Azabu University Science Information Repository / 麻布大学学術情報リポジトリ
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Presumptive hemophagocytic syndrome associated with immune-mediated anemia in two Miniature Dachshunds
Get PDFThis report describes the cases of two Miniature Dachshunds who were suspected to have immune-mediated hemolytic anemia (IMHA) and were treated with immunosuppressive therapy. However, progression of anemia, increases in C-reactive protein (CRP) and total-bilirubin (T-Bil) levels, splenomegaly, transition to nonregenerative anemia, and thrombocytopenia occurred after the treatment. Splenectomy and bone-marrow aspirations were performed subsequently. Both dogs were diagnosed with hemophagocytic syndrome (HPS) associated with IMHA. Unfortunately, they died 9 and 6 days later. These findings indicate that some cases of refractory IMHA have the pathogenicity of HPS. HPS should be included as a differential diagnosis of refractory IMHA concurrent with thrombocytopenia. Continuously elevated CRP and T-Bil levels may be helpful indicators in the detection of HPS associated with IMHA.journal articl
Relationship between genital carriage and udder infection with Mycoplasma bovigenitalium in dairy farms
Get PDFWe isolated Mycoplasma bovigenitalium(M.bg) from the vagina and the farm environment of the postpartum primiparous cows in two dairy farms where M.bg was previously detected in milk, and these strains were genotypically analyzed using pulsed-field gel electrophoresis. M.bg of various genotypes were detected at high rates in the vagina and the environment. Some of the M.bg detected from the vagina and environment had the same genotype as detected from previous positive milk. In these farms, there were cows carrying M.bg in their genital organs, and it was possible that M.bg could enter the udder through the environment from the lochia of postpartum cows. Our results indicate that it is important to manage postpartum cows to prevent udder infection with M.bg.journal articl
Functional analysis of CD44 variants and xCT in canine tumours
Get PDFThe cell surface glycoprotein CD44 has various types of splicing variants, which contribute to its multiple distinct cellular functions. Recently, it was reported that the CD44v8-10 isoform interacts with the system Xc(-) transporter-related protein (xCT), and inhibits the accumulation of reactive oxygen species by promoting the synthesis of the antioxidant glutathione in human tumour cells. In this study, we investigated the expression and function of CD44 variants and xCT in canine tumours. From semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analysis, the mRNA expression of the CD44v8-10 isoform was observed in canine tumour tissues as well as human cases. The overexpression of CD44v8-10 may promote the synthesis of glutathione and enhance the resistance to radiation of canine breast tumour cells. Furthermore, canine xCT mRNA expression was significantly upregulated in the canine breast tumour tissues as compared to the normal tissues surrounding the tumours. To investigate the function of canine xCT, we treated canine tumour cells with the xCT inhibitor sulfasalazine. Consequently, the sulfasalazine-treated cells were more sensitive to oxidative stress than the non-treated cells. Taken together, these results suggested that CD44v8-10 and xCT play important roles in the therapy resistance of canine tumours as well as human tumours.journal articl
Verification of a simplified disk diffusion method for antimicrobial susceptibility testing of bovine mastitis isolates
Get PDFBovine mastitis is mainly treated with antimicrobials. Determination of antimicrobial treatments based on the results of an antimicrobial susceptibility test is important to reduce the risk of emergence of antimicrobial resistance and to provide effective treatment. In Japan, not only the standardized agar disk diffusion method (standardized-ADD) based on Clinical and Laboratory Standards Institute guidelines, but also the agar disk diffusion method further simplified (simplified-ADD) are widely used as antimicrobial susceptibility tests for bovine mastitis isolates in the clinical laboratory. However, whether the simplified-ADD is a useful alternative to the standardized-ADD has not yet been sufficiently verified. Therefore, to verify the usefulness of the simplified-ADD, we compared the results of the standardized-ADD and the simplified-ADD using clinical isolates of bovine mastitis. Following testing of 83 isolates from 11 bacterial species, the correlation coefficient of the disk zone diameters in both methods was 0.92, indicating that the simplified-ADD is effective as an alternative method to the standardized-ADD. However, because the disk zone diameter tended to be smaller in the simplified-ADD than in the standardized-ADD, sufficient attention should be paid to this point when determining the treatment for clinical cases of mastitis from the results of the simplified-ADD. The fact that a difference in the results between the two methods was present means that the results cannot be interpreted based on the same criteria. Therefore, determination of the criteria appropriate for the simplified-ADD is needed.journal articl
Investigation of Staphylococcus aureus positive for Staphylococcal enterotoxin S and T genes
Get PDFStaphylococcus aureus produces staphylococcal enterotoxins (SEs) and causes food poisoning. It is known that almost all SE-encoding genes are present on various types of mobile genetic elements and can mobilize among S. aureus populations. Further, plasmids comprise one of SE gene carriers. Previously, we reported novel SEs, SES and SET, harbored by the plasmid pF5 from Fukuoka5. In the present study, we analyzed the distribution of these SEs in various S. aureus isolates in Japan. We used 526 S. aureus strains and found 311 strains positive for at least one SE/SE-like toxin gene, but only two strains (Fukuoka5 and Hiroshima3) were positive for ses and set among the specimens. We analyzed two plasmids (pF5 and pH3) from these strains and found that they were different. Whereas these plasmids partially shared similar sequences involved in the ser/selj/set/ses gene cluster, other sequences were different. A comparison of these plasmids with those deposited in the NCBI database revealed that only one plasmid had the ser/selj/set/ses cluster with a stop mutation in set similar to that in pH3. In addition, the chromosomes of Fukuoka5 and Hiroshima3, positive for ses and set, were classified into different genotypes. Despite the low rate of gene positivity for these SEs, it is suggested that there is diversity in plasmids and strains carrying these two SEs. Consequently, regarding the entire feature of SE prevalence, we improved the multiplex PCR detection method for the SE superfamily to obtain further insight.journal articl
The center of mass of the dog using the limb load distribution measuring device and study on quantification of hindlimb function evaluation
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Static measurements have been increasingly used in recent years to assess the condition of limbs in lameness associated with orthopedic disease in dogs. In this study, the usefulness of static measured center of mass (CoM) analysis was investigated in normal dogs and clinical cases. In normal dogs, changes in the CoM when the limbs were suspended and changes in the CoM when pain was given were investigated using five postures. The CoM of the dog in control was located slightly anterior to the center, and moved right or left backward when the left or right forelimb was suspended and right or left forward when the left or right hindlimb was suspended. The CoM was located posterior to the left and backward during pain in the right forelimb and anterior to the right and forward during pain in the left hindlimb. This change in the CoM was more pronounced in the forelimbs than in the hindlimbs. The function of the hindlimbs could be evaluated by combining the hindlimb loading test and the hindlimb dropping test. The weight imbalance could be clarified by increasing the load on the hindlimbs to 60% of the body weight. In addition, the hindlimb dropping test, which requires a rapid response, induced a reaction after the drop and was able to detect a similar imbalance between the left and right hindlimb. Based on these results, we measured and evaluated changes in the CoM over time from postoperative to eight weeks after orthopedic surgery for cases of radial and ulnar fracture and cranial cruciate ligament rupture (CrCLR). In the case of radial and ulnar fracture, the change over time could be associated with functional recovery only by measuring the CoM. On the other hand, it is suggested that the CrCLR case needs to be evaluated statically by combining the hindlimb loading test and the hindlimb dropping test. This is the first study to establish and quantify methods for the CoM measurement and hindlimb function evaluation test in static measurement of dogs. The study also revealed changes in the postoperative CoM over time in cases of radial and ulnar fracture and CrCLR.【背景】
フォースプレート (Force Plate; FP) は、一般的に犬の整形外科疾患に対する歩行分析を目的に使用される。歩行中の最大垂直床反力や力積の垂直成分は、薬物治療または整形外科手術後の回復を評価するために使用される動的パラメータである。これらの動的パラメータは四肢の状態の定量化には有用であるが、歩行様式や速度により分析の変動性をもたらす可能性がある。そこで、静的姿勢において荷重分散から計算される重心 (Center of Mass; CoM) や左右の体重バランスが、安定した肢障害評価の定量化パラメータになると仮説を立てた。
本研究では、CoM と肢障害との関連性に焦点を当て、犬のCoM 評価の有用性を検討し、臨床応用のための定量化を目的とした。第一章では、四肢荷重分散測定装置での犬の静的姿勢のCoM 測定方法を確立し、前肢および後肢感覚刺激によるCoM の変化を評価した。第二章では、後肢重負荷時および後肢落下時の後肢バランスを定量化し、これらの後肢感覚刺激による変化を観察した。第三章では、犬の橈骨尺骨骨折および前十字靭帯断裂症例において、橈骨尺骨骨折症例に対してはCoM を、前十字靭帯断裂症例に対してはCoM と後肢バランスをそれぞれ経時的に測定した。これらの結果よりCoM ならびに後肢バランスの静的パラメータが、小動物臨床における機能評価系としての有用性を示す可能性について考察した。
第一章 静的姿勢のCoM 測定法の確立と前肢および後肢感覚刺激によるCoM 変化
【材料および方法】
健常ビーグル犬雄6 頭を使用した。またテストフロア上に4 つのFP を設置し、各肢に１つずつ対応するように四肢荷重分散測定装置を作成した。
犬が各FP 上で自然起立位を維持している状態をオリジナルポジションと定義した。試験者は1 肢ずつ挙げ、オリジナルポジション、右前肢 (RF) 挙上、左前肢 (LF) 挙上、右後肢 (RH) 挙上、左後肢 (LH) 挙上の5 つの静的姿勢からデータを得た。右前肢および左後肢にそれぞれ可逆性感覚刺激を与え、同様に5 つの静的姿勢からデータを得た。右前肢および左後肢に対する可逆性感覚刺激による5 つの静的姿勢に関するCoMのX およびY 軸成分の変化は、Bonferroni の多重比較検定にて解析し、有意水準は5%とした。
【結果と考察】
全ての犬において、各静的姿勢でのCoM 測定が可能であった。オリジナルポジションのCoM は、体の中心より前方にあり、左右のバランスは均等であることを示した。RF またはLF 挙上時には、CoM はそれぞれ左後方または右後方に移動した。RH またはLH 挙上時には、CoM はそれぞれ左前方または右前方に移動した。RF 感覚刺激では、オリジナルポジションおよび各肢挙上時のCoM 変化が大きく認められた。しかし、LH 感覚刺激ではオリジナルポジションおよび各肢挙上時のCoM 変化は認められるものの、小さかった。
過去の報告では、前肢への体重負荷が跛行や疼痛の顕在化に関与していることが考えられており、静的姿勢によるCoM 測定は前肢への疼痛評価において特に有用であると結論づけた。
第二章 後肢負荷時および後肢落下時の後肢バランスの後肢感覚刺激による変化
【背景】
第一章において、前肢への感覚刺激はオリジナルポジションおよび各肢挙上で明らかなCoM 変化が認められたが、後肢への感覚刺激によるCoM 変化はわずかであった。そこで我々は、後肢感覚刺激の影響を顕在化可能な試験方法の確立を目指し、健常ビーグル犬雄6 頭および既存の装置を使用して以下の2 つの実験を実施した。
【材料および方法】
1．後肢負荷試験による後肢バランスの評価
オリジナルポジションにて試験者は犬の両前肢を持ち、後肢の負荷が体重の60％を超えるまで10秒かけて持ち上げ、持ち上げ前後の後肢荷重を測定した。
2．後肢落下試験による後肢バランスの評価
オリジナルポジションにて、試験者は犬の腰を持ち、両後肢を約10cm の高さに持ち上げ、FP に垂直に落下させ、落下前後の後肢荷重を測定した。
両試験において、LH における可逆性感覚刺激による後肢荷重のX 軸およびY 軸成分の差は、Mann–Whitney のU 検定を用いて分析し、有意水準は5%とした。
【結果と考察】
後肢負荷試験においてコントロールでは、両前肢持ち上げ前後のX 軸成分の変化は認められなかった。LH 感覚刺激では、体重の60%の負荷が後肢に加わった時点でX 軸成分の変化が認められ、後肢の体重はRH に向かって有意に偏っていた。
後肢落下試験においてコントロールでは、落下前後のX 軸成分の変化は認められなかった。LH 感覚刺激では、落下直後にLH を踏み直る動作が認められ、踏み直り後のX 軸成分はコントロールと比較して有意にRH に向かって偏っていた。踏み直る動作は、後肢バランスを安定化させるための適応反応の一種であると推察された。
これらの後肢負荷試験と後肢落下試験は、静的姿勢では評価することが困難な後肢異常の検出および後肢機能の定量化が可能であった。後肢の異常時には、静的姿勢によるCoM 評価に加えて後肢負荷試験および後肢落下試験を組み合わせることで後肢バランスの定量化が可能となると結論づけた。
第三章 犬の橈骨尺骨骨折および前十字靭帯断裂症例におけるCoM・後肢バランスの時間的推移
【背景】
第一章および第二章で実施した前肢感覚刺激および後肢感覚刺激によるCoM 変化が、臨床症例に応用可能かを検討した。前肢の感覚刺激に対して、小型犬において一般的な前肢の整形外科疾患である橈骨尺骨骨折を対象にした。また、後肢の感覚刺激に対しては、後肢において一般的な疾患である前十字靭帯断裂を対象とした。右側橈骨尺骨骨折症例に対して、オリジナルポジションによるCoM 測定を手術前から手術後に一定期間実施した。左側前十字靭帯断裂症例に対しては、上記に加えて後肢負荷試験および後肢落下試験による測定を追加し、評価・解析した。
【材料および方法】
1．橈骨尺骨骨折症例
2020 年4 月から2020 年10 月にDVMs どうぶつ医療センター横浜 整形外科 (神奈川県) に紹介受診した症例のうち右側橈骨尺骨骨折と診断し、Locking Compression Plate (LCP) にて整復固定を実施し、手術後8 週間の診察終了まで経過観察が可能であった5kg 以下の症例16 例を対象とした。対象症例は、右側橈骨尺骨骨折以外の罹患はなく、その他の整形外科領域に関する既往歴はない犬とした。オリジナルポジションの測定は、既存の装置を用いて、手術前、手術後2, 4, 8 週の時点で実施し、それぞれのデータを比較・検討した。
2．前十字靭帯断裂症例
上記期間・同施設にて、左側前十字靭帯断裂と診断し、Tibial Plateau Leveling Osteotomy (TPLO法) にて制動術を実施し、手術後8 週の診察終了まで経過観察が可能であった15kg 以下の症例13 例を対象とした。なお症例は、左前十字靭帯断裂以外の罹患はなく、その他の整形外科領域に関する既往歴はない犬を使用した。オリジナルポジションの測定ならびに後肢負荷試験および後肢落下試験は、既存の装置を用いて、手術前、手術後2, 4, 8 週の時点で実施し、それぞれのデータを比較・検討した。
手術前、手術後2, 4, 8 週間の時点において、右橈骨尺骨骨折症例および左前十字靭帯断裂症例に対するCoM のX 軸およびY 軸成分の差は、Bonferroni の多重比較検定を用いて分析し、有意水準は5%とした。
【結果と考察】
橈骨尺骨骨折症例に関するCoM 変化は、手術後から時間経過に伴い、X 成分は正中に向かって回復し、Y 成分は手術後4 週間以降に変化しない過程が認められた。このCoM 変化は、橈骨尺骨骨折の治療の経過に密接に関連していることを示唆している。橈骨尺骨骨折に関する本検討では、CoM 変化のみに着目しており、骨癒合過程の段階変化や体重に対する固定器具の大きさなどは考慮されていない。骨癒合過程の段階とCoM 変化が相関性を示すことは臨床上重要であり、治療効果判定を行う上で有用であるといえる。
前十字靭帯断裂症例に関するCoM 変化は、橈骨尺骨骨折の結果と異なり、時間経過に伴うX 成分・Y 成分の変化はともにわずかであった。このCoM 変化は、後肢のCoM のみでの治療判定が前肢と比較してより困難であることを示しており、第一章での結果を裏付けることとなった。また手術後8 週の時点では、CoM のX 成分はほぼ中心に位置しているにも関わらず、後肢負荷試験および後肢落下試験において明確な左右バランスの差が認められた。これらの結果の相違は、後肢の治療過程がCoM に大きな変化を与えないが、後肢機能には明確な影響が生じていることを示唆している。本検討では、膝関節の疾患のみに着目しており、股関節や足根関節などの後肢の疾患あるいはその併発に関しては検討しておらず、本章の結果とは異なる変化をする可能性がある。また、手術前および手術後の前十字靭帯断裂に伴う骨関節炎の程度は評価・検討していない。これらの病態が後肢負荷試験および後肢落下試験の結果に影響を与える可能性も少なくないと推察される。
【総括】
本研究では、静的姿勢のCoM は前肢に障害を有する症例において、後肢バランスは後肢障害症例において機能評価に有用な定量的パラメータとなりうることが示唆された。本知見が犬種間あるいは疾患ごとにも一貫したデータ取得が可能であるかどうかは今後検証していく必要がある。CoM の測定および後肢負荷および落下試験に関して、臨床現場にて継続して実施していく予定である。doctoral thesi
Sequence type and primary structure of the vru gene upstream region of Streptococcus uberis isolated from bovine clinical mastitis in Japan
Get PDFIn the present study, we investigated the variability of bovine clinical mastitis isolates of Streptococcus uberis in Japan by multilocus sequence typing. We also investigated the variations in the primary structure of the vru gene upstream region of the isolates to elucidate the association of this region with the occurrence of clinical mastitis. Eighty-two isolates were recovered from 62 dairy farms in Japan; these isolates were associated with 57 sequence types (STs), including 54 novel STs to which 78 isolates belonged. Thirty isolates with ST1003 (one of the novel STs) and related STs at the triple-locus variant level accounted for 37% of the isolates examined. A total 16 (20%) isolates were assigned to clonal complexes (CC143 and CC86) that are major in New Zealand and Australia. Seventy-one of the 82 isolates had 1, 3, 4 or 5 bp deletions in the vru gene upstream region in comparison with the corresponding region in the S. uberis virulent strain 0140J and the remaining 11 isolates had no deletions. These results suggest that S. uberis is a diverse mastitis-causing pathogen, and the integrity of the vru gene upstream region is not necessarily conclusive for the occurrence of bovine clinical mastitis.journal articl
Serum concentration and safety of intravenous drip versus subcutaneous administration of carboplatin in dogs
Get PDFCarboplatin is used to treat certain cancers in dogs and cats and is routinely administered via intravenous drip (IVD). Subcutaneous (SC) administration has also been described. However, the toxicity, serum concentrations, and area under blood concentration-time curves (AUCs) of SC carboplatin are unknown. This study aimed to compare serum carboplatin concentrations in dogs after SC and IVD and to monitor any adverse events. In this crossover study, five dogs received SC or IV carboplatin (300 mg/m2). After a minimum of 3 weeks, each dog received the other treatment. No gross skin toxicity or abnormal clinical signs were observed in any of the dogs. Blood test abnormalities were detected in most dogs. Decreased neutrophil and platelet counts, and increased C-reactive protein (CRP) levels were found. There was no significant difference in the neutropenia, thrombocytopenia, and CRP scores between the groups. Systemic toxicities of SC carboplatin were comparable to those of IVD carboplatin. The time to maximum carboplatin concentration after SC was longer than that after IVD (P<0.001). SC carboplatin remained in the serum longer than IVD carboplatin (P=0.008). The AUC of SC was less than that of IVD (P=0.002). The AUC and time taken to reach the maximum concentration of SC carboplatin were lower than those of IVD carboplatin. This study suggests that SC carboplatin may be an efficacious option for the treatment of tumors in dogs, particularly where IVD administration is challenging.journal articl
Studies on the regulation of gene expression via DNA methylation: A focus on the carp Ucp1 gene and mouse Hepcidin gene
Get PDF麻布大学博士(獣医学)プロモーターやエンハンサー領域におけるDNAメチル化(CpG配列部分でシトシンにメチル基が付加する化学反応)は、一般にその遺伝子の転写を抑制し、ゲノムインプリンティングやX染色体不活性化、組織特異的な遺伝子発現パターンなどに関与し、正常な分化発生に重要な役割を持つ。
本研究では特に組織特異的な遺伝子発現パターンの制御に注目し、組織特異的発現を特徴とする遺伝子について、その遺伝子発現制御におけるDNAメチル化の関与を明らかにすることを目的とした。そこで、所属研究室でこれまで扱ってきた遺伝子のうち、特徴的な組織特異的発現を示した、コイUcp (uncoupling protein)1及びマウスHepcidinの遺伝子に注目してDNAメチル化との関連を調べた。
\n第1章 プロモーター領域のDNAメチル化によるコイUcp1遺伝子発現への影響
UCP1は恒温動物であるマウスなどの哺乳類においては褐色脂肪細胞のミトコンドリア内膜に限局するイオン輸送体タンパク質として知られ、体温の維持やエネルギー代謝調節などに関与する。一方、変温動物であるコイでは肝臓で特異的に高い発現がみられる。マウスにおいてはUcp1プロモーターならびにエンハンサー領域における特にCRE(cAMP応答配列)のメチル化がUcp1遺伝子発現を直接抑制することが報告されている。しかし、魚類におけるUcp1遺伝子上流のDNAメチル化状態ならびにその遺伝子発現制御への関与についてはまだ明らかにされていない。そこで、コイUcp1発現におけるプロモーターとその上流領域のDNAメチル化の影響を調べた。
まず、コイの肝臓、脳、腎臓、骨格筋、鱗の5つの組織についてUcp1 mRNA発現レベルをreal-time qPCRにより調べたところ、既報と同様に肝臓でもっとも高い発現であった。次に、バイサルファイト法を実施して、同組織のコイUcp1遺伝子上流領域のDNAメチル化状態を調べた。バイサルファイト法では、マウスにおいてDNAメチル化によるUcp1発現制御への関与が報告されているCRE配列と比較的相同性の高い配列を含む2つの領域に注目して実施した。2つの領域はUcp1転写開始点(+1)より上流のnt -2562~ nt -2102領域（CpGを7ヶ所含み、遠位領域とする）とnt -215~ nt -12領域（CpGを5ヶ所含み、近位領域とする）である。その結果、遠位領域のnt -2178、nt -2173、nt -2103の3ヶ所のシトシンにおいて肝臓と腎臓では他の組織に比べてメチル化の程度が有意に低かった。近位では5ヶ所のCpGすべてにおいてメチル化の程度が肝臓で有意に低いことがわかった。これらの結果から、肝臓でのUcp1遺伝子上流領域の低DNAメチル化状態がUcp1遺伝子の高発現に関与している可能性があると考えられた。そこで次に、この上流領域のDNAメチル化によるコイUcp1転写活性への直接的な影響を検討するために、転写開始点より上流の推定プロモーター領域 (nt -2634~ nt +49：遠位と近位を含む)ならびに近位領域(nt -236~ nt +49)のみをそれぞれ組み込んだプラスミドコンストラクトを作製して、ゼブラフィッシュの肝臓由来細胞株ZF-Lを用いてレポーターアッセイを実施した。その結果、いずれの領域をメチル化した場合でも、Ucp1プロモーターの転写活性は抑制しないことが分かった。このことは、コイUcp1転写活性の抑制は、調べたプロモーター領域のDNAメチル化によって引き起こされるのではないのかもしれない。クロマチンリモデリングを介して転写調節に関与している可能性もあり、今後の検討課題である。一方で、プロモーター領域の各CpGサイトに変異導入したレポーターアッセイ法を実施したところ、DNAメチル化による影響とは直接関与しないものの、nt -108の塩基置換がUcp1プロモーター活性を有意に減少させた。この領域にはいくつかの転写関連因子が結合することが推定されたことから、コイUcp1の転写制御に関与する新たな転写制御サイトの候補をみつけることができた。
\n第2章 プロモーター領域のDNAメチル化によるマウスHepcidin遺伝子発現への影響
ヘプシジンは正常なマウスの肝臓で高く発現して血中鉄量調節に関与するペプチドホルモンであり、主に炎症によるIL-6シグナルや、貯蔵鉄増加によるBMPシグナルを介してHepcidin遺伝子発現が増加する。一方で、マウス肝癌由来細胞株であるhepa1-6細胞ではほとんどその発現が認められず、BMPシグナル刺激によっても検出可能レベルに至らない。また、ヒト肝癌由来細胞株であるHuh7やHepG2でもHepcidinの低発現が報告されている。Huh7ではHepcidinの近位上流領域(開始コドンを+1とするnt -154までの領域)におけるDNAメチル化と遺伝子発現との間で負の相関が示唆されている一方で、HepG2では同領域においては負の相関がないとされている。本研究ではまだ明らかにされていない、マウスの各組織及びhepa1-6細胞でのHepcidin遺伝子発現におけるHepcidinプロモーター領域のDNAメチル化による影響を検討した。
マウスの肝臓、白色脂肪組織、骨格筋の3つの組織とhepa1-6細胞のHepcidin mRNA発現レベルをreal-time qPCRにより調べたところ、既報の通り肝臓で最も高いHepcidinの遺伝子発現と、その他組織ならびにhepa1-6細胞ではほとんど発現していないことが確認できた。次にHepcidin遺伝子の開始コドン(+1)より上流の既知のプロモーター領域(約2.3kbp)に含まれる29ヶ所のCpGのメチル化状態をバイサルファイト法により調べたところ、肝臓では特にメチル化の程度が低い2つの領域があることが分かった。それらの領域を遠位領域(nt -1708~ nt -1454であり8ヵ所のCpGを含む)ならびに近位領域(nt -678~ nt -102であり9ヵ所のCpGを含む)とした。特に遠位領域のうち7ヵ所のCpGと近位領域のうち6ヵ所のCpGについては、肝臓では他組織ならびにhepa1-6細胞と比較してメチル化の程度が有意に低かった。次に、プロモーター領域のDNAメチル化によるHepcidin転写発現への直接的な影響を調べるために、レポーターアッセイを実施した。その結果、プロモーター領域全長(nt -2018~ nt -35)、近位領域のみを含む領域(nt -565~ nt -35)、遠位領域のみを含む領域(nt -2018~ nt -1448)をそれぞれ組み込んだコンストラクトにおいて、全てのCpGメチル化処理はいずれの転写活性も有意に減少させた。また、Hepcidinプロモーターには、Hepcidin遺伝子発現を促進する転写因子として知られるリン酸化Smad1/5/8の結合領域と推測されるBMP-RE1(nt -155~ nt -150)またはBMP-RE2(nt -1678~ nt -1673)が含まれる。BMP-RE1、BMP-RE2にはそれぞれCpG配列が一つずつ含まれている。そこで、これらのBMP-REのCpGのみをメチル化処理し同様にレポーターアッセイを行ったところ、転写活性が有意に減少した。BMPはキナーゼ型受容体であるALK3やALK2の活性化を介して、Smad1/5/8をリン酸化する。リン酸化したSmad1/5/8はSmad4と複合体を形成し、核内に移行して、BMP-REを介してHepcidin転写を促進する。そこで、本研究ではさらに恒常活性型BMP受容体であるALK3(QD)を一過性過剰発現させたHepG2細胞を用いて、レポーターアッセイを行い、受容体過剰発現に対する転写活性化効果におけるメチル化の影響を比較した。その結果、BMP-RE1またはBMP-RE 2のCpGがメチル化されたレポーターコンストラクトにおいて、ALK3(QD)による転写活性化効果は強く減弱した。これらのことから、マウスおける組織特異的なHepcidin遺伝子発現はHepcidinプロモーター領域の特徴的なメチル化状態がその制御に関与しており、特にBMP-REのメチル化がリン酸化Smad1/5/8のBMP-REへの結合を直接阻害してHepcidin転写発現を抑制していることを示した。
\n 本研究では、第1章において、コイのUcp1遺伝子発現制御におけるDNAメチル化の影響について、既報のマウスと同様に高発現組織における低メチル化パターンの傾向が維持されている一方で、遺伝子発現制御への関与はマウスとは異なることを示唆することができた。さらに、コイUcp1遺伝子発現制御における新たな転写制御因子結合サイトの候補を見つけることができた。また、第2章においてマウスHepcidin遺伝子プロモーターのDNAメチル化が、Hepcidin遺伝子発現を直接抑制することを証明した。さらに、メチル化によるHepcidin遺伝子発現抑制において、BMP応答配列におけるメチル化が特に重要な要因であることを見出した。以上の結果を通して本研究では、まだDNAメチル化との関与が明らかにされていなかった組織特異的発現を示す複数の遺伝子についてそのDNAメチル化による遺伝子発現制御への影響を示唆することができた。doctoral thesi