアレルゲンの輸送担体として用いて実験を行った。卵白精製抗原であるオボアルブミンを発現したLactobacillus caseiをマウスに経口投与し、オボアルブミン発現L. caseiの抗アレルギー効果を検討した。オボアルブミン発現L. caseiを投与した群のアナフィラキシー反応や血清中IgEの結果は他の群と比較して違いがなく、抗アレルギー効果は認められなかった。今後、経口免疫寛容誘導に必要な抗原量の検討を行い、それらの情報を基にアレルゲン発現L. caseiの改良を行う必要があると考えられる。
本研究では、イヌのIgE依存性ならびに非依存性の食物アレルギーの免疫学的な解析を行った。さらにイヌの食物アレルギーの根治療法として、アレルゲン発現組換え乳酸菌を用いた経口免疫療法の基礎的な研究を行った。イヌの卵アレルギーにおいて卵の各精製アレルゲンに対するIgE抗体の反応性を検討して、ヒトの卵アレルギーにおけるIgE反応性とよく似ていることを明らかにした。本研究のイヌの卵アレルギーはヒトのモデルとしても有用であることが判った。また、本研究における遺伝的に非依存性食物アレルギーを発症するイヌも食物アレルギーを研究する上で有用なモデルとなると思われる。アレルゲン発現組換え乳酸菌を用いた経口免疫療法については今後さらなる研究を行い、有効な根治療法の開発をしていく予定である。doctoral thesi
Studies on the regulation of gene expression of BMP pathway-specific R-Smad, Smad8/9
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Transforming growth factor-β(TGF-β) family members, comprising three subfamilies, TGF-β, activin and bone morphogenetic protein (BMP) groups, are pluripotent growth/differentiation factors involved in diverse physiological processes. They transmit signals through a complex formation consisting of a ligand, type I and type II receptors. Activation of receptor complexes resulting from ligand binding induces the phosphorylation of receptor-regulated (R)-Smad, followed by complex formation with Co-Smad, Smad4. Subsequently, R-Smad and Co-Smad translocate into the nucleus where they participate in transcriptional regulation of target genes. R-Smad is categorized into two subclasses: BMP pathway-specific R-Smad (Smad1/Smad5/Smad8/9), and TGF-β/activin pathway-specific R-Smad (Smad2/Smad3).
We previously showed that the expression of Smad8/9 is decreased in response to the differentiation stimulation of myoblasts into myotubes. This change of expression in Smad8/9, but not Smad1 and Smad5, paralleled changes in endogenous BMP activity. We also find the up-regulation of Smad8/9 expression in 3T3-L1 during the differentiation; so far, it is known that among Smads, only Smad6/Smad7, inhibitory Smads, are inducible genes by the TGF-β family. These findings suggested that unlike the other R-Smads, Smad8/9 is a target gene for the BMP pathway. In this study, we examined regulation of the expression of Smad8/9 by BMPs.
Chapter 1
To examine the up-regulation of Smad8/9 expression, we detected mRNA level of Smads in various cell types using RT-qPCR. Treatment with BMP4 for 2 h increased Smad8/9 expression in all examined cells. The expression levels of R-Smads other than Smad8/9 were not affected by BMP4. In addition, the up-regulation of Smad8/9 expression was also detected in cells treated with BMP2. Both TGF-β1 and activin A did not substantially increase Smad8/9 expression. These results suggests that Smad8/9 is a unipue R-Smad gene regulated at the mRNA level through BMPs.
Chapter 2
To investigate the character of Smad8/9 up-regulated by BMP4, we analyzed nucleotide sequences.
1) Determination of Smad8 or Smad9
The nucleotide sequence of mouse Smad9 indicates that six nucleotides are inserted at nt +961 of mouse Smad8. According to analysis of nucleotide sequences, C2C12 cells express Smad8, whereas the other examined cells express Smad9. Moreover, the nucleotide sequencing in 3T3-L1 cells reproducibly indicated the expression of both Smad8 and Smad9.
2) Detection of Smad8/9 splicing variants
There are some reports about splicing variants of Smad8/9 in human. We detected Smad8/9 variants 1 and 2 in mouse cells. BMP4 increased the gene transcript level of all 3 Smad8/9, that is, wild-type, variants 1 and variant 2, but the stimulated BMP pathway substantially increases activity of wild-type Smad8/9.
Chapter 3
To examine the molecular mechanism underlying the regulation of Smad8/9 expression, the effects of cycloheximide, an inhibitor of protein synthesis, on BMP-induced Smad8/9 expression were examined. Smad8/9 expression by BMP4 was up-regulated, regardless of treatment with cycloheximide, suggesting that Smad8/9 expression by BMP is transcriptionally regulated.
We next examined the BMP-induced transcription of Smad8/9 by luciferase-based reporter assays using the Smad8/9 promoter. BMP4 increased the expression of luciferase, and pretreatment with LDN-193189, an inhibitor of BMP type I receptors, suppressed the responsiveness to BMP4 in C2C12 and 3T3-L1 cells. These result suggested that BMP-induced Smad8/9 expression is transcriptionally regulated through the activation of BMP type I receptors.
Chapter 4
Next we explored the potential region within the Smad8/9 promoter responsible for transcriptional activation in response to BMP4 treatment using deleted mutants of the Smad8/9 reporter. The deletion of 330bp within 1,000bp upstream of the Smad8/9 gene decreased responsiveness to BMP4 in C2C12 and 3T3-L1 cells. BMP4 did not induce transcriptional activation, when Smad8/9(-43)-luc was used in both cells, indicating that BMP-responsive elements(BREs) are located at the distal region of nt -43 of the Smad8/9 promoter.
Examination of the nucleotide sequence indicated five potential BREs within nt -121 of the Smad8/9 promoter. According to reporter plasmids with individual or combinational mutation of the BREs, all five BREs are necessary for BMP-induced Smad8/9 transcription, although BRE-3 is the most critical region.
We further explored whether Smad1/5/8 binds to the region including BREs of Smad8 gene in C2C12 cells by ChIP assay, indicating that phosphorylated Smad1/5/8/9 binds to the BREs of Smad8 gene, and that the binding is dependent on BMP signaling in C2C12 cells.
We demonstrate that Smad8/9 is an exceptional R-Smad positively regulated by BMPs at the mRNA level, and that gene induction occurs in multiple cell types in Chapter 1. In addition, we showed that expression of
Smad8 and Smad9 is cell-type dependent, there is some splicing variants of Smad8/9 in mouse cells in Chapter 2. In Chapter 3, Smad8/9 gene expression is transcriptionally regulated by BMP and this gene expression regulated via the BMP pathway were revealed. Finally, we demonstrated that several BREs within nt -121 of the Smad8/9 promoter are involved in the transcriptional activation of Smad8/9 in Chapter 4.
The present study reveals that Smad8/9 is a unique R-Smad regulated through the BMP pathway at the mRNA level. We has not been shown in biological process yet, however, further studies to explore the biological role of Smad8/9 clarify the significance of Smad8/9 gene induction.Bone morphogenetic protein（BMP）はTransforming growth factor-beta（TGF-β）ファミリーに属するサイトカインであり、生体内での役割は、細胞分裂の制御や、初期胚のパターン化、細胞分化の決定など多岐にわたる。BMPによるシグナル伝達は、主に細胞内シグナル伝達因子であるSmadを介して行われる。すなわち、BMPが細胞膜表面の特異的な受容体に結合すると、receptor-regulated Smad（R-Smad）であるSmad1、5、8/9がリン酸化され、それがcommon-Smad（Co-Smad）であるSmad4とともに核内に移行し、転写因子として働いて標的遺伝子を活性化する。
Smadには上記のSmad1、4、5、8/9のほかに、TGF-βファミリーのBMPとは別グループであるTGF-β、アクチビンのシグナル伝達因子であるSmad2、3（R-Smad）やシグナル伝達を阻害するinhibitory-Smad（I-Smad）であるSmad6、7が知られている。TGF-βファミリーはこれらSmad（1～8/9）のリン酸化を介してその機能を発揮している。これまでにTGF-βファミリーがそれ自身のシグナル伝達因子であるSmadの遺伝子発現を制御する（つまりSmadを標的遺伝子とする）という報告がI-Smadについては知られているが、R-Smadについては見られない。著者らは下記の先行研究において、TGF-βファミリー、特にBMPがそれ自身のR-SmadであるSmad8/9の遺伝子発現を促進していることを見つけた。
1）マウス脂肪前駆細胞由来細胞株（3T3-L1）のTGF-βファミリー刺激下での分化過程における網羅的な遺伝子発現解析で、Smad8/9の発現促進が認められた。この発現促進はTGF-βファミリーの中でBMPによる刺激が最も顕著であり、またこの作用は持続的だった。
2）マウス筋芽細胞由来細胞株（C2C12）の筋分化過程において、内因性BMPの変動に伴い、Smad8/9の遺伝子発現量も変動した。この変化は、他のR-Smad（Smad1、2、3、5）には見られなかった。
これらの事実をきっかけとして、BMPはそのシグナル伝達因子であるSmad8/9の遺伝子を標的としてその発現を制御しているという仮説を立て、BMPによるSmad8/9の遺伝子発現制御について詳細な研究を行った。
第1章 新規なBMP応答遺伝子としてのSmad8/9の遺伝子発現解析
まず、C2C12と3T3-L1を用いてBMP刺激後2時間におけるSmad1～8/9の各遺伝子発現を、qRT-PCRにより定量的に調べた。その結果、これまでに報告されているSmad6、7以外に、Smad8/9のmRNAの著しい発現量の上昇が認められた。Smad1～5の遺伝子発現量には変動が認められなかった。次に、このBMPによるSmad8/9の遺伝子発現促進が各種細胞で起こるのかを確認するため、マウスメラノーマ由来細胞株（B16）、ヒト肝癌由来細胞株（HepG2）、ラット心臓横紋筋由来細胞株（H9c6）、ラット表皮由来初代培養細胞株を用いた。その結果、いずれの細胞においてもBMP刺激によりSmad8/9遺伝子発現の促進が認められた。
TGF-βファミリーの他のメンバーであるTGF-β、アクチビンによるSmad8/9遺伝子発現量の変化についても、C2C12と3T3-L1を用いて調べた。TGF-βまたはアクチビンで2時間刺激したところ、TGF-βとアクチビンのいずれにおいてもBMP刺激で見られたようなSmad8/9の顕著な発現上昇は認められなかった。
以上のことから、TGF-βファミリーのうち、BMPがSmad8/9の遺伝子発現を正に制御しており、この反応はあらゆる細胞において普遍的である可能性が示唆された。
第2章 各種細胞におけるSmad8/9の遺伝子解析
本研究で注目しているSmad8/9は、正確には登録配列上、Smad8とSmad9に分けられる。Smad8のCDS領域（1290bp長）の塩基配列の642番目に6塩基の挿入（2個のアミノ酸挿入；アルギニンとバリン）が見られるものがSmad9であるが、機能的な違いは報告されていない。これらは対立遺伝子と考えられ、通常は区別されずにSmad8/9と表される。第1章において、各種細胞でのSmad8/9 mRNAのqRT-PCRではSmad8とSmad9のいずれも検出できるように、共通プライマーを用いて測定した。しかし、細胞により、BMP刺激によるSmad8とSmad9での遺伝子発現様態が異なることも考えられ、細胞により発現しているSmad8/9 mRNAの塩基配列解析を行いSmad8とSmad9の特定を試みた。その結果、C2C12ではSmad8のみを、B16、HepG2、H9c6およびラット表皮由来初代培養細胞株ではSmad9のみを、そして3T3-L1ではSmad8とSmad9の両方を発現していることがわかり、細胞により異なっていた。クローニングにより3T3-L1で発現しているSmad8とSmad9のmRNA量の割合を調べたところ、それぞれの発現は41%（Smad8）と59%（Smad9）と僅かの偏りがみられた。この偏りは、BMPに対する応答性の違いというよりは、核型解析などからゲノムDNA中に存在するそれぞれの遺伝子の存在割合を反映していると思われた。以上のことより、細胞によりSmad8かSmad9かの遺伝子の違いはあるものの、BMP刺激によるSmad8/9の発現上昇を調べる上でこれらを区別して検討する必要はないと考えた。
また、Smad8/9遺伝子には、いくつかのスプライシングバリアントの配列もマウスにおいて登録されている。そこで、それらのバリアントをそれぞれ検出するプライマーを設定しPCRを行ったところ、BMP刺激によりすべてのバリアントの発現が同程度に促進していた。従って、BMPによるSmad8/9遺伝子発現促進においてSmad8/9バリアントの識別も必要ないと思われた。
このようにBMPは全体としてSmad8/9遺伝子発現を促進していると考えられた。
第3章 BMPによるSmad8/9遺伝子発現促進の制御機構の解析
第1章より、Smad8/9が新規のBMP応答遺伝子であることが示唆されたため、C2C12と3T3-L1を用いてこの遺伝子発現促進の制御機構を調べることとした。
1）タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドを用い、BMP刺激後12時間のSmad8/9の遺伝子発現量をqRT-PCRにより調べたところ、シクロヘキシミドの存在の有無にかかわらず、BMP存在下ではSmad8/9の発現量が増加した。このことから、BMPによって誘導されるSmad8/9遺伝子発現には、BMP刺激後に新たなタンパク質の産生を必要としないことが示唆された。
2）あらかじめ細胞にBMPのI型受容体阻害薬であるLDN-193189を処理しておき、BMPで刺激したところ、Smad8/9のmRNAの発現上昇は見られなかった。また、BMP刺激後に生じるSmad1/5/8/9のリン酸化がLDN-193189によって阻害されることもウエスタンブロットで確認した。このことは、BMPによるSmad8/9遺伝子発現上昇は、BMP刺激後のBMPのI型受容体を介したSmad1/5/8/9のリン酸化が関与していることを示している。
1）、2）より、BMPによるSmad8/9遺伝子発現促進は、BMP刺激後、受容体を介したリン酸化Smad1/5/8/9が直接転写因子として作用して転写段階を制御していると推測した。そこで、マウスのSmad8/9遺伝子の推定プロモーター領域をルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだコンストラクト（Smad8/9の転写開始点を+1として、-1000～+113の領域 : Smad8/9(-1000)-lucとする）を作製し、レポーターアッセイを行った。その結果、BMP存在下ではルシフェラーゼの発光量の著しい上昇が認められた。またLDN-193189を用いるとその応答性は低下した。このことから、BMPによるSmad8/9遺伝子発現促進は転写レベルで制御されていることが確認できた。
第4章 BMPによるSmad8/9遺伝子発現における遺伝子発現制御領域（プロモーター領域）の解析
BMPによるSmad8/9の遺伝子発現の制御領域（プロモーター領域）を詳細に解析するため、Smad8/9(-1000)-lucを基とする9種類のデリーションミュータントを作製し、プロモーターの責任領域の絞り込みを行った。C2C12及び3T3-L1を用いてこれらのミュータントを導入し、レポーターアッセイを行ったところ、BMPに対する応答性は-338からゆるやかに減少し、-4まで欠失させると消失した。したがって、応答領域は-338～-4の領域に位置すると考えられた。この領域において、既知のBMP応答配列（BMP responsive element : BRE）であるGCCGもしくはGC-rich配列を検索したところ、-101～-14にBRE候補が5ヶ所存在していた。これらのBRE候補に様々な組み合わせで変異を加えたコンストラクトを11種類作製し、レポーターアッセイを行ったところ、5ヶ所のBRE候補のいずれにもBMPに対する応答性が認められた。そのうち-51～-46に位置するGGCGCCの6塩基が、最も影響の大きいBRE候補であった。なお、5ヶ所すべてに変異を加えると、BMPに対する応答性は完全に消失した。これらより、BMPによるSmad8/9遺伝子発現促進には、転写開始点の近位上流（-101～-14）に存在するプロモーター領域の5ヶ所すべてのBRE候補が重要であることが示唆された。
続いて、BMPによるSmad8/9遺伝子の転写促進時に、これら5ヶ所のBRE 候補にSmad1/5/8/9タンパク質が結合しているかを調べるために、クロマチン免疫沈降（Chromatin immunoprecipitation : ChIP）を行った。BMP刺激後2時間のC2C12から得られたクロマチンサンプルを、抗リン酸化Smad1/5/8/9抗体により免疫沈降し、沈降したDNA断片を鋳型として上記のSmad8/9遺伝子のプロモーター領域のBRE候補 5ヶ所を含む領域においてPCRによる増幅を試みたところ、目的のサイズの増幅産物が得られた。このことから、BMP刺激時において、本研究でのSmad8/9遺伝子制御機構におけるBRE候補とリン酸化Smad1/5/8/9の結合が細胞内で起こっていることが示された。
以上、本研究により1）Smad8/9遺伝子はBMPの新たな標的遺伝子であり、BMPによるこの遺伝子誘導はあらゆる細胞で普遍的に起こっている可能性があること、2）BMPによるSmad8/9の遺伝子発現は転写レベルで制御されていること、3）BMPによるSmad8/9の転写活性にはSmad8/9遺伝子のプロモーター領域における5ヶ所のBRE候補が関与していること、を示した。すなわち、BMP応答細胞内シグナル伝達因子であるSmad8/9は、その遺伝子発現が転写レベルでBMPによって制御されていること、およびその制御領域を明らかにした。
BMPによる様々な細胞変化（生物現象）は、これまで考えられていたSmad1/5/8/9のリン酸化による活性化だけでなく、Smad8/9それ自体の遺伝子発現を増加させることによっても促進されるのかもしれない。doctoral thesi
The Value of Teaching Old Theories in the Scientific History : Focusing on the Treatment of Use-and-Disuse Theory in High School Biology
Get PDF本研究では，高等学校の生物，特に生物の進化に関わる学説について，科学上の旧理論（用不用説など）が教科書において取扱われていることに着目した。まず，このような旧理論が提示されることは，教授したい（現代では正当とされる）科学理論・学説について，その意義や特徴が明確になることで，生徒の理解や記憶を促進できるからではないか，という仮説を立てた。そして，実際にプレテスト・ポストテストからなる調査を実施することによって，この仮説の検証を試みた。
自然選択説だけではなく用不用説も提示した上で，さらに後者が誤りであることを明示することで，理解（記憶）が促進されることが，結果の一部から示唆された。これは，筆者らの仮説を支持するものである。つまり，科学上の旧理論には，それ自体の教授価値はともかく，現代の理論を学習するうえでの「功利的」な価値を見いだしうるということである。
ただし，今回の調査では，被験者数が限られおり，仮説を支持しない結果も得られた。さらに，被験者が本学の学生のみであることから，一般的な生徒・学生を代表していない可能性もある。また，1週間という短期的なスパンでのポストテストであるため，長期的な記憶や，真の「理解」については，十分には検証できていない。従って，このような結果や考察を一般化するためには，より長期的・多面的な調査，および，他の科学理論についての調査が必要である。
また，実験群においても，科学的に現在では妥当と考えられている学説を選択できていない者が少なくない。このことから，生物授業において両学説を紹介する場合でも，それらがかえって混乱を招かないよう，それらの正誤とその根拠については，注意深く解説する必要がある。さらに，自然選択説などの進化学説の説明においては，キリンの長い首がよく例として取り上げられる（本研究のプレテストでも採用した）が，本研究のポストテスト（チーターの速い脚）のように，他の進化事象も取り上げたり，典型例を応用させるような練習も，理論について深く理解するためには有効であると考えられる。
最後に，本研究では立ち入らなかったが，科学史にはそれ自体にも独自の十分な学習価値があるという主張が，説得力をもってなされている。これについては，福井・鶴岡（2003）で詳しく論じたが，例えばMatthews（1997）は，理科教育において科学史を活用する意義・根拠について，以下の7点をあげている。
1． 歴史は，科学的概念・方法のより良い理解を促進する。
2． 歴史的アプローチは，個人的思考の発達を，科学的アイデアの発展と結び付ける。
3． 科学史は，本質的に，労力をかけるだけの価値がある。科学史・文化史における重要なエピソード―科学革命，ダーウィニズム，ペニシリンの発見など―は，全ての生徒がよく知っているべきである。
4． 歴史は，科学の本質の理解のために，不可欠である。
5． 歴史は，科学テクストや科学クラスに一般に見出される，科学至上主義や独断主義を和らげる。
6． 個々の科学者の生涯や時代を調べることによって，歴史は科学の素材を，それを生徒にとってあまり抽象的ではなくむしろ没頭させるものとしつつ，人間的なものにする。
7． 歴史は，科学のトピック･学科が，その他の人文学科と結び付くのを容認するだけではなく，相互に結び付くことをも容認する。すなわち，歴史は，人間の業績の集約的・相互依存的な本質を表す。
従って，本研究で示唆された旧理論の「功利的」な有用性にのみ着目するのではなく，科学史をより積極的に理科教育の中で活用していくことも，必要であると考える。また一方，本研究で取り上げた「生物進化」についても，日本の理科教育においては決して重視されているとは言えない。しかし，福井・鶴岡（2002）で論じたように，その学習には他の生物学の主要概念と比べても特筆すべき意義があるため，より積極的な取扱いが必要であろう。In Japanese high schools, science education generally teaches only the latest theories. However, in biological education, old theories often appear in textbooks. For example, in biological evolution, the textbooks are still teaching Lamarckian evolutionary theory (the theory of use-and-disuse). Why are schools teaching such old theories in fields of science? One answer is because there is an opinion that scientific history has educational value and perhaps practical value as well. Presenting old theories may improve student understanding and memories of current theories. This hypothesis has been verified in pre- and post-tests. Consequently, where classes teach both the theory of natural selection and the theory of use-and-disuse, a better understanding (memories) of biological evolution has been promoted. Therefore, the hypothesis of this study has been supported to some extent. However, a final conclusion is premature as there are still some problems remaining to be resolved.P(論文)原著論文application/pdfORIGINAL ARTICLEdepartmental bulletin pape
麻布獣医学園創立125周年記念講演会 : 麻布獣医学会及び麻布環境科学研究会
Get PDFP(論文)会議録・学会報告ゴリラから見た地球共生系ゲノム・遺伝子から見た地球共生系application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape
The Frequency Variations of the Oxytocin Receptor Gene Polymorphisms among Dog Breeds
Get PDFThe domestic dog (Canis familiaris) has been diverged from wolves 15,000–100,000 years ago and certain genetic changes may have enabled them to adapt to the human social niche. In this study, we investigated the polymorphisms of the oxytocin receptor gene in dogs and wolves in order to investigate the possibility of the genetic change in the oxytocin system during dog domestication processes. Genotypes of the oxytocin receptor gene polymorphisms were determined in dogs and wolves. The single nucleotide polymorphisms (SNP; rs22927829, rs8679682, rs22896457) were observed in the sampled dogs. On the other hand, for the SNPs rs22927823 and rs22927826, only homozygous GG genotypes were observed (n=25). The frequencies of the SNPs (rs8679682 and rs22896457) were significantly different among wolves and dogs, and also among dog breed groups (p<0.05, chi-square test). The frequency profile of these SNPs among dog breed groups supports the hypothesis that there were selections on the oxytocin receptor gene during the dog domestication processes.P(論文)原著論文application/pdfORIGINAL ARTICLEdepartmental bulletin pape
The pathological study on membranous nephropathy in dogs with special reference to phospholipase A2 receptor in the podocytes
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Introduction
Membranous nephropathy (MN) is a major immune complex-mediated glomerulonephritis (ICGN) and can be grouped into idiopathic (primary) type and secondary type of MN in human.
Phospholipase A2 receptor (PLA2R) is expressed in the glomerular podocytes of human kidney. Anti-PLA2R autoantibodies were discovered in the majority of patients with idiopathic MN. Also, enhanced glomerular expression of PLA2R is reported in most patients of the disease. Therefore, PLA2R is suggested to be causative autoantigen of human idiopathic MN. On the other hands, PLA2R is expressed minimal or absent in murine and rat podocytes. Because a suitable animal model of PLA2R -associated glomerular disease has not been established, the function of this receptor in podocytes, and whether the circulating autoantibodies actually bind PLA2R on podocytes, remains unclear.
In dogs, MN is a major spontaneous glomerular disease and its histological and clinical characteristics are analogous to idiopathic MN in humans. However, there are no reports describing the expression of PLA2R in canine podocytes, and the pathogenesis of canine MN has not been investigated. In this study, the author hypothesized that some case of canine MN might be induced by the autoimmune mechanism in common with human idiopathic MN.
Chapter 1
Human MN can be grouped into idiopathic (primary) type and secondary type. In electron microscopy, the dense deposits are usually limited in subepithelial area in idiopathic MN, while these are observed also in subendothelial and mesangial area in addition to subepithelial area in secondary MN. In this chapter, the author investigated the localization of immune deposits in 8 cases of MN dogs by electron microscopy. In 4 cases, the deposits were limitedly observed in subepithelial area. In another 4 cases, subendothelial and mesangial deposition was also observed. In this study, the author demonstrated some cases of canine MN exhibiting restrictive subepithelial localization of dense deposits, which is consistent with characteristic finding in human idiopathic MN.
Chapter 2
In this chapter the author performed gene cloning and motif analysis for canine PLA2R obtained from normal glomeruli and investigated the expression and detailed localization of PLA2R in normal glomeruli and a MN cases dogs by immunofluorescence (IF). The author provided fundamental information that canine PLA2R obtained has high homology and common extracellular structures with human PLA2R. In addition to expression of PLA2R in normal glomeruli, the author demonstrated increased expression of PLA2R in some cases of MN dog showing idiopathic deposition pattern in chapter 1. Similar altered expression of PLA2R was reported in human idiopathic MN, in association with the presence of serum anti- PLA2R auto-antibody. The results in this chapter may support the author’s hypothesis that some canine MN cases may be autoimmune mechanism associated with PLA2R as an autoantigen expressed in podocyte.
Chapter 3
In the previous chapter, the author revealed glomerular expression of PLA2R in dogs. The object in this chapter is to establish the method of podocyte primary culture for dogs and to confirm the expression of PLA2R in the canine cultured podocyte. The author succeeded in effective isolation of glomeruli from canine kidney by modifying the method for rat. Canine cultured podocytes in the present study distinctly expressed PLA2R in addition to several podocyte-specific markers, including nephrin, podocin and synaptopodin. The podocyte expression of PLA2R was confirmed by reverse transcriptase polymerase chain reaction, western blotting and IF in dogs. The in-vitro experiment provided from this method may contribute to progression of investigation for canine glomerular disease including MN.
Conclusion
In this study, the author revealed new findings on ultrastructural feature of canine MN and PLA2R expression in glomerular podocytes of dogs as follows.
1. Canine MN showed two different deposition patterns of dense deposit in the glomeruli resembling human idiopathic or secondary MN. This may suggest the presence of different pathogenesis in canine MN as suspected in human MN.
2. Canine PLA2R obtained from the glomeruli has high homology and common extracellular structures with human PLA2R.
3. Canine PLA2R is expressed in podocyte and distributed on the foot process in tissue sections. This is important finding suggesting the possibility of dogs as an animal model of human idiopathic MN. Because PLA2R is not expressed in the podocytes of rodents, rabbits and no experimental or spontaneous animal models for idiopathic MN have been established, so far.
4. The increased expression of PLA2R, which is feature of human idiopathic MN associated with PLA2R, demonstrated in some of MN dog cases with idiopathic ultrastructural pattern of dense deposit. These results may support the author’s hypothesis that some canine MN cases are autoimmune disease associated with PLA2R as an autoantigen expressed in podocyte.
5. The primary culture method for canine podocyte expressed several podocyte specific proteins was established. The in vitro experiment provided from this method may contribute to progression of investigation for canine glomerular disease including MN.
These results may support the author’s hypothesis that some canine MN cases are autoimmune disease associated with PLA2R as an autoantigen expressed in podocyte. In addition, the author established the primary culture method for canine podocyte. The in vitro experiment provided from this method may contribute to progression of investigation for canine glomerular disease including MN.イヌの膜性腎症（MN）はヒトとの類似性の高い代表的な糸球体疾患であるとともに、高い発生頻度を示す重要な腎疾患である。成人のMNは、先行する疾患のない特発性（原発性）MNと感染症や腫瘍、薬剤、全身性疾患などに続発する続発性（二次性）MNとに分類されている。さまざまなモデル動物を用いた研究やヒトの新生児MNの研究などから、ヒトの特発性MNでは、糸球体足細胞足突起表面に存在するunknownな自己抗原に循環血中の自己抗体が結合することで引き起こされるin situでの免疫複合体（Immune complex：IC）形成が発病機序として考えられてきた。近年、ヒトの足細胞に発現するphospholipase A2 receptor （PLA2R）に対する自己抗体が特発性MN患者血中に高率に検出され、PLA2Rがヒトの特発性MNにおける自己抗原の候補分子として注目を集めている。一方、イヌのMNは病理組織学的・臨床病理学的にはヒトのMNに類似するが、発生機序については全く検討されていない。
本研究では、イヌのMNの病態解明に資することを目的として、ヒトの特発性MNにおいて病理発生との関連性が指摘されているICの沈着部位、イヌのPLA2Rの遺伝子解析と全身における発現、正常犬・MN症例の糸球体におけるPLA2R発現を解析した。さらに初代培養足細胞を用い、イヌの足細胞がPLA2Rを発現していることをヒト以外の動物の腎臓で初めて明らかにした。
第一章 MN症例の免疫複合体の沈着部位
MNにおいて糸球体係蹄壁の上皮下にIC集積部と考えられるdense deposit (DD)の沈着がみられることは重要な特徴所見であるが、イヌのMNにおいて上皮下以外への沈着に言及した報告は少ない。本章ではイヌの腎生検症例のうちMNと確定診断した 8症例について、透過型電子顕微鏡を用い各症例2つ以上の糸球体の観察し、DD沈着様式を超微形態学的に精査した。その結果、半数の症例（4例）ではDDの沈着は上皮下のみであったのに対し、半数の症例では上皮下に加え、内皮下またはメサンギム領域にも沈着を認めた。
ヒトのMNに関する過去の多くの研究が示すように、上皮下に限局したDDの沈着は足突起上の抗原に対する自己抗体の結合によるin situでのICの形成を示唆する。一方、上皮下以外の部位への沈着は続発性MNにおける循環ICの沈着を示唆する重要な所見の一つとなる。本章ではイヌのMNにおいて異なるDD沈着パターンが存在すること、イヌのMNにおいても異なる発生機序を持つ症例が含まれる可能性があることを初めて示唆した。
第二章 正常犬の糸球体におけるPLA2Rの局在とMN症例におけるPLA2Rの発現変化
第一章の結果から、一部のMN症例ではin situでのICの形成機序が疑われたため、ヒトと同様にPLA2Rに関連したMNがイヌにも存在するかを検討することを本章の目的とした。現在までにイヌの糸球体におけるPLA2Rの発現に関する報告はなく、本章では正常犬の糸球体から得られたPLA2R遺伝子のクローニングを行った。さらに、免疫蛍光法（IF）により正常犬の糸球体における詳細なPLA2Rの局在を明らかにするとともに、MN症例の糸球体におけるPLA2Rの発現変化を検討した。
2-1 PLA2Rの発現分布およびアミノ酸配列の同定
正常なビーグル犬の全身諸臓器および単離糸球体からTotal RNAを抽出、cDNAを作成し、PLA2Rの部分配列についてRT-PCRを行った。また単離糸球体からPLA2R全長配列をクローニングし、シークエンス解析・相同性検索を行った。RT-PCRでは多臓器において特異的なバンドが得られたが、特に肺、脾臓、大腸、生殖器、腎臓および単離糸球体において強い陽性シグナルが得られた。またイヌのPLA2Rはヒトと相同性が高く（86%）、予想されるモチーフ構造はヒトと同様であった。
2-2 正常糸球体におけるPLA2Rの発現・局在
正常なビーグル犬の腎臓凍結切片を用い、IFによりPLA2Rの発現を調べた。また糸球体におけるPLA2Rの詳細な局在を検索するために、糸球体基底膜の構成要素であるIV型コラーゲンおよび足細胞の足突起、細胞質にそれぞれ存在するpodocin、vimentinとの二重染色を行った。さらに2-1で得られた遺伝子配列情報からPLA2Rに特異的なプローブ作成し、パラフィン切片を用いたIn situ hybridization（ISH）法を実施した。また単離糸球体からの抽出タンパク質を用いPLA2Rに対するWestern Blotting (WB)をおこなった。IFの結果、PLA2R陽性シグナルは糸球体で足細胞パターンを示し、podocinと共局在し、vimentinの内側、IV型コラーゲンの外側に沿うように存在していた。ISH法では糸球体に特異的なシグナルが得られ、WBにおいてもPLA2Rに特異的なバンドが得られた。
2-3 MN症例犬の糸球体におけるPLA2Rの発現
第一章で用いたMN症例8例のうちの5症例とその他の免疫介在性の糸球体疾患として膜性増殖性糸球体腎炎2症例、非免疫介在性糸球体腎症2症例の生検組織についてPLA2RのIFによる観察を行った。その結果、第一章において上皮下のみにDD沈着が認められたMN4症例のうち検索できた2症例の糸球体においてPLA2Rの明らかな発現増加が認められた。上皮下以外にもICの沈着が認められたMN2症例およびその他の糸球体疾患では発現増加は認められなかった。
本章では全長配列、モチーフ構造、組織分布などのイヌのPLA2Rに関する基礎的情報を示し、IFおよびISHからイヌの腎糸球体におけるPLA2Rの発現を初めて明らかにした。また二重免疫染色でPLA2Rがpodocinと共局在したことから、ヒトと同様にイヌの糸球体、特に足細胞の足突起にPLA2Rが存在していることを示唆した。また、ヒトの特発性MNにおいて、糸球体におけるPLA2Rの発現上昇が血中抗PLA2R自己抗体の存在と一致して認められることが報告されていが、本章でPLA2Rの発現上昇がみられた2症例ではDDの沈着も上皮下に限局しており、これらの結果はイヌのMNにおいても一部の症例ではヒトの特発性MNと同様の発生機序が存在する可能性を示唆するものであると考えられた。
第三章 イヌの足細胞初代培養法の確立と培養足細胞のPLA2R発現
第二章では糸球体におけるPLA2Rの発現を明らかにしIFにより足細胞に発現している可能性を示したが、本章では足細胞における発現を証明することを目的とした。そこで本章ではラット足細胞の初代培養に用いられる磁気ビーズ法を用い正常犬の足細胞の培養を試み、足細胞特異タンパク質およびPLA2Rの発現を解析した。正常なビーグル犬3頭から採材した腎臓を鉄粉を含むPBSで潅流した後、皮質組織を細切し、collagenaseで処理。250µmメッシュで濾した後、鉄を含む糸球体をマグネットおよび100µmメッシュ上にトラップすることで糸球体を回収した。この回収した糸球体を37℃、3日間培養し、その周囲に増殖している細胞について、nephrin、podocin、synaptopodin およびPLA2RのIF観察を行った。WBおよびRT-PCRにはトリプシンを用い細胞を剥離し、40µmメッシュで濾し残存する糸球体を取り除いたのちに、もう1日培養した培養足細胞を用いた。回収された糸球体の純度は高く、初代培養2日以内に糸球体より細胞が伸長し、3-4日目には糸球体の間を埋めるように細胞の遊出・伸長が認められた。培養細胞はIFおよびRT-PCRにおいて足細胞特異タンパク質（nephrin、podocin、synaptopodin）を発現しており、足細胞であることが確認された。同時にこれらの細胞がPLA2Rを発現していることも、IF、RT-PCRおよびWBによって確認した。
本章では糸球体より遊出する培養足細胞は足細胞特異タンパク質を発現しており、初めてイヌの足細胞を培養することに成功した。また初代培養足細胞はPLA2Rを発現しており、第二章で示唆されたイヌの足細胞でのPLA2R発現を証明した。
【総括】
イヌにおいてMNは重要な糸球体疾患の一つであるが、その病理発生機序はこれまでまったく研究されてこなかった。本研究では蛋白尿を呈したイヌのMN腎生検症例においてICの異なる沈着パターンの存在を示し、イヌのMNが異なる病理発生機序によるものを含んでいる可能性を示唆した。さらに、イヌの糸球体におけるPLA2Rの発現・局在を明らかにし、ヒトの特発性MNに類似した糸球体におけるPLA2Rの発現上昇を一部のイヌMN症例において認めたことから、イヌのMNにおいてもPLA2Rを抗原とするin situ IC形成が引き金となる病態が存在する可能性が考えられた。また足細胞におけるPLA2R発現はヒトでのみの報告されており、現在までにPLA2Rを抗原としたMNのモデル動物は存在していない。本研究で示したイヌの足細胞におけるPLA2R発現とMN症例の糸球体におけるその高発現は、特発性MNの病態モデルとしてのイヌの可能性を示す重要な新知見である。doctoral thesi