Azabu University Science Information Repository / 麻布大学学術情報リポジトリ
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The study of the transcriptional machinery of RNA helicase YTHDC2 and the role of YTHDC2 in tumor metastasis
Get PDF麻布大学博士(学術)YTH domain containing 2 (YTHDC2) belongs to the DExD/H-box family of ATP-dependent RNA helicases. The author previously found that YTHDC2 expression is up-regulated in several human cancer cells. In this study, the author investigated the transcriptional machinery of YTHDC2 and the role of YTHDC2 in tumor metastasis. By luciferase reporter assay and chromatin immunoprecipitation assay, it was identified that the cAMP response element (CRE) in the promoter region of YTHDC2 gene and activation of transcription factor c-Jun and ATF-2 could be critical for transcription of YTHDC2. To investigate the role of YTHDC2 on tumor metastasis, the author established YTHDC2 knocked-down colon tumor cell lines by shRNA strategy. The repression of YTHDC2 significantly decreased in vitro motility of colon tumor cells in wound healing and transwell assay. In addition, decreased cell motility was restored by re-expression of YTHDC2. Furthermore, the repression of YTHDC2 also inhibited in vivo metastatic ability of colon tumor cells in a xenograft mouse model. Subsequently, the author examined expression levels of YTHDC2 by immunohistochemical staining in human colon cancer tissues from 72 patients and found a significantly positive correlation between YTHDC2 expression and the tumor stage. These data indicated that YTHDC2 plays important roles in clinical progression of colon tumors, including metastasis. Next, the author investigated the function of YTHDC2 in hypoxia and found that YTHDC2 promotes translation of HIF-1α. HIF-1α is required for transcription of epithelial-to-mesenchymal transition-related genes. In conclusion, these results suggest that the RNA helicase YTHDC2 contributes to colon tumor metastasis by promoting translation of HIF-1α and that YTHDC2 is potentially a diagnostic marker and target gene for cancer therapies.【背景と目的】
近年、筆者らはC型肝炎ウイルスのゲノム複製に寄与する新規のRNAヘリカーゼ遺伝子として、YTH domain containing 2 (YTHDC2)を同定した。ヒトの正常組織および様々な癌細胞株を用いてYTHDC2遺伝子の発現を調べた結果、正常組織では発現が低いが、一方で多くの癌細胞株では発現が高いことが明らかになった[参考論文(B), 3 ; Morohashi, Tanabe (9th author) et al., PLoS one, 6, e18285, 2011]。また、これまでの研究で、様々なRNAヘリカーゼが癌遺伝子の翻訳を促進することで癌細胞の悪性化に寄与していることが報告されている。そこで本研究では、癌化に伴って発現が亢進するYTHDC2の転写制御機構および癌細胞の主要な悪性形質の一つである癌転移におけるYTHDC2の役割について解析した。
第1章：YTHDC2の転写制御機構解析
はじめに、YTHDC2の転写開始に重要なプロモーター領域を同定するために、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。ヒト肝癌細胞株Huh-7を用いて実験した結果、転写開始点より−261から+159塩基の領域が重要であることが示唆された。データベースによる解析により、その領域内にはcAMP Response Element(CRE)、GATA、AP-1の3種類の転写因子結合サイトが含まれていることがわかった。そこで、それぞれの結合サイトに変異を導入して、再度ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った結果、CREサイトに変異を導入したときのみプロモーターの活性が低下したため、このCREサイトがYTHDC2遺伝子の転写に重要であることが示唆された。次にこのCREサイトに結合する転写因子を同定するためにクロマチン免疫沈降法（ChIP）を行った。Huh-7細胞を用いて実験した結果、このCREサイトには転写因子c-Jun, ATF2が結合することが明らかになった。また、これらの転写因子は炎症性サイトカインTNFαで刺激したヒト正常肝細胞でも活性化し、YTHDC2の転写に寄与していることが示唆された（参考論文(A), 1; Tanabe et al., Gene, 535, 24-32, 2014）。
第2章：YTHDC2の転移促進効果についての解析
YTHDC2における癌化形質、特に癌細胞転移への役割を調べるために、ヒト大腸癌細胞株HCT116においてRNA干渉法によるYTHDC2遺伝子発現が持続的抑制された細胞株の作出を試みた。まずは既知のヒト遺伝子を標的としていないshRNA (non-target shRNA)とYTHDC2を標的とするshRNA (YTHDC2-shRNA)をそれぞれ形質導入した。その結果、YTHDC2のmRNA発現量が野生型のHCT116細胞とほとんど変わらないコントロールHCT116細胞株(sh-cont細胞)とYTHDC2のmRNA発現量が野生型のHCT116細胞に比べて約80%低下したYTHDC2ノックダウン細胞株(Y2-KD細胞)を樹立した。樹立した細胞株の運動能力をWound HealingアッセイとTranswellアッセイによって解析した。Wound Healingアッセイは、高密度で培養されている細胞が人工的に作った新しいスペース(Wound)に移動する量を調べることで二次元的な細胞運動能力を測定する方法である。Transwellアッセイは、細胞がTranswellのメンブレンに開いている8μmの穴を通り抜けて反対側に移動した量を調べることで三次元的な運動能力を測定する方法である。in vitroにおける2種類の運動能力測定法により、Y2-KD細胞の運動能力がsh-cont細胞に比べて大きく低下していることがわかった。また、Y2-KD細胞にYTHDC2遺伝子を再発現させることで細胞の運動能力が回復するか否かをTranswellアッセイによって解析した。その結果、YTHDC2遺伝子を再発現させたY2-KD細胞の運動能力は、sh-cont細胞と同程度まで回復した。 さらに、in vivoにおけるY2-KD細胞の転移能力を調べるために、ヌードマウスの脾臓にY2-KD細胞を移植し、肝臓に転移するか否かを調べた。その結果、sh-cont細胞の移植を移植したマウスでは全例で肝臓への転移が見られたが、Y2-KD細胞を移植したマウスでは、5例中2例だけにしか肝臓への転移が見られなかった。以上の結果から、YTHDC2は大腸癌細胞の転移に寄与していることが示唆された。
サイクロスポリンA（CsA）にはYTHDC2の分子機能を阻害する効果が認められている[参考論文(B), 3 ; Morohashi, Tanabe (9th author) et al., PLoS one, 6, e18285, 2011]。そこで、先の野生型HCT116細胞を移植した肝転移モデルマウスにCsAを投与すると、やはり転移が抑制された。以上の結果からCsAがYTHDC2の分子機能を阻害し、大腸癌細胞の転移を抑制したことが示唆された。
次に、YTHDC2の作用が実際にヒト大腸癌の進行度に関連しているのか否かを外科病理学的に調べた。ヒト大腸癌患者由来の72例の病理組織標本（札幌医科大学医学部・消化器外科講座との共同研究）を当研究室で作製した抗YTHDC2モノクローナル抗体を用い、免疫組織化学染色を行った。その結果、YTHDC2の発現レベルと癌の進行度（Stage）およびリンパ節転移の間に有意な正の相関が認められ、臨床的にもYTHDC2が転移を伴う大腸癌の進行に重要な役割を持つことが示唆された。
（参考論文(A), 2; Tanabe et al., Cancer Letters, in press）
第3章：YTHDC2によるHIF-1αの翻訳促進機構の解析
固形癌における癌細胞転移では、固形癌内部の低酸素環境が引き金となって、上皮間葉系転換が誘導されて癌細胞が転移能力を獲得することが知られている。そこで筆者は、低酸素環境下において重要な役割を果たしている低酸素誘導因子1α (Hypoxia Inducible Factor-1α：HIF-1α)とYTHDC2との相互作用について解析した。HIF-1αは正常酸素環境では、ユビキチン-プロテアソーム経路を介してタンパク質分解されるため、タンパク質の発現量が減少しているが、低酸素環境では、ユビキチン化が阻害されるのでタンパク質の発現量が増加する。そこでまず始めにsh-cont細胞とY2-KD細胞を酸素濃度1%の低酸素環境で培養し、HIF-1αの発現量を調べた。その結果、低酸素環境におけるHIF-1αのmRNA発現量にはsh-cont細胞とY2-KD細胞の間で有意な差がなかった。しかしながら、HIF-1αタンパク質発現量はsh-cont細胞では大きく増加しているが、Y2-KD細胞では増加していなかった。これらの結果から、低酸素環境においてYTHDC2はHIF-1αの翻訳を促進していることが示唆された。
RNAヘリカーゼは遺伝子mRNAの5末端非翻訳領域（5’UTR）の二次構造を解くことで翻訳を促進することが知られている。データベースによる解析により、HIF-1α mRNAの5’UTR は平均的なmRNAの5’UTRに比べて、複雑な二次構造を形成しやすいことが示された。そこで、YTHDC2がHIF-1α mRNAの5’UTRの二次構造を解くことで翻訳を促進しているか否かを解析するため、ルシフェラーゼレポーターアッセイを応用して次の実験を行った。まず、ホタルルシフェラーゼ発現ベクターのプロモーター領域とホタルルシフェラーゼ遺伝子領域の間にHIF-1α mRNAの5’UTRを挿入した。このベクターからホタルルシフェラーゼ遺伝子のmRNAが転写されると、HIF-1α mRNAの5’UTRと同じ二次構造が形成される。したがって、YTHDC2が5’UTRの二次構造を解くことで翻訳を促進するならば、Y2-KD細胞ではこの二次構造が解けないので、sh-cont細胞と比べてホタルルシフェラーゼ活性が低下すると予想される。ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果、Y2-KD細胞ではsh-cont細胞と比べてホタルルシフェラーゼの活性が有意に低下した。この結果からHIF-1αの翻訳にはYTHDC2が必要とされていることが示唆された。
HIF-1αは低酸素環境で、上皮間葉系転換形質に関わる遺伝子群の転写に必要であるとされ、転移に重要な働きを持つ遺伝子である。YTHDC2がそれを標的としていることは、YTHDC2の転移促進作用の結果を強く支持するものであった。これらの結果から、RNAヘリカーゼYTHDC2がHIF-1αの翻訳を促進することで大腸癌細胞の転移に寄与すること、そしてYTHDC2が癌治療の予後予測因子や治療標的遺伝子になり得ることが示唆された。
（参考論文(A), 2; Tanabe et al., Cancer Letters, in press）doctoral thesi
Investigation into factors affecting the emergence of resistance to third generation cephalosporins among Escherichia coli isolates from livestock in Japan
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Third-generation cephalosporins (TGC) are approved for use in not only humans, but also cattle and swine. The Japanese Veterinary Antimicrobial Resistance Monitoring System (JVARM), which was established in 1999, monitors TGC resistance among bacterial isolates from livestock and between 1999 and 2002 detected TGC-resistant Escherichia coli from broiler chickens, an animal for which TGC was not approved.
In this study, potential factors affecting the emergence of resistance to TGC among E. coli isolates from livestock in Japan were investigated. Firstly, TGC resistance among E. coli isolated from farm livestock (cattle, pigs, layer chickens and broiler chickens) between 2004 and 2009 was investigated and molecular genetic analysis of the TGC-resistant isolates was conducted. Secondly, to determine how TGC resistance had arisen among E. coli isolates from broiler chickens in which TGC was not approved for use, an investigation into antimicrobial use on the farms and the antimicrobial profiles of isolates was undertaken. Thirdly, other factors that may have affected the emergence of TGC resistance among E. coli isolates from boiler chickens were investigated.
I. Investigation into the susceptibility to TGC of E. coli isolates from farm livestock between 2004 and 2009
In total, 3274 E. coli isolates were obtained (cattle: 1095 strains; pigs: 802 strains; layer chickens: 699 strains; broiler chickens: 678 strains) from farm livestock between 2004 and 2009, and of these, 108 isolates were resistant to TGC (cattle: 2 strains; pigs: 2 strains; layer chickens: 15 strains; broiler chickens: 89 strains). When two isolates from a fecal sample exhibited the same β-lactamase gene and antimicrobial resistance type, they were considered to be a single isolate. Accordingly, 69 E. coli isolates (cattle: 1 strain; pigs: 1 strain; layer chickens: 10 strains; broiler chickens: 57 strains) were used for further analyses. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analyses with XbaI digestion of TGC-resistant E. coli showed high diversity among the PFGE profiles. Using the unweighted pair group method and the arithmetic mean, a low level of similarity (< 80%) was observed among all of the isolates with the exception of six broiler chicken isolates. Also, of 69 TGC-resistant isolates, 45 isolates (pigs: 1 strain; layer chickens: 6 strains; broiler chickens: 38 strains) harbored the blaCMY-2.
II. Investigation of the factors that contribute to the appearance of TGC-resistant E. coli among broiler chickens
It is well established that the routine use of antimicrobial agents can lead to the emergence of antimicrobial-resistant bacteria. Therefore, the appearance of TGC-resistant E. coli strains at broiler chicken farms was investigated by considering whether the extra-label use of TGC had occurred on the farms or at the hatcheries, and whether other antimicrobial agents had been administered. It is worth noting that investigations by JVARM had not included the monitoring of hatcheries.
In this study, the antimicrobial resistance profiles of 78 E. coli isolates obtained from broiler chickens at farms in 2009 were analyzed, and the use of antimicrobial agents at these farms was also investigated. Of these 78 strains, 12 exhibited resistance to TGC but interestingly, cephem antibiotic had never been used at these farms. When comparing the antimicrobial resistance profiles between TGC-resistant and TGC-susceptible strains, the resistance rates to dihydrostreptomycin and chloramphenicol were significantly higher for TGC-resistant strains than for TGC-susceptible strains (p<0.05); however, this was not the case for β-lactam antibiotics. However, dihydrostreptomycin and chloramphenicol had not been administered to the broiler chickens from which the dihydrostreptomycin- and chloramphenicol-resistant strains had been isolated.
III. Voluntary withdrawal of ceftiofur (CTF) at hatcheries influenced TGC resistance among E. coli isolated from broiler chickens at farms
The off-label use of CTF was voluntarily withdrawn by the farmer’s association around March 2012. To assess the effect of this, the percentage of TGC-resistant E. coli isolates from healthy broilers before and after the voluntary withdrawal of CTF was investigated.
A total of 693 E. coli isolates (2010: 195 strains; 2011: 161 strains; 2012: 206 strains; 2013: 131 strains) were obtained from 362 fecal samples from broiler chickens from July to September between 2010 and 2013. TGC resistance was detected in 84 of these 693 isolates (12.1%). The percentage of TGC-resistant E. coli isolates significantly decreased after voluntary withdrawal from the off-label use of CTF from 16.4% (32/195) in 2010 and 16.8% (27/161) in 2011 to 9.2% (19/206) in 2012 and 4.6% (6/131) in 2013 (p<0.05). Regarding the detection of β-lactamase genes, 58 of the 84 TGC-resistant isolates harbored the blaCMY-2 (69.0%), and the blaCMY-2 was the predominant β-lactamase gene among TGC-resistant strains for all of the years examined (57.9–83.3%). Of the other β-lactamase genes detected, such as blaCTX-M, no significant changes in the rates of occurrence were detected among TGC-resistant E. coli before and after the withdrawal of CTF use.
In conclusion, this study revealed the widespread distribution of TGC-resistant E. coli among livestock, including broiler chickens, at farms in Japan. Furthermore, the percentage of TGC-resistant E. coli isolated from broiler chickens at farms was found to be significantly decreased after voluntary withdrawal from the off-label use of CTF at hatcheries. These findings indicated that TGC resistance among E. coli isolates from broiler chickens could be controlled by restricting the use of CTF at the hatchery level.第3世代セファロスポリン（TGC）はヒト用のみならず牛および豚用の動物用医薬品としても承認され、使用されている。家畜由来細菌の薬剤耐性モニタリング（JVARM, Japanese Veterinary Antimicrobial Resistance Monitoring System）では、1999年から家畜におけるTGCに対する耐性状況のモニタリングを開始しており、1999年から2002年に分離された家畜（牛、豚、採卵鶏および肉用鶏）由来の大腸菌のうち、TGCが承認されていない肉用鶏から分離された大腸菌において、TGCに対する耐性株が認められたことを報告した。そこで本研究は、（１）2004年から2009年に収集された家畜由来大腸菌におけるTGC耐性大腸菌の推移を調べるとともに、耐性菌の分子遺伝学的解析を行い、（２）TGCが承認されていない肉用鶏にTGC耐性大腸菌が出現した要因を、農場における抗菌性物質使用歴およびTGC耐性大腸菌に認められる特徴から調べ、（３）農場以外の要因が農場の肉用鶏由来大腸菌のTGC耐性に与えた影響を調べた。
第１章 2004年から2009年に農場の家畜から分離された大腸菌のTGCに対する薬剤感受性調査
JVARMで分離された大腸菌についてTGCに対する薬剤感受性調査を行い、TGC耐性大腸菌については分子遺伝学的解析を行った。
計3,274株の大腸菌（牛由来1,095株、豚由来802株、採卵鶏由来699株および肉用鶏由来678株)に対し薬剤感受性試験を実施したところ、TGC耐性が108株(3.3 %)で認められた。畜種別では、牛由来株の2株(1.9 %）、豚由来株の2株(1.9 %）、採卵鶏由来株の15株(13.9 %）および肉用鶏由来大腸菌の89株(82.4 %）においてTGC耐性株が認められた。同一検体から分離された同一薬剤耐性遺伝子型および薬剤耐性型の2株は同一株として取扱い、最終的には69株（牛由来1株、豚由来1株、採卵鶏由来10株および肉用鶏由来57株）のTGC耐性株についてパルスフィールドゲル電気泳動を行った結果、69株のうち54株はそれぞれ80 %以下の低い相同性を示した。また、β-ラクタマーゼ遺伝子型別において、69株のうち45株（65.2 %、肉用鶏由来38株、採卵鶏由来6株および豚由来1株）はセファロスポリナーゼのblaCMY-2を保有していた。
以上より、我が国の家畜には特に肉用鶏にTGC耐性大腸菌が多く認められ、TGC耐性株間では遺伝学的多様性が認められる一方で、TGCに対する耐性遺伝子は特定の型が分布していたことが示唆された。
第２章 農場の肉用鶏由来大腸菌におけるTGC耐性出現要因の検討
薬剤耐性菌は薬剤使用の選択圧によって選択されることから、TGC耐性大腸菌の出現要因として、①肉用鶏農場におけるTGCの適応外使用の可能性、②農場よりも上流の孵卵場におけるTGCの適応外使用の可能性、③TGC以外の薬剤の使用に起因する交差耐性または共耐性により、肉用鶏におけるTGC耐性大腸菌が選択された可能性が考えられた。このうち、②孵卵場における使用状況調査は、JVARMのモニタリング対象外であったことから、本研究では、農場の抗菌性物質使用歴調査を行うとともに、肉用鶏から分離された大腸菌に対し、TGC以外の薬剤についても薬剤感受性試験および遺伝学的性状解析を行った。
2009年に肉用鶏から分離された大腸菌96株のうち、同一検体から分離された同一薬剤耐性型の2株は1株として取り扱い、最終的には78株についてさらなる解析を行った。78株中12株でTGCであるセフチオフル（CTF）に対する耐性が認められたが、セフェム系抗菌性物質はTGC耐性株が分離された鶏のみならず、いずれの鶏に対しても一切使用されていなかった。薬剤感受性ではTGC耐性株のアンピシリン（AMP）、セファゾリン（CFZ）、ジヒドロストレプトマイシン（DSM）およびクロラムフェニコール（CHL）の耐性率がTGC感受性株よりも有意に高く、また他の薬剤についても有意差は認められないものの感受性株と比較して高い傾向が認められた。このうち、AMPおよびCFZは、CTFと同系統の薬剤かつ大腸菌に対する抗菌力がCTFよりも弱いため、TGC耐性株で高くなったと考えられた。一方、DSMおよびCHLについてはCTFと系統が異なる薬剤であるため、CTFと系統が異なる薬剤の使用によってTGC耐性が選択される可能性が示唆されたが、DSM耐性またはCHL耐性を保有するTGC耐性株が分離された肉用鶏に対してDSMまたはCHLは投与されていなかった。
以上より、農場の肉用鶏由来大腸菌におけるTGC耐性は農場におけるセフェム系抗菌性物質の適応外使用およびTGC以外の薬剤の使用が要因である可能性は低いと考えられた。
第３章 孵卵場におけるセフチオフルの自主的使用禁止が農場の肉用鶏由来大腸菌のTGC耐性に与える影響
2012年3月に生産者の協会から生産者に対して孵卵場におけるCTFの接種を中止するよう自主的な注意喚起がなされた。このため、注意喚起の前後における農場の肉用鶏由来大腸菌のTGC耐性の変動を調べることで、孵卵場におけるCTFの適応外使用と農場における肉用鶏由来大腸菌のTGC耐性との関係を検討できるものと考えられた。そこで孵卵場における注意喚起の前後2年における肉用鶏由来大腸菌のTGCに対する薬剤感受性調査を行い、孵卵場でのCTF接種中止が農場における肉用鶏由来大腸菌のTGC耐性に与える影響を調べた。
2010年から2013年に農場の肉用鶏から分離された計693株（2010年195株、2011年161株、2012年206株および2013年131株）の大腸菌に対し薬剤感受性試験を実施したところ、TGCに対する耐性が693株中84株（12.1 %、2010年32株、2011年27株、2012年19株および2013年6株）で認められた。農場の肉用鶏由来大腸菌のCTFの接種中止前後のTGCの耐性率の変動は、2010年: 16.4 %（32/195)および2011年: 16.8 %（27/161)に対し、2012年: 9.2 %（19/206)および2013年: 4.6 %（6/131)）であり、CTFの接種中止の前後で耐性率が有意に減少した。主要なβ-ラクタマーゼ遺伝子としては、CTF接種中止の前後のいずれの年もblaCMY-2が優勢であり（2010年: 62.5 %（20/32)、2011年: 81.5% （22/27)、2012年: 57.9 %（11/19)および2013年: 83.3 %（5/6)）、84株のTGC耐性株のうち58株がblaCMY-2を保有していた。blaCMY-2以外にもblaCTX-M等の耐性遺伝子が認められたが、CTFの接種中止前後で耐性遺伝子保有割合の有意な変動は認められなかった。
以上より、注意喚起後１年という短期間で肉用鶏由来大腸菌におけるTGC耐性率が主要なβ-ラクタマーゼを維持したまま有意に減少したことは、農場の肉用鶏におけるβ-ラクタマーゼ遺伝子の起源が孵卵場であることを示唆すると考えられた。
以上、本研究は我が国の家畜分野におけるTGC耐性大腸菌の分布状況を明らかにするのみならず、農場の肉用鶏由来大腸菌におけるTGC耐性出現の要因についても明らかにし、また同時に農場よりも生産段階が上流の孵卵場における薬剤耐性に対する取り組みが、農場における薬剤耐性を効果的に減弱させた1例についても示した研究である。doctoral thesi
Studies on Producing Calves of Desired Sex Using Reproduction Engineering Technologies
Get PDF麻布大学博士(学術)Although sexing of bovine embryos has been applied to cattle industries, especially as commercial embryo transfer technologies, cryopreservation of sexed bovine embryos resulted in reducing the viability and the pregnancy rate after the embryo transfer. The objective of the present study was to improve cryopreservation of sexed bovine embryos and superovulation protocol for in vitro production (IVP) of bovine embryos using X-sorted sperm.
Viability of biopsied bovine embryos
The objective of this study was to improve the viability of biopsied/cryopreserved embryos in the cattle. Bovine embryos collected from donor females on day 7 (d7: day 0 = onset of estrus), and were then biopsied for sexing by PCR or LAMP. The freezing solutions 1) 10% glycerol (G) (10G-SW, 10G-ISD) in PBS supplemented 20% calf serum (mPBS: mdodified PBS), 2) 10% ethylene glycol (EG) (10EG-DR) in mPBS, 3) 10% EG and 0.1 mol/L sucrose in mPBS (10E1S-DR), 4) 10% G and 0.25 mol/L sucrose (S) in TCM199 supplemented 20% CS (10G25S-DR) and 5) 5% G and 0.1 mol/L S in TCM199 supplemented 20% CS (5G1S-DR) were compared. In the 10G-SW and the 10G-ISD treatments, embryos were expelled from the plastic straws, and that the survival of frozen-thawed embryos was observed before transfer. In the 10E-DR, the 10E1S-DR, the 10G25S-DR and the 5G1S-DR treatments, embryos were transferred directly to recipients without expelling embryos from the straws, the development and pregnancy rates were assessed. There were no significant differences among the pregnancy rates between the groups in intact embryos (P > 0.05). However, the pregnancy rate of the 10E1S-DR was significant lower than them of the fresh (non-frozen) embryos, the 10G-SW and the 10G25S-DR in biopsied embryos (P < 0.05).
Transfer of the blastocyst that divided into two half-blastocysts in a zona pellucida
Three expanded blastocysts were collected from the Japanese Black cow on the d7 after insemination, and cryopreserved in liquid nitrogen (LN). One of the frozen-thawed blastocysts contained two half-blastocysts in the zona pellucida. The embryo was then transferred to the recipient cow, and twin calves, that were females and their birth weight, 13.0 kg and 14.0 kg each, were born on the 261 day after transfer. The results demonstrate that a successful birth of identical twin calves after transfer of a blastocyst had two half-blastocyst in a zona pellucida.
Effects of warming procedure on the viability of vitrified bovine embryos
The objective of this study was to examine factors affecting the post-warming viability of bovine embryos. In vitro produced blastocysts of d7-8 age were vitrified with 25% EG (v/v), 25% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO) and 0.3% (w/v) bovine serum albumin (BSA) dissolved in PBS by using 0.25-mL straws as devices. The vitrified-warmed embryos were morphologically evaluated to examine embryonic survival after warming and by a in-straw dilution method. There were no effect of warming temperature and dilution solution on the survival and hatching rates of vitrified-warmed embryos. However, the survival of vitrified embryos held at 38.5℃ after warming significantly degreased when the holding for more than 5 min compared with the holding for 5 min (P < 0.05). The hatching rate of embryos the holding for 40 min after warming was significant lower than those of the no-holding and holding for 5 min (P < 0.05). Maintaining embryos in the dilution medium for longer periods would be detrimental after warming, thus that causes lowering the pregnancy rate after transfer of vitrified/warmed embryos.
Viability of biopsied-vitrified bovine embryos after in-straw dilution
The objective of this study was to evaluate the viability of biopsied-vitrified bovine embryos. Bovine embryos staged from the compacted morula to the blastocyst stage on d7 (day 7: day 0 = onset of estrus) were collected from donor females, biopsied for sexing, and vitrified with 25% EG (v/v), 25% DMSO (v/v) and 0.3% BSA (w/v) dissolved in PBS using 0.25-mL straws. We assessed the concentrations of cryoprotectants in the straw after in-straw dilution, and the percentages (v/v) were 6.9-7.7% for EG and 2.8-3.3% for DMSO. The pregnancy rate of vitrified-warmed embryos in the in-straw dilution group (ISD group) was 57.9% when embryos were expelled from the straws after diluting the cryoprotectants in the straws, and that the survival of vitrified-warmed embryos were observed before transfer. In contrast, the pregnancy rate in the directly transfer group (DIR group) was 62.5% when embryos were transferred directly to recipients without expelling embryos from the straws. There were no differences among the pregnancy rates of the ISD group (P > 0.05), the DIR group and the non-vitrified biopsied embryos (NV group) (56.3%). The results suggest that it was possible to warm the vitrified-biopsied bovine embryos on farms and to transfer them immediately to recipients, yielding a practical pregnancy rate.
Calf production from sexed-vitrified bovine embryos following in-straw dilution
The objective of this study was to develop an in-straw dilution method, which is suitable for direct transfer of sexed-vitrified bovine embryos. Embryo sexing was performed by molecular diagnosis via PCR or LAMP. Several of the sexed and vitrified-warmed embryos were transferred after evaluation of survival of the embryos at warming and in-straw dilution (Evaluation group). The other embryos were immediately directly transferred to recipients without first being expelled from the straws after in-straw dilution (Non-evaluation group). The pregnancy rates of sexed- vitrified embryos were 38.7% and 34.8% in the Evaluation group and Non-evaluation group, respectively, which were not significantly different (P > 0.05). The viability of lower-quality embryos before vitrification tended to be lower (P = 0.087) than that of the higher-quality embryos, regardless of evaluating embryos after warming and in-straw dilution. The abortion rates of the embryos were similar, and there was no difference (P > 0.05) between the two groups (13.9% and 12.5%, respectively). The results demonstrate that sexed-vitrified bovine embryos can be vitrified and diluted by the in-straw method, and that the vitrified and warmed sexed-embryos can develop to term.
In vitro production of bovine sex preselected embryo using X-sorted sperm
The objective of this study was to examine that superstimulation protocol for in vitro production (IVP) of bovine embryos using X-sorted sperm. The superstimulations were conducted to lactating Holstein cows using SOV group and FGT group in a cross-over design. In the SOV group, all cows received a controlled intravaginal progesterone device on a random day of estrus cycle (0 d). Dominant follicle ablation was underwent on 5 d, superovulation was induced by intramuscular administration of eight declining doses of FSH and PGF2α beginning on evening of 6 d, following standard procedure. Controlled intravaginal progesterone device was removed on morning of 9 d. For LH surge induction, GnRH was administered on the morning of 10 d. Therefore, ovum pick up (OPU) was carried out on the morning of 11 d (25 to 26 h after GnRH injection). In the FGT group, OPU was carried out on a random day of estrus cycle (0 d). Dominant follicle ablation and insertion of a controlled intravaginal progesterone device was underwent on 5 d, superstimulation was induced by intramuscular administration of eight declining doses of FSH and PGF2α beginning on morning of 7 d, following standard procedure. Therefore, ovum pick up (OPU) was carried out on the morning of 11 d. Oocyte quality was assessed by developmental ability after in vitro/in vivo maturation and subsequent in vitro fertilization using X-sorted sperm and culture. There were no difference between groups in the number of oocytes that were recovered from > 5 mm follicles. All recovered oocytes were immature in FGT group, although the matured oocyte accounted for 62.1% among the recovered oocytes in SOV group. There were no differences among blastocyst rates of the SOV group (34.0 ± 4.3%) and the FGT group (21.8 ± 7.3%). However, the number of blastocysts per OPU session was higher in the SOV group compared with the FGT group (6.3 ± 1.4 and 2.2 ± 0.2, P < 0.05). IVP embryos derived from the SOV group and the FGT group that had been cryopreserved and fresh embryos were transferred to recipient animals, no significant differences were observed in the rate of pregnancy (37.5% and 35.7%), gestation length (276.2 ± 1.7 and 278.9 ± 1.4 d), birth weight (41.8 ± 3.1 and 45.3 ± 1.7 kg) of offsprings. These results indicate that many transferable blastocysts can be produced by IVF with X-sorted sperm using in vivo matured oocytes derived by OPU from lactating Holstein cows.
In conclusions, the results of the present study demonstrate that sexed embryos that were vitrified and diluted by the in-straw method can be applied to the field work in cattle industries with the same efficiency as a fresh sexed-embryos. The present study demonstrates that it is very useful and available for dairy production of successors to apply the new system for in vitro production of bovine embryos using in vivo-derived oocytes via OPU and sorted sperm for sexing as gametes for IVF. The findings in the present studies would increase productivity and contribute to development in cattle industries.性判別胚を用いて計画的な子ウシ生産を農家段階で実用化するためには、性判別胚を超低温保存し、受胚牛の移植適期に合わせて融解し移植できる技術体系の確立が不可欠である。しかし、性判別胚はバイオプシーにより胚の一部の細胞が切除されるとともに透明帯も除去されるため、緩慢凍結により保存された性判別胚において新鮮胚と同等の受胎性を確認した報告がある一方で、インタクト（非バイオプシー）胚と比べて耐凍性や受胎性が低下することも報告されている。しかし、性判別胚をガラス化保存した場合には新鮮胚に近い受胎率の得られることが報告されている。
ガラス化保存法は、細胞外液に氷晶を形成させないため、緩慢凍結法に比べて高濃度の耐凍剤を含む溶液が用いられており、加温後は早期に耐凍剤を希釈することが、耐凍剤の化学的毒性を抑制するために必要とされている。このためガラス化保存胚をダイレクトトランスファー法やワンステップストロー法のように加温後直ちに受胚牛に移植した報告は少ない。
一方、X精子またはY精子を90%以上の確率で含むウシ性選別精液が市販されているが、この性選別精液はストロー1本あたりの充填精子数が通常精液に比べて少ないことなどから、人工授精後の受胎率や多排卵処理後に採取した胚の移植可能な胚の生産率の改善が望まれている。また、ウシにおける生体内卵吸引法（以下、OPU）由来卵子の体外受精技術は、超音波画像診断装置を用いて生体卵巣から採取した卵を体外受精して胚を生産する技術であり、これまでの胚生産の中心であった子宮灌流による体内受精由来胚の採取に代わる、あるいはこれを補完する胚生産技術として開発されてきた。この体内成熟卵は、体外受精後の発生能が体外成熟卵に比べて高いが、体内成熟卵と性選別精液を利用した性判別胚の生産に関する報告や生産した性判別胚の受胎性に関する報告は少なく、普及性や実用性に関する報告はほとんどない。
本論文では、ウイバイオプシー胚および性判別胚の超低温保存後の生存性と受胎性を明らかにし、農場における子ウシの雌雄産み分け技術の確立を目的として、ウシ胚の緩慢凍結およびガラス化保存の方法や融解・加温法の影響について調べた。また、OPUにより採取した体内成熟卵と性選別精液の体外受精による性判別胚の生産について、胚の生産効率と性判別胚を用いた子ウシ生産システムを検討した。
第2章では、ウシバイオプシー胚の緩慢凍結方法が胚の生存性と受胎性に及ぼす影響を調べた。過剰排卵処理を施した供胚牛から人工授精後7～8日目に採取した胚はマイクロブレードでバイオプシーした後に緩慢凍結保存した。緩慢凍結方法は10%グリセリンおよび20%子ウシ血清（以下、CS）添加修正PBSを凍結溶液として融解後に段階的に耐凍剤を希釈除去し胚の生存性を判定した後に受胚牛に移植した10G-SW、融解後にストロー内で12.5%シュークロースおよび20%CS添加修正PBSと混合して一段階で耐凍剤を希釈除去し胚の生存性を判定した後に受胚牛に移植した10G-ISD、10%エチレングリコールおよび20%CS添加修正PBSを凍結溶液として融解後に耐凍剤の除去操作を行わず直ちに受胚牛に移植した10E-DR、10%エチレングリコール0.1mol/Lシュークロースおよび20%CS添加修正PBSを凍結溶液として融解後に耐凍剤の除去操作を行わず直ちに受胚牛に移植した10E1S-DR、10%グリセリン0.25 mol/Lシュークロースおよび20%CS添加修正PBSを凍結溶液として融解後に耐凍剤の除去操作を行わず直ちに受胚牛に移植した10G25S-DR、5%グリセリン0.1 mol/Lシュークロースおよび20%CS添加修正PBSを凍結溶液として融解後に耐凍剤の除去操作を行わず直ちに受胚牛に移植した5G1S-DRの6手法を用いてインタクト胚とバイオプシー胚の保存後の生存性と受胎性を調べた。その結果、インタクト胚の受胎率は凍結法との間には有意差は認められなかったが、バイオプシー胚の受胎率は10E1S-DRが新鮮胚、10G-SWおよび10G25Sに比べて有意に受胎率が低かった。また、いずれの方法においてもバイオプシー胚の受胎率はインタクト胚に比べて低い成績となっており、バイオプシー胚に適した緩慢凍結法について更なる検討が必要と推察された。また、緩慢凍結したインタクト胚を移植により双子分娩が確認された事例から、ウシにおける自然発生的な一卵性双子の発生様式を記載して考察した。
第3章では、ガラス化保存したウシ胚をストロー内希釈後に直接移植する方法を農家段階で実用化するために、加温温度、加温後の経過時間、希釈液の組成が加温後の胚の生存性に及ぼす影響を検討した。媒精後7～8日目に発生した胚盤胞をガラス化溶液(VSED: 25% EG + 25% DMSO)で平衡した後にストロー内でガラス化保存し、加温後に胚の生存性と発育性を調べた。加温温度は20℃区と30℃区において加温後の胚の生存率および透明帯脱出率に有意な差は認められなかった。また、加温後の保持時間0分に対して5分以降は、ガラス化保存胚の生存率が有意に低下し、0分および5分に対して40分でガラス化保存胚の透明帯脱出率が有意に低下した。さらに、希釈液組成により加温後の胚の生存率および透明帯脱出率に差は認められなかった。これらのことから、ガラス化保存したウシ胚において、加温温度の違いや希釈液の組成により生存性の低下は認められなかったが、加温から移植終了までの時間が延長した場合、加温胚の生存性が低下することが示された。
第4章では、ガラス化保存したウシバイオプシー胚を、農場内で加温し直ちに受胚牛に移植するために、耐凍剤の希釈方法が受胎性に及ぼす影響を調べた。人工授精後7日目の供胚牛から採取し、性別判定のためにバイオプシーを施した胚をVSED液で平衡した後、ストロー内でガラス化保存した。加温後、耐凍剤をストロー内で希釈しストローから取り出し胚の生存性を確認して移植したISD区の受胎率は57.9%、耐凍剤をストロー内で希釈後に胚をストローから取り出すことなく直ちに受胚牛に移植したDIR区の受胎率は62.5%であり、いずれもガラス化保存していないNV区（56.3%）と有意な差のない受胎率が得られた。ストロー内希釈後のストロー内のエチレングリコール濃度は6.9～7.7%、DMSO濃度は2.8～3.3%であった。これらのことから、ガラス化保存したウシバイオプシー胚は、農場内での加温操作を行い直ちに受胚牛に移植することが可能であり、実用的な受胎率の得られることが示唆された。
第5章では、ガラス化保存したウシ性判別胚を加温後直ちに受胚牛に移植するために、耐凍剤のストロー内希釈が移植後の受胎性と子ウシ生産性に及ぼす影響を調べた。過剰排卵処理を施した供胚牛から人工授精後7～8日目に採取した胚をマイクロブレードでバイオプシーして雄特異的DNA増幅の有無により性別を判定した。性判別胚はVSED液で平衡し、希釈液と空気層を隔てて0.25-mLストロー内に充填し、液体窒素中に投入した。加温後、ストロー内でガラス化液と希釈液を混合し3分間保持した。評価区はストロー内希釈した胚の生存性を判定した後に受胚牛に移植し、非評価区ではストロー内希釈後の胚をストローから取り出すことなく直ちに受胚牛に移植した。評価区および非評価区の移植後の受胎率は38.7%および34.8%であり、両区の間に有意差は認められなかった。しかし、評価区においてガラス化保存前の品質の劣る胚の生存性は品質の高い胚に比べて有意ではないが低い傾向であった（P = 0.087）。受胎した受胚牛の流産率は両区の間で有意な差は認められなかった（13.9%、12.5%）。これらのことから、耐凍剤のストロー内希釈はガラス化保存したウシ性判別胚を加温後直ちに受胚牛に移植するために有効な方法であることが確認された。
第6章では、ホルスタイン種泌乳牛の卵巣よりOPUにより採取した卵と性選別精液を用いて体外受精し、性判別胚の生産効率と性判別胚の移植による子ウシ生産状況を調べた。供試牛に多排卵処理（SOV区）または卵胞発育同調処理（FGT区）を施した後、直径5 mm以上の卵胞から卵を採取し、ホルスタイン種雄牛の性選別精液を用いて媒精し、胚盤胞期胚以降への発生能を調べた。また、媒精後7および8日目の胚盤胞期胚および脱出中胚盤胞期胚を受胚牛に移植した。SOV区およびFGT区における採取卵数に有意な差は認められなかった。SOV区では採取卵のうち62.1%が成熟卵であったが、FGT区の採取卵は全て未成熟卵であった。媒精後7～9日の胚盤胞期胚率は試験区間に有意な差は認められなかったが、供卵牛１頭当たりの胚盤胞期胚数はSOV区がFGT区に比べて有意に多かった（P < 0.05）。また、SOV区およびFGT区で生産した性判別胚の移植後の受胎率、在胎日数および産子の生時体重に有意な差は認められなかった。このことから、ホルスタイン種泌乳牛からSOV処理後にOPUにより採取した卵と性選別精液を体外受精して性判別胚を生産する方法は、後継牛の計画的な生産に利用可能であることが示された。
本研究の結果より、ウシバイオプシー胚および性判別胚の超低温保存としては緩慢凍結法に比べてガラス化保存法が優れており、ウシ性判別ガラス化保存胚は、新鮮胚移植と同等の実用的な受胎率が得られることが明らかとなった。また、ガラス化保存胚のストロー内希釈は超低温保存した性判別胚を農場で加温し、一般的な胚移植と同様の簡単な操作により受胚牛への移植が可能なことを示した。さらに、ストロー内希釈後の胚の生存性および受胎性に影響を及ぼす要因となる胚の品質や加温後から移植までの時間を確認したことにより、本技術の野外普及を進めるにあたっての注意点や技術普及のための課題を提示した。また、SOV処理後にOPUにより採取した体内成熟卵と性選別精液との体外受精による新しい性判別胚の生産システムが後継牛生産に有効な手法であることを示した。
このように本研究で実施したウシバイオプシー胚および性判別胚の超低温保存方法およびOPU由来の成熟卵と性選別精液を利用した性判別胚の体外生産に関する研究成果は、酪農経営ならびに肉牛生産における計画的な後継牛生産の実現と今後の家畜繁殖技術の発展に寄与するものと考えられる。doctoral thesi
Elucidation of Mechanism for Enhancing Female Reproductive Function by Male Ultrasonic Vocalizations
Get PDF麻布大学博士(学術)Male-female interaction is important for selecting a suitable mating partner and for ensuring reproductive success. It was suggested that male sexual signals such as vocalizations are attractive to females in many animals. Male mice emit song-like “ultrasonic vocalizations (USVs)”, when they encounter female or female’s urinary pheromones. The characteristics of male USVs differ among inbred strains (Panksepp et al., 2007; Kikusui et al., 2011; Sugimoto et al., 2011), and their USV profiles are suggested to be regulated genetically. On the other hand, the biological significance of these repertoires of USVs has not been identified. To demonstrate that female mice could discriminate different male USVs, we recently conducted playback experiments to assess the responses of female mice to USVs of male mice from various strains. We found that inbred female mice could discriminate the characteristics of USVs, and that they preferred the USVs of mice that were from different strains than their own strains. It was suggested that this preference of females for USVs of males from a different strain contributes to disassortative mating, which is an important mate choice strategy for avoiding inbreeding and facilitating the heterozygosity of offspring. In addition, we also found that the preference of females for USVs from a different strain was only observed when females were concomitantly exposed to the male pheromone, “Exocrine grand-secreting peptide 1 (ESP1)” (Asaba et al., 2014). This implies that the preference for male USVs is governed by the multisensory integration of both acoustic and olfactory signals. In Chapter 1, to understand the underlying neural mechanism, we searched the nuclei that were activated when exposed to both male USVs and pheromone in female mice.
Male vocalizations are not only attracting to females but could also promote female fertility in some animals. However, it had not been studied intensively in mice USVs. We recently investigated the relationship between the numbers of delivery in breeding pairs for 4 months and numbers of USVs syllables emitted from males of those pairs during 3 minutes of sexual encounter with unfamiliar females. Interestingly, there was a positive correlation between these two indices, suggesting a possibility that male USVs could promote female’s fertility. We also examined the effect of male USVs on sexual behavior in females, and found that females approached towards vocalizing-males more frequently as compared to devocalized-males. In Chapter 2, to understand how male USVs activate reproductive function in females, we examined whether male USVs could increase estradiol level and activate Kisspeptin neurons, key neurons to regulate reproductive function in the hypothalamus.
Chapter 1: Multisensory integration of male USVs and pheromone in female mice
In experiment 1, we analyzed the c-fos expression pattern by in situ hybridization in the whole brain areas of female mice when exposed to male USVs generated by the ultrasound speakers after ESP1 exposure. The results demonstrated that the higher expression of c-fos mRNA was observed in the medial prefrontal cortex (mPFC) when females were exposed to “ESP1 and USVs” with compared to “ESP1 and noise” as control. This area has been identified as a key region for multisensory integration and decision-making. Additionally, a higher expression of c-fos mRNA was also observed in the primary auditory cortex (Au1), the ventromedial hypothalamic nucleus dorsomedial part (VMHdm), and the basolateral amygdaloid nucleus (BLA).
In experiment 2, we focused on the mPFC and analyzed the relationship between its neural activity using immunocytochemistry and behaviors. Females were exposed to either male USVs or noise control combination with either ESP1 or Tris-HCL (vehicle for ESP1) exposure. Compared with exposure of “Tris and noise”, the larger number of c-fos-immunoreactive (IR) cells in the prelimbic region (PrL) of the mPFC and longer time in searching behavior to the speaker were observed in females exposed to “ESP1 and USVs”. In addition, there was a positive correlation between these 2 matters, suggesting that females exposed to the USVs had a larger number of c-fos-IR cells in the PrL and a longer time searching.
In experiment 3, to examine characteristic of neurons in the PrL that were activated by “ESP1 and USVs”, we conducted dual-label immunocytochemistry with c-fos and either GABAgenic or glutamatergic neuronal marker. As a glutamatergic neuronal marker, GLS2 (phosphate activated glutaminase 2) was used. As results, most of c-fos-IR cells in the PrL also expressed GLS2, indicating that the neurons activated by ESP1 and USVs are excitatory glutamatergic neurons. It is suggested that these neurons transmit neural signals to another region and regulate approaching behavior to male USVs.
Chapter 2: Effect of male USVs to reproductive neuroendocrine system in female mice
In experiment 4, we measured estradiol concentration in the feces when exposed to male USVs or noise control by enzyme immunoassays. It has suggested that the fecal estradiol concentration reflects peripheral estradiol level (Chelini et al., 2005). However, there was no significant difference in the fecal estradiol concentration between the groups.
In experiment 5, we focused on estradiol in brain and measured estradiol concentration in the hypothalamus and auditory cortex. Previous studies have revealed that the estradiol level in this brain area is increased by exposure of male vocalization in birds (Maney and Pinaud, 2011). However, there was no significant difference in the estradiol concentration between USVs exposure group and noise exposure group in these areas.
In experiment 6, the activation of kisspeptin neurons were examined using dual-label immunocytochemistry with cAMP response element-binding protein phosphorylation (pCREB) in females exposed to “Tris and noise”, “ESP1 and noise”, “Tris and USVs”, and “ESP1 and USVs”. We focused on two distinctive populations of kisspeptin neurons located in the anteroventral periventricular nucleus (AVPV) and the acuate nucleus (Arc) in the hypothalamus. In the AVPV, there was no significant difference in the rate of kisspeptin neurons expressing pCREB between the groups. On the other hand, in the Arc, the rate of kisspeptin neurons expressing pCREB significantly increased in both “Tris and USVs” and “ESP1 and USVs” exposure groups as compared with “Tris and noise”. Kisspeptin neurons in the Arc have known to be the proximate source of the GnRH pulse secretion that is essential for basal FSH secretion, thereby promoting follicular development. This results suggest that male USVs could increase female fertility by activating the kisspeptin neurons in the Arc.
In conclusion, we discovered that higher neural activity was evoked in the PrL of mPFC when female mice were exposed to both male pheromone and USVs. We suggest that the preference for male USVs is induced by multisensory integration with pheromonal cue in PrL. Additionally, our results suggest that male USVs activate kisspeptin neurons in the Arc, implying that male USVs contribute to follicular development in female mice. The present study uncovers new possibilities for studying the molecular and neural mechanisms of multisensory integration, and contributes to reveal the mechanism for enhancing female reproductive function by male signals in animals.【総合緒言】
動物の繁殖は、適切な交配相手を見つけ、認知し、求愛することによって始まり、その際に、雄と雌は様々な感覚を利用してコミュニケーションをとりあう。その一つである音声による雌雄間コミュニケーションは、これまで鳥類やシカなどで詳しく調べられており、雄の鳴き声には雌を誘引する効果があるだけでなく、排卵を促進するといった繁殖機能を活性化する効果があることも報告されている。
雄マウスも雌に出会うと、ヒトには聞こえない超音波領域で鳥類のさえずりのような歌（Ultrasonic vocalizations; USVs）を発する。マウスのUSVs研究の多くは、様々な発達過程や環境下、系統や疾患モデルにおける発声パターンの解析に焦点が当てられてきた。しかしながら、雌マウスにおけるUSVsの受容と伝達に関わる神経回路と繁殖制御機構に対する効果については未だ不明な点が多い。博士前期課程の研究では、雌は自身とは異系統の雄のUSVsへ嗜好性を示し、子孫の遺伝的多様性をもたらす配偶者選択に寄与することを示唆してきた。また、雌のUSVsへの嗜好性は雄の床敷や雄フェロモンが存在している際に顕著に現れることを明らかにしている。このことから、雌は雄が発する聴覚シグナルと嗅覚シグナルを脳内で統合することで、適切なUSVsへの嗜好性を示す可能性が考えられた。そこで、本研究の第1章では、雄のUSVsが雌の接近行動に対して効果を示すための聴覚シグナルと嗅覚シグナルの統合機構を明らかにすることを目的として、USVsとフェロモンの共提示により活性化する脳部位の同定を目指した。
雄のUSVsが雌の繁殖機能を促進させるかについては、博士前期過程の研究で、USVsを多く発声する雄とペアになった雌は出産回数が増えることを明らかにしている。このことから、雌が雄のUSVsを受容することで繁殖制御中枢が活性化し、交尾行動や排卵の促進によって繁殖効率が向上するメカニズムの存在が考えられた。しかし、USVsがどのように雌の繁殖制御機構に作用しているのかは明らかになっていない。そこで、第2章では、雌性ホルモンであるエストラジオールと、生殖内分泌中枢を司るキスペプチンニューロンに着目し、雄のUSVsの提示によりその活性レベルが高まるかを調査した。
【第１章 雄の超音波音声とフェロモンの統合神経核の同定】
実験1では、雌の性的覚醒を高めることが報告されている雄フェロモンであるExocrine gland-secreting peptide 1 (ESP1) (Haga et al., 2010) と雄のUSVs、あるいはESP1とバックグラウンドノイズ (Noise) を提示されたC57BL/6J (B6)系統の雌の神経活動を比較した。再生音には、B6系統の雄のUSVsよりも嗜好性を示すことが明らかになっているBALB/c系統の雄のUSVsを用いた。活性化した神経細胞の脳内局在は、c-fosのmRNA発現を指標に、in situ ハイブリダイゼーション法を用いて全脳領域で解析した。その結果、内側前頭前皮質 (mPFC) において、ESP1とUSVsを共提示した群は、ESP1とNoiseを提示した群に比べてc-fos陽性反応の顕著な上昇が見られた。また、一次聴覚野 (Au1) の2-4層、視床下部の腹内側部背内側核 (VMHdm)、扁桃体基底核 (BLA) においてもESP1とUSVsを共提示した群ではc-fos陽性反応が有意に高かった。
実験2では、複数の刺激に由来する情報を統合する領域だと考えられており、実験1で雄のESP1とUSVsの共提示により高い神経活性があることが検出されたmPFCの前辺縁皮質 (PrL) と下辺縁皮質 (IL) に着目して、その神経活性と雌の行動との関連を調査した。その結果、ESP1とUSVsを共提示した群では、対照群である溶媒 (Tris) とNoiseを共提示した群やESP1とNoiseを共提示した群に比べて、PrLのc-fosタンパク質の発現が有意に多く観察された。再生音提示中の行動と相関分析を行った結果、PrLのc-fos陽性細胞数と再生開始から5分間のスピーカー探査行動の持続時間には、正の相関が認められた。
実験3では、二重免疫組織化学的手法を用いてESP1とUSVsにより活性化した神経細胞の特性を調べた。皮質における神経細胞は、使用している神経伝達物質によって抑制性ニューロンと興奮性ニューロンに大きく分類され、抑制性ニューロンはGABA (γ-aminobutyric acid: ガンマ-アミノ酪酸) を、興奮性ニューロンはグルタミン酸を伝達物質として使用している。そこで、GABA作動性ニューロンならびにグルタミン酸作動性ニューロンに着目して解析を行った。その結果、c-fos陽性細胞の多くが、GABA陽性細胞よりも、グルタミン酸作動性ニューロンのマーカーとして用いたGLS2 (Phosphate activated glutaminase 2) 陽性細胞と重なっていた。このことから、USVsとESP1の複合的な刺激によりPrLで活性化する神経細胞の多くが興奮性のグルタミン酸ニューロンであり、情報を他の領域へ伝達し、USVsに対する接近行動を制御している可能性が示された。
【第２章 雄のUSVsが雌の生殖内分泌へ及ぼす効果の調査】
超音波スピーカーによる雄のUSVsの提示により、雌の生殖内分泌中枢が活性化されるかを末梢（実験4）、中枢（実験5）、神経細胞（実験6）単位で調査した。実験4 では、末梢に蓄積されたエストラジオール値を反映している糞中のエストラジオール値が雄のUSVsによって上昇するかを調べた。齧歯類の糞中のエストラジオール値は、雌の性成熟や性周期に応じて変化することが認められている（Chelini et al., 2005）。本実験では、非発情期の雌、発情期の雌、発情前期の雌、卵巣を除去した雌にNoiseまたはUSVsを提示し、その後、排泄した糞中のエストラジオール濃度を測定した。しかし、Noise提示群とUSVs提示群の間で、糞中エストラジオール濃度に明瞭な差は見られなかった。
実験５では、非発情期の雌と発情前期の雌に、NoiseまたはUSVsを提示し、その後、視床下部と聴覚野のエストラジオール濃度を測定した。鳥類では、雄の歌によって視床下部や聴覚野のエストラジオール値が上昇することが報告されている (Maney and Pinaud, 2011)。しかし、マウスを用いた本実験では、どちらの領域においてもNoise提示群とUSVs提示群の間で、エストラジオール濃度に明瞭な差は見られなかった。実験１では、雌に雄のUSVsとフェロモンを共提示することによって、聴覚野や視床下部の一部により高い神経活性が起こることを見出している。マウスの場合、USVsのみの刺激ではなく、雄の聴覚シグナルと嗅覚シグナルの複合的な刺激を受けることが、これらの脳部位の活性を効果的に高めるために必要であると考えられた。
そこで、実験６では、雄の嗅覚シグナルとの共提示の影響を加味し、視床下部の神経細胞に着目して解析を試みた。性腺刺激ホルモン放出ホルモン (GnRH) のサージ状分泌を制御し、また排卵の誘発に関与する前腹側周囲核 (AVPV) におけるキスペプチンニューロンと、GnRHのパルス状分泌とFSH分泌を制御し、また卵胞発育に関与する弓状核 (Arc) におけるキスペプチンニューロンの活性を、リン酸化cAMP応答配列結合タンパク (pCREB) を指標に二重免疫組織化学的手法により観察した。その結果、AVPVにおける活性化キスペプチン陽性細胞の割合は、提示した刺激の違いによる差が認められなかった。一方、Arcを背側部 (ArcD) と外側部 (Arc L) の2領域に分けて解析した結果、ArcLにおける活性化キスペプチン陽性細胞の割合は、提示した刺激によって差があった。ArcLではpCREB陽性細胞数とキスペプチン陽性細胞数に違いはなかったが、USVsを提示したTris + USVs 群とESP1 + USVs群は、Tris + Noise群に比べて活性化キスペプチン陽性細胞の割合が高い傾向が見られた。これらの結果から、雄のUSVsはArcにおけるキスペプチンニューロンに作用していることが示唆された。
【総合考察】
本研究の解析から、雄のUSVsとESP1の共提示により雌のPrLの神経がより活性化することが明らかになった。PrLは感覚統合や意思決定に関連していることが報告されていることから、雌は雄の聴覚情報と嗅覚情報をこの部位で統合し、適切な雄への嗜好性や接近行動を示すことを見出した。加えて、USVsはArcにおけるキスペプチンニューロンに作用し、卵胞発育を促進する可能性も示した。本研究は、雄のUSVsがフェロモンと共に雌の感覚統合機構に作用して適応的な繁殖行動を誘発するという雌雄間コミュニケーションの新たなメカニズムを明らかにし、さらに雄のUSVsが雌の繁殖内分泌中枢を活性化することで、繁殖機能促進に寄与していることを示唆した。doctoral thesi
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Get PDF第34回麻布環境科学研究会 一般演題8P(論文)会議録・学会報告application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape
Optimization of infectious conditions with Helicobacter pylori in the infection-highly resistant Mongolian gerbils supplied in Japan
Get PDF麻布大学博士(学術)Optimization of infectious conditions with Helicobacter pylori (H. pylori) in the infection-highly resistant Mongolian gerbils was performed. Mongolian gerbils were inoculated with H. pylori without pre-treatment or administered with sodium bicarbonate prior to inoculation. Serum titers of IgG and IgM against H. pylori measured by ELISA. H. pylori were isolated from the stomachs of Mongolian gerbils with increased IgM and IgG titers. On the other hand, H. pylori were not isolated from the stomachs of Mongolian gerbils with unchanged titers. All of the Mongolian gerbils obtained from supplier A were infected with H. pylori suspended in sterilized saline without pre-treatment, while none of the Mongolian gerbils obtained from supplier B were infected with H. pylori suspended in sterilized saline, while 42% of the Mongolian gerbils inoculated with H. pylori suspended in brain heart infusion medium were infected. Furthermore, infection with H. pylori in Mongolian gerbils previously administered with famotidine, an H2-blocker, was unsuccessful. Low infection rates were also observed in Mongolian gerbils administered 10% sodium bicarbonate solution prior to inoculation. However, infection with H. pylori in these Mongolian gerbils was successful after administration of 0.1% sodium bicarbonate solution prior to inoculation. The infection rate in Mongolian gerbils administered 0.1% sodium bicarbonate prior to inoculation with H. pylori suspended in brain heart infusion medium was 90%, and this rate was higher than with other pre-treatment methods. H. pylori infection of highly resistant Mongolian gerbils supplied in Japan is possible by adjusting gastric pH.1983年にWarren とMarshallによって初めてヒトの胃粘膜から分離されたHelicobacter pylori （H. pylori ）の動物実験には、BALB/cヌードマウスあるいはBALB/c 無菌マウスなどが用いられたこともあるが、スナネズミがヒトのH. pylori感染の病態を最もよく反映することから現在ではスナネズミが用いられている。
本邦では、H. pyloriが容易に感染するスナネズミを最も多く供給していた繁殖会社（A社）が、2012年中頃からその供給を中止したため、現在は他の1社（B社）から供給されているスナネズミしか入手できない。しかし、B社から供給されているスナネズミには従来のH. pyloriの接種条件ではほとんど感染しないため、現在わが国ではスナネズミを用いたH. pyloriの研究を行うことが困難な状況下にある。
本研究では、B社から供給されているH. pylori難感染性のスナネズミに感染を容易にさせる条件を検討した。本研究の概要は以下の通りである。
本研究には、A社（27匹）及びB社（162匹）の雄性スナネズミ合計189匹を用いた。供試したH. pyloriの菌株は、東海大学医学部感染症研究室の古賀康裕教授から分与された1株及び一般財団法人東京顕微鏡院から分与された臨床分離株5株である。本研究ではH. pyloriの接種量は5×107CFU/mlとし、その接種及び各種溶液のスナネズミへの経口投与には経口ゾンデを用いた。
本研究におけるH. pyloriの感染の有無は、H. pyloriに対する血清中のIgM及びIgG抗体の上昇によって判定した。その血清抗体の上昇がH. pyloriの感染成立の指標となることは、B社のスナネズミを用いて次の方法で確認を行った。H. pylori接種2週間後のスナネズミの胃の組織を培養してH. pyloriの感染が確認された個体と確認されなかった個体の両方について血清抗体との関係を検討した。H. pyloriの感染が成立し易い群では、前処置としてpH1.7の胃液約0.1mlを中性付近まで上昇させるために0.1％炭酸水素ナトリウム溶液、pH 9.5（重曹）0.3mlを投与したスナネズミ（10匹）へbrain heart infusion（BHI）培地で調製したH. pyloriを1日1回、2日間連続接種した。他方、H. pyloriが感染しにくい群では、スナネズミ（20匹）へfamotidineを投与した後に滅菌生理食塩水（生理食塩水）で調製したH. pyloriを1日1回接種した。これらのスナネズミは、H. pylori接種の2週間後に麻酔下の採血によって安楽死させ、血清中のIgM及びIgG抗体をELISAで測定した。それと同時に、摘出した胃の組織へ滅菌したPBS、pH7.4を加えてホモジナイズし、それをウマ血清加BHI寒天培地で培養した。その結果、前処置で0.1％重曹0.3mlを投与した10匹のスナネズミのうち血清中のIgM及びIgG抗体が有意に上昇した9匹のスナネズミ全ての胃からH. pyloriが分離された。一方、famotidineを投与したスナネズミのうちH. pylori 接種後に血清中のIgM及びIgG抗体が有意に上昇しなかった18匹から無作為に選んだ10匹のスナネズミの胃からは全くH. pyloriが分離されなかった。これによってH. pyloriに対する血清中のIgM及びIgG抗体の上昇がH. pyloriの感染成立の判定を行う指標になることが確認された。それ故に、以下の実験では血清抗体の上昇を指標としてH. pyloriの感染を判定した。
A社及びB社のスナネズミへ生理食塩水あるいはBHI培地で調製したH. pyloriをそれぞれ接種した場合の感染率を比較した結果、A社のスナネズミ（27匹）は全例が生理食塩水で調製したH. pyloriに感染したが、B社のそれ（40匹）では全例で感染が成立しなかった。また、BHI培地で調製したH. pyloriをB社のスナネズミへ接種した場合には、42%（5/12）に感染が確認された。感染が成立しなかった原因として、BHI培地で調製したH. pyloriの接種で42％に感染が認められたことならびにH. pyloriはウレアーゼを分泌して尿素をアンモニアと二酸化炭素に分解することで強酸性の胃内を自らが生存可能な環境に変えることから、胃内のpHが関係することが推察された。そこで、H. pylori を接種する前に、H2-ブロッカーであるfamotidineあるいは重曹を用いて胃内のpHを上げる前処置を試みた。その条件下で行った感染実験の結果及びすでに得られていた成績を併せた結果は次の通りであった。(1) BHI培地（pH7.2）で調製したH. pyloriを接種したところ、42％（5/12）で感染が認められた。(2) H. pylori接種3時間前に10㎎/㎏（体重）のfamotidineを投与した後に、生理食塩水で調製したH. pyloriを接種した結果、10％（2/20）に感染が認められた。(3) 0.02％に尿素を含有したBHI培地（pH7.3）で調製したH. pyloriを接種したところ、70％（7/10）で感染が確認された。(4) H. pylori接種10分前に0.1％の重曹0.3mlを投与して胃内のpHを中性付近に調整した後、生理食塩水で調製したH. pyloriを1日1回接種したところ、70%（7/10）で感染が認められ、これを2日間連続接種したときには80%（8/10）に感染が認められた。(5)(4)と同様に、0.1%重曹を投与した後に、BHI培地で調製したH. pyloriを1日1回接種した結果、80％（8/10）に感染が認められ、これを2日間連続接種したときには90％（9/10）で感染が確認された。
次に、継代の少ない臨床分離株の感染性を検討するために、生理食塩水で調製したH. pyloriをB社の無処置のスナネズミ各3匹へそれぞれ接種したところ、5株のうち2株で3匹中各1匹に感染が確認された（13.3%）が、他の3株では感染が成立しなかった。
絶食させたスナネズミ10匹の胃液のpHは平均1.7で、その量は約0.1mlであった。pH1.7の0.08M 塩酸0.1mlに0.1%重曹0.3ml及びBHI培地1.0mlを加えたときのpHは6.9に上昇した。そのことから、前処置によって胃内のpHが中性付近まで上昇したことで、継代を重ねたH. pyloriの感染率が高まったものと考えられた。その明確な機序は不明であるが、接種されたH. pyloriが胃粘膜に定着する際に、初めはその生存に必要な量のアンモニアを生成させるに充分なウレアーゼを分泌できないために、H. pyloriが定着する部位のpHを生存可能なpHにまで上昇させることができないことが定着を困難にしたと考えられた。また、継代の少ないH. pylori臨床分離株が、継代を重ねた菌株よりもわずかに感染し易いと思われる成績が得られたが、その感染率（13.3%）は低く、継代を重ねた菌株との相違は明らかにできなかった。
以上のように、本研究では、菌体を生理食塩水に浮遊させた菌液を接種する一般的な接種方法ではH. pyloriの感染がきわめて困難なB社のスナネズミにおいて、H. pyloriの感染率を高める条件として菌接種前に胃内のpHを中性付近に調整する前処置が有効であることを確認した。doctoral thesi