Azabu University Science Information Repository / 麻布大学学術情報リポジトリ
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The study on origin of chytrid fungus (Batrachochytrium dendrobatidis) and of pathogenesis of chytridiomycosis
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Introduction
Chytrid fungs (Batrachochytrium dendrobatidis: Bd) is emerging pathogen that associated with global decline of amphibian species and individuals. We detected chytridiomycosis at first in Japan and in Asia in 2006. The Japanese field survey and pathological examination detected 2 differences with large scale damaged foreign countries; the amphibian mass die-off from Bd epidemic has not detected and diversity of Bd haplotype of Japan were higher than that of damaged foreign countries. These situations were similar in the Asian foreign countries where have not damaged by Bd. Thus, the hypothesis: Bd originated from Asia and Japan (Bd originated Asia hypothesis) has occurred, but this hypothesis has not concluded because Bd plevarence in Asia is very low and it had passed only short term after Bd detected in Asia. On the other hand, pathogenesis of chytridiomycosis has not yet been completely clarified because it is only observed cause of death known that infected frog dead by osmotic imbalance through loss of electrolytes and cardiac arrest after effected skin chytridiomycosis. To clarify pathogenesis of chytridiomycosis, disruption of amphibian unique physiological function by chytridiomycosis must be observed because the integument of frog is a site of regulated transport for water, ions (electrolytes) and respiratory gases.
The aim of this study was to identify the origin of Bd by detecting distribution and genetic analysis of Bd in Japan with in mind that Bd originated Asia hypothesis. And to reveal pathogenesis of skin chytridiomycosis focused on the water channel, aquaporin (AQP) that amphibian unique physiological function.
Chapter 1. Confirming of oral chytridiomycosis in bullfrog (Lithobates catesbeiana) larvae and establishment of Bd examination method
We examined bullfrog (Lithobates catesbeiana) larvae (tadpole) usability as monitor of Bd field survey, since the reasons as follows. Bullfrog distributed over Japan widley, and it is known that this animal harbor Bd highly and its variety of haplotype is widely. We can capture bullfrog tadpole easily, and only examine the larval mouthparts that only distributed keratinized layer that area of Bd infection. Additionally, we established the examination method which can detect Bd infection exactly in this capter.
Fifty nine wild-captured bullfrog tadpole mouthparts underwent macroscopic, histopathological examination and nested PCR. Macroscopic lesions were observed in 21 of 59 tadpoles, and its 20 tadpoles were detected Bd infection by nested PCR and/or histopathological examination. Seventeen in 38 tadpoles that were not observed macroscopic lesions, were detected Bd indection. Total prevalence was 62.7% in these tadpoles. The macroscopic lesion characters were depigmentation, thinning of pigmented layer and partial defect of jaw sheaths and whited tooth rows.
We concluded that bullfrog tadpole is usable for Bd field survey because the animal is compromised host for Bd infection and its mouthparts legion is easily detected by macroscopic examination.
To establish the usable examination method, we compared nested PCR (materials: swab and mouthparts) and histopathological examination of mouthparts. One hundred twenty wild-captured bullfrogs from 2 habitas were divided into 2 groups, each group were 60 individuals, because we unable to conduct all examination methods to same one tadpole. The group 1 was sampled mouthparts swab and dissected mouthparts, and conducted nested PCR. Another group were conducted histopathological examination. Detection rate of each examination was high in order of swab nested PCR (67%), mouthparts nested PCR (65%) and histopathological examination (33%). The mouthparts nested PCR was recommended as Bd survey, however, sensitivity of swab nested PCR was higher than that of mouthparts nested PCR, because the sampling of swab was effected by sampling techniques. We concluded that collecting bullfrog tadpole mouthparts and conduct nested PCR can detect Bd infection situation in Japanese field.
Chapter 2. Seasonality of Bd infection of bullfrog tadpole
To decide term of Bd field survey, we detected seasonality of Bd infection of bullfrog tadpole. We collected 15 or 30 tadpoles in even months without December 2012, and totally 345 tadpoles were collected in between December 2011 and June 2014. The prevalence rate at each collected month was detected by nested PCR of mouthparts of these tadpoles.
The seasonality of Bd prevalence in Japanese bullfrog was revealed: the highest prevalence was April and June that average prevalence was 79%, the lowest prevalence was Augst and October that has not detected Bd infection. February and December detected Bd infection, however, the prevalence of these months were different in collected year that 7 to 63%.
Bd infection dynamic cycle amoung the year is seems that Bd grows and diffuses in winter to next spring, and largely decreases in summer that temperature is higher than that of Bd growth optimal temperature, and grows in late autum to winter. We decided that sampling Bd survey conduct between February and June as described above.
Chapter 3. Distribution and haplotype of Bd infected in bullfrog in Japanese field
We surveyed the Bd situation in Japan such as prevalence and Bd haplotype that infected in wild-captued bullfrog in Japan. 2012 and 2013, we collected 835 tadpoles from 44 areas of 26 counties, between February and June in each year. We conducted nested PCR from these samples, and determined the ITS gene region sequence from Bd positive samples, and conducted phylogenetic analysis with Bd that has been detected in previous studies.
Bd detected 266 individuals (32%) from 29 areas of 19 counties. The average prevalence was 51% (3 to 100%) in detected Bd areas. Sixty eight samples were detected sequence from 266 samples and were distinguished 41 haplotypes. Six types were already isolated haplotypes; Bd global pendemic lineage (A type: 19, CW34 Clone N: 1 sample), isolated in China (Bd50: 1, Bd41: 1 sample) and isolated in Japan (P type: 2, Z type: 2 samples). The other 35 types were newly identified haplotypes in this study. Interestingly, A type was detected highly and distributed widely in Japan. We conducted phylogenetic analysis by neighbor-joining method with Bd which isolated in previous study such as China, Africa, Brazil, Australia, Ecuador and Texas. Distinguishable areal difference was not observed in clade of phylogenetic tree, and partial clade was included with Chinese haplotypes.
These result likely suggest that Bd is originated from Asia and Japan, and this pathogen seems to coevolved with host amphibians for long history.
Chapter 4. The effect on skin water absorption by Bd infection
To clarify the pathogenesis of chytridiomycosis, we performed skin water permeability test and histopathological examination of skin and biochemical test with animal experiment. Ten frogs, Litoria caerulea from commercial market were eradiated Bd because some were already infected, and randomly assigned to exposure and control groups (each group were 5 frogs). Infection group frogs were exposed Bd via shallow immersion in bath of diluted water containing 1 ×106, 5,000 or 6,000 zoospores per 1ml. After 24 h frogs were moved to fresh container and keep 6 days. Control group were immersed in diluted water for 24 h, and keep 6 days similarly. Thigh and dorsal skins were sampled and conducted water mermeability test using a modified Ussing chamber. Ventral and dorsal skins were conducted histopathological examination. And collected blood was conducted biochemical test. To obtain Bd infection, we examined skin of all frogs, and conducted nested PCR of 5 frog skins (infection group:3, control group: 2).
Three of 5 frogs of infection group showed severe skin sloughing, and 1 frog was assossiated with anorexia and lethargy. Two of 5 frogs of infection group were obtained Bd infection by histopathological examination or nested PCR. Disruption of water regulatory function via thigh skin was observed: water absorption associated arginine vasotocin (AVT) reactive AQPa2s(AQP6vs) significantly decreased, however, water absorption associated with AQP3 that permeable with or without AVT stimulation significantly increased. Dorsal skin water permeability was not observed in all animals. Histologically, thicknning of stratum corneum and skin epidermal hyperplasia of both thigh and dorsal skin were observed in infected frogs, but not detected significant differences. The osomorality, Na, K and Cl level decreased slightly, and Mg and Ca level significantly decreased in biochemical test.緒言
カエルツボカビ（Batrachochytrium dendrobatidis : Bd）は世界的な両生類の種類および個体数の減少に関与する新興病原体である。2006年、我々はアジアおよび国内で初めてツボカビ症を発見した。その後、全国調査や病性鑑定を行った結果、流行が起きている諸外国と異なる次の2点が明らかになった。①国内野生下両生類にBdによる大量死が認められない。②Bdのhaplotypeの多様性は、被害が大きい諸外国では低いが、日本は非常に高い。この状況は、Bdの被害が認められないアジア諸外国でも同様であった。このことから、Bdはアジアおよび日本を起源とし、世界中に拡散したという「アジア起源説」が提唱されている。しかし、アジア地域においてはBdが発見されて間も無く、感染率が低いため、未だ結論に至っていない。一方、ツボカビ症の病理発生機序には、皮膚ツボカビ症を発症した後、電解質異常をきたし、心不全によって死亡することが知られている。しかし、これは死因を特定したのみでその機序は不明である。カエルの皮膚はガス交換、電解質輸送、水吸収などを行っており、生命維持に重要な役割を担っていることから、ツボカビ症の病理発生機序を解明するためには、カエルに特徴的な生理学的機能の破綻を解明する必要がある。
本研究の目的は、アジア起源説を念頭に入れて、Bdの国内分布および遺伝子型解析からBdの由来を解明すること。そして、両生類の皮膚の生理学的特徴である皮膚に分布する水チャネルaquaporin（AQP）に注目して、皮膚ツボカビ症の病理発生機序を解明することである。
第1章 ウシガエル幼生における口器ツボカビ症および検査法の確立
Bdの国内実態を的確に調べるために、後述する理由から、ウシガエル（Lithobates catesbeina）幼生の好適モニター動物としての検証を行った。ウシガエルは国内に広く分布しており、過去の調査によってBd感染率が高く、保菌するhaplotypeの種類も多いことが確認されている。また、幼生個体は採集が容易であり、かつ、Bdの感染部位である角質層が口器に限局していることから、口器のみを検査対象とすることができる。さらに本章では、的確にBdを検出する検査法についても検討した。
一生息池からウシガエル幼生59匹を採集し、これらの口器を病理検査（肉眼検査と組織検査）および口器から採取したswabを用いたPCR検査（nested PCR法）を行った。その結果、21匹の口器に肉眼的変化を認め、そのうち20匹にPCR検査または病理組織検査でBd感染を確認した。肉眼的変化がなかった38匹のうち17匹からPCR検査、病理組織検査のいずれか、または両方でBdを検出した。よって、62.7％の感染率であった。Bd感染による口器肉眼的変化の特徴は、嘴の①色素消失、②色素沈着層の菲薄化、③変形および④歯列の淡明化であった。
以上より、ウシガエル幼生はBdを高率に保菌し、目視によって容易に感染を確認できることから、Bdモニター動物として有効であると結論づけた。
ウシガエル幼生の口器のBdを的確に検出する検査法を確立するために、nested PCR法（swab、口器）および口器病理組織検査を比較した。2ヵ所の生息池から各60匹、合計120匹を採集した。1検体ですべての検査を実施できないため、目視検査によって口器異常を有する個体が同程度に含まれるように2群に分け、1群はswabおよび口器を材料とするnested PCR法、2群は口器病理組織検査を行った。各種検査の検出率は、swab nested PCR法（67%）、口器nested PCR法（65%）および口器病理組織検査（33%）の順に高かった。感度は口器よりもswabを材料とするnested PCR法の方が高かったが、統計学的に有意差を認めないこと、swabの採取は採取者の手技習熟度の影響を受けることから、口器を材料とするnested PCR法が推奨された。
以上より、ウシガエル幼生の口器を採材し、nested PCR法を行うことで、的確なBd感染状況を把握できると結論づけた。
第2章 ウシガエル幼生におけるBd感染の季節変動の把握
Bd調査適期を決定するために、ウシガエル幼生のBd感染率の季節変動を検討した。2011年12月～2014年6月の31ヶ月間のうち、2012年12月を除く偶数月に長崎県の一生息池から15回にわたって、各回ウシガエル幼生を15匹または30匹、計345匹を採集した。これらの口器をnested PCR法に供し、感染率の推移を調べた。
その結果、日本におけるBdの感染率に明らかな季節変動があった。最も感染率が高かったのは4～6月で、平均79%であった。感染率が最も低かったのは8～10月で、感染を認めなかった。2月、12月は7～63%と、採集年によって感染率が異なっていた。
以上より、国内自然界におけるBd感染動態の年間サイクルは、冬～春にかけて増殖し、気温が発育至適温度を上回る夏季に大きく減少した後、晩秋～冬にかけて再び増殖すると結論づけた。従って、Bd国内実態調査の採集適期を2～6月とした。
第3章 野生下ウシガエル幼生を対象としたBdの国内分布と遺伝子型
野生下ウシガエル幼生におけるBd感染率、保有haplotypeを解析し、Bd国内実態を調べた。2012年および2013年の各1～6月、26都府県44地域から835匹のウシガエル幼生を採集し、そのPCR産物からダイレクトシーケンス法によりBdのITS領域の塩基配列を決定し、既存のhaplotypeと比較、各haplotypeの国内分布を調べた。
その結果、19都県、29地域、266匹（感染率32%）に感染を認めた。検出地域におけるBd感染率は平均51%（3～100%）であった。266検体中68検体の塩基配列が決定され、これらは41種類のhaplotypeに型別された。そのうち、6 typeは既存のhaplotypeと一致し、その内訳は世界流行系統（A type：19、CW34 Clone N：1検体）、中国検出株（Bd50：1、Bd41：1 検体）、P type：2、Z type：2、検体であった。他35 typeは過去に報告のないものであった。なかでもA typeの高率かつ広域分布を確認した。国内、中国、アフリカ、ブラジル、オーストラリア、エクアドルおよびテキサス検出株の遺伝子データとともに、系統解析（近隣結合法）を行った。Clade形成に明瞭な地域差はなく、中国検出株と同じcladeを形成している検体も認められた。
以上より、Bdは日本およびアジアでは固有病原体（endemic）であり、長い歴史を経て宿主両生類と共に共進化している可能性があると考えた。
第4章 Bd感染が皮膚水吸収に与える影響
ツボカビ症の病理発生を明らかにするために、次の実験を行った。Bd高感受性動物イエアメガエル（Litoria caerulea）感染群5匹、対照群5匹、計10匹を用いた。感染群には、培養したBd遊走子1×106、5,000または6,000個/mlの飼育水を1日浸漬させた後、7日間、通常飼育し、軽度ツボカビ症を発症させた。対照群は7日間、通常飼育した。これらのカエルを安楽死させた後、Ussing chamber改良装置を用いて大腿部と背部の皮膚の水透過性試験を行った。併せて、皮膚を病理組織学的に、血液を血清生化学的に調べた。Bd感染確認は全個体の皮膚を病理組織学的に観察した他、5匹（感染群：3匹、対照群：2匹）の皮膚のnested PCR検査を行った。
感染群5匹中、3匹にツボカビ症の特徴である高度の脱皮を認め、そのうち、1匹は食欲不振、元気消失を伴っていた。5匹中2匹に病理組織検査またはnested PCR法によりBd感染を認めた。水透過性試験において、大腿部皮膚の水透過性における水分調節機能の障害を確認した。すなわち、抗利尿ホルモン（arginine vasotocin: AVT）反応性に働くAQPa2S(AQP6vs)を介する水透過性が有意に減少し、AVT刺激の有無に関わらず水を透過させるAQP3を介する水透過性が有意に上昇した。背部皮膚には、感染群、対照群ともに水透過性を認めなかった。病理組織学的検索では、大腿部、背部ともに表皮角質層・表皮細胞層の肥厚および表皮細胞数の増数を認めたが、有意差は得られなかった。その他、表皮細胞の変性などを観察した。血清生化学検査では、血漿膠質浸透圧、Na、Mg、CaおよびClの減少を認めた。これらのうち、MgとCaの変化には有意差を認めたが、その他の成分の変化に有意差は認められなかった。
以上の結果より、ツボカビ症の病理発生機序において、Bd感染から心不全に至る経路の1つに皮膚水透過性を介する水分調節機能の障害が関与し、電解質バランスの恒常性を維持できなくなり、心不全に至ると結論づけた。感染群の一部にBd感染が確認できなかったこと、電解質成分の減少と病理組織変化が軽度であったことは、発症の程度が軽症であったことによるものと考えた。doctoral thesi
Considerations on Jean Fautrier’s Paintings and their Literary Context
Get PDFIn the 20th century, paintings were created as a result of essentially free and subjective activities of individuals. During the transition to modernism, numerous works emerged, painted on the basis of greater subjectivity and more innovative ideas for art. These ideas resulted in a more uniquely subjective and abstracted creativity. In the case of Jean Fautrier, although his early works were based on realism, he also transformed and altered his style of expression, and finally adopted a method of ‘impasto.’
After World War Two, a more eccentric abstraction, painting without any form or style, emerged. The resulting works were the products of more arbitrary and independent intentions of painters as individuals. At the same time, it is certainly true that modern art after the 1950s has been criticized in many respects. As abstract modern art diverged from tradition and from the conservative creativity of western painting, art without form became a target for traditional criticism. Jean Fautrier’s sequence of works, Otage, was an early example of what Michel Tapié named Art Informel. The motif is clearly the threat of violence by Nazism and the victims of that violence; Fautrier’s expression is quite impressive and understandable as a product of historical disaster. Inhuman cruelty, deformed in the medium of thick oil painting, claimed a literary context which is inherent in the paintings. However, the essence of the works is possible only when expression is consistent with the literary context. Extreme deformation by Fautrier is clearly a product of the literary predicament which he experienced during the war. Fautrier’s trial is regarded as pre-Art Informel, inherited in the trend of abstractionism. Such an idea for abstractionism, different from that of W. Kandinsky or P. Klee, transformed traditional ideas of art into a more indecipherable form and deformed the individual’s concept. This study intends to examine the essence of Fautrier’s works and clarify the literary context behind his art, from the basis of criticism of modern art.P(論文)原著論文application/pdfORIGINAL ARTICLEdepartmental bulletin pape
麻布大学第5回学術展示 : 「熱帯雨林が紙になる━インドネシア泥炭湿地林の喪失」展
Get PDF2010年10月18日（月）から12月22日（水）までの期間で「熱帯雨林が紙になる─インドネシア泥炭湿地林の喪失」展を麻布大学獣医学部棟1階の学術展示スペースで行った。以下は，展示にコーディネーターおよび企画・制作に携わった筆者による記録である。Ever-growing global interests in environmental and social issues have created pressures on forest industry companies to manage their supply chains effectively. But yet, for both supply and demand-side reasons, the advances are limited in doing little to slow deforestation. Efforts require an understanding of individuals as consumer as well as understanding of corporations. The present article gives a review on the academic exhibition which focused on two different regions of rainforest, low land tropics of Sumatra and taiga of Russian Far East. Each of the exhibitions with a set of visual displays and artistic installations was designed for viewers to rethink relationships between demand-side customers and affected stakeholder groups in supply chains.P(論文)特集application/pdfFEATURE ARTICLESdepartmental bulletin pape
Roles of Schools in Addressing Community Issues in Japan: A Study Focusing on Educational Approaches Implemented by Schools
Get PDFThe present paper discusses the roles of schools in addressing community issues, based on the results of education systems implemented by Japanese schools, which have been suggested by previous studies.
In Japan, various approaches to school education have been implemented to develop measures to support children of relatively-poor parents living in areas inhabited by people subjected to discrimination or by foreigners and immigrants, and to develop communities, for children in particular, facing the issues of depopulation due to population aging and a declining birthrate.
In the implementation of those approaches to education, schools play important roles in encouraging community residents, both individuals and families, to address problems in collaboration with one another, facilitating cooperation among children and other community residents to discuss problems, and supporting children’s participation in the process of addressing community issues that influence them, such as poverty relief support and community improvement.P(論文)原著論文application/pdfORIGINAL ARTICLEdepartmental bulletin pape
A development of a live-cell observation method and analyses of the effect of blood molecules on the cell adhesion on the surface of Polytetrafluoroethylene
Get PDF麻布大学博士(学術)Polytetrafluoroethylene (PTFE), a kind of fluoropolymer, is widely used as a biomaterial for blood-contacting medical devices because of its properties, such as good biocompatibility, chemical stability and anti-cellular adhesiveness. In blood vessel prostheses, the anti-platelets adhesiveness and endothelialization on the surface of PTFE have been studied for the suppression of thrombus formation. Especially, the endothelialization plays an important role for the longstanding suppression of thrombus formation, the stability of the endothelial adhesiveness on the PTFE is important for that. Inverted phase-contrast microscopy is suitable for the chronological observation, which is needed to estimate the stability of the cellular adhesiveness on the PTFE. However, it is difficult to observe on the surface of thick PTFE, which have sufficient mechanical strength for use in biological experiments, by inverted phase-contrast microscopy because of its low optical transmittance. Although a thin layer of PTFE is likely to have low optical transmittance sufficient for observation under an inverted phase-contrast microscope such a thin layer would have insufficient mechanical strength. In the present study, we developed a PTFE-coated glass with optical transmittance sufficient for observation under an inverted phase-contrast microscope but with sufficient mechanical strength for use in biological experiments. The purpose of this thesis is that the observation of cells under an inverted phase-contrast microscope and the analysis of the effect of blood molecules on the cell adhesion on the surface of PTFE by using the PTFE-coated glass. The background of this thesis was explained in the first chapter. The PTFE-coated glass, which was made by the PTFE coating on the cover glass, was developed to achieve these opposite properties, the optical transmittance and mechanical strength, in the second chapter. Rat aortic endothelial cells (RAOECs) were seeded on the PTFE-coated glass treated with plasma that achieves the cell adhesion to PTFE. The observation of RAOECs on the PTFE-coated glass was tried by using an inverted phase-contras microscope and an inverted fluorescence microscope. It was possible to observe RAOECs on the surface of the PTFE-coated glass by using these microscopes. Any recognizable damage or peeling was recognized in the present study. These results showed that the PTFE-coated glass has sufficient strength and transmittance to be used for biological experiments. The PTFE-coated glass enabled live-cell observation of the PTFE surface using a phase-contrast microscope and also chronological observation. We estimated the effects of the blood molecules and extra cellular matrix on the RAOECs adhesion to PTFE, in third chapter. RAOECs or platelets were seeded on the PTFE-coated glass, which was treated with plasma, serum or cell adhesion molecules contained in blood and extra cellular matrix. The estimation of morphology and adhesion of RAOECs and platelets on the PTFE surface showed that treatment with the fibronectin, laminin, collagen, plasma and serum enhanced the cell adhesion, and tended to suppress the platelets adhesion. The chronological observation of RAOECs on the PTFE-coated glass treated with the fibronectin, laminin, collagen or plasma was performed by using phase-contrast microscopy. RAOECs stably adhered, proliferated, and covered the PTFE surface within 3 days by treatment with fibronectin and laminin. The plasma and collagen also enhanced the cell adhesion to the PTFE surface, however most RAOECs were detached within 7 days. These results suggested that RAOECs unsteadily adhere to the PTFE synthetic graft implanted via blood molecules, the speed of endothelialization of the graft is delayed by the detachment of the endothelial cells from that. It was suggested that the treatment with the fibronectin and laminin suppress the thrombus of the PTFE synthetic graft implanted by both the rapid endothelialization caused by the stably adhesion of endothelial cells and the suppression of the platelets adhesion.【緒論】
Polytetrafluoroethylene（PTFE）はフッ素樹脂の一種であり、生体適合性、化学的安定性、抗細胞接着性の高さから、血液接触型の医療機器に広く使用されている。人工血管においてもPTFEは使用されており、血栓形成の抑制のために、血小板付着抑制や血管内皮細胞による血管内壁の裏打ち（内皮化）の研究が行われている。PTFE製人工血管への長期にわたる抗血栓性付与には、血管内皮細胞の接着の安定性が重要である。その評価には、経日的な観察が必要であり、その解析には位相差顕微鏡による観察が適している。しかしながら、PTFEは光透過率と機械的強度がともに低いため、実験に十分な強度の厚さでは光透過率が不十分であり位相差顕微鏡による観察ができない。一方、薄膜であれば位相差観察は可能であると予測されるが、機械的強度が不十分となり、実験に用いるのは困難である。このため、PTFE表面の細胞の経日的観察の報告、特に血液との接触を想定した基礎的な報告はほとんどない。
本研究は2章から構成されている。第1章では培養下においてPTFE表面の細胞の位相差観察を可能にするため、後述のPTFEコートガラスを開発し、PTFE表面の細胞を可視化できることを示した。第2章では、開発したPTFEコートガラスを用いて、血液との接触を想定して内皮細胞を経日的に観察し、血中分子と細胞外マトリクスを介した接着を評価した。
第1章：PTFE表面の細胞の可視化
【背景と目的】
PTFE表面には細胞が直接接着することがほとんどないものの、血漿を介することで接着が可能になることが報告されている。PTFEは光透過率が低いため、位相差顕微鏡による生細胞の観察ができず、固定、染色した後に観察が行われている。
本章では、カバーガラス上に薄膜のPTFEコーティングを施したPTFEコートガラスを開発することで、PTFE表面の生細胞の位相差顕微鏡観察を可能にすることを目的とした。
【材料と方法】
PTFEコートガラスと一般的なPTFE樹脂（PTFEブロック）で細胞接着の低さの同等性を評価するために、ラット大動脈血管内皮細胞（RAOEC）を播種し、24時間後の接着細胞数をWST-8 Assayで測定した。
血漿を介した細胞接着もPTFEコートガラスとPTFEブロックで同等であるか評価するために、PTFEコートガラスとPTFEブロックをラット血漿に一昼夜浸漬した後、ラット大動脈血管内皮細胞（RAOEC）を播種し、24時間後の接着細胞数をWST-8 Assayで測定した。血漿を介してPTFE表面に接着した細胞の観察には、倒立型位相差顕微鏡を用いた。
【結果と考察】
PTFEコートガラスにはPTFEブロックと同様に、RAOECがほとんど接着しないことが示された。また、PTFEコートガラスにはPTFEブロックと同様に血漿処理によりRAOECが接着可能になった。この接着した細胞はPTFEコートガラスにおいてのみ位相差観察が可能であった。また、PTFEコートガラス表面には、実験中に大きな傷や剥離は確認されなかった。これらのことから、PTFEコートガラスは位相差顕微鏡観察に十分な光透過率と機械的強度を持つことが示された。
【結論】
これまでPTFE表面の細胞を観察するためには、固定や染色が必要であったが、PTFEコートガラスを用いることでPTFE表面の位相差顕微鏡による培養下での生細胞観察が可能になった。
第2章：血中分子と細胞外マトリクスを介したPTFEへの細胞接着の評価
2-1：PTFEへの細胞接着の短期的解析
【背景と目的】
安定した細胞の接着の指標の一つとして、細胞が仮足を広げているかどうかが挙げられる。しかし、PTFE表面は位相差顕微鏡観察が困難であるため、接着細胞の形態評価はほとんど行われていない。PTFEコートガラスを用いることで、細胞仮足の位相差観察が容易に行え、細胞接着の安定性を評価することが可能である。
そこで、第1章で示した血漿を介した細胞接着が接着分子特異的か、また、どの接着分子がPTFE表面への細胞接着を促進するか解析した。同時に、これらの接着分子がPTFE表面への血小板接着に及ぼす影響を解析することで、血小板接着を促進せずに内皮化を促進する物質を探索することを目的とした。
【材料と方法】
血漿を介した細胞接着が接着分子特異的か解析するために、血漿処理PTFEコートガラスに、広範囲な接着分子阻害ペプチドであるアルギニン-グリシン-アスパラギン酸-セリン（RGDS）で処理したRAOECを播種し、24時間後に位相差顕微鏡観察およびWST-8 Assayで細胞接着を解析した。
接着分子であるフィブロネクチン、ヴィトロネクチン、フィブリノゲン、ラミニン、コラーゲンの細胞接着への影響を評価するために、PTFEコートガラスをこれらの接着分子で前章と同様に処理し、RAOECを播種し、24時間後の接着を位相差顕微鏡観察およびWST-8 Assayで評価した。また、同様にラット血小板を播種し90分後の接着を乳酸脱水素酵素（LDH）Assayで評価した。
フィブリノゲンの細胞接着への影響を解析するために、PTFEコートガラスを前章と同様に血漿もしくは血清で処理し、RAOECを播種し、24時間後の接着を位相差顕微鏡観察およびWST-8 Assayで評価した。また、ラット血小板を播種し、90分後の接着を乳酸脱水素酵素（LDH）Assayで評価した。
【結果と考察】
血漿処理PTFEコートガラス表面の、RGDS処理されたRAOECを位相差顕微鏡観察した結果、仮足を広げない不安定な接着が確認された。この細胞接着をWST-8 Assayで評価すると、RGDSにより抑制される傾向が示された。
接着分子で処理したPTFEコートガラス表面のRAOECを位相差顕微鏡観察した結果、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン処理においてRAOECの仮足を広げた安定な接着が確認された。このときの細胞接着をWST-8 Assayで評価すると、フィブロネクチン処理が最も高い細胞接着を示し、次いでラミニンとコラーゲン処理が比較的高い細胞接着を示した。また、血小板の接着ではフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン処理が抑制傾向を示し、フィブリノゲン処理は促進傾向を示した。
【結論】
PTFEへの血漿を介したRAOECの接着は接着分子特異的であることが示唆され、接着分子のうちフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンがPTFEへの細胞接着を誘導することが示された。
2-2：PTFEへの細胞接着の経日的解析
【背景と目的】
2-1より血漿、フィブロネクチン、ラミニンもしくはコラーゲン処理されたPTFE表面において、播種24時間後では仮足を広げた細胞接着が確認された。人工血管の内皮化には、これらの接着がより長期間にわたり安定であり、その表面で細胞増殖が可能であることが重要である。
このため、これらの処理をされたPTFE表面の細胞接着の安定性および増殖を経日的に評価することで、人工血管の内皮化に有用な分子を探索することを目的とした。
【材料と方法】
血漿、フィブロネクチン、ラミニンもしくはコラーゲンで前章と同様にPTFEコートガラスを処理し、RAOECを播種し、経日的に位相差顕微鏡により観察し、細胞接着の安定性および増殖を評価した。
【結果と考察】
フィブロネクチンおよびラミニン処理したPTFE表面へのRAOECの接着は安定的であり、細胞増殖もみられ、PTFE表面の内皮化が可能であった。血漿およびコラーゲンもPTFE表面への細胞接着を誘導したが、この接着は不安定であり、播種7日以内にほとんどの内皮細胞が剥離し、内皮化は起こらなかった。フィブロネクチンやラミニンが、PTFE表面における細胞接着の安定性や細胞増殖を促進することが示されたことから、これらの処理をPTFE製人工血管にも施すことで、安定な内皮化を引き起こすことが可能になると予測された。一方、血漿処理後のPTFE表面には細胞が接着するものの、不安定であり数日で接着細胞が認められなくなった。移植されたPTFE製人工血管においても、血液を介した細胞接着は不安定であり、内皮化が起こりにくいと予測された。
【結論】
本実験でPTFE表面へのフィブロネクチンやラミニン処理が、安定な細胞接着を引き起こし、内皮化を可能にすることが示された。また、血漿で処理されたPTFE表面は細胞接着が不安定であり、内皮化が困難であることが示唆された。
【総括】
本研究では、カバーガラスにPTFEをコーティングしたPTFEコートガラスを開発し、これまで困難であったPTFE表面の位相差顕微鏡観察を可能にした（第1章）。位相差顕微鏡を用いて、PTFEコートガラス表面のRAOECを経日的に観察した。血漿処理されたPTFE表面では、播種7日後にはほとんどの細胞がPTFE表面から剥離した。このことから、移植されたPTFE製人工血管では、その表面に血中の接着分子を介して細胞が接着するが、不安定であるため内皮化の速度が遅くなると予測された（第2章）。
研究によりPTFE表面の細胞観察が容易となったため、細胞の接着安定性等を評価することで、人工血管をはじめとするPTFE製の医療機器の改良に繋がると考えられる。doctoral thesi
Distribution of Major Staphylococcal Cassette Chromosome mec Types and Exfoliative Toxin Genes in Staphylococcus pseudintermedius Strains from Dogs with Superficial Pyoderma in Japan
Get PDFStaphylococcus pseudintermedius is a major pathogen of canine pyoderma, known to produce exfoliative toxins that could be involved in formation of cutaneous lesions. To understand the genotypic distribution of S. pseudintermedius, we surveyed 74 dogs with pyoderma in three veterinary hospitals in Japan. Seventy-four S. pseudintermedius strains were isolated, 52 of which (70.3%) were mecA-positive methicillin-resistant S. pseudintermedius (MRSP). Staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing of the identified MRSP strains revealed that the most prevalent genotype was type III-like (63.4%) followed by type V (34.6%). These data suggest high prevalence of MRSP strains consisting of two major SCCmec types among canine pyoderma in Japan. We found low prevalence of exfoliative toxin genes (exp) in the MRSP strains: expA and expB were present in 1.9% and 0%, respectively. These findings suggest no association in carriage between mecA and exp genes in S. pseudintermedius from canine pyoderma.P(論文)原著論文application/pdfORIGINAL ARTICLEdepartmental bulletin pape
麻布大学第15回学術展示 : 「トラと家具？～ロシア極東の森で今 起こっていること～」展の記録
Get PDF2014年5月20日（火）から2014年8月28日（木）までの期間で「トラと家具？～ロシア極東の森で今 起こっていること～」展を麻布大学獣医学部棟1階の学術展示スペースで行った。以下は，展示にコーディネーターとして関わった筆者と展示の企画・制作を担当されたタイガフォーラムの諸氏による記録である。The forests of the Russian Far East—known as the “Ussuri Taiga”—are being put in danger of disappearing due to rampant, large-scale illegal logging, largely to supply Chinese furniture and flooring manufacturers. A massive volume of their final products are flushed into the markets of the U.S., EU and Japan. Russian Far East as a part of Northeast Asia is located close to Japan though only a few of the Japanese people understand the closeness and much fewer know where their furniture is sourced from. In the exhibition, we aim to inform viewers of the vast biodiversity of “Ussuri Taiga” and the harmonious coexistence of the Udege indigenous people and critical habitat for the endangered Amur tiger.P(論文)特集application/pdfFEATURE ARTICLESdepartmental bulletin pape