Azabu University Science Information Repository / 麻布大学学術情報リポジトリ
Not a member yet
1842 research outputs found
Sort by
Sulfoquinovosyl Acyl Panediol (SQAP) as a Radiation Sensitizer for Dogs with Tumors : A Pilot Study
Get PDFSulfoquinovosylacylpanediol (SQAP) was discovered to be a radiation sensitizer in 1997. However, the safety of SQAP and radiotherapy to treat naturally occurring tumors in dogs remains unknown. The purpose of this study was to evaluate the safety of SQAP and hypofractionated radiotherapy in healthy beagle dogs, and dogs with tumors. Healthy beagle dogs were administered SQAP at doses of 0, 1, 2, 4, and 8 mg/kg for 5 consecutive days on the first week, while radiotherapy was performed once weekly for 4 weeks. Five dogs with soft tissue sarcoma, thyroid carcinoma, undifferentiated carcinoma, hemangiosarcoma, and liposarcoma were also enrolled in this prospective study. SQAP at 4 mg/kg was administered to the dogs with tumors. The adverse events of SQAP included angialgia in most cases. The adverse events of SQAP and radiotherapy were mild. The systemic administration of SQAP and concomitant radiotherapy appears to be safe for short-term use.P(論文)症例報告application/pdfdepartmental bulletin pape
レジオネラ属菌のすみか、バイオフィルムを知る!
Get PDF第38回麻布環境科学研究会 生命・環境科学部教員によるセミナー1P(論文)会議録・学会報告application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape
「最先端の亜鉛生命医科学」にあたって : 第21回 麻布大学 生殖・発生工学セミナー
Get PDF第21回 麻布大学 生殖・発生工学セミナーP(論文)会議録・学会報告application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape
ヒト疾患とモデルマウスから究明する亜鉛恒常性システムの重要性
Get PDF第21回 麻布大学 生殖・発生工学セミナーP(論文)会議録・学会報告application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape
Pathological analysis of aged animal brains
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Introduction
Animal aging is progressing due to the development of veterinary medicine. In the aging human society, the control of senile brain diseases, among which Alzheimer’s disease (AD) is a representative, has become an important issue. Various brain lesions are also known to occur with aging in companion animals; however, the details about their pathophysiology and pathogenesis are unknown. Cognitive dysfunction syndromes seen in aged dogs and cats also reportedly have differing pathological lesions. In this manner, age-related lesions in the brains of animals may be characterized by species. In this study, the aim was to comparatively pathologically search the brains of individual aged animals from various animal species.
Chapter 1. Pathological search of brain lesions in aged animals
A pathological search was carried out on cerebral formalin-fixed specimens from 155 mammals from 8 species and 28 families and 27 birds wherein the animals died at ages judged to be elderly for each species. Although in many of the animals there were no morphological changes classified as specific diseases, there were some in the suborder of canines (Caniformia) and primates in whom senile plaque-like eosinophilic homogenous unstructured deposits found in AD in humans were observed. Amyloid beta (Aβ) deposition, a hallmark lesion of AD, reportedly also occurs in the cerebrum of advanced age animals in various forms. In the present study, although only a small number was seen, senile plaque-like structures seemingly from amyloid deposits in aged canines and squirrel monkeys were observed. Conversely, no senile plaque-like structures were found in animals of the same carnivorous order in the feline (Feliformia) suborder. Additionally, amyloid depositions to the blood vessel wall were also observed in dogs, monkeys and parakeets, and cerebral hemorrhage was seen in squirrel monkeys and parakeets. These results suggest that there may be a characteristic pattern of Aβ deposition in animal species.
As a specific disease, porencephaly was observed in a fennec fox, and tauopathy was observed in a domestic cat in 1 animal each. Porencephaly frequently occurs in cows and sheep and is a rare disease in other animals, and this study is the first report of its observation in a fennec fox. In the domestic cat, age-related lesions similar to Alzheimer's disease have been reported, characterized by the deposition of 3R tau/4R tau-type phosphorylated tau within neuronal cells and neurofibrillary tangles in the hippocampus. Although 3R tau/4R tau-type phosphorylated tau was also deposited in the tauopathy of domestic cats in this study, neurofibrillary tangles were widely distributed not only in the hippocampus but also in the cerebral cortex and midbrain. Additionally, the deposition of phosphorylated tau was found not only in neurons but also in microglia and some oligodendroglia. From the aforementioned pathological findings, a diagnosis of non-Alzheimer type tauopathy that has not been reported in the past in domestic cats was given.
Chapter 2. Search for Aβ and hyperphosphorylated tau accumulation in the brain of advanced age animals
In Chapter 1, it was suggested that there might be a characteristic pattern of Aβ deposition in animal species. In humans, Aβ deposition is considered to be a lesion associated with AD. Thus, age-related lesions similar to that observed in AD (Aβ deposition, phosphorylated tau accumulation, and neurofibrillary tangles) in each animal species were comparatively analyzed by immunological and special staining of the animals evaluated in Chapter 1. The amount and sites of deposition of Aβ varied among species. Aβ deposition was not observed in rodents, lagomorphs, perissodactyls, diprotodontia, chiroptera, and most bird species, and was frequently observed in carnivores (17 species, 88 animals) and primates (8 species, 18 animals) (as well as in 2 animals in 2 other species). The primate order was found to have predominantly vascular wall Aβ deposition (CAA), and the deposition morphology in brain parenchyma varied according to suborder or species. The carnivorous order had differing characteristics in each suborder and, in the canine suborder, diffuse spots with unclear boundaries from surrounding areas and CAA were mainly observed, as well as depositions that differed in each species, while in the feline suborder, only diffuse deposition of Aβ was observed except for 1 animal in 1 species. In the feline suborder, deposited Aβ were not stained with diazo stain for argentaffin granules and was negative for Congo red staining, suggesting that they do not form amyloid fibrils. Neurofibrillary tangles in the hippocampus were observed only in 6 animals in the 2 species of domestic cat and cheetah in the feline suborder. Accumulation of phosphorylated tau was observed in 25 animals in 7 species that were positive for deposition of Aβ. In the feline suborder, accumulation of phosphorylated tau was frequently observed in 21 animals in 3 species, i.e., domestic cats, cheetahs, and pumas.
From the aforementioned results, it became clear that animal species differences existed in age-related lesions that were similar to AD. In particular, in domestic cats and cheetahs, age-related lesions similar to those in all ADs were found, with deposition of Aβ, phosphorylated tau accumulation, and neurofibrillary tangles, suggesting the presence of AD-like pathologies similar to humans.
Chapter 3. Analysis of animal Aβ Amino acid sequences and amyloid fibril formation
In Chapter 2, it was suggested that the deposition of Aβ in the feline suborder did not form amyloid fibrils. The amino acid sequence that determines the secondary structure of Aβ is reportedly important for the formation of amyloid fibrils. Thus, the amino acid sequence in the feline suborder is considered different from that of other species. Therefore, in this chapter, the aim was to clarify the sequence of the Aβ coding region of the amyloid precursor protein (APP) gene and the amyloid fibrogenicity of each Aβ in various animal species, including the feline suborder. Gene sequences in the Aβ region were highly conserved among species and were similar to humans in many animal species, but differed partly from humans only in the feline suborder. Human and feline suborders differed in amino acids at residue 7 of the APP gene-encoded Aβ. In human Aβ the amino acid was Asp and in the feline suborder Aβ it was Glu. Synthetic peptides of human Aβ and feline suborder Aβ were generated, and amyloid fibrogenicity was compared using a thioflavin assay in vitro. The Aβ of the feline suborder showed predominantly lower fibrogenicity compared to human Aβ. Additionally, the ultra-fine morphology of the formed fibers was also different, and the human Aβ consisted of many long and elongated fibers about 12 nm in width forming intertwined aggregates, whereas short fibers of about 19 nm in width were sporadically seen in the feline suborder Aβ, and the formation of aggregates was slight. These results indicated that the amyloid fibril formation of Aβ is remarkably low in the feline suborder, because the amino acid of the 7th residue is Glu.
The site of deposition of Aβ in domestic cats was observed by immuno-scanning electron microscopy, and coarse and short fibers were independently present. Conversely, in canines with the same sequence as humans, elongated Aβ fibers were deposited in a manner that aggregated and spread to the surrounding area. The difference in the aggregation properties of Aβ shown in vitro is considered to influence the difference in deposition morphology.
Chapter 4. Search for tau phosphorylation-related factors in felines
Neurofibrillary tangles were found only in the domestic cats and cheetah families in the feline suborder, despite the common morphologies of deposition and sequence of Aβ amino acids. The accumulation of phosphorylated tau is also highly prevalent in these animals, but there was no accumulation of phosphorylated tau in lions or tigers belonging to the same feline family. Neurofibrillary tangles reportedly arise from the release from microtubules through phosphorylation of tau, a microtubule-associated protein, and there may be species differences in the process by which phosphorylated tau accumulates among feline suborders. Thus, a comparative analysis of the expression isoforms affecting phosphorylation and microtubule binding and the expression of GSK-3β, a phosphoenzyme of tau, in the feline suborder was performed. Total proteins extracted from the brains of advanced age domestic cats with and without accumulation of phosphorylated tau and neurofibrillary tangles, and aged lions with and without Aβ deposition were analyzed by Western blot using antibodies against the isoforms 3R tau and 4R tau. As a result, signals corresponding to the sizes of 3R tau and 4R tau in domestic cats and aged lions were detected. Signals of 3R tau were higher than 4R tau in domestic cats, and the findings were vice versa in lions. 3R reportedly has properties that are more prone to release from microtubule binding than 4R tau. From this finding, more phosphorylated tau was considered to have been liberated from microtubules in cells of domestic cats in comparison to lions, leading to neurofibrillary tangles. Immunostaining for the expression of the phosphorylation enzyme of tau, GSK-3, led to findings of it being diffusely expressed in neurons in the hippocampi of domestic cats, cheetahs, and pumas, confirming its colocalization with phosphorylated tau in some neurons. However, differences correlated with the degree of accumulation of phosphorylated tau were not found when activated GSK-3β was detected by Western blot; thus, its participation in the phosphorylation of tau was not clarified.
Discussion
The brains of aged animals of various species were analyzed and Aβ deposition was shown to be highly prevalent in the carnivorous and primate orders, and its deposition morphology and distribution shown to differ among species. Particularly in the feline suborder, the deposition of Aβ without amyloid fibrils was observed, and characteristic phosphorylated tau accumulation and neurofibrillary tangles, which resembled AD, were observed in domestic cats and cheetahs. This study showed that Aβ in the feline suborder was associated with low amyloid fibril formation, and the thought is that the properties of Aβ affected the difference in deposition morphology. In AD, amyloidization of Aβ is important in the pathogenesis. However, phosphorylated tau accumulation and neurofibrillary tangles, which are similar to AD age-related lesions, were observed in the absence of amyloid fibril formation in domestic cats and cheetahs, suggesting a pathogenesis not mediated by amyloidogenesis. However, when the expression isoforms of tau in lions exhibiting the same Aβ deposition as domestic cats and no accumulation of phosphorylated tau were compared, it was found that domestic cats expressed a higher amount of the isoform 3R tau, which is prone to release from microtubules. These results suggest that there is freer phosphorylated tau in the neural cells of domestic cats than lions, which may contribute to the formation of neurofibrillary tangles. Thus, this study suggests that AD-like age-related lesions found in feline suborder animals have a different pathogenesis from AD.緒言
獣医療の発達により動物の高齢化が進んでいる。ヒトでは高齢化社会において、アルツハイマー病(AD)を代表とする老齢性脳疾患の制御が重要な課題となっている。伴侶動物においても、加齢に伴い様々な脳病変が生じることが知られているが、その病態や発生機序について詳細は不明である。また、高齢なイヌとネコでみられる認知機能不全症候群は、それぞれ病理学的にみられる病変が異なる事が報告されている。このように動物の脳の加齢性病変は、種によりそれぞれに特徴的な変化が生じている可能性がある。本研究では、様々な動物種における高齢個体の脳について、比較病理学的に検索することを目的とした。
第1章 高齢動物の脳病変の病理学的検索
哺乳類8目28科および鳥類の各動物種の高齢と判断された年齢で斃死した症例について、哺乳類155例、鳥類27例の大脳ホルマリン固定材料を対象に病理学的検索を行った。多くの症例では特定の疾患に分類される形態学的変化は認められなかったが、イヌ亜目と霊長目の動物においてヒトのADで認められる老人斑様の好酸性均質無構造な沈着物を認める症例が存在した。ADの特徴病変であるアミロイドβ(Aβ)沈着が高齢動物の大脳にも様々な形態で生じていることが報告されている。本研究においても、高齢のイヌとリスザルに少数であるがアミロイドからなる老人斑様の構造を認めた。一方で、同じ食肉目であるネコ亜目の動物には老人斑様構造は認められなかった。また、イヌ、サル、インコで血管壁へのアミロイド沈着も認め、リスザルとインコでは脳出血が生じていた。以上の結果より動物種に特徴的なAβ沈着の様式が存在する可能性が示唆された。
特定の疾患として、フェネックで孔脳症、イエネコでタウオパチーを1症例ずつ認めた。孔脳症は牛や羊に発生することが多く、他の動物では稀な疾患であり、フェネックでは本研究が初の報告である。イエネコでは加齢性に、神経細胞内の3Rタウ/4Rタウ型リン酸化タウの沈着と海馬における神経原線維変化を特徴とするアルツハイマー病に類似した病変が報告されている。本研究で明らかにしたイエネコのタウオパチーにも3Rタウ/4Rタウ型リン酸化タウが沈着していたが、神経原線維変化は海馬だけでなく、大脳皮質、中脳の広範囲に分布していた。また、リン酸化タウの沈着は神経細胞だけでなく、ミクログリアと一部のオリゴデンドログリアにも認められた。以上の病理所見より、イエネコでは過去に報告のない非アルツハイマー型のタウオパチーと診断した。
第2章 高齢動物の脳のAβおよび高リン酸化タウ蓄積の検索
第1章において、動物種に特徴的なAβ沈着の様式が存在する可能性が示唆された。ヒトではAβ沈着はADに関連した病変と考えられている。そこで、第1章で検索した症例を対象に、各動物種のAD 類似の加齢性病変（Aβ沈着・リン酸化タウ蓄積・神経原線維変化）について免疫・特殊染色にて比較解析した。Aβ沈着の量と沈着部位は種により異なっていた。Aβ沈着は齧歯目、ウサギ目、奇蹄目、双前歯目、翼手目及びほとんどの鳥類では認められず、食肉目（17種88例）・霊長目（8種18例）で高頻度に観察された（その他2種2例）。霊長目は血管壁のAβ沈着（CAA）を主体に認め、脳実質の沈着形態は亜目あるいは種によって異なっていた。食肉目は亜目ごとに特徴があり、イヌ亜目では、CAA及び周囲との境界が不明瞭なび漫斑を主体に、種ごとに異なる沈着がみられる一方、ネコ亜目では1種1例を除き、び漫性のAβ沈着のみ認めた。ネコ亜目では沈着Aβは嗜銀性を示さず、Congo Red染色陰性であり、アミロイド線維を形成していないことが示唆された。海馬における神経原線維変化はネコ亜目であるイエネコとチーターの2種6例でのみ認めた。リン酸化タウの蓄積はAβ沈着陽性であった7種25例に認めた。ネコ亜目では、イエネコ、チーター、ピューマの3種21例で高頻度にリン酸化タウの蓄積が観察された。
以上の結果より、AD類似の加齢性病変には動物種差が存在することが明らかとなった。特にイエネコとチーターではAβ沈着、リン酸化タウ蓄積、神経原線維変化と全てのAD類似の加齢性病変が認められ、ヒトのAD類似の病態の存在が示唆された。
第3章 動物のAβアミノ酸配列及びアミロイド線維形成性の解析
第2章で、ネコ亜目のAβ沈着はアミロイド線維を形成していないことが示唆された。アミロイド線維の形成にはAβの二次構造を決定するアミノ酸配列が重要であることが報告されている。そのためネコ亜目のAβのアミノ酸配列が他種と異なることが考えられる。そこで本章では、ネコ亜目を含む様々な動物種のアミロイド前駆蛋白(APP)遺伝子のAβコード領域の配列と各Aβのアミロイド線維形成性を明らかにすることを目的とした。Aβ領域の遺伝子配列は種間の保存性が高く、多くの動物種でヒトと共通であったが、ネコ亜目でのみヒトと一部異なっていた。ヒトとネコ亜目ではAPP遺伝子にコードされているAβの７残基目のアミノ酸が異なっており、ヒトAβはAsp、ネコ亜目AβはGluであった。ヒトAβとネコ亜目Aβの合成ペプチドを作成し、in vitroでアミロイド線維形成性を用いて比較したところ、ネコ亜目のAβはヒトAβと比較して有意に低い線維形成性を示した。また、形成された線維の超微形態も異なっており、ヒトAβは幅約12nmの長く伸長した線維が絡み合った凝集物を多数形成するのに対し、ネコ亜目Aβは幅約19nmの短い線維が散見され、凝集物の形成は僅かであった。これらの結果から、7残基目のアミノ酸がGluであることにより、ネコ亜目のAβのアミロイド線維形成性は著しく低いことが示された。
イエネコのAβ沈着部位を免疫走査型電子顕微鏡で観察したところ、粗で短い線維が独立して存在していた。一方、ヒトと同じAβ配列を有するイヌでは、伸長したAβ線維が凝集して周囲へ広がる様に沈着していた。in vitroで示されたAβの凝集性の違いが沈着形態の違いに影響していると考えられる。
第4章 ネコ科動物におけるタウのリン酸化関連因子の検索
Aβ沈着形態及びAβアミノ酸配列はネコ亜目で共通するにもかかわらず、神経原線維変化はネコ科のイエネコとチーターにのみ認められた。これらの動物ではリン酸化タウの蓄積も高頻度に生じているが、同じネコ科に属するライオンやトラではリン酸化タウの蓄積はみられなかった。神経原線維変化は微小管結合タンパク質であるタウがリン酸化をうけ微小管から遊離することが起点となって生じることが報告されており、ネコ亜目間ではリン酸化タウが蓄積する過程に種差が考えられる。そこでネコ科を対象に、リン酸化および微小管結合に影響する発現アイソフォームおよびタウのリン酸化酵素であるGSK3βの発現を比較解析した。リン酸化タウの蓄積と神経原線維変化がみられた高齢のイエネコと病変のないイエネコ、Aβ沈着がみられた高齢のライオンと病変のないライオンの脳から抽出した総タンパク質を、タウのアイソフォーム3Rタウと4Rタウに対する抗体を用いたウェスタンブロットで解析した。その結果、イエネコと高齢のライオンで3Rと4Rタウに相当するサイズにシグナルを検出した。イエネコでは4Rより3Rタウのシグナルが高く、ライオンではその逆であった。3Rは4Rタウより微小管結合から遊離しやすい性質をもつことが報告されている。そのことから、ライオンと比較し、イエネコでは微小管から遊離したリン酸化タウが細胞内に多量に存在し、神経原線維変化へ至ることが考察された。タウのリン酸化酵素であるGSK3βの発現を免疫染色で観察したところ、イエネコ、チーター、ピューマの海馬においてび漫性に神経細胞に発現しており、一部の神経細胞にリン酸化タウとの共局在が確認された。しかし、ウェスタンブロットで活性化型GSK3βを検出したところ、リン酸化タウの蓄積の程度と相関した差は認められなかったことから、タウのリン酸化への関与は明らかにされなかった。
考察
様々な種の高齢動物の脳を解析し、Aβ沈着は食肉目と霊長目で高頻度にみられ、その沈着形態や分布には種によって異なることを示した。特にネコ亜目ではアミロイド線維を伴わないAβ沈着が生じ、イエネコとチーターにADに類似する特徴的なリン酸化タウ蓄積と神経原線維変化が生じていた。本研究でネコ亜目のAβはアミロイド線維形成性が低いことが示され、Aβの性状が沈着形態の違いに影響していると考えられる。ADではAβのアミロイド化が病理発生に重要とされている。しかし、イエネコとチーターではアミロイド線維の形成が無いにもかかわらず、AD類似の加齢性病変であるリン酸化タウ蓄積と神経原線維変化が生じており、アミロイド形成を介さない病理発生機序が示唆された。だが、イエネコと同様のAβ沈着を呈しリン酸化タウの蓄積がないライオンにおけるタウの発現アイソフォームを比較したところ、イエネコでは微小管から遊離しやすいアイソフォームのタウ（3Rタウ）を多く発現していた。これより、イエネコの神経細胞内には、ライオンより遊離したリン酸化タウが多く存在し、それが神経原線維変化の形成に寄与する可能性が示唆された。以上より、本研究ではネコ亜目動物でみられるAD類似の加齢性病変は、ADとは異なる発生機序があることを示唆した。doctoral thesi
Measuring the Effectiveness of Adoption Program by Means of a Litter Survey
Get PDFAzabu University took part in an Adoption Program based on an agreement with Sagamihara City and cleaned up sidewalks in the city 57 times from November 2005 to October 2008 (the first period), and 18 times from April 2018 to March 2019 (the second period). In addition, a research was conducted to investigate fluctuations in the number and composition of litter on the sidewalks both by visual observation and counting the actual litter items. This paper discusses the effectiveness of Adoption Program as an activity to improve the local environment beautification based on quantitative data.
The Findings are as follows:
1. In the first period, scattered waste decreased dramatically, and the number of scattered garbage at the end of the first period decreased to 30% to 40% compared with the beginning of this period.
2. The number of scattered garbage at the beginning of the second period was about the same as at the end of the first period. It shows that beautification levels had been maintained for the past ten years.
3. The data was collected in several subdivisions according to the location characteristics of the survey area. The result of survey suggests that there is an important relationship between location characteristics and transi-tion of scattered garbage.
4. In the transition by type of scattered garbage, the number of cigarette butts decreased significantly.
5. By cross-checking the visual and real survey results, visual surveys are effective as simple survey methods.P(論文)原著論文application/pdfORIGINAL ARTICLEdepartmental bulletin pape
環境が野生動物の行動を変える : 人が無意識に手がけた野生動物のリゾート
Get PDF第38回麻布環境科学研究会 市民公開講座2P(論文)会議録・学会報告application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape
In utero di(n-butyl)phthalate exposure affects rat testicularLeydig cells and Sertoli cells
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Di (n-butyl) phthalate (DBP) is a widely used plasticizer with many advantages such as durability, long life and low cost. Therefore, it is a widely used organic compound such as medical tube, lacquer, adhesive, leather, printing ink, safety glass, cellophane, dye, pesticide production, fragrance solvent, textile lubricant, and cosmetics. DBP is a rapidly excreted compound.After i.g. of DBP to rats, 90 to 96% of administered dose is excreted in urine within 48 hr. But some DBP transferred to the placenta or breast milk and passed into the next generation, with particular effects on Leydig and Sertoli cells in rodent neonates. However, it has been unclear how in utero exposure to DBP affects from postpuberty to adulthood in the next generation.In this study, we investigated the effects of in utero exposure to DBP on testicular Leydig and Sertoli cells from puberty to adulthood in the next generation.
Chapter1
The ultrastructural features of rat testicular Leydig cells exposed to DBP in utero from puberty to adulthood has examined. The animals were divided into 4 groups of 0, 10, 50 and 100 mg DBP/kg/day and administered by gavage (i.g) from gestation days 12 to 21. Thereafter, the testes were harvested at the age of 5, 7, 9, 14, and 17 weeks after euthanasia.The present study describes atypical Leydig cell (LC) hyperplasia Sprague-Dawley rats with low testosterone and high luteinizing hormone levels after prenatal administration of 100 mg/kg/day di (n-butyl) phthalate on days 12 to 21 post conception. In testes exposed to 100 mg DBP, the total LC area and N/C of LC increased with age in weeks, and LC hyperplasia was observed.Aggregated LCs had atypical nuclei, abundant free ribosomes, stripped rough endoplasmic reticulum, intermediate-size filaments, elongated cytoplasmic filopodia, atypical tight junctions, and cilia formations.And, immunohistochemical analysis showed expression of proliferating cell nuclear antigen and vimentin in many hyperplastic LCs.Terefore Degenerative degeneration of the seminiferous tubules with numerous Sertoli cells was observed in the seminiferous tubules. Male rat offspring following exposure to 100mg/kg/day DBP in utero has lower serum T values and higher Luteinizing hormone(LH) levels than controls from postpuberty to adulthood. DBP exposed rats in utero showed high LH levels from puberty to adulthood, but T levels were not elevated. Terefore that LC hyperplasia occurred and impairment of LC suggested.
Chapter2
Expression of strogen receptor α, β (ERα and ERβ) and androgen receptor (AR) in hyperplastic LCs was studied because, LC hyperplasia indicative of impaired testicular LC was observed in rats in utero exposed to 100 mg/kg/day DBP. At 5, 7, 9, 14, and 17 weeks of age, Animals were euthanized. And these testes were harvested. In addition, the expression of ERαERβAR protein and mRNA was examined using RT-PCR. Rats were housed under conditions similar to those in Chapter 1. There was no significant difference in the expression of sex hormone receptors from 5 to 7 weeks of age. However, at 9 to 17 weeks of age, LC in the DBP exposed in utero group had significantly higher and lower ERα and ERβ and AR expression. The increased ERα in the testis suggested an increased sensitivity to estrogen in Leydig cells. The decreased AR also suggested a decreased sensitivity of Leydig cells to T.
Chapter3
Since decreased T production was observed from puberty to adulthood, the factors involved in T production, StaR and P 450 scc distributed in mitochondria (Mt) of LC and 3 β-HSD, P 450 c 17 and 17 β-HSD distributed in sER, were molecularly studied.
Testis exposed to 100 mg DBP/kg in utero were examined at 5, 7, 9, 14, and 17 weeks of age after euthanasia, and testis T values were determined. StAR, P 450 scc, 3 β-HSD, P 450 c 17, and 17 β-HSD were examined for mRNA and protein expression.
This analyses revealed that StAR and P450scc, distributed in sER , levels in the DBP group were significantly lower at 5 and 7 weeks compared with the vehicle group but became similar during weeks 9–17. Although 3β-HSD, P450c17, and 17β-HSD, distributed in Mt , levels in the DBP group were similar to the vehicle control group at 5 and 7 weeks of age, they were significantly lower during weeks 9–17. The inhibition of T synthesis by DBP exposure in utero was thought to change with growth, because the T synthesis-related enzymes distributed in sER were inhibited during puberty and those distributed in Mt during adulthood.
Chapter4
Testicles exposed to 100 mg DBP/kg showed degenerative changes in which seminiferous tubules are occupied by Sertoli cells (St). Normal St is known as having a markedly lower mitotic activity.It has been examined the ability of St to divide by the BrdU reaction in degenerative seminiferous tubules in the next generation of rat exposed to DBP.
Testis exposed to 100 mg DBP/kg in utero were examined at 5, 7, 9, 14, and 17 weeks of age after euthanasia.We investigated ST numbers ,number of vimentin labeled Sertoli cells, BrdU-positive Sertoli cells/Sertoli cell ratios ,and Percentage of DNA mitotic (S phase) cells in rats in utero exposed to 100 mg/kg/day DBP.
The numbers and diameters of ST testicular sections were statistically similar at weeks 7 and 9; however, at weeks 14 and 17, they were statistically different and displayed higher BrdU-positive Sertoli cells/Sertoli cell ratios in the DBP treatment group. In utero DBP exposure significantly increased Sertoli cell numbers and their cellular proliferation from postpuberty to adulthood. The significant increase in FSH after adulthood suggested that FSH caused Sertoli cell proliferation.
Summary
The lowest-observed-adverse-effect level for Leydig and Sertoli cells exposed to DBP in utero was 100 mg/kg. In the DBP group, significant inhibition of testosterone synthesis after puberty and adulthood and hyperplasia of atypical Leydig cells showing higher levels of hormone receptors such as increased ERα and decreased ERβ and AR were observed. In addition, the expression of testosterone synthesis-related enzymes distributed in sER was suppressed during puberty, and the expression of related enzymes distributed in mitochondria was suppressed during adulthood.[諸言]
Di(n-butyl)phthalate(以下DBP)は広く利用されている可塑剤で、耐久性、長寿命、低コストなど利点が多いため、医療用チューブ、ラッカー、接着剤、レザー、印刷インキ、安全ガラス、セロハン、染料、 殺虫剤の製造、香料の溶剤、織物用潤滑剤、ニトロセルロース・塩化ビニル樹脂・セルロースアセテート・ポリスチレン・メタクリル樹脂の可塑剤、化粧品原料など幅広く利用されている有機化合物である。DBPは速やかに体外に排泄される化合物であり、投与量の90〜96％は48時間以内に尿中に排泄される、しかし、一部は胎盤に移行もしくは母乳内に溶出し次世代に移行し、特にげっ歯類新生仔の精巣Leydig 細胞 および Sertoli 細胞に障害を及ぼすことが明らかにされている。しかし、胎生期DBP曝露が次世代の思春期から成獣期へいかなる影響を及ぼすかについては不明とされてきた。
本研究では、DBPのラット胎生期曝露が次世代の思春期から成獣期の精巣Leydig 細胞 およびSertoli細胞に及ぼす影響について以下4項目について検討を行った。
[第1章]胎生期DBP 曝露ラット精巣Leydig細胞の超微形態学的検討
[目的] 胎生期DBP 曝露ラット精巣Leydig細胞の次世代思春期から成獣期における超微形態について検討を行った。
[材料および方法]
DBP (99.8% pure)はAldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI)から入手した。湿度55±5%、約22±2℃で12時間の明暗環境下で、高効率粒子空気(HEPA)でろ過した大気置換室において、木材チップを敷いたポリカーボネートゲージに個別に収容した。動物には餌と水を自由摂取させた。すべての実験手順は、麻布大学動物実験倫理委員会の承認を得て行った。また国立衛生研究所公衆衛生サービスポリシーによって定められた、家畜の人道的使用およびケアに関する医療ガイドラインに従った。妊娠Sprague-DawleyラットをSRC(静岡、日本)から入手した。（対照群）0mg、10mg、50mg、100mgDBP/kg/dayの4つのグループに分け、妊娠12日齢から21日齢まで強制経口投与(i.g)を行った。その後次世代出生、5週齢、7週齢、9週齢、14週齢、17週齢の各週齢で、安楽死後精巣を採材した。
［結果と考察］
10mg、50mg、100mDBP/kg胎生期曝露の次世代ラットでは体重、体長、生存率、性別の偏りに有意差は認められなかった。しかし、100mgDBP曝露群は成獣期9、14、17週齢時点で他群と比べ精巣重量の有意な減少と、Leydig 細胞 (LC)の過形成が認められた。超微形態学的観察から、胎生期100mgDBP/kg曝露の精巣では他群と比較して、総LC面積、LC のN / Cは週齢に従いLC過形成が認められた。さらに、過形成LCには、核小体を伴う非定形の核と粗面小胞体、遊離リボソーム、中間系ミクロフィラメント、微小管束、細胞突起、線毛が認められた。しかし、滑面小胞体(sER)とTeststerone(T)代謝に関与するペルオキシゾームはほとんど認められなかった。さらに、過形成LCは免疫組織化学的にPCNAとビメンチンに陽性を示した。また、精細管中に多数のSertoli細胞を認める精細管の退行変性が認められた。100mg DBP曝露群は次世代思春期から成獣期で、有意に低い精巣T値を示したのに対して、精巣Luteinizing hormone(LH)値は有意に高い値を示した。100mg DBP曝露群の次世代ラットは、思春期から成獣期で高LH値を示すも、T値が上昇しないことから、LC過形成が発現したものと考えられ、LCの障害が示唆された。
第2章「胎生期DBP曝露ラット精巣Leydig細胞のEstrogen/Androgen受容体発現に関する検討」
［目的］
胎生期100mg DBP/kg曝露ラットでは、精巣LCの障害を示唆するLC過形成が認められたので、性ホルモン受容体であり核内受容体であるestrogen receptor α、β(ERα、ERβ)およびandrogen receptor(AR)の、過形成LCおける発現について分子生物学的な検討を行った。
[材料および方法]
胎生期100mgDBP曝露の次世代ラットを5週齢、7週齢、9週齢、14週、17週齢時点で安楽死後精巣を採材した。さらにRT-PCRを用いてERα、ERβ、AR・mRNAおよびタンパク質の発現について検討した。ラットは第1章と同等の条件下で飼育した。
［結果と考察］
5週齢から7週齢時点で、性ホルモン受容体の発現に、有意差は認められなかった。しかし、9から17週齢時点では、100mgDBP曝露群のLCでは、有意に高いERα、および、有意に低いERβとARの発現が認められた。精巣のERαの増加からLeydig細胞におけるエストロゲンに対する感受性の上昇が考えられた。また、ARの低下から、Leydig細胞のTへの感受性の低下が考えられた。
第3章「胎生期DBP曝露ラット精巣Leydig細胞の Teststeron生合成酵素発現に関する検討」
［目的］
T産生低下が思春期から成獣期に認められたことから、T産生に関与する因子、LCのミトコンドリア(Mt)に分布するStaR、P450sccと、sERに分布する3β-HSD、P450c17、17β-HSDについて分子生物学的に検討した。
［材料と方法］
胎生期100mgDBP/kg曝露の次世代5、7、9、14、17週齢時点で、安楽死後に精巣を採材した。精巣T値を測定した。さらに、StAR、P450scc、3β-HSD、P450c17、17β-HSD、について、mRNAの発現とタンパクの発現を検討した。ラットは第1章第2章と同等の条件下で飼育した。
［結果と考察］
100mgDBP曝露群で思春期5、7週齢におけるsERの3β-HSD 、P450c17、17β-HSD発現量が、有意に低い値を示した一方で、9、14、17週齢時点では、これらの発現量は対照群と有意差は認められなかった。これに対して、100mgDBP曝露群における、Mtに分布するStAR, P450sccの発現は、5、7週齢時点では、対照群と比べて有意差は認められなかったが、9週齢以降で有意に低い値を示した。思春期にはsERに分布するT合成関連酵素が抑制され、成獣期ではMtに分布する関連酵素が抑制されたことから、胎生期100mgDBP曝露によるTの合成の抑制は、成長に伴い変化すると考えられた。
第4章「胎生期DBP曝露ラット精巣Sertoli細胞のBrdU発現に関する検討」
［目的］100mgDBP/kg曝露の精巣では、精細管がSertoli細胞(St)で占められる退行変性を示すことが明らかとなった。正常Stは細胞分裂能が顕著に低いことから、DBP曝露群の次世代において、退行変性を示す精細管におけるStの細胞分裂能をBrdU反応で検討した。
［材料と方法］
100mgDBP曝露群の次世代5、7、9、14、17週齢時点で、ラットから安楽死後精巣を採材した。精細管あたりのBrdU陽性Stの数を検討し、BrdU陽性St/（BrdU陽性St+ BrdU陰性St）を算出し、DNA分裂期(S期)細胞の割合を検討した。ラットは第1章第2章第3章と同等の条件下で飼育した。
［結果と考察］
100mgDBP曝露群の精細管の数は、7、9週齢時点では対照群と比べ有意差はなかったが、14、17週齢では有意な増加を示した。また、精細管あたりのビメンチン陽性St細胞数は、100mgDBP曝露群ラットは、7と9週齢時点で対照群と同様の値を示していたが、14、17週齢時点で対照群と比べて有意に高い値を示した。さらに、BrdU陽性St/Stの比率は、14、17週齢時点で、有意に高値を示した。100mgDBP曝露群の精巣のSt増殖能が、成獣期に上昇することが認められた。成獣期以降にFSHが有意な増加を示すことから、FSHによりSertoli細胞の増殖が引き起こされたと考えられた。
「総括」
胎生期DBP曝露のLeydig細胞、Sertoli細胞への最小毒性量は100mg/kgであった。100mgDBP曝露群では、思春期・成獣以降有意にテストステロン合成阻害と、ERαの増加とERβとARの減少などホルモン受容体の異常を示す異形Leydig細胞の過形成が認められた。さらに、思春期にはsERに分布するテストステロン合成関連酵素の発現抑制を認め、成獣期ではミトコンドリアに分布する関連酵素の抑制が認められた。また、成獣期ではFSH上昇と精細管におけるSertoli細胞の細胞分裂増殖が認められた。doctoral thesi
Toxicological studies of citreoviridin that is a mycotoxin contaminating rice and grains
Get PDF麻布大学博士(学術)Citreoviridin (CTVD) is a mycotoxin that is a secondary metabolite produced by Penicillium citreonigrum, Aspergillus terreus and Eupenicillium ochrosalmoneum. Because P. citreonigrum capable of producing CTVD contaminates mainly rice, contamination with CTVD can be problem in countries of Asia and South America, where rice is a staple food. CTVD is a yellow rice toxin, and a case of its contamination in an imported rice sample was previously reported in Japan. Recently, the occurrence of P. citreonigrum capable of producing CTVD has been reported in areas with a tropical climate, such as Thailand and Brazil.
Regarding toxicity of CTVD, in the 1940s, several toxicological studies revealed that symptoms such as progressive paralysis, vomiting, convulsions and temporary respiratory disturbance developed when a crude extract from contaminated rice was administered to mammals and other vertebrates via intraperitoneal (IP), subcutaneous (SC) and oral (PO) routes. Furthermore, it was found that isolated CTVD causes the same symptoms as experiments using moldy rice. Neurological symptoms progressed faster at higher doses of extracted toxin, and the median lethal dose (LD50) of CTVD for mice has been reported be 3.6 to 11.8 mg/kg (SC) and 7.5 mg/kg (IP). As a human adverse effects, CTVD has been considered to be related to Shoshin-kakke (acute cardiac beriberi) and Keshan disease which adversely affects the heart. In 2006, an outbreak of Shoshin-kakke occurred in Brazil, and the presence of rice contaminated with P. citreonigrum capable of producing CTVD was reported in the outbreak area.
An understanding of toxicokinetics is essential when performing a toxicological study. However, from the 1940s to the 1980s, when toxicological studies of CTVD were performed actively, no high-resolution analytical methods had yet been developed, and the toxicokinetics of CTVD were determined based solely on the results of a fluorescence analysis using thin layer chromatography.
The present study was conducted with the following three experiments: (1) the toxicokinetics of CTVD were investigated by administering CTVD to swine, which are similar to humans both anatomically and physiologically; (2) the permeability of CTVD was investigated using Caco-2 cells, which are a model of human intestinal cells; and (3) a CTVD metabolic study was conducted using the swine or human hepatic S9 fraction containing metabolic enzymes.
The bioavailability of CTVD to humans was estimated, while in addition the toxicokinetics of CTVD in vitro to humans was compared with that to swine on studies (2) and (3).
I. Toxicokinetics of CTVD in swine
CTVD (0.1 mg/kg body weight) was administered to swine (weighing about 10 kg) intravenously (IV) and PO. The CTVD concentration of plasma samples was determined via liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The toxicokinetics parameters (TK) were analyzed, and the following results were obtained: (1) the CTVD concentration in plasma decreased quickly shortly after IV administration and then continued to decrease moderately until 48 h (final sampling point); however, some amount of CTVD remained in plasma even at 48 h after administration. (2) The rate constant (Kel) after IV administration was 0.5 ± 0.1 × 10 -1 h-1. The half-life (T1/2) and volume of distribution (Vd) were 16.2 ± 4.3 h and 1.5 ± 0.2 L, respectively. (3) The CTVD concentration in plasma in PO gently increased after administration and reached the maximum concentration (Cmax: 38.2 ± 6.7 ug/mL) at 15.0 ± 6.0 h (Tmax), after which it moderately decreased until 48 h. (4) The Kel after PO administration was small (0.4 ± 0.2 × 10-1 h-1, similar to that in IV). The T1/2 and Vd were 21.4 ± 12.7 h and 1.7 ± 0.3 L, respectively. (5) The bioavailability of CTVD was 79.3% from 0 to 48 h and 116.4% on extrapolating from 48 h to infinity. These results suggested that CTVD had a high bioavailability in swine. In addition, CTVD was eliminated slowly from the body and was easily distributed to tissues. These findings suggested that CTVD remained in the body for a relatively long time after administration.
II. Permeability of CTVD for Caco-2 cells, a human intestinal cell model
Because CTVD had a relatively high bioavailability in swine, a permeability study was performed using Caco-2 cells, which are a human intestinal cell model. CTVD (3 μM and 10 μM) was treated to the apical side (AP) of Caco-2 cells cultured in a monolayer using a CorningTM BioCoatTM Intestinal Epithelium Differentiation Environment Kit (Corning, NY, USA) and then incubated at 37 °C. After 2 h, the culture medium was sampled from the AP and basolateral side (BL). The CTVD concentration was determined using LC-MS/MS, and then the transepithelial electrical resistance (TEER) and permeability coefficient (PaPP) were estimated. The results of this study were as follows: (1) The TEER was unchanged at each concentration of CTVD. (2) The PaPP values at each CTVD concentration of 3 μM and 10 μM were 52.2 ±28.3 and 42.6 ± 17.7 (×10-6 cm/s), respectively, indicating a relatively high permeability. These findings suggested that CTVD could be easily absorbed by the human intestine, similar to swine, which reflected a high lipid solubility of CTVD.
III. CTVD metabolism and its metabolites as assessed using swine and human hepatic S9 fractions
Our in vivo study showed that the plasma CTVD concentration decreased gently, and CTVD was still detected even at 48 h after administration. Given these results, the CTVD metabolism was next investigated using swine and human hepatic S9 fractions containing metabolic enzymes. CTVD was incubated at 37 °C with hepatic S9 fraction in solution containing glucose-6-phosphate (G6P) and NADP. The solution was sampled at 30 min, 1 and 4 h after incubation, and then the concentrations of CTVD and its metabolites were determined using a quadrupole time-of-flight mass spectrometer (Q-TOF). The findings were as follows: (1) The CTVD metabolites were estimated to be hydroxylation-methylation, desaturation and dihydoroxylation derivatives. (2) Each metabolite was produced in greater quantities using the human hepatic S9 fraction than the swine hepatic S9 fraction. (3) The CTVD concentration was significantly lower with the human hepatic S9 fraction than with the swine hepatic S9 fraction. These results suggested that CTVD was slowly metabolized in swine, which may have been the cause of the slow elimination rate noted in the swine in the in vivo study. In addition, humans seemed to more readily metabolize CTVD than swine.
Because CTVD glucuronide was unable to be detected in the metabolic study using S9 fractions in the presence of G6P and NADP, CTVD was incubated with an S9 fraction in the presence of UDP-glucuronic acid and alamethicin to examine CTVD glucuronidation ability. The following results were obtained: (1) CTVD glucuronide had not been produced by 30 min after incubation, regardless of the fraction used. (2) The levels of CTVD glucuronide at 4 h after incubation were significantly greater with the swine hepatic S9 fraction than with the human hepatic S9 fraction. These findings suggested that CTVD glucuronide was more readily produced in swine than in humans.
The present studies showed that CTVD is easily absorbed by the body and has a long T1/2 and large Vd, indicating that CTVD persists for a relatively long time in the body. In addition, the bioavailability of CTVD appeared to be high in both humans and swine. Regarding CTVD metabolism, humans were able to metabolize CTVD earlier than swine according to in vitro findings, while the glucuronidation ability for CTVD was better in swine than in human from an in vitro perspective.シトレオビリジン（CTVD）は、Penicillium citreonigrum、Aspergillus terreus、Eupenicillium ochrosalmoneumなどが二次代謝産物として産生するカビ毒である。CTVDを産生するP. citreonigrumなどは穀類のうち主にコメを汚染するため、コメを主食とするアジアや南米などの国々でCTVDの汚染は問題となる。CTVDに汚染されたコメが黄色くなることから、CTVDは黄変米毒の一つとしても知られており、日本国内で過去に輸入米での汚染事例が報告されている。近年においても、タイやブラジルなど熱帯性気候の地域でCTVD産生能を有するP. citreonigrumの存在が報告されている。
CTVDの毒性については、1940年にP. citreonigrumに汚染されたコメの粗抽出物を腹腔内投与（IP）、皮下投与（SC）又は経口投与（PO）により哺乳類や脊椎動物に投与した場合に、四肢の進行性麻痺、嘔吐、痙攣、漸次的呼吸障害などを引き起こすことがいくつかの毒性学的研究から明らかとなった。その原因カビ毒としてCTVDが同定され、精製品を用いた動物実験において、神経症状の進行時間は毒素抽出物の用量が多くなるほど短くなることが報告されている。マウスに対するCTVDのLD50は3.6-11.8 mg/kg（皮下投与）、7.5 mg/kg（腹腔内投与）とされている。ヒトで起こる健康被害としては、衝心脚気やKeshan病との関連も指摘されており、2006年にブラジルで発生した衝心脚気のアウトブレイクでは、当該地域のコメからCTVDを産生するP. citreonigrumが検出されており、同毒素が原因物質として疑われている。
毒性学研究においてはトキシコキネティクスや体内動態の情報が欠かせないが 、CTVDの毒性実験が盛んに行われていた1940年代から1980年代には微量分析が可能な分析機器等がなく、感度の低い薄層クロマトグラフィーによる蛍光分析での結果に留まっていた。そこで、本研究ではCTVDのトキシコキネティクスを明らかにする目的で、解剖学的、生理学的にヒトと類似しているブタを用いたCTVDの投与実験により検討した。また、ヒトとの比較を行うため、ヒト腸管細胞モデルであるCaco-2細胞を用いた透過実験及び代謝酵素を含む肝臓S9画分を用いた代謝実験をin vitroで行い、ヒトにおけるCTVDのバイオアベイラビリティを推測した。本研究の概要は次のとおりである。
Ⅰ ブタにおけるCTVDのトキシコキネティクス
約10 kgのブタにCTVD 0.1 mg/kg bwを静脈投与及び経口投与した。継時的に血液を採取し、分離した血漿中のCTVD濃度をLC-MS/MSで分析した。分析結果から解析ソフト(WinNonlin)を用いてトキシコキネティクスパラメータ(TKパラメータ)を算出し、次の結果を得た。（１）静脈投与後のCTVDの血漿中濃度は、投与後急激に減少し、最終採血時点である48時間後まで緩やかに減少したが48時間後でも血漿中からCTVDが検出された。（２）静脈投与時のTKパラメータは、小さな速度定数（Kel）（0.5 ± 0.1 ×10-1 h-1）を示し、半減期（T1/2）及び分布容積（Vd）はそれぞれ16.2 ± 4.3 h、1.5 ± 0.2 Lであった。（３）経口投与後のCTVDの血漿中濃度は、投与後緩やかに上昇し、15.0 ± 6.0 h（Tmax）でピーク（Cmax：38.2 ±6.7 ng/mL）を迎えたのち、48時間後まで緩やかに減少した。（４）経口投与時のTKパラメータは、静脈投与と同様にKelが小さく（0.4±0.2 ×10-1 h-1）、比較的長いT1/2（21.4 ± 12.7 h）と大きなVd（1.7 ± 0.3 L）を示した。（５）CTVDのブタにおけるバイオアベイラビリティは、投与後48時間までで79.3 %と比較的高く、無限時間まで外挿した場合には116.4%を示した。これらの結果から、CTVDはブタにおいて高いバイオアベイラビリティを持つことが示唆された。また、CTVDは体内からの消失が遅く、組織移行性も高いと考えられ、比較的長く体内に残留することが示唆された。
Ⅱ ヒト腸管培養細胞Caco-2細胞を用いたCTVDの透過係数
ヒトにおけるCTVDのバイオアベイラビリティを推定するため、ヒト腸管細胞モデルであるCaco-2細胞を用いた透過実験を実施した。CorningTM BioCoatTM Intestinal Epithelium Differentiation Environment Kitを用い、単層に培養したCaco-2細胞の粘膜面側にCTVD（3 µM及び10 µM）を暴露し、37℃でインキュベートした。2時間後の粘膜面側及び基底膜面側の培地を採取し、培地中のCTVD濃度をLC-MS/MSを用いて測定して、経上皮電気抵抗値（TEER）及び透過係数（Papp）を求めた。その結果、（１）いずれのCTVD濃度においてもTEERに変化は認められなかった。（２）各CTVD濃度におけるPappは、それぞれ52.2 ± 28.3、42.6 ± 17.7 （×10-6 cm/s）であり、比較的高い透過係数を示した。これらから、CTVDはブタと同様にヒトにおいても体内に吸収されやすいことが示唆された。高い透過係数は、CTVDの脂溶性の高さを反映する結果と考えられる。
Ⅲ ブタ及びヒト肝臓S9画分を用いたCTVDの代謝とその代謝物
ブタを用いたCTVDのin vivo実験において、血漿中CTVD濃度が比較的緩やかに減少し、48時間後においても血漿中に残留していたことから、ブタにおいては代謝が比較的遅い可能性が示唆された。そのため代謝酵素を含むブタ及びヒトの肝臓S9画分を用いた代謝実験によりCTVDへの代謝能を比較した。始めにグルコース−６−リン酸（G-6-P）及びNADPを含む溶液中に肝臓S9画分（0.5 mg/mL）及びCTVD（1.5 µg/mL）を加え、37℃でインキュベートした。インキュベート後30分、1時間及び4時間後の溶液を採取し、Q-TOFで分析した。その結果、（１）CTVDの代謝物は主に水酸化-メチル化体、不飽和化体及びジヒドロキシ化体であることが推測された。（２）いずれの代謝物もヒト肝臓S9画分を用いたほうがブタ肝臓S9画分を用いるよりも有意に多く産生された。（３）CTVD濃度がブタ肝臓S9画分を用いるよりもヒト肝臓S9画分を用いたほうが有意に低下した。これらから、CTVDは、ブタにおいてS9による代謝が遅いことが示唆され、ヒトにおいてはブタよりもCTVDを代謝しやすいことが考えられた。
S9画分を用いた代謝実験において、グルクロン酸抱合体が産生されなかったことから、ウリジン二リン酸グルクロン酸及びアラメチシンの存在下でCTVDとS9画分をインキュベートして、CTVDのグルクロン酸抱合体の産生を調べた。その結果、（１）いずれのS9画分を用いた場合でも、インキュベート後30分までにCTVDのグルクロン酸抱合体は産生されなかった。（２）インキュベート後4時間でブタ肝臓S9画分を用いたほうがヒト肝臓S9を用いるよりも有意にグルクロン酸抱合体が産生された。これらから、CTVDのグルクロン酸抱合体についてはブタのほうがヒトよりも産生されやすいことが示唆された。
本研究では、in vivoにおけるブタでのCTVDのトキシコキネティクスの結果より、CTVDが体内に吸収されやすく、長い半減期と大きい分布容積を持つことが示された。これらのことから比較的長く体内に残留することを明らかにした。また、CTVDのバイオアベイラビリティはブタにおいて高いだけでなく、ヒトにおいても高い可能性をin vitroで明らかにした。一方で、CTVDの代謝については、ヒトではブタよりも早いが、グルクロン酸抱合体形成能はブタのほうが優れていたことをin vitroの観点から明らかにした。doctoral thesi