Azabu University Science Information Repository / 麻布大学学術情報リポジトリ
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Cerebellar Coenurosis with Hind Limb Paralysis in Sheep and Goats in Mongolia
Get PDFCerebellar coenurosis is caused by Coenurus cerebralis, the larval stage of Taenia multiceps, particu-larly in goats and sheep. In this case report, we describe gross and histopathological characteristics of cerebel-lar coenurosis in two goats and one sheep in mongolia. In march 2017, animals showing ataxia and hind limb paralysis were referred to the Laboratory of Veterinary Pathology, Institute of Veterinary medicine, Ulaanbaatar Mongolia. At necropsy, fluid-filled coenurus cysts were detected exclusively in the cerebellum of all the animals. Histological examination of the affected cerebellar hemispheres revealed necrosis, granulomatous inflammation and diffuse gliosis at the periphery of the cysts. Based on the results of this study, cerebellar coenurosis should be considered a differential diagnosis in cases with neurologic signs such as ataxia and hind limb paralysis, in mongolia.P(論文)症例報告application/pdfdepartmental bulletin pape
Establishment of Multiplex High-Content Assay for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes, Hepatocytes, and Endothelial Cells
Get PDF麻布大学博士(獣医学)To date, toxicity testing of pharmaceutical and industrial chemicals, as well as environmental agents, relies primarily on data derived from animal studies.
While animal toxicity testing is still widely regarded as the most acceptable systems, it is costly and time-consuming and has for animal welfare concerns. Significant advances in stem cell engineering have now resulted in the availability of human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cells, a physiologically relevant, organotypic in vitro model that promises to overcome these animal model key limitations. iPSC differentiates into almost any cell type, and the organotypic cells derived from iPSC are physiologically relevant and chemical toxicity testing using these organotypic cells promise to avoid problems for animal toxicity testing. Furthermore, iPSC genetic homogeneity and unlimited proliferation provide high quality per isolated batch and stable supply for in vitro toxicity testing. From these advantages, there is increasing demand that iPSC derived organotypic cells apply high-throughput and high content screening (HCS) using automated microscopy system. In terms of conflict with human ethical principles, iPSC-derived cells are easily available compared with primary cell culture models.
This study used iPSC derived organotypic cells to establish in vitro toxicity assays which are high-throughput and can measure multiple physiological functions. In the chapter 1, by using HCS, we developed functional vascularization and cellular toxicity evaluation in iPSC-endothelial cells (ECs) which fully has not been reported on applications to toxicity testing. In the chapter 2, we developed the high-throughput multiplex HCS systems to obtain effectively toxicity profiling, using iPSC cardiomyocytes and hepatocytes which has been reported on availability to prediction of cardio- and hepato-toxicity. In the chapter 3, we applied the HCS system developed in the chapter 2 to evaluation of toxicity profiling of 21 petroleum substances, as a case study.
Chapter 1: Establishment of a vascularization and cellular toxicity assay in induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells
In the chapter 1, in order to test the efficiency of iPSC-ECs for toxicity evaluation of chemicals, we demonstrated a vascularization and cellular toxicity assay. We conducted a side-by-side performance comparison of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and iPSC-derived ECs with the hypothesis that the iPSC-derived ECs would be similar or better in performance.
Both iPSC-ECs and HUVECs were exposed to selected angiogenesis inhibitors and cytotoxic agents in response for either 18 or 24 hours for the purpose of establishing vascularization and cellular toxicity assay. Both type of cells formed tube-like structures in vascularization assay. Exposure to a known chemical inhibitor of angiogenesis, nocodazole and suramin, resulted in decrease or disruption of angiogenic growth in both cell types. 100 nM nocodazole treatment showed 90% inhibition of angiogenic growth in HUVEC and 50 % inhibition in iPSC-ECs, compared with vehicle treatment. A cytotoxic agent treatment, 50 µM Tetrabutylammonium Bromide (TAB), revealed a decrease in the number of nuclei in both cell types (HUVEC: 80%, iPSC-ECs: 50 %).
Altogether, we established an HCS approach to evaluate chemical effects on the angiogenesis potential and general cytotoxicity of ECs in a high throughput compatible format, using iPSC-ECs and HUVECs. In terms of a comparison of the cell model, HUVECs performed better particularly for the angiogenesis assays, because the reactivity of the nocodazole-treated samples was higher for HUVECs as compared with iPSC-ECs. In the cellular toxicity assay, the variability of the TAB-treated samples was lower for HUVECs as compared with iPSC-ECs. However, HUVECs have problems that the number of passages keeping cellular functions is limited, and batch-to-batch variations. Therefore, once these problems of iPSC-ECs are improved, they should be a model that promises to overcome the key limitations associated with traditional primary cell culture systems.
Chapter 2: Establishment of multiplex high-content assay for toxicity screening in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and Hepatocytes
In the rodent risk assessment of chemicals, cardiotoxicity evaluation is insufficient and hepatotoxicity is one of the most prevalent toxicity. Therefore, in the chapter 2, we used two human iPSC types, cardiomyocytes and hepatocytes, to test various high-content assay combinations for cardiotoxicity and hepatotoxicity prediction in a multiparametric format. It has been reported that conventional in vitro hepatotoxicity assays which measure only one parameter have poor prediction to in vivo toxicity. A greater predictive power could be achieved when several parameters regarding hepatotoxicity are combined. Thus, simultaneous detection of various parameters through combination of HCS is useful for toxicity prediction. We tested the combination of cardiomyocyte beating assay and measurement of intracellular cAMP in iPSC cardiomyocytes to determine if the effects on cardiac physiology were β-adrenergic action dependent. Effects on cardiomyocyte beating were characterized by calcium flux measurements. Subsequently, intracellular cAMP levels were measured by ELISA. In addition, we utilized high-content cell imaging to simultaneously determine reactive oxygen species (ROS) formation, mitochondrial integrity, and cytotoxicity which are related to heaptotoxicity in iPSC hepatocytes. As a result, cardiac concentration–response beating changes were observed in isoproterenol treatment for 90 min. The changes were statically and consistent with previous observations reported before (e.g. beat frequency increase induced by isoproterenol, a β-adrenergic agonist, at more than 0.1 μM). Isoproterenol treatment at 10 μM increased intracellular cAMP levels nine fold. This result indicate that a combination of the calcium flux and intracellular cAMP assays is applicable in a same screening format. However, beat frequency increase was seen at more than 0.1 μM, whereas intracellular cAMP increase was only confirmed at 10 μM. For example, in the experiment using mouse cardiomyocytes, it has been reported that intracellular cAMP increase reach a peak within a few minutes after isoproterenol stimulation. Therefore, we need to examine the earlier time point at which both beat frequency and intracellular cAMP increase is detactable at the same concentration. The feasibility of combining ROS formation, mitochondria integrity and cytotoxicity, for high-content imaging of iPSC hepatocytes was evaluated by incubating cells for 30 min and 24 hrs in the presence of TAB and menadione. ROS formation was observed after 30min in cells treated with 100 μM menadione, increasing the number of cells with detectable ROS formation to above 60%. After 30 minutes TAB treatment at 10 μM, mitochondria injury and cytotoxicity was observed. Thus, it was found that ROS formation, mitochondria integrity and cytotoxicity was simultaneously detectable. Although ROS formation in cells treated with menadione had decreased to basal levels after 24 hrs, Mitochondria injury and cytotoxicity in the treatment with TAB at 50 µM was more apparent than after 30 minutes. Altogether, we established a multiplex assay which detects simultaneously ROS formation, mitochondria integrity, and cytotoxicity in iPSC hepatocyte HCS format. This three parameters are considered to be important for hepatotoxicity prediction. Therefore the assay we developed potentially shows high predictability for hepatotoxicity.
Chapter 3: An application of the developed multiplex high-content assay to evaluation of petroleum substances
In the chapter 3, we applied the HCS system we developed to the evaluation of petroleum substances. The aim of this study was to test the applicability of our combinatorial HCS approaches. The risks of petroleum substance exposure to human need to be concerned in their refining process and daily life of consumer. However, most petroleum substances lack traditional animal study-derived data that can be used to evaluate their safety.
Therefore, it is important to conduct animal testing effectively after the selection of substances and parameters considered to be evaluate by using alternative methods including in vitro toxicity testing. Especially, we need to predict severe and prevalent type of toxicity, such as, cardiotoxicity potentially resulting in death, and hepatotoxicity often reported as toxicity of chemicals.
In the chapter 3, we assessed 21 petroleum substances from three product groups (gas oils, heavy fuel oils, residues) in iPSC cardiomyocytes and hepatocytes using HCS systems established in the chapter 2. As a result, gas oils and heavy fuel oils contributed the most bioactive petroleum substances in the cardiomyocyte beating assay. Gas oils and heavy fuel oils increased cardiomyocyte beat frequency at lower concentrations, resulting in a biphasic appearance of the respective concentration-response plots, i.e. initial increases in the beat rate at low concentrations, followed by decreasing beat rate at high concentrations. In contrast to gas oils and heavy fuel oils, residues did not show these bioactivities in cardiomyocytes. Bioactivity trends observed in hepatocytes correlated well within cardiomyocytes. Gas oils constituted the most bioactive trend of tested petroleum substances. However, Treatment of hepatocytes with heavy fuel oils and residues resulted in moderate to low bioactivity. It has been reported that gas oils contain more highly toxic substances than heavy fuel oils and residues. In this study, gas oils showed higher bioactivity than heavy fuel oils and residues. Hence, there is a relationship between the bioactivities of in our HCS and in vivo toxicity, and the multiplex HCS potentially is applicable to the prediction of petroleum substance toxicity.
In this study, in in the chapter 1, in order to examine the applicability of iPS-derived organotypic cells to assess toxicity of chemicals, we established HCS using iPSC-derived ECs. In the chapter 2, we used two human iPSC types, cardiomyocytes and hepatocytes, to test several HCS combinations for their applicability to in vitro toxicity screening. In iPSC heaptocytes, we developed multiplex HCS for prediction of hepatotoxicity. In the chapter 3, to test the applicability of the developed system, we evaluate toxicity of petroleum substances. In addition, the assays presented here could be further enhanced by incorporating other type of iPSC-derived organotypic cells to increase data generated and further refine the toxicity profile of the chemicals including petroleum substances. In the future, toxicity prediction by our multiplex HCS system will be expected to effectively select chemicals which have unknown toxicity profiles for complementation of toxicity testing using animals.医薬品、工業用および環境中の化学物質の毒性評価は主に動物を用いた試験により行われている。化学物質の毒性評価において動物試験は最も信頼性の高い評価法とされる一方、コストや時間がかかり効率が悪い点、動物愛護の観点で問題がある。これらの問題を解決するために、近年、ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）から分化誘導した細胞を用いた毒性評価系への期待が高まっている。iPS細胞は生体を構成する全ての細胞に分化可能であるとされる。ヒトiPS細胞から分化誘導した細胞は生体の各種臓器細胞に近い生理学的機能を保持しており、これら臓器別細胞を化学物質評価に用いることで、動物試験の問題点を回避することが期待されている。
遺伝的背景が同じ細胞を繰り返し作製できるため、ロット間差が少なく、細胞の供給が安定的である点もiPS細胞の利点と考えられている。これらの利点から、再現性の高い評価が安定的に実施できると考えられ自動顕微鏡を用いたスループット性の高いハイコンテントスクリーニング（HCS）への応用も期待されている。また心筋細胞など、倫理的な問題から初代培養による入手が難しいヒト由来細胞を安定的に入手できる点も大きな利点である。
本研究ではヒトiPS細胞由来の臓器別細胞を用い、高いスループット性を有し、複数の生理学的機能の測定ができる毒性評価系を構築するため、第一章では、これまで化学物質の毒性評価への応用報告のないヒトiPS細胞由来内皮細胞を用いてHCSによるアッセイを行い、ヒトiPS細胞由来内皮細胞の細胞モデルとしての有用性を検討した。第二章ではすでに毒性評価に一部応用され、その有用性が報告されているiPS細胞由来心筋および肝細胞のHCSによる評価系を組み合わせ、ハイスループットな評価系の構築を行った。第三章では第二章で構築したHCSの応用例として、第二章で構築した評価系を利用し、21個の石油化学物質のiPS細胞由来心筋および肝細胞への反応性を評価した。
第一章: iPS細胞由来内皮細胞を用いた血管新生アッセイおよび細胞毒性評価系の構築
iPS細胞由来内皮細胞の化学物質評価への有用性を検討するため、HCSによる血管新生アッセイおよび細胞毒性評価系の構築を試みた。また既存の内皮細胞モデルであるヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）との比較を行った。血管新生阻害および細胞毒性物質を18-24時間細胞に反応させ、血管新生阻害作用を評価するための血管新生アッセイと細胞毒性評価系の構築を行った。その結果、血管新生アッセイではiPS細胞由来内皮細胞およびHUVECともに播種後18時間で、細胞外基質上に血管様の網目管様構造を形成した。これらの構造形成は血管新生阻害作用を持つノコダゾールとスラミン処置によって阻害された。ノコダゾールでは100 nM処置によってiPS細胞由来内皮細胞で50%、HUVECで90 %の管様構造形成が阻害された。また細胞毒性評価系においても細胞毒性物質であるTetrabutylammonium Bromide（TAB）50 µMの24時間処置によってiPS細胞由来内皮細胞で70%、HUVECで80 %の細胞数の減少（細胞毒性）がみられた。これらの結果から、iPS細胞由来内皮細胞を用いて内皮細胞に対する化合物の作用を評価できるHCS評価系の構築ができたと考えられた。細胞の比較という観点では血管新生アッセイにおいてHUVECの方がノコダゾール処置による反応性がより高い傾向があり、細胞毒性評価系においてもiPS細胞由来内皮細胞よりHUVECの方がTAB処置時のサンプル間のばらつきが少ないことがわかった。しかしながら、HUVECは初代培養細胞であるため、機能保持できる継代数が限られる、ロット間差が存在するといった欠点がある。したがってiPS細胞由来細胞で試験系のさらなる改良を行い反応性やサンプル間のばらつきを改善できれば、初代培養細胞の持つこれらの欠点を解決する評価系になると考えられた。
第二章: iPS細胞由来心筋細胞および肝細胞を用いたHCSによる複合的毒性評価系の構築
従来のげっ歯類を用いた化学物質の評価では心毒性のリスク評価は不十分である。また一般的に化学物質は肝毒性を多く示すことが知られている。したがって本章では効率的に心・肝毒性を予測するために、iPS細胞由来心筋および肝細胞を用い、心および肝毒性に関する毒性予測では評価項目を組み合わせて測定する評価系の構築を目指した。肝毒性に関する評価項目を単一で測定するだけでは生体の毒性発現を十分に予測できず、数個の評価項目を組み合わせることが予測に重要とされており、評価項目の複合測定は有用性があると考えられる。iPS細胞由来心筋細胞では心毒性予測に有用とされる心筋細胞拍動変化とその作用発現経路（β作用による細胞内cAMP増加）の組み合わせ測定を検討するため、細胞内カルシウム濃度測定による心筋細胞拍動アッセイ後、cAMP濃度測定をELISAによって行い、この2項目を組み合わせて測定できるか検討した。iPS細胞由来肝細胞では肝障害に関与しているとされる評価項目を組み合わせるため、HCSによるROS産生、ミトコンドリア障害性、細胞毒性の3項目の複合測定を行った。その結果、心筋細胞拍動アッセイではβ作用を持つイソプロテレノール90分処置において0.1 µMの濃度から濃度依存的に溶媒対照群と比較して統計的に有意な拍動増加がみられた。細胞内cAMPに関してはイソプロテレノール10 µM処置時に溶媒対照群と比べて9倍程度の増加を確認でき、組み合わせ測定ができることがわかった。しかしながら、拍動数増加は0.1 µM処置からみられたのに対し、cAMPの増加がみられたのは10 µM処置であった。マウス心筋細胞などではイソプロテレノール処置によるcAMPの増加は処置後数分内で増加のピークを迎え、その後は減少することが知られている。したがって、今後の評価系の構築には測定時点を早期にする変更を行い、cAMP測定の反応濃度が心筋細胞拍動アッセイと同程度になるような検討をする必要があると考えられた。iPS細胞由来肝細胞のROS産生、ミトコンドリア障害性、細胞毒性の3つの複合測定では、ROS産生物質であるメナジオン100 µMの30分処置で60 %程度の細胞がROS産生陽性になり、また細胞毒性物質であるTAB 50 µMの30分処置でミトコンドリア障害性および細胞毒性が確認できたことから、ROS産生、ミトコンドリア障害性、細胞毒性の複合測定は可能であると考えられた。24時間処置ではメナジオン100 µM処置によるROS産生はみられなかったが、TABの50 µM処置によるミトコンドリア障害性および細胞毒性は30分処置時より反応が強く、ミトコンドリア障害性と細胞毒性の測定には24時間処置の方が適していることがわかった。したがってiPS細胞由来肝細胞を用いたHCSによるROS産生、ミトコンドリア障害性、細胞毒性の3つの項目を複合的に測定できる評価系の構築ができたと考えられた。ROS産生、ミトコンドリア障害性、細胞毒性は生体の肝毒性予測に重要な評価項目とされていることから、効率的に複数の毒性情報を取得できる本評価系によって肝毒性の予測ができる可能性を示した。
第三章:構築した複合ハイコンテント毒性スクリーニング系による石油化学物質の安全性評価への応用
第二章で構築した評価系の有用性を示す応用例として既知の21個の石油化学物質の毒性を調べた。石油化学物質は消費者の身近で使用される製品が多く、また、その精製過程において作業従事者への暴露が懸念されるが、動物試験による有害性情報が明らかでない物質が数多く存在している。したがって動物試験の前段階で代替法により、生命に直接関係する重篤な毒性である心毒性や、化学物質の毒性として報告の多い肝毒性などの毒性予測を行い、評価すべきと考えられる物質および評価項目を絞り込んだ後に効果的かつ効率的に動物試験を実施することが重要である。第三章では、iPS細胞由来心筋細胞の心筋細胞拍動アッセイと、 iPS細胞由来肝細胞のミトコンドリア障害性と細胞毒性の複合HCS測定を利用し、石油の精製過程による分類で軽油、重油、残渣とされる21個の石油化学物質を処置した。その結果、軽油と重油では心筋細胞拍動アッセイにおいて低、中濃度処置での拍動増加、高濃度処置での拍動減少と停止の反応がみられ、残渣ではこれらの反応はみられなかった。肝細胞のミトコンドリア障害性と細胞毒性の複合測定では高濃度処置での反応が、軽油で最も強く、重油で中程度、残渣で最も弱かった。したがって利用した評価系での反応は軽油で最も強く、重油で中程度、残渣で最も弱い傾向を示すことがわかった。
軽油には重油や残渣より毒性物質が多く含まれることが知られており、生体への毒性がより強いと考えられている。今回の評価系の結果においても、実際の生体への毒性が強い可能性のある軽油で他の2分類の物質より強い反応がみられたことから、評価系の反応性と生体への毒性の強さの間には関連性があり、石油化学物質の毒性予測に構築した複合的HCSを利用できる可能性が考えられた。
本研究ではiPS細胞由来臓器別細胞の化合物評価への有用性を検討するため、第一章ではiPS細胞由来内皮細胞を用いHCSによる毒性評価系の構築を行った。第二章ではヒトiPS細胞由来心筋・肝細胞を用い、HCSによる複合測定の評価系構築を試み、肝細胞では肝毒性予測への応用が可能な複合HCS評価系の構築ができた。第三章では第二章で構築した評価系の応用性を検討するために石油化学物質の評価を行った。将来的にはiPS細胞由来の様々な臓器別細胞を用いることで評価系をさらに拡充し、石油化学物質を含む種々の化学物質等、未知の毒性プロファイルを持つ物質の毒性予測を動物試験の前段階で構築した評価系を用いて行い、効果的に化学物質を絞り込むことで、動物試験を補完する役割が期待される。doctoral thesi
Single Nucleotide Polymorphisms and Conserved Transcription Factor Binding Site of CD14 Gene in Yorkshire Terrier
Get PDFIn humans, single nucleotide polymorphisms (SNPs) of CD14 promoter region are associated with allergic diseases. There are no reports of canine CD14 gene cloning, nor any reports studying the pathogenesis of CD14 polymorphism in dogs. In this study, canine CD14 gene was cloned by 5' and 3' RACE method and its SNPs were analyzed. The presence of two SNPs were identified. SNP1 was located at predicted AP-1 binding site of CD14 promoter region (-187C>T) in the Yorkshire terrier. SNP2 (c.930G>A), silent mutation of Glu, identified in 5 dog breeds. The relative transcriptional activity of a general breed type CD14 promoter (-187C/luc) did not differ from those of Yorkshire terrier type (-187T/luc); however, the relative activity was diminished when the AP-1 site was mutated. In conclusion, CD14 gene structure was highly conserved in dog breeds and its expression could be regulated by the transcription factor AP-1.P(論文)原著論文application/pdfORIGINAL ARTICLEdepartmental bulletin pape
人での亜鉛欠乏症の現状と課題
Get PDF第21回 麻布大学 生殖・発生工学セミナーP(論文)会議録・学会報告application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape
胚の操作および移植技術を基盤とした効率的な種雄牛造成
Get PDF第22回 麻布大学 生殖・発生工学セミナーP(論文)会議録・学会報告application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape
Neural mechanism underlying regulation of maternal behavior in the posterior paraventricular thalamic nucleus of lactating mouse
Get PDF麻布大学博士(獣医学)[General Introduction]
The mother of mammals, including humans, cares their offspring by breast-feeding. The placenta, formed shortly after fertilization, not only provides fresh blood to the offspring from the mother but also synthesizes various hormones during pregnancy, inducing changes necessary for maternal behaviors. The hormones synthesized by the placenta include progesterone, estrogen, prolactin, and oxytocin (OT). These endocrine changes act not only on peripheral tissues such as the uterus and mammary gland but also on contribution on promoting the onset of od maternal behaviors in the
central region. In particular, estrogen, which increases in late pregnancy, plays a central role in the development of nurturing behavior (Siegel and Rosenblatt, 1975; Terkel and Rosenblatt, 1972). Estrogen increases the expression of oxytocin receptors (OTR) (Champagne et al., 2001; Ostrowski et al., 1995). It has been reported that maternal behaviors are induced in mice deficient in the OT and OTR gene (Takayanagi et al., 2005 a, 2005 c) and that the expression level of OTR in the central region correlates with the number of maternal behaviors (Champagne et al., 2001). Thus, the estrogen-driven OT system plays an important role in the development of nurturing behavior. OT-synthesizing neurons in the hypothalamus extend their axons to the various regions in the brain (Knobloch et al., 2012). In the lateral septum and paraventricular thalamic nucleus (PVT) of the mother mouse, the terminals of OT neurons are observed at high densities (Knobloch et al., 2012). OTR-expressing neurons in the lateral septum have been implicated in stress response and have been shown to contribute to maternal tolerance to fear during lactation (Menon et al., 2018). On the other hand, PVT is involved in associated learning (Do-Monte et al., 2015), but there are few previous findings of social behavior and nurturing behavior. In the present study, we investigated how the OTR-expressing neurons 10
in PVT contribute to maternal behavior.
[Capter1: Oxytocin receptor-expressing neurons in the posterior paraventricular thalamic nucleus enhance maternal behavior of dams]
Along the anterior-posterior axis, the pattern of neural input to the rostral aPVT and caudal pPVT is not identical, and some nuclei project more strongly to one side (Li and Kirouac, 2012). Also, aPVT and pPVT have different responses to rewarding stimuli, and pPVT has more neurons that are more responsive to rewarding stimuli (Choi et al., 2019). Therefore, it was considered necessary to separate aPVT and pPVT, which have different anatomical and functional properties, for experimental and analytical studies on PVT. We longitudinally examined the distribution of OTR-expressing neurons in PVT and defined the regions of aPVT and pPVT from the pattern. We provided pups to a dam and quantified the number of activated OTR-expressing neurons in aPVT and pPVT. OTR-expressing neurons in pPVT are predominantly activated by pup exposure. Additionally, when the OT input to pPVT was inhibited by the chronic blockade of OTR, the dams showed a specific decrease in the crouching behavior. These results suggest that OTR-expressing neurons in pPVT are actively involved in crouching behavior.
[Capter2: The activation of oxytocin receptor-expressing neurons in the posterior paraventricular thalamic nucleus reinforces behaviors]
Behavior is induced by a specific sensory stimuli, which are called antecedent stimuli. An increase in the behavioral frequency results from a stimulus or treat accompanying the behavior, which is called reinforcement. An inhibition of OTR, which is involved in processing the antecedent stimuli, results in an immediate reduction in maternal 11 behaviors of mouse dams (Marlin et al., 2015). On the other hand, maternal behaviors are not decreased by a blockade of OTR involved in the reinforcement, but decreases by multiple times block (Pedersen et al., 1995). In Chapter 1, although the acute blockade of OTR in pPVT was ineffective in the reduction of crouching behavior, the chronic blockade reduced that duration. Furthermore, OTR-expressing neurons in PVT were activated by OT (Febo et al., 2005), which suggests that activation of OTR-expressing neurons in pPVT contributes to the reinforcement. Then, we combined optogenetic techniques with conditional place preference test (CPP) to examine whether activation of OTR-expressing neurons in pPVT
contributes to the reinforcement. The relationships between specific neural activity and the reinforcement have been quantified by increasing or decreasing the interesting behavior or have been evaluated as a more sensitive method by CPP (Gul Dolen et al., 2013). In this study, CPP was performed as a conditioned stimulus for activation of OTR-expressing neurons in pPVT. This activation allowed the experimental mice to stay longer in the conditioned area. The result suggests that the activation of neurons expressing OTR in pPVT is involved in the reinforcement.
[Capter3: In the posterior paraventricular thalamic nucleus, neurons projected from the medial prefrontal cortex inhibit maternal behavior of dams]
From the results of Chapters 1 and 2, it was suggested that crouching behavior is regulated by the reinforcement through the activation of OTR-expressing neurons in pPVT. On the other hand, there are cases in which activation of PVT causes behavioral extinction (Lkhagvasuren et al., 2014; Zhu et al., 2018). These suggest that PVT contains not only neurons that are activated to enhance behavior but also neurons to decrease behavior. In other words, we hypothesized that, in the pPVT of dams in which the maternal behavior was eliminated, the other neurons were enhanced instead of OTR-expressing neurons. We prepared mother mice in which maternal behaviors were decreased due to a stress 12 sensitization (stressed dams). Hereinafter, the mouse is referred to as stressed dams. The pPVT in stressed dams exposed to pups showed no difference in the number of activated neurons, compared with control dams. On the other hand, pup exposure activated mPFC, which is the main input region of pPVT (Li and Kirouac, 2012), in stressed dams than in control dams. Additionally, compared with control dams, stressed dams had an increased proportion of neurons activated by pup exposure in the mPFC neurons projecting to pPVT. Using pharmacogenetic techniques, the chronic activation of mPFC neurons projecting to the pPVT reduced the crouching behavior of dams. These results suggest that neurons projected from the mPFC in the pPVT reduce crouching behavior of dams through the chronic activation.
[General consideration]
To date, studies of the neural mechanisms for the onset of maternal behaviors have been conducted extensively by many researchers, and many findings have been presented (Kohl et al., 2018; Numan and Young, 2015). Dams usually maintain high levels of nurturing behavior, but when significant changes occur in their physiology or environment, they flexibly regulate the amount of maternal behavior (Murgarroyd et al., 2016). Although some neural mechanisms involved in regulating the amount of maternal behavior have been previously reported (Bosch and Neumann, 2008; Figueira et al., 2008; Francis et al., 2002), many aspects of the neural mechanisms remain unclear. The present study showed that the crouching behavior of the mother mice was enhanced by activation of OTR-expressing neurons in the pPVT and abolished by activation of neurons receiving neural projections from the mPFC. It has been shown that an excitability of neurons involved in behavioral reinforcement in PVT are inhibited by punishments, whereas neuronss involved in behavioral extinction are inhibited by reinforcers (Zhu et al., 2018). As with other thalamic regions, PVT contains few inhibitory neurons (Zhu et al., 2016). Moreover, NAc, which receives projections from the PVT, regulates behavioral expression in a 13 learning manner by inhibitory projections and mutually projects to the PVT (Broms et al., 2017). These results suggest that OTR-expressing neurons to receive OT from the PVN and neurons projected from mPFC in pPVT mutually suppresses each other through NAc. The single neural manipulations in pPVT did not affect maternal behavior, but the decreases of
crouching behavior were observed by chronic manipulations in pPVT. PVT has been shown to induce plastic changes and alter a behavioral expression by repeated trials (Zhu et al., 2018). This suggests that the regulation of crouching behavior by pPVT requires plastic changes in the postsynaptic neurons of pPVT projected from the PVN or the mPFC. Taken together, all results obtained through this study suggest that the crouching behavior of mouse dams is regulated to enhance by OT secretion from the PVN and to inhibit by projections from the mPFC. It is also important in the regulation ofcrouching behaviors that plastic changes of the pPVT neurons are induced by repeated activations through each input.この博士論文は内容の要約のみの公開（または一部非公開）になっています【総合緒言】
その名のごとく、ヒトを含めた哺乳類の母動物は母乳を介して仔を育てる。受精後、間も無く形成される胎盤は、母から仔へ新鮮な血液を供給するだけでなく、様々なホルモン合成を行い、妊娠中の母体に養育に必要な変化を引き起こす。胎盤によって合成されるホルモンはプロゲステロンやエストロゲン、プロラクチン、オキシトシン(OT)などが挙げられる。これらホルモンは子宮や乳腺などの末梢組織に限らず、養育行動を司る中枢領域に作用し、養育に必要な形質を作り上げる。とくに、OTは養育行動の発現に中心的な役割を果たす。OT遺伝子やOTR遺伝子を欠損したマウスでは養育行動の発現は見られず(Takayanagi et al., 2005a, 2005b)、また中枢領域におけるOTRの発現量が養育行動の発現量に相関することが報告されている(Champagne et al., 2001)。
視床下部におけるOT含有神経細胞は脳内のあらゆる領域にその軸索を伸ばしており、母マウスの外側中隔と視床室傍核(PVT)では高い密度のOT神経細胞の神経終末が観察される(Knobloch et al., 2012)。外側中隔はストレス応答に関わるとされ、そのOTR発現細胞は母マウスの恐怖刺激に対する耐性に寄与することが明らかにされている(Menon et al., 2018)。一方で、PVTは一般学習課題に関与することが示されていたものの(Do-Monte et al., 2015)、社会行動に関する知見は極めて少なく、PVTにおけるOTR発現細胞の機能については未だ明らかにされていない状況であった(Kasahara et al., 2016; Lonstein et al., 1997)。そこで、本研究では、豊富なオキシトシンを受けるPVTと、そのOTR発現細胞が養育行動に対してどのような機能を有するのか調べることとした。
【第1章：視床室傍核-尾側部における養育行動を強化する神経細胞】
吻尾側に長いPVTでは、吻側側のaPVTと尾側側のpPVTへの神経入力のパターンは同一ではなく、一方に対してより強く投射を行う神経核が存在する(Li and Kirouac, 2012)。また、aPVTとpPVTでは報酬性刺激に対する応答性が異なり、pPVTの方が報酬性刺激に対して反応性の高い細胞が多く存在している(Choi et al., 2019)。したがって、PVTに関する研究を進める上で、異なる解剖学的および機能的性質を持つaPVTとpPVTは分離して、実験および解析を行う必要があると考えられた。
そこで本研究では、第1章にて、PVTのOTR発現細胞の分布を縦断的に調べ、そのパターンよりaPVTとpPVTとする領域を定義した。次に、仔マウスを提示し、aPVTとpPVTそれぞれにおいて活性化されるOTR発現細胞の数を定量したところ、pPVTにおいてのみ活性化したOTR発現細胞の割合が増加していた。さらに、OTRのアンタゴニストを用いてpPVTへのOT入力を慢性的に阻害したところ、母マウスは母性行動のひとつであるクラウチング行動（仔への覆いかぶさり行動）の特異的な減少を示した。これらの結果は、pPVTにおけるOTR発現細胞が養育行動に対して促進的に関わっていることを示唆している。
【第2章：視床室傍核-尾側部における活性化により強化子となる神経細胞】
行動の発現は特定の感覚刺激により誘起され、そのような刺激を先行刺激と呼ぶ。また、行動に随伴する刺激によって、その行動頻度が増すことを強化と呼ぶ。先行刺激となる仔マウスからの情報処理に関与するOTRを阻害すると、操作を受けた母マウスは直ちに養育行動を減少させる(Levy et al., 2004)。しかし、行動の強化に関与するOTRは複数回の阻害によってのみ行動の減少を引き起こす(Pedersen et al., 1995)。第1章では、pPVTにおけるOTRの阻害は単回では効果はなく、慢性的な阻害によってのみクラウチング行動の減少が観察された。これらのことから、pPVTにおけるOTRは行動の強化に寄与していると考えられた。また、PVTのOTR発現細胞はOTの受容により活性化することから(Febo et al., 2005)、pPVTにおけるOTRは細胞を活性化させることで行動の強化に寄与していると仮説を立てた。そこで、光遺伝学的手法と場所指向性テスト(CPP, Conditional Place Preference Test)を組み合わせ、その仮説を検証した。具体的には、条件づけ刺激の提示として、pPVTのOTR発現細胞の活性化をもたらす光照射を実験装置内の特定の場所で行なった。これにより、実験マウスは光照射が行われた場所での滞在時間を延長させた。この結果は、pPVTのOTR発現細胞の活性化が行動の強化に寄与することを示唆している。
【第3章：視床室傍核-尾側部における養育行動を消去する神経細胞】
第1章および第2章の結果から、母マウスのクラウチング行動はpPVTのOTR発現細胞の活性化を通して強化されていると考えられた。しかしながら、PVTは報酬だけでなく、消去を引き起こす罰の曝露によっても活性化され(Zhu et al., 2018)、その活性化が行動の消去をもたらすことが示されている(Lkhagvasuren et al., 2014; Zhu et al., 2018)。これらのことから、PVTには活性化することで、行動の強化をもたらす細胞だけでなく、行動の消去をもたらす細胞が存在すると考えられた。そこで、養育行動が消去されている母マウスのpPVTでは、OTR発現細胞に変わって他の細胞の神経活性が増強され、養育行動の発現が制御されていると仮説を立てた。
まず、ストレス感作により養育行動の発現量が減少した母マウスを作出した。以下、そのマウスをストレス母マウスと呼称する。仔マウスを提示した際のストレス母マウスのpPVTにおける神経活性を調べると、仔マウスを提示された通常の母マウスと比較しても差は見られなかった。一方、pPVTの主要な入力な領域であるmPFCでは(Li and Kirouac, 2012)、ストレス母マウスは通常の母マウスに比べ仔マウス提示により多くの細胞が活性化していた。そこで、ストレス母マウスのmPFCにおけるpPVTへ投射する神経細胞が活性化される割合を調べた。すると、ストレス母マウスは、通常の母マウスに比べて、仔マウス提示により活性化されるmPFCのpPVTへ投射する神経細胞の割合を増加させていた。さらに、遺伝薬理学的手法を用いて、pPVTへ投射するmPFCの神経細胞を慢性的に活性化させると、母マウスのクラウチング行動は減少した。これらの結果は、pPVTにおけるmPFCからの入力をうける神経細胞が慢性的に活性化されることで、クラウチング行動に対して抑制的に働くことを示唆している。
【総合考察】
これまで、養育行動の獲得や実行に必要な神経メカニズムに関する研究は、多くの研究者によって広く行われ、多くの知見が示されてきた(Kohl et al., 2018; Numan and Young, 2015)。一般に獲得された母ラットの養育行動の発現量は高く維持されているが、自身の生理的状態や環境に応じて、柔軟にその量が調節される(Murgatroyd et al., 2016)。このような養育量を調節する神経機構については、いくつかの知見が示されているものの(Bosch and Neumann, 2008; Figueira et al., 2008; Francis et al., 2002)、その神経メカニズムについては未だ明らかでない点が多く残っている。本研究は、養育のひとつであるクラウチング行動が、pPVTにおけるOTR発現細胞の活性化により強化され、mPFCからの神経投射を受ける細胞の活性化により消去されることを示唆した。
PVTにおける強化に関与する細胞は罰の提示によりその活性が抑制され、消去に関わる細胞は報酬により抑制されることが示めされている(Zhu et al., 2018)。また、他の視床領域と同様、PVTの構成する細胞に抑制性細胞はほとんど存在しない(Zhu et al., 2016)。さらに、PVTからの投射を受けるNAcは抑制性伝達により行動発現を学習性に制御しており、PVTへ投射している(Broms et al., 2017)。これらのことから、pPVTはNAcに対して興奮性伝達を行うとともに、NAcから抑制性の負のフィードバックを受けていると考えられた。そして、行動の強化と消去を効率的に行うために、PVNからのOTを受けるOTR発現細胞とmPFCからの神経投射を受ける細胞は、その下流であるNAcを介して、相互に抑制する回路を形成していると考えられた。
pPVTに対する神経操作は、いずれも行動試験中の単回の操作では影響を与えず、養育期間中の慢性的な操作によってのみ行動の変化を引き起こした。PVTは複数回の試行を繰り返すことで、神経の可塑的な変化を引き起こし、学習した行動の発現量を変化させていることが示されている(Zhu et al., 2018)。また、同研究において、強化された行動の発現量はPVTの単回の神経操作では変化せず、繰り返し神経操作が行われることで影響を受けることが示されている(Zhu et al., 2018)。このことから、pPVTによるクラウチング行動の発現調節には、養育行動を促進するPVNまたは養育行動を抑制するmPFCからpPVTへの投射におけるポストシナプス側であるpPVTの神経細胞の可塑的な変化が必要となると考えられた。
本研究を通して得られた結果をまとめると、母マウスのクラウチング行動はPVNからのOT分泌とmPFCからの神経投射により、強化または消去が引き起こされ、その発現量が調節されていることを示唆している。また、その強化や消去のプロセスには、それぞれの入力を受けるpPVTの細胞が繰り返し活性化されることで可塑的な変化を起こすことが重要であるといえる。thesi
Study of risk factors of mitral valve repair in dogs and genes associated with mitral valve degeneration in Chihuahuas
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Introduction: In dogs, mitral valve degeneration (MVD) is the most common cause of acquired heart disease. MVD is common in small dogs, and its incidence is high in certain dog breeds. However, the genetic mechanisms underlying the development of MVD have not been elucidated, and no curative treatment has been performed. Treatment of MVD is usually medical, but in severe cases, secondary to congestive heart failure, surgery may be performed. The prognosis of MVD is limited in patients with congestive heart failure. In recent years, surgical treatment for MVD has been performed in dogs, and the prognosis has improved. However, to date, information on the risk factors and complications of surgical treatment of MVD is limited, and the impact on surgical outcomes is unknown.
The purpose of this study was to investigate the risk factors for complications and the effects of complications on surgical outcomes in order to improve the clinical outcomes of surgical treatment of MVD in dogs. Regarding the genetic aspect, we focused on Chihuahuas because they have a large population in Japan and account for a large proportion of dogs undergoing surgical treatment. Furthermore, we investigated possible genes responsible for MVD in Chihuahuas.
Chapter 1 Risk factors for ventricular fibrillation following aortic cross-clamping release during mitral valve repair in dogs
Background: Although hearts with ventricular fibrillation have electrical ventricular excitement, the pumping function is lost. If treatment is not immediately successful, fatal arrhythmia may develop. In this study, we investigated the risk factors for ventricular fibrillation after releasing aortic cross-clamping, a fatal complication during surgery, with the aim of improving surgical outcomes.
Methods: A total of 237 dogs that underwent mitral valve repair from November 2015 to September 2017 were recruited. Crystalloid cardioplegia (CCP) or blood-CCP (BCP) obtained by mixing CCP with autologous blood at a ratio of 1:1 was used. The age, body weight, left atrial-to-aortic diameter ratio (LA/Ao), standardized left ventricular end-diastolic diameter (LVIDDN), aortic cross-clamping time, cardioplegia type, and cardioplegia dose as predictors of ventricular fibrillation were recorded. In addition, the effects of different myocardial protective solutions were evaluated by comparing the amount of transfusion used during surgery, survival rate 1 month after surgery, and effect of reducing the heart size.
Results: In the group of patients with ventricular fibrillation, body weight, LA/Ao, LVIDDN, and aortic block time significantly increased, and LVIDDN was closely related to the occurrence of ventricular fibrillation. When BCP was used as the cardioplegic solution, the incidence of ventricular fibrillation significantly reduced compared to when CCP was used. The incidence of intraoperative blood transfusion was significantly lower in the BCP group. One month postoperatively, the survival rate or reduction in the heart size did not differ between cardioplegia types.
Conclusion: High body weight, LA/Ao, LVIDDN, and aortic block time are risk factors for ventricular fibrillation after releasing aortic cross-clamping. For cardioplegia, BCP was confirmed to be as safe as CCP. Furthermore, the use of BCP reduced the incidence of ventricular fibrillation and intraoperative blood transfusion.
Chapter 2 Unilateral diaphragmatic paralysis following mitral valve repair in dogs
Background: The phrenic nerve innervates the diaphragm, the main respiratory muscle. Damage to the phrenic nerve causes unilateral diaphragmatic paralysis (UDP), resulting in diaphragmatic dysfunction. In this study, we evaluated the incidence and recovery time of UDP, which is a postoperative complication, as well as the effect on survival outcomes following intraoperative complications.
Methods: The subjects were 284 dogs who underwent mitral valve repair from August 2014 to March 2017. In an inspiratory dorsoventral image obtained with chest X-ray the day after operation, if the left diaphragm was raised more than one intercostal level from the right diaphragm, the patient was diagnosed with UDP. The recovery time was evaluated at the time of discharge from the hospital 1 month postoperatively and at the 3-month follow-up.
Results: In this study, the incidence of UDP was 30.3%. Almost all cases of UDP had improved 3 months postoperatively. The presence/absence of UDP was not significantly associated with postoperative death. However, the incidence of UDP was significantly higher among patients who died of respiratory failure than among patients who died of other causes. Furthermore, many patients who died of respiratory failure had respiratory disease before surgery.
Conclusion: Although the incidence of UDP is high after mitral valve repair, there is early improvement. The involvement of UDP in the surgical results is unlikely to be a direct cause of death, but combined with other respiratory diseases, patients are at high risk of death due to postoperative respiratory failure.
Chapter 3 Search for candidate genes for mitral regurgitation in Chihuahua
Background: Mitral regurgitation (MR) is common in the dog breed Chihuahua. Furthermore, in the studies reported in chapters 1 and 2, most patients who underwent surgical treatment for MVD were Chihuahuas. Therefore, the aim of this study was to perform a survey of candidate genes for MR in Chihuahuas.
Methods: In this study, we recruited Chihuahuas aged 7 years or older. Participants without MR or with minimal MR were considered healthy. The MR group comprised patients with severe MR and cardiac expansion after developing American College of Veterinary Internal Medicine stage B2. DNA was extracted from peripheral blood of each individual, and nucleotide sequences of the healthy and MR groups were compared to search for a candidate gene for the cause. Polymorphisms were investigated in the serotonin transporter (SERT) gene, which is associated with MR in Maltese dogs, and the xeroderma pigmentosum complementation group C (XPC) and DCHS1 genes, which are associated with mitral valve prolapse in humans, were compared.
Results: Regarding SERT, the nucleotide sequences of the healthy and MR groups were the same in all exon 13 regions examined, and no apparent gene polymorphism was observed. In XPC, an adenine-guanine polymorphism was observed at the 902nd amino acid, but the polymorphism ratio was not significantly different between the healthy and MR groups. The amino acids translated by the adenine-guanine polymorphism were the same. In DCHS1, two gene polymorphisms were found in exon 19 equivalents, and one gene polymorphism was found in exon 21 equivalents. One of the observed polymorphisms was a missense mutation that caused an amino acid change, but there were no differences in the percentage of polymorphisms between the healthy and MR groups.
Conclusion: Genetic polymorphisms of XPC and DCHS1 were observed in Chihuahuas, but their associations with MR were considered to be low. In addition, in this study, no difference in the nucleotide sequence of SERT was observed between the healthy and MR groups in Chihuahuas, suggesting that the candidate gene may differ across dog breeds.
Summary: We demonstrated the risk factors for typical complications of MVD surgery and effects of complications on surgical outcomes and identified candidate genes associated with MR in Chihuahuas. High levels of LVIDDN were an excellent risk factor for ventricular fibrillation following aortic cross-clamping release, a fatal arrhythmia. BCP, which mixes autologous blood with myocardial protective fluid, was found to be an effective method to reduce the incidence of ventricular fibrillation. The use of BCP was a new technique suggested to improve surgical outcomes.
Although respiratory failure is known to be a major cause of postoperative death, this study revealed that UDP combined with other respiratory diseases increases the risk of death from respiratory failure. In addition, UDP occurred at a high rate, and reducing the occurrence of phrenic palsy may have reduced the risk of postoperative respiratory failure. The cause of UDP could not be established in this study. Future studies should be performed to clarify which surgical manipulations cause UDP.
In addition, we searched for candidate genes for MR in Chihuahua. We examined polymorphisms in SERT, XPC, and DCHS1. However, we found no polymorphisms that may be involved in the development of MR.
The results of this study could contribute to improving the surgical outcome of MVD in dogs and reducing the incidence of complications. In the future, we will continue to search for candidate genes for MR in Chihuahuas.この博士論文は内容の要約のみの公開（または一部非公開）になっています【緒言】
犬において、僧帽弁閉鎖不全症は後天性心疾患の中で最も発生率の高い疾患である。僧帽弁閉鎖不全症は小型犬で多く認められ、特定の犬種で発症率が高いことから、本疾患の発生に遺伝的な関与が考えられている。しかし、これまで僧帽弁閉鎖不全症の発生に関わる遺伝的なメカニズムは明らかにされておらず、根治治療は行われていないのが実際である。僧帽弁閉鎖不全症の治療は内科治療が一般的であるが、重症例の場合、うっ血性心不全を続発する。うっ血性心不全を発症した症例では、予後が制限されることが明らかになっている。近年、犬においても僧帽弁閉鎖不全症に対する外科治療が行われるようになり、予後の改善が可能となった。しかしながら、現在まで僧帽弁閉鎖不全症に対する外科治療のリスク因子や合併症に関する情報は少なく、これらの手術成績への影響は不明である。
本研究は犬の僧帽弁閉鎖不全症の臨床学的な側面として、外科治療の手術成績の向上を目的に、合併症のリスク因子と合併症の手術成績に与える影響について検討した。また遺伝学的な側面として、好発犬種の中でも日本で飼育頭数が多く、外科治療を受ける犬種の中で高い割合を占めるチワワに着目し、チワワにおける僧帽弁閉鎖不全症の原因候補遺伝子の調査を行った。
【第1章】 僧帽弁修復術における大動脈遮断解除後に発生する心室細動に関する検討
［目的］心室細動は電気的な心室の興奮は認められるものの、心臓のポンプ機能は失われた状態であり、すみやかに治療が奏功しない場合、致死性の不整脈である。本章では、手術成績の向上を目的に術中の致死的な合併症である大動脈遮断解除後に発生する心室細動を予測するリスク因子の調査を行った。
［方法］2015年11月から2017年9月までに僧帽弁修復術を実施した犬237例を対象とした。心筋保護液は晶質液カルディオプレジア（CCP）またはCCPと自己血液を1:1で混合した血液カルディオプレジア（BCP）を使用した。心室細動の予測因子として年齢、体重、左心房・大動脈径比（LA/Ao）、標準化左室拡張末期径（LVIDDN）、大動脈遮断時間、心筋保護液の種類、カルディオプレジア投与量について検討を行った。また心筋保護液の違いによる影響の評価として、術中の輸血使用量、術後1ヵ月の時点での生存率と心臓サイズの縮小効果を比較した。
［結果］心室細動を発症した症例群では、体重、LA/Ao、LVIDDN、大動脈遮断時間の有意な高値を認め、特にLVIDDNが心室細動の発生に密接に関わっていることが明らかとなった。また、心筋保護液としてBCPを使用した場合、CCP使用時と比較して有意に心室細動の発生率が減少した。術中の輸血使用量はBCP使用症例群において有意に少なかった。術後1ヵ月の時点での生存率と心臓サイズの縮小効果は心筋保護液の種類によって差は認められなかった。
［小括］大動脈遮断解除後に発生する心室細動のリスク因子として体重、LA/Ao、LVIDDN、大動脈遮断時間の高値が指標となることが明らかとなった。また心筋保護液としてBCPはCCPと同等の安全性が確認された。さらにBCPの使用は心室細動の発生率を低下させ、術中の輸血使用量を減らすことが明らかとなった。
【第2章】 僧帽弁修復術の術後に発生する横隔神経麻痺に関する検討
［目的］横隔神経は主な呼吸筋である横隔膜を支配する重要な神経である。横隔神経の損傷は横隔神経麻痺の原因となり、横隔膜の機能障害をもたらす。本章では手術成績に関わる術中の合併症に続き、術後の合併症である横隔神経麻痺について発生率と回復時期、手術成績への影響について評価した。
［方法］2014年8月から2017年3月に僧帽弁修復術を実施した犬284例を対象とした。横隔神経麻痺の診断は、手術翌日の胸部X線検査で得た吸気時背腹像を用い、左側横隔膜が右側横隔膜より1肋間以上挙上した症例を横隔神経麻痺と診断した。回復時期については退院時、術後１ヵ月検診時、術後3ヵ月検診時で評価した。
［結果］本章では、横隔神経麻痺の発生率は30.3%であった。また術後3ヵ月の時点でほぼすべての症例で横隔神経麻痺の改善が認められた。横隔神経麻痺の有無は術後の死亡について有意な関連は認められなかった。しかし、死亡原因を呼吸不全とその他の死亡原因に分けた場合、呼吸不全で死亡した症例における横隔神経麻痺の発生率は有意に高値であった。さらに呼吸不全で死亡した症例の多くが術前に呼吸器疾患を有していたことが明らかとなった。
［小括］横隔神経麻痺は発生率の高い合併症であるが、術後早期に改善することが明らかとなった。また横隔神経麻痺の手術成績への関与として、横隔神経麻痺は単独では直接的な死亡原因となる可能性は低いが、他の呼吸器疾患と合併した場合、術後の呼吸不全による死亡リスクを高めることが明らかとなった。
【第3章】 チワワにおける僧帽弁閉鎖不全症の原因候補遺伝子の探索
［目的］チワワは僧帽弁閉鎖不全症の好発犬種であることが知られている。また本研究の第1章、第2章において僧帽弁閉鎖不全症の外科治療を受けた症例の過半数がチワワであったことから、本章ではチワワに着目し、僧帽弁閉鎖不全症の原因候補遺伝子の調査を行った。
［方法］本研究では7歳以上のチワワを対象とした。僧帽弁逆流の認められないまたは僧帽弁逆流は認められるものの、逆流量はごく軽度である個体を健常群とした。僧帽弁閉鎖不全症罹患群（MR群）は、重度の僧帽弁逆流が認められ、心拡大を呈したACVIM stage B2以降の症例を対象とした。それぞれの個体から得た末梢血液よりDNAを抽出し、健常群とMR群の塩基配列を比較することで原因候補遺伝子の探索を行った。調査した遺伝子多型はマルチーズにおいて僧帽弁閉鎖不全症との関連が報告されているSerotonin Transporter（SERT）遺伝子、人において僧帽弁逸脱症との関連が報告されているXeroderma Pigmentosum Complementation Group C（XPC）遺伝子、DCHS1遺伝子について比較を行った。
［結果］SERT遺伝子について、調査した全エクソン13領域において健常群とMR群の塩基配列は同一であり、明らかな遺伝子多型は認められなかった。XPC遺伝子においては902番目のアミノ酸においてアデニン-グアニンの遺伝子多型が認められたが、遺伝子多型の割合は健常群とMR群で有意な差は認められなかった。またアデニン-グアニンの遺伝子多型により翻訳されるアミノ酸は同一であった。DCHS1遺伝子において、エクソン19相当箇所に2つの遺伝子多型、エクソン21相当箇所に1つの遺伝子多型が認められた。認められた遺伝子多型のうち1つはアミノ酸の変化を生じるミスセンス変異であったが、健常群とMR群でそれぞれの遺伝子多型の発生頻度の差は認められなかった。
［小括］XPC遺伝子、DCHS1遺伝子についてはチワワにおいて遺伝子多型が認められたが、僧帽弁閉鎖不全症との関連性は低いと考えられた。また本章では、チワワにおいて健常群とMR群でSERT遺伝子の塩基配列の差異は認められなかったことから、原因候補遺伝子は犬種により異なる可能性が示唆された。
【総括】
本研究は僧帽弁閉鎖不全症に対する外科手術の代表的な合併症のリスク因子、合併症が与える手術成績への影響について明らかにし、チワワにおける僧帽弁閉鎖不全症に関与する原因候補遺伝子を特定することを目的とした。
本研究の結果から、致死的な不整脈である大動脈遮断解除後に発生する心室細動について、LVIDDNの高値が優れたリスク因子となることが明らかとなった。また心室細動の発生率を減少させる方法として心筋保護液に自己血液を混合するBCPの有用性が示され、BCPの使用は手術成績を向上させる新たな手技となることが示唆された。
呼吸不全は術後の主な死亡原因のひとつであるが、本研究から横隔神経麻痺は他の呼吸器疾患と合併することで呼吸不全による死亡リスクを高めることが明らかとなった。また横隔神経麻痺は高率で発生することが示され、横隔神経麻痺の発生を減らすことは術後の呼吸不全のリスクを下げることにつながると考えられた。今回の研究では、横隔神経麻痺の原因を明らかにすることはできなかった。さらなる調査として、手術中のどのような操作が横隔神経麻痺の原因となるか明らかにすることが必要であると考えられた。
さらに、チワワにおける僧帽弁閉鎖不全症の原因候補遺伝子の探索を行った。本研究ではSERT遺伝子、XPC遺伝子、DCHS1遺伝子の遺伝子多型について検討したが、僧帽弁閉鎖不全症の発症にかかわると考えられる遺伝子多型を確認することはできなかった。
本研究の成果は、犬の僧帽弁閉鎖不全症の外科治療の手術成績の向上、合併症の発生率の低下に貢献すると考えられる。今後はさらにチワワの僧帽弁閉鎖不全症の原因候補遺伝子の探索を進める。thesi
The study on periodontal disease in companion animals
Get PDF麻布大学博士(学術)Periodontal disease, which is defined as a chronic inflammatory disease of the periodontal tissue, is most frequently observed in small companion animals, such as dogs and cats. Approximately 80% of cats reportedly suffer from periodontal disease at 4 years of age, which affects their overall health and wellbeing. Periodontal disease develops when periodontitis-related bacteria form a mature biofilm through coaggregation with endogenous bacteria in dental plaque. Periodontal pathogenic bacteria are able to alter the environment of the periodontal tissue, even when present at low levels. This can induce an abnormal host immune response that may lead to tissue destruction and establishment of periodontitis. Several periodontitis-related bacteria have been isolated from periodontal tissue specimens collected from dogs and cats. Porphyromonas gulae (also known as P. gingivalis resemblance bacteria or P. gingivalis of animal type) is a gram-negative anaerobic bacterium that produces melanotic pigment and has been implicated as one of the key bacterial species involved in the establishment of periodontal disease in many animal species. At present, P. gulae has been isolated from the oral cavities of dogs and cats. Although several investigations have focused on the periodontitis-related bacterial species that have been isolated from cats, the role of specific bacterial genes and proteins in the development of periodontitis in cats has not yet been investigated. The investigation of the pathogenicity of major periodontal pathogenic bacteria in cats is important and will aid the identification of cats with a higher risk of periodontitis. Early dental treatment can then be implemented to these animals as an effective preventive measure.
Halitosis is another common problem encountered in companion animals and can cause significant problems in the relationship between an affected animal and its owner. It is generally attributed to an increase of anaerobic bacteria in the oral cavity. Volatile Sulfur Compounds (VSC) produced by these bacteria are primarily responsible for halitosis. Organoleptic examination is currently the standard assay used to evaluate halitosis; however, it lacks objectivity. Therefore, the development of an alternative halitosis assay, which is both objective and quantitative, is required.
Chapter 1: Identification and molecular characterization of P. gulae fimA types among cat isolates
P. gulae, a gram-negative, black-pigmented, anaerobic bacterium, is one of several major periodontal pathogenic bacteria found in animals. Bacterial fimbrial structures that are formed at the cell surface are composed of FimA, which is a 41-kD a fimbrillin subunit protein. FimA was originally identified in P. gingivalis cloned from a human. Subsequent studies revealed that FimA is also expressed in bacterial isolates from companion animals. For example, P. gulae FimA, which is highly homologous to P. gingivalis FimA, has been identified in bacterial strains isolated from dogs. The FimA from dog P. gulae and human P. gingivalis have been classified into three (types A, B, and C), and six (types I, Ib, II, III, IV, and V) genotypes, respectively. Each genotype appears to be closely related to severity of periodontal disease. P. gulae strains are cytotoxic to human gingival epithelial cells and cause systemic inflammation and toxicity in mice. Studies comparing the relative pathogenic abilities of strains expressing each of the FimA genotypes have suggested that type C P. gulae with are the most virulent. Indeed, type C P. gulae have been detected at high levels in an oral cavity swab specimen taken from a dog with serious periodontal disease. To date, although some studies have focused on the identification of periodontitis-related bacterial species in cats, none have investigated the roles of specific bacterial genes or proteins in this process. Therefore, in Chapter 1, I analyzed FimA diversity and virulence of P. gulae isolated from cats and investigated whether that diversity affects periodontal condition.
P. gulae isolates were identified from samples of tooth plaque collected through oral swabs from the periodontal tissues of cats visiting the animal hospital. The fimA nucleotide sequence was determined from each isolated P. gulae strain, and a phylogenic tree was constructed based on putative FimA amino acid sequences. To evaluate the adhesion and invasion properties of each of the P. gulae isolates, periodontal ligament fibroblasts (HPdLF) were infected with cultures of each P. gulae strain adjusted to a density of 1×107 colony-forming units (CFU). Next, the effect of each strain on cell proliferation and migration was investigated using in vitro cell proliferation and wound healing assays. Finally, to investigate the general distribution of P. gulae fimA genotypes among cats, oral cavity swabs ware taken from cats visiting the animal hospital, and a PCR-based method was used to determine the P. gulae genotype present.
The putative amino acid FimA sequences from 15 P. gulae isolates obtained from 13 cats were classified into three genotypes (types A, B, and C), and showed 95%–100% identity and similarity to P. gulae obtained from dogs. The type C strains exhibited stronger adhesion properties to HPdLF cells and higher invasion rates compared with the type A and type B strains. Furthermore, the wound healing assay revealed that the type C strains significantly inhibited cellular proliferation and the scratch closure of HPdLF cells.
Finally, a PCR-based method for identification of P. gulae fimA genotypes was developed and used to analyze 99 oral swab specimens obtained from cats. The distribution rates of P. gulae type A, B, and C strains were found to be approximately 75%, 30%, and 20%, respectively. A high level of type A strain was detected regardless of the severity of periodontal disease. However, high levels of type B and C strains were detected in cats affected by moderate and severe periodontal disease, respectively.
In summary, three fimA genotype of P. gulae isolates derived from cats were identified and classified. The fimA genes were classified into three genotypes, type A, B, and C. Although the type C isolates were less prevalent than type A and B isolates, they were the most pathogenic for HPdLF. Furthermore, the molecular technique used to classify P. gulae fimA genotypes developed in this study will be useful to predict the risk of periodontitis development in cats.
Chapter 2: Establishment of a simple gas chromatography method as a quantitative measurement method for dog halitosis.
There is halitosis as the clinical manifestations appealed from dog owners. Room breeding rate of dog was more than 80% in this country and a relation of owner and dog became closer. The primary cause of halitosis is considered to be volatile sulfur compounds (VSC), such as hydrogen sulfide, methyl mercaptan, and dimethyl sulfide produced by pathogenic bacteria, which proliferate as periodontitis progresses. In recent years, dental clinics have quantified VSC using gas chromatography- and semiconductor sensor-based measuring instruments and odor sensors. However, a diagnosis of halitosis in dogs generally relies on organoleptic test. Although organoleptic test is easy to perform it lacks objectivity. Therefore, the development of an alternative halitosis assay, which is both objective and quantitative, is required. The present study aimed to assess the association between oral malodor and periodontitis in dogs.
Laboratory Beagle dogs were included in this study. Oral halitosis was evaluated using an organoleptic test score and OralChroma™ to measure the oral levels of the following VSC: hydrogen sulfide (H2S; HS), methyl mercaptan (CH3SH; MM), and dimethyl sulfide (CH3SCH3; DMS)
The frequencies of detected VSC were in the following order: HS > MM > DMS. No significant change was observed in the levels of VSC before and after food intake. In addition, a significantly positive relationship was revealed between oral malodor and periodontitis, both of which are age-dependent in dogs.
In summary, this investigation suggested that aging is an important factor for oral malodor and periodontitis in dogs. Therefore, the quantification of the level of VSC would be a useful method to predict the probability of a companion animal developing periodontitis.
To conclude, the results presented in Chapter 1 showed that P. gulae was the important periodontal pathogenic bacteria common to dogs and cats, and FimA diversity was linked to pathogenicity. It is possible that the identification of the FimA type in a P. gulae strain isolated from oral swabs would be useful to predict the periodontitis risk of a companion animal. The data described in Chapter 2 suggested that VSC present in breath air cause canine malodor, and the level of VSC is closely associated with aging and the development of periodontitis in dogs【背景】歯周病はイヌやネコとなどの小型伴侶動物に最もよくみられる感染症であり、歯周組織の慢性炎症疾患として定義される。4歳のイヌおよびネコは約80％が歯周病を発症しており、歯周病は全身の健康や生活状態にも悪影響を及ぼすことが知られている。歯周病は歯垢内に存在する内因性の細菌によって始まり、口腔内細菌の増加を介し、歯周病に関連する病原性細菌が成熟したバイオフィルムを形成することにより発症する。歯周病原性細菌はたとえ少数であっても歯周組織の環境を変え、異常な宿主免疫反応を誘発し、歯周病を進展させる。歯周炎に関連する細菌種がイヌおよびネコから採取された歯周組織検体において検出さている。Porphyromonas gulae （かつてはP. gigivalis類似菌、または、P. gingivalisの動物型、と呼称された）は黒色色素を産生するグラム陰性嫌気性細菌であり、いくつかの他の病原細菌種とともに、多くの動物種において歯周病と関連している。現在までに、P. gulaeはイヌおよびネコの口腔内から検出されている。
ネコから検出された歯周炎に関連する細菌種に着目した研究はいくつか報告されているが、特定の細菌の遺伝子やタンパク質と歯周病との関連については検討されていない。歯周病リスクの高いネコを判別し、可及的速やかに適切な処置を行うには、ネコにおける主要な歯周病原性細菌の病原性を調べることが重要である。
また、伴侶動物と飼主の関係がより密接になったことから、伴侶動物の口臭が問題となっている。一般に口臭は口腔状態の悪化により口腔内の嫌気性細菌が増加した結果、生成される揮発性硫黄化合物（VSC: Volatile Sulfuric Compounds）が主要な原因物質であると考えられている。標準的な口臭測定法である官能試験は、簡易な方法であるものの客観性に乏しい方法でもあるため、客観的かつ定量的な口臭の測定法の確立が期待されている。
第一章：ネコ由来Porphyromonas gulaeのfimAタイプの同定および分子学的特性
グラム陰性、黒色色素産生性、偏性嫌気性細菌であるPorphyromonas gulaeは動物の主要な歯周病原性細菌の一つである。菌体表層に形成される線毛は分子量41kDaの構成タンパク質fimbrillin (またはFimA)で構成され、ヒトから分離されたP. gingivalisにおいてはじめて同定された。小動物では、FimAはイヌから分離されたP. gulaeにおいて見出されており、ヒト由来P. gingivalisのFimAと相同性が高いことが報告されている。ヒト由来P. gingivalisのFimAは 6タイプの遺伝子型(Ⅰ～Ⅴ型およびⅠb型)に、イヌ由来P. gulaeのFimAは3タイプの遺伝子型(A型、B型およびC型)に分類され、これらの遺伝子型は歯周病の重症度と密接に関連している。P. gulaeは歯周上皮細胞に細胞毒性、マウスに全身性炎症を惹起するなど、さまざまな毒性を発現する。3タイプの遺伝子型の比較では、C型のP. gulaeはA型およびB型よりも病原性が強く、重篤な歯周病を有するイヌから採取した口腔スワブ検体から高い割合で検出される。ネコから検出された歯周炎に関連する細菌種に着目した研究はいくつか報告されているが、特定の細菌の遺伝子やタンパク質と歯周病との関連については検討されていない。第一章では、ネコから分離したP. gulaeのFimA多様性および病原性を解析し、この多様性が歯周状態に影響を及ぼすか否かを検討した。
【材料と方法】動物病院に来院したネコの歯周組織から口腔スワブを用いて歯垢を採取した後、P. gulaeを分離、株化した。その後、fimAの塩基配列を決定し、アミノ酸配列に基づいた系統樹を作製した。次に、1×107CFUに調整したP. gulaeを歯根膜線維芽細胞に感染させ、細胞への付着・侵入能を評価した。また、細胞増殖率、細胞遊走能を評価するため、細胞増殖試験およびin vitro創傷治癒試験を実施した。また、一般家庭で飼育されているネコにおける、P. gulaeの亜型の保有率を調査するため、動物病院に来院したネコから口腔スワブを用いて歯垢を採取し、PCR法にて亜型を検出した。
【結果】13匹のネコから分離した15株のP. gulaeが保有するFimAの推定アミノ酸配列は3つの異なる遺伝子タイプ（A型、B型およびC型）に分類されるとともに、イヌから分離したP. gulaeの各3タイプと95～100%の高い相同性を示した。C型分離株はA型およびB型よりも、歯根膜線維芽細胞への高い付着・侵入能を示すとともに細胞の増殖を有意に抑制し、in vitro創傷治癒試験においてひっかき傷による空隙が埋まるのを強く抑制した。次に、本研究はPCR法を基にしたfimA遺伝子型の判別方法を確立し、99匹のネコの口腔スワブ検体を解析した。ネコの口腔スワブ検体において、P. gulaeのA型、B型、C型の分布率は、それぞれ約75%、30%、20%であった。A型は歯周病の重症度に関係なく高い割合で検出されたが、B型は中等度歯周病ネコで、C型は重篤な歯周病ネコで検出率が高かった。
【考察・結論】本章ではネコ由来P. gulaeのfimA遺伝子型を同定・分類した。fimA遺伝子は3タイプに分類でき、そのなかでもC型はA型およびB型よりも検出率が低かったものの、歯周細胞に対して最も強い病原性を示した。本研究で開発された口腔スワブ検体から直接、P. gulaeの fimA遺伝子型を分類する分子生物学的手法は、ネコの歯周病リスクを評価することに有用であると考えられる。
第二章：簡易ガスクロマトグラフを用いたイヌ口臭の定量的測定法の確立
歯周病のイヌの飼い主が訴える臨床症状として口臭がある。イヌの室内飼育率が本邦では80%以上となり、ヒトとイヌの関係がより密接になった。口臭の主な原因は歯周病の進行に伴い増殖した歯周病原性細菌が発生させる硫化水素、メチルメルカプタンおよびジメチルサルファイドなどの揮発性硫黄化合物(VSC)であると考えられている。近年、ヒト歯科医療では半導体センサーを用いた匂いセンサーや簡便な口臭測定器、さらにガスクロマトグラフに基づくVSC測定器が開発されている。しかし、イヌにおいては口臭の診断は官能試験が一般的である。官能試験は簡易的である反面、客観性に乏しい欠点がある。そのため、口臭の原因となる物質を定量的に測定する方法が望まれている。本章は近年、ヒト用に開発された簡易ガスクロマトグラフであるオーラルクロマ®を使用し、イヌの呼気中におけるVSC濃度の測定法を確立し、口臭および歯周病との関連性を調べることを目的とした。
【材料と方法】麻布大学内で飼育されている実験用ビーグル犬を実験に使用した。口臭の測定は官能試験およびオーラルクロマによって行った。官能試験は一人の測定者による判定により口臭スコア（0～3）付けを行った。歯周状態の評価は歯石と歯肉炎の程度によりスコア（0～3）付けを行った。呼気中に含まれる3種のVSC（硫化水素、メチルメルカプタンおよび硫化ジメチル）の濃度を測定は、イヌの口内にシリンジを差し込んで採取した呼気1mlをオーラルクロマに注入し、自動測定した。
【結果】ヒトと比較して非常に高濃度のVSCがイヌで検出され、イヌの口内のVSC濃度は硫化水素>メチルメルカプタン>ジメチルサルファイドの順に高かった。食事摂取前後でVSC濃度に大きな変化はみられなかった。VSC濃度は官能試験スコア、イヌの年齢および歯石指標ならびに歯肉炎指標と正の相関がみられた。
【考察・結論】以上の成績より、VSCはイヌにおいても口臭の原因物質であり、加齢および歯周病と密接に関連することが示唆された。呼気中VSC濃度の測定は、イヌの口臭の定量化および歯周病の危険性予測を可能にするのに有用な方法と考えられる。
【総括】第一章の成績より、P. gulaeはイヌとネコに共通した重要な歯周病原性細菌であり、FimAの多様性が病原性に関与することが明らかとなった。そのため、P. gulaeのFimA型の検出は伴侶動物の歯周病リスクを予測することに有用であることが考えられる。第二章の成績より、呼気中VSCはイヌの口臭原因物質であり、その濃度は年齢および歯周病と密接に関連することが示唆された。doctoral thesi