Azabu University Science Information Repository / 麻布大学学術情報リポジトリ
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Identification of Amyloidosis in ICR Mice [Crl;CD-1(ICR), Crlj;CD-1(ICR)]; Analysis of Copy Number Variations (CNVs) in SAA1 and SAA2
Get PDF麻布大学博士（獣医学）Amyloidosis characterized by the extracellular deposition of insoluble protein fibrils that cause cellular damage and dysfunction in organs and tissues. Multiple types of amyloidosis and the causative precursor proteins have been identified in humans and animals. In carcinogenicity studies, a high incidence of spontaneous amyloidosis was reported to occur in CD-1 mice; but the precursor protein responsible for this amyloidosis was unclear. Meanwhile B6C3F1 mice have a low incidence of amyloidosis. This study aimed to identify the types of amyloidosis and the causative precursor proteins in CD-1 mice and investigate the role of Copy Number Variations (CNVs) in the genes encoding the precursor protein among different mouse strain. Histopathological examination revealed amyloid in multiple organs that was confirmed by Direct Fast Scarlet (DFS) staining and TEM. Immunohistochemistry and LC-MS/MS analysis revealed that the deposition was derived from Serum Amyloid A (SAA) 1 and 2, suggesting that these CD-1 mice have AA amyloidosis. No mutation of SAA1 and SAA2 amino acid sequence was detected from the LC-MS/MS analysis. In addition, RT-PCR was performed to confirm the sequence of messenger RNA of SAA1 and 2. Messenger RNA was extracted from frozen liver of the non-amyloidosis CD-1 mice. The sequence of SAA1 and 2 were consistent with the previous report. Genomic DNA was extracted from FFPE tissues of CD-1 mice with and without amyloidosis, and other mouse strain (C57BL6, C3H/He, BALB/c, DDY) to use CNV assay. CNV assays were demonstrated that CD-1 mice have a CNVs of SAA1 and 2 gene, and the copy number tend to be higher in CD-1 mice with amyloidosis compared to the CD-1 mice without amyloidosis. In addition, the higher copy numbers for SAA1 and SAA2 in CD-1 mice with amyloidosis compared to C3H/He mice (the parent strains of B6C3F1 mice), which had lower copy numbers of these genes. These findings suggest that high copy numbers of SAA1 and SAA2 may contribute to the high incidence of AA amyloidosis in CD-1 mice.
This study revealed spontaneous amyloidosis seen in CD-1 mice is AA amyloidosis. In addition, this study revealed the correlation between SAA1 and SAA2 CNVs in the pathogenesis of the disease and the genetic factors influencing amyloidosis. Assessing CNVs of SAA gene in humans and animals may contribute to a better understanding of the pathogenesis of AA amyloidosis.第1章 緒言
アミロイドーシスは、クロスβシート構造からなる線維状の不溶性タンパク質であるアミロイドが、細胞外に沈着することで沈着臓器に機能障害を起こす疾患である。アミロイドーシスは、原因となる前駆タンパク質の種類によって分類され、ヒトでは43種の報告がある。
医薬品や化学物質のがん原性試験では、ICRマウス【Crl;CD-1（ICR）、Crlj;CD-1（ICR）】で自然発生性のアミロイドーシスが知られ、がん原性試験で使用される他のマウス系統B6C3F1マウス（C57BL6とC3Hマウスを親系統とするF1マウス）よりも発生頻度が高いと報告がある。しかし毒性試験の中では、ICRマウスのアミロイドーシスはHE染色のみで診断され、その種類は同定されていない。
そこで毒性試験のICRマウスに高頻度に発生する自然発生性アミロイドーシスについて、種類と前駆タンパク質の同定を目的として研究に取り組んだ。またICRマウスでは、前駆タンパク質のアミノ酸配列やコードする遺伝子配列について発症に関与する特徴があるかを検索した。加えてマウスの系統間で発生頻度の差が報告されることから、この発生頻度の差が何に起因するかを研究する目的で、ICRマウスのアミロイドーシス発症個体と非発症個体およびその他のマウス系統について、ゲノムDNA上で前駆タンパク質をコードする遺伝子のコピー数変異（CNVs, Copy number variations）を解析した。
第2章：ICRマウスの自然発生性アミロイドーシスの精査、種類の同定
本章では毒性試験のICRマウスで、HE染色によりアミロイドーシスと診断されている病変が、病理組織学的、超微形態学的にもアミロイドかを確認した。またアミロイドーシスの種類を同定するために免疫組織学的に検索した。
受託施設にてHE染色標本よりアミロイドーシスと診断されたICRマウスのFFPE標本またはホルマリン浸漬標本を使用し、病理組織検査（HE染色、DFS染色）と超微形態学的検索（透過型電子顕微鏡観察）によって沈着物がアミロイドかを確認した。DFS染色陽性だった個体について抗マウス血清アミロイドA（SAA1/2）抗体を使用して免疫染色を実施した。
結果、HE染色では複数臓器で弱好酸性均一無構造物（アミロイド様物質）の細胞外への沈着が認められた。これらはDFS染色に陽性を示し、電子顕微鏡下では幅約10 nmの分岐のない線維の束として観察された。また免疫組織学的検索では、沈着物は抗マウスSAA1/2抗体に陽性であった。
以上の結果より、毒性試験のICRマウスでみられるアミロイド様物質は、病理組織、超微形態学的にもアミロイドの定義と一致していると確認され、アミロイドの種類はSAAを前駆タンパク質とするAAアミロイドーシスであると示された。ヒトや他の動物では、AAアミロイドーシスは炎症に起因して二次的に起こることが知られている。本研究で解析したICRマウスでは、アミロイドーシスの他に表皮潰瘍などの炎症性病変がみられていたため、ICRマウスにおいても炎症性病変がAAアミロイドーシスの発症に関与していると考えられた。
第3章：アミロイドーシス発症ICRマウスにおけるアミロイド前駆タンパク質の同定
本章では、前駆タンパク質の同定を目的として、ICRマウスのアミロイドーシス発症個体のアミロイド沈着臓器からタンパク質を抽出し、質量分析により解析した。加えてICRマウスのアミロイドーシスの特徴を明らかにするために、アミロイド共通構成タンパク質（共沈着タンパク質）の検索と、前駆タンパク質のアミノ酸配列に変異がないかにを検索した。また非発症ICRマウスの凍結肝臓を用いてRT-PCRにより前駆タンパク質をコードする遺伝子配列について確認した。
質量分析の結果、ICRマウスのアミロイド沈着臓器から、SAA1とSAA2のそれぞれに特異的なペプチド断片が検出された。沈着SAA1とSAA2のイオン強度、およびタンパク質全長に対する検出されたペプチドのカバー率は、SAA2の方が高かった。アミロイド発症個体と非発症個体からの検出タンパク質の比較では、SAA1とSAA2を含む78種のタンパク質が発症個体からのみ検出された。アミロイド発症個体から検出されたSAA1とSAA2のアミノ酸配列は、マウス既知配列と一致しており、変異はみつからなかった。また非発症ICRマウスのRT-PCRより得られた遺伝子配列からの予測アミノ酸配列は、既知のマウスのSAA1とSAA2のアミノ酸配列の情報と一致していた。
以上の結果より、ICRマウスのAAアミロイドーシスの前駆タンパク質はSAA1とSAA2と同定された。また沈着ペプチドのイオン強度や、ペプチドのカバー率の結果からICRマウスのアミロイドはSAAファミリーのうちSAA2を主体に構成されており、SAA1はそこに巻き込まれていると考えられた。またAAアミロイドーシス発症ICRマウスのアミロイド沈着臓器では、ヒトやその他の動物でも共沈着すると報告があるタンパク質（ビトロネクチン、SAP、ApoE）が検出され、ICRマウスのAAアミロイドーシスにおいてもこれらが共通構成タンパク質であることが示唆された。ICRマウスの発症個体で得られたSAA1とSAA2のアミノ酸配列は、既知のマウスのSAA1とSAA2のアミノ酸配列と一致しており、ICRマウスでアミロイドーシス発生率が他マウス種よりも多い理由は前駆タンパク質のアミノ酸配列の違いによるものではないと推察された。
第4章：ICRマウスのアミロイド前駆タンパク質（SAA1、2）をコードする遺伝子のコピー数変異(CNVs)の解析
本章では前駆タンパク質であるSAA1とSAA2をコードするゲノムDNA上におけるコピー数がICRマウスのアミロイドーシス発症に関与すると仮説を立てた。仮説検証のためにICRマウスのアミロイドーシス発症または非発症個体、およびその他のマウス系統（C57/BL6J、C3H/HeN、BALB/c、DDY）のFFPE標本（肝臓または肝臓、腎臓、脾臓を含む）からgDNAを抽出し、リアルタイムPCRの比較定量法によりコピー数変異（CNVs）を解析した。
ゲノムDNA上のSAA1とSAA2のコピー数の解析の結果、非発症のICRマウスのSAA1とSAA2のコピー数には、個体毎にばらつきがみられた。またアミロイドーシス発症個体（SAA1：約3-4、SAA2：約4-5）では、非発症個体（SAA1：約1-4、SAA2：約1-5）よりもコピー数が高い傾向がみられた。他の系統については、B6C3F1マウスの親系統にあたるC57BL/6では、SAA1は約3-4、SAA2は約3-4となり、C3Hマウスでは、SAA1は約0-1、SAA2は約0-1であった。BALB/cマウスでは、SAA1は約3-4、SAA2は約3、DDYマウスではSAA1は約3-4、SAA2は約3であった。系統間で比較した結果、C3HマウスではSAA1とSAA2のコピー数は、ICRマウスの発症個体よりも低かった。
ICRマウスでは、ゲノムDNA上のSAA1とSAA2のコピー数にCNVsがみられた。発症個体では、非発症個体よりもコピー数が高い傾向がみられ、発症個体ではSAA1とSAA2のコピー数が倍数体になっている可能性が示唆された。ゲノムDNA上のSAA1とSAA2のコピー数が多い個体ほど、SAA1とSAA2の転写、翻訳量が多く血清中のSAA濃度が高くなると推察された。また血清中のSAA濃度が高いことはアミロイド形成やアミロイドーシス発症に寄与すると報告がある。よってコピー数が多い個体ほどAAアミロイドーシスを発症しやすいと考えられた。加えてマウス系統間の比較では、ゲノムDNA上のSAA1とSAA2のコピー数の増加が、ICRマウスにおけるAAアミロイドーシスの高発生率と、B6C3F1マウス（C57/BL6とC3HマウスのF1）におけるアミロイドーシスの低発生率に寄与している可能性が示唆された。AAアミロイドーシスとCNVsとの関連をより理解するためには、ICRマウスでSAA1、2のコピー数が高い個体では、正常時または慢性炎症条件下でSAA1およびSAA2の血清中濃度が高いことやコピー数が高い個体ほどAAアミロイドーシスをより発症しやすいかを確認することが重要であると考える。
第5章：総括
本研究により、毒性試験のICRマウスで自然発生性に認められるアミロイドーシスの種類は、SAA2とSAA1を前駆タンパク質とするAAアミロイドーシスであると同定された。ICRマウスにおいて前駆タンパク質であるSAA1とSAA2のアミノ酸配列は、既知のマウスのSAA1とSAA2の配列に対して変異は認められなかった。CNVs解析では、ICRマウスにおいてゲノムDNA上のSAA1とSAA2のコピー数にばらつきがみられ発症個体ほど、コピー数は高い傾向があった。系統間の比較ではC3Hマウスでは、コピー数は低かった。よってICRマウスのAAアミロイドーシスの発症には、ゲノムDNA上のSAA1とSAA2のCNVsが関与しており、SAA1とSAA2のコピー数がICRマウスでのAAアミロイドーシスの高発生率と、B6C3F1マウスにおける低発生率に寄与している可能性が示唆された。
ヒトやその他の動物種においても、AAアミロイドの前駆タンパク質であるSAAをコードする遺伝子について、CNVsを評価することはAAアミロイドーシスのさらなる病態解明に貢献することが期待される。doctoral thesi
Clinical applications and improvements of Mohs paste in veterinary medicine
Get PDF麻布大学博士（獣医学）In veterinary medicine, complete surgical excision of skin tumors under general anesthesia is widely accepted as the gold standard. However, tumor excision may not be an option for patients at high risk for general anesthesia, such as those with complications of heart failure, hepatopathy, or nephropathy. Additionally, some animal owners may decline tumor resection due to the financial burden of surgical treatment and the laboratory work-up required for general anesthesia. In these cases, as well as for terminally ill patients with skin tumors, the tumor surface often becomes ulcerative, hemorrhagic, and malodorous, eventually developing into malignant wounds. These conditions significantly reduce the quality of life (QOL) for both animals and their owners. Malignant wounds are a common challenge in the long-term management of animals with unresectable skin tumors. Furthermore, in Japan, due to the cultural significance of companion animals, many owners are unwilling to authorize euthanasia for their pets. These factors emphasize the need for cost-effective and noninvasive approaches to manage malignant wounds, which is a necessity for animals with skin tumors in Japan.
Mohs paste, developed by Frederic E. Mohs in the 1930s, is used for fixed-tissue micrographic surgery for accessible skin tumors. It works by degenerating proteins through the astringent action of ionized zinc, produced by the chemical reaction between zinc chloride and the exudate from the skin wound. The paste is non-toxic to medical practitioners.
In Japanese medicine, Mohs paste has been applied to patients with malignant wounds resulting from unresectable skin tumors. Its application has shown positive effects on fixed necrotic tissues, alleviated the signs and symptoms of malignant wounds, and decreased tumor volumes, allowing their subsequent excision, such as in pleomorphic adenoma, adenoid cystic carcinoma, malignant melanoma, and squamous cell carcinoma, and for those with non-cutaneous skin tumors, like angiosarcoma and advanced breast cancer.
In veterinary medicine, only two case reports have demonstrated the use of Mohs paste to achieve hemostasis and reduce malodor, However, these reports lacked objective evidence regarding its efficacy. To address the limited veterinary studies on this topic, this case series aimed to examine whether Mohs paste could serve as a viable option for palliative treatment of malignant wound signs and symptoms in terminally ill dogs and cats with cutaneous and non-cutaneous skin tumors.
Medical records of seven animals with unresectable malignant tumors and malignant wounds admitted to our Veterinary Teaching Hospital from August 2012 to May 2013, were reviewed.
The results showed that Mohs paste treatment (MPT) significantly reduced the number of dressing gauze changes required, resulting in decreased tumor size. In two feline cases of mammary gland tumors, the malignant wounds were completely closed with MPT. In addition, MPT extended the lifespan of animals by at least one month.
In conclusion, Mohs paste treatment was effective in reducing tumor progression and exudate production associated with malignant wounds. It controlled bleeding at the wound site, minimized malodor and infection, and promoted malignancy-related wound closure. MPT appears to be an effective treatment for alleviating the signs and symptoms of malignant wounds in veterinary patients, especially when health contraindications and/or financial difficulties exclude other treatment options.
This first report establishes methods for Mohs paste treatment and objectively evaluates managing malignant wounds in dogs and cats described in Chapter 1.
Mohs paste is not commercially available as a pharmaceutical product and must be prepared immediately before use in the hospital. The preparation poses several disadvantages: i) It requires significant time and effort to prepare for each treatment, as i the paste’s properties change immediately after component mixing. ii) It is difficult to handle; petroleum jelly should be applied to the skin to limit the application of Mohs paste to a specific region. iii) A metal (zinc)-containing liquid waste is generated when malignant wounds are scrubbed and when the mortar used to prepare the paste is washed. These limitations may be attributed to the starch in the base material. Researchers have attempted to modify Mohs paste by incorporating d-sorbitol, microcrystalline cellulose, hydrophilic ointments, and macrogol ointments to stabilize its properties for subsequent use. However, these modified pastes require mortar for preparation, and malignant wounds must be scrubbed before application. To address these limitations, the base material was changed to Carboxymethyl cellulose (CMC), a thickener used in the food industry. In the second study, the base material of the Mohs paste was changed from zinc oxide starch powder to CMC (modified Mohs paste based on CMC: moM-CMC).
Research was conducted to determine the optimal viscosity of the moM-CMC sol and analyze its properties. The sol, composed of composed of 1 g of CMC, 2 ml of saturated zinc chloride water, and 1–1.5 ml of purified water, was easily prepared in a disposable cup, which could be discarded after use. When the moM-CMC sol was applied to a malignant wound, it gelled on the wound surface, allowing for easy removal without scrubbing. Therefore, no metal-containing liquid waste was generated. In addition, the moM-CMC sol could be handled easily using a syringe, thereby addressing the handling difficulties associated with traditional modified Mohs paste.
This case series aimed to evaluate the properties of moM-CMC sol and conduct a pilot trial involving its use in three dogs with malignant wounds.
In conclusion, our case series showed that the moM-CMC sol requires significantly less time and effort for preparation, use, and cleaning. i) The preparation of moM-CMC sol was completed within a few minutes in the treatment group for all cases. ii) It was handled easily, be applied using a syringe in Case 3. iii) Metal-containing liquid waste was not generated because the moM-CMC gel was removed without scrubbing the malignant wound and all equipment used could be conveniently discarded as medical waste. Moreover, the efficacy of the moM-CMC sol appears comparable to that of the modified Mohs paste, making it a viable, alternative for managing malignant wounds.
To address the limitations of the initial version, a modified Mohs paste using carboxymethyl cellulose sol (moM-CMC sol) was developed to treat malignant wounds associated with bleeding, infection, and malodor. However, it has a few disadvantages. 1) moM-CMC 1.0 cannot be stored due to its property changes within an hour of mixing necessitating fresh preparation before treatment. 2) It is not easy to handle it. These disadvantages are due to that the moM-CMC 1.0 sol transitioned to a gel in approximately one hour. To overcome these issues, we further developed a Mohs paste designed for long-term storage while retaining usability. The composition of zinc chloride and distilled water did not change; however, the volume of CMC changed. The hardness of each paste was verified. Moreover, the paste was heated at the end of the process, and a storable Mohs paste was obtained. The paste was named modified Mohs paste based on carboxymethyl cellulose sol 2.0 (moM-CMC 2.0). Therefore, moM-CMC 2.0, which has better handling properties than moM-CMC 1.0, remains stable for over 3 months. The composition of moM-CMC sol 2.0 includes 5 g of zinc chloride, 2.5 mℓ of purified water, and 0.75 g of CMC. The suspension was packed in a syringe and made jelly like in a boiling water bath for 15 min. It was applied directly from a syringe to the wound area. Next, moM-CMC 2.0 was used to treat malignant wounds in animals. All ten cases showed clinical symptoms of malignant wounds; moM-CMC 2.0, was applied to the malignant wounds using a syringe. The sol transitioned to gel on the tumor because of the exudate from the ulcer lesion. The treatments were performed for 10–60 min, 1–20 times at one-week intervals. All ulcerated cases demonstrated temporary palliative benefits, including reduced malodor. The pre-prepared moM-CMC 2.0 offers an immediate and convenient application for malignant wounds.
This study focused on the use of Mohs paste as a palliative treatment option. Mohs paste was used in clinical cases to confirm its objective efficacy.
By modifying the base material from zinc oxide starch powder to CMC, moM-CMC 1.0 and moM-CMC 2.0 were developed, improving the preparation, disposal, and storage processes. These advancements were validated in clinical cases, highlighting their potential to enhance the palliative treatment of malignant wounds in skin tumors.Mohsペーストは、1930年代に米国の外科医であるFrederic E. Mohs博士によって考案されたケモサージェリーに用いられる外用薬で、主成分である塩化亜鉛の蛋白凝固作用により腫瘍組織を化学的に固定し、病理組織学的に腫瘍細胞が無くなるまで段階的に切除を繰り返し腫瘍の根治を目指す治療法である。2000年代になり重山らによって、亜鉛華デンプンを基剤としたMohsペーストが考案され、我が国の医学領域では、自壊した腫瘍からの止血、滲出液の産生軽減、悪臭の軽減目的や、基礎疾患があり麻酔が不可能な症例に対して腫瘍の減容積目的など、患者のQuality of life（以下 QOL）向上のための緩和ケアとして使用が拡がった。獣医領域においても飼育動物の高齢化により腫瘍に罹患する犬猫は増加しており、腫瘍の自壊はヒトと同様に罹患動物のQOLを低下させ、さらに悪臭や出血によって飼い主に負担をかける。それらの改善にMohsペーストによる緩和治療が、獣医療でも有効であると推測された。そのため、本研究はヒトの自壊腫瘍に対するMohsペースト療法を参考にし、獣医領域での応用を検討した。第1章では、ヒトで使用されているMohsペーストが、犬猫でも有効な治療手段となり得るのか検討することを目的とした。そのため、自壊腫瘍を有する臨床例に対してMohsペーストを使用し、Mohsペーストによる治療方法の確立とその有効性の評価を試みた。次に第2章では、亜鉛華デンプンを基剤とする従来のMohsペーストの難点を改善することを目的とし、基剤をカルボキシメチルセルロース（carboxymethylcellulose: 以下CMC）に変更したMohsペーストの作成を試みた。これにより調製が簡単で金属廃液の産生が抑えられるMohsペーストを考案し、これをイヌ3頭の自壊腫瘍に対して使用した。その結果、使用感の向上と従来のMohsペーストと同様の有効性を確認した。さらに第3章では、保存可能なMohsペーストの作成を目的とし、CMC量の変更や調製方法の改良を行い、自壊腫瘍を有するイヌ8頭、ネコ2頭の臨床例で使用感の改善と有効性を確認した。
第1章は従来のMohsペーストを、犬猫の自壊腫瘍に対して臨床応用する事を目的とした。イヌおよびネコの皮膚腫瘍やその他の腫瘍により形成された皮膚自壊創に対してMohsペーストの塗布を行い、塗布の方法や時間、治療間隔、治療回数などについて検討を行った。さらに、Mohsペースト治療による効果の判定を、客観的な指標にて評価した。体表部の腫瘍が増大し自壊したイヌ4頭、ネコ3頭の計7頭の臨床例で、基礎疾患により全身麻酔ができない症例や飼い主が手術を希望しなかった症例を対象とした。有効性の評価は、自壊部分の大きさ、滲出液の量、悪臭改善効果、止血効果を、治療前と最終治療2または3週後との間で比較した。その結果、最終治療後の腫瘍自壊部の大きさは、治療前と比較して有意に減少していた（p < 0.05）。7頭中4頭でMohsペースト療法後に自壊部の大きさが減少し、そのうち2頭は完全に消失した。滲出液量の指標となるガーゼの交換回数も治療前と比較して有意に減少した（p < 0.01）。7頭すべてにおいて、治療後には出血および悪臭が顕著に減少した。以上の事からMohsペースト療法は、犬猫においても自壊腫瘍の増殖抑制および自壊創からの滲出液量の減少効果を有することが確認された。さらに、自壊部の出血の制御、悪臭の軽減、感染管理、ならびに腫瘍の縮小に伴う創部の閉鎖が認められた。Mohsペースト療法は基礎疾患を有する症例や、経済的な理由などから他の治療法が選択できない症例において、自壊腫瘍の症状を緩和する有効な治療法となり得ることが示唆された。
現在、Mohsペーストは医薬品として市販されておらず、院内で使用直前に調製されている。本研究、第1章のMohsペーストも同様であるが、このMohsペーストはいくつか難点がある。まず、調製に乳鉢や乳棒を使用して各成分を撹拌するため、それらが塩化亜鉛で汚染され、その洗浄により亜鉛が混入した金属廃液が生じる。また調製後、経時的に硬化しはじめ、再度混和やグリセリンを添加すると軟化するが、自壊部への固着性が低下し使用感が悪化する。硬化の原因は基剤のデンプンであることから、第2章では基剤を変更することにより調製方法の改善と使用感の良いMohsペーストの作成を試みた。本研究では、食品工業において増粘剤として使用されているカルボキシメチルセルロース（CMC）を基剤として選択した。飽和塩化亜鉛水2 ml、CMC 1 g、蒸留水1〜1.5 mlを原料として使用し、これらを混合して新規Mohsペーストを作成した。このCMCを基剤としたMohsペーストをmodified Mohs paste based on CMC（moM-CMC）と命名した。調製直後のmoM-CMCはゾル状であり（moM-CMCゾル）、数分でゲル化することが確認された。具体的には、鶏胸肉に塗布したmoM-CMCゾルが数分以内にゲル状に変化した。したがって、治療後に擦らずに容易に除去することが可能であり、患部の洗浄を必要としない。また、調製も使い捨てのプラスチックカップで行うことができるため、亜鉛を含む金属廃液の発生が回避できた。moM-CMCゾルの適正粘度の決定と特性の解析や吸水性および塩化亜鉛の放出性の評価を行い、それをもとにイヌ3頭の自壊した悪性腫瘍に対してmoM-CMCゾルを用いて治療を行なった。その結果、止血作用および悪臭軽減効果などの臨床症状の改善がこの3頭でも認められ、従来のMohsペーストと同等の効果を有する可能性が示唆された。従ってmoM-CMCゾルは、従来のMohsペーストを用いた自壊腫瘍管理の代替療法となり得ると考えられた。
しかしながら、moM-CMC ゾルは10分を過ぎるとゲル化が始まり硬化するため従来のMohsペーストと同様、使用する直前に作る必要がある。第3章では、この点を克服するために研究を進めた。CMCの入った液体を加温し、その後冷却すると粘度が上昇することを確認し、各成分の混合液を調製の過程で加温することにより、懸濁液であったものが冷めるとゾルとなり保存可能なMohsペーストを約1時間で作成することが可能となった。続いて塩化亜鉛量、蒸留水量を一定にし、添加するCMC量を段階的に変えて調製し、それぞれに対して固さの検証を行った。これにより、ゾルの状態で長期保存が可能なMohsペースト（moM-CMC 2.0）を考案した。さらに自壊腫瘍を有する臨床例に対して使用し、その症状緩和効果を検証した。2019年7月から2021年8月までにmoM-CMC 2.0を用いた10頭について回顧調査を実施した。調査項目は、動物種、品種、年齢、性別、体重、臨床徴候、においスコア、診断、腫瘍ステージ、moM-CMC 2.0の塗布方法、治療時間、回数、間隔、治療期間、治療反応、除去後のにおいスコア、合併症、死因、および生存期間とした。治療には、あらかじめ準備しておいたmoM-CMC 2.0（塩化亜鉛 5 g、蒸留水 2.5 ml、CMC 0.75 g）を使用し、シリンジから自壊部に直接押し出して塗布した。においスコアの評価には、9段階の快・不快度尺度を用い、同一症例については同一の評価者が判定した。腫瘍ステージは悪性腫瘍と仮定しTNM分類に基づいて分類を行った。また、治療反応の評価にはcRECIST v1.0を適用した。使用後に残ったmoM-CMC 2.0はシリンジに入れたまま保存し、次の治療に対しても使用した。moM-CMC 2.0でも治療を行った10頭すべてで、においスコアが平均-2から0へと改善し、7頭中6頭で止血効果、3頭では寛解が得られた。以上のことからmoM-CMC 2.0は従来のMohsペーストやmoM-CMC ゾルと同様に自壊腫瘍の症状緩和効果が認められた。
本研究は、Mohsペーストを獣医療でも緩和療法での使用に着目しその有効性を見出した。さらに獣医師の利便性を良くするために改良を重ねmoM-CMC ゾル、およびmoM-CMC 2.0 を考案し実際の症例でその有効性を確認した。
医療におけるこれまでのMohsペーストの改良は、A) 保存性の改善、が主であった。moM-CMC ゾルは、B) シリンジによりピンポイントの投与が可能、C) 金属廃液が生じないという利点がある。さらにmoM-CMC 2.0は上記A), B), C) 全ての利点を有し使用直前の準備が不要なことから自壊腫瘍の緩和治療が容易になる可能性がある。doctoral thesi
ヒト免疫とヒト腸内細菌叢を同時に再構築したデュアルヒト化マウスモデル樹立のための基盤整備に関する研究
Get PDF麻布大学博士（獣医学）腸内細菌叢はヒト宿主と共生関係にあり、様々な疾患の病態に関与していることが明らかになっている。特に免疫疾患との関係が注目されており、免疫細胞の分化とその機能に対する腸内細菌叢の生理的な役割について研究が進められている。これらの研究には、無菌マウスにヒト腸内細菌を投与したノトバイオートマウス、あるいはヒト糞便移植に代表されるような、ヒト菌叢を投与したヒト微生物叢関連マウスが用いられている。しかしながらマウスを用いた基礎研究は、種を超えてヒト腸内細菌叢とマウス免疫細胞の相互作用を評価するという点で限界がある。これまでのところ、ヒト腸内細菌叢とヒト免疫を同一生体内で再現するモデル動物は報告されていない。本研究は腸内細菌叢と免疫系の2つをヒト化した「デュアルヒト化マウス」を構築するための研究基盤を整備することを目的とし、以下の研究を実施した。
第1章：ヒト免疫とヒト腸内細菌叢を同時に再構築したデュアルヒト化マウスモデルの樹立
ヒト造血幹細胞を移植したNOGマウスは、免疫系ヒト化マウスとして様々な免疫学研究に活用されている。本研究では無菌NOGマウスにヒト造血幹細胞ならびに糞便を移植し、ヒト免疫とヒト腸内細菌叢を同時に再構築したデュアルヒト化マウスモデルを作製した。まず、無菌NOGマウスにヒト造血幹細胞を移植し、無菌免疫系ヒト化マウスを作成した。その結果、従来のSPF免疫系ヒト化NOGマウスと同様に、末梢血や骨髄、脾臓においてヒトCD45＋白血球の生着が認められた。得られた無菌免疫系ヒト化マウスにヒト糞便を移植することでデュアルヒト化マウスを作製した。次世代シーケンサーを用いて腸内細菌叢構成を分析したところ、移植したヒト糞便ドナーの特徴を反映した菌叢がマウスの腸管に定着していることが確認された。次に、ヒト糞便移植による免疫細胞の構成の変化を分析した。デュアルヒト化マウスと無菌免疫系ヒト化マウスにおける末梢血の免疫細胞の構成を比較したところ、全白血球中のヒト由来CD45+白血球の割合には有意差を認めなかったが、ヒトCD3+T細胞の割合はデュアルヒト化マウスにおいて有意に増加した。また、脾臓におけるデュアルヒト化マウスのCD3+エフェクターメモリーT細胞の割合は無菌免疫系ヒト化マウスよりも高い傾向が認められた。本研究で確立したデュアルヒト化マウスは、ヒト免疫における腸内細菌叢の生理学的役割の解明に寄与するとともに、腫瘍免疫分野における新規前臨床モデルとして有用であると考えられた。
第２章：ビニールアイソレータを用いない無菌マウス飼育方法の開発
マウスを用いたマイクロバイオーム研究を実施する際には、微生物汚染を回避するためにビニールアイソレーター(VI)を用いることが多い。しかしながらVIを用いた実験は、限られたスペースで厚いゴム手袋越しに作業をする必要があるため、時間や労力を要するとともに、実施できる処置に制約がある。本研究では個別換気ケージとバイオバブルを組み合わせることで、実用性の高いヒト微生物叢関連マウスの飼育・実験システムを構築した。本システムは内部の清浄度を高めるバイオバブル内に、陽圧制御の個別換気ケージを設置した2重のバリア機構で構成される。飼育器材はデータロガーの温度データを元に滅菌条件を設定し、高圧蒸気滅菌したものを用いた。まず、本システムをコンベンショナル動物室に導入し、無菌マウスの飼育を試みた。次に、無菌マウスとノトバイオートマウスを同一ラックで飼育し、交差汚染が発生しないか検証した。最後に、陰圧制御飼育室に本システムとバイオセーフティキャビネットを設置し、無菌マウスの飼育を試みた。その結果、いずれの実験環境においても3ヵ月以上にわたって微生物汚染を起こさずに動物を飼育することが可能であった。以上の結果より、本システムが無菌マウスを扱った実験やバイオセーフティレベル2のマイクロバイオーム動物実験に使用できることが示された。本システムは十分な作業スペースを有し、VIでは実施できなかった大型実験機器の搬入が可能に、なる。さらに厚いゴム手袋越しの作業が不要となり、繊細な作業を容易に実施することが可能である。本研究で構築したシステムは、腸内細菌叢の移植実験をはじめとしたマイクロバイオーム研究の作業効率の向上に寄与すると考えられた。
第３章：患者末梢血を移入可能なヒト化マウスの改良
免疫不全マウスにPBMCを移植することで、患者由来のサンプルを用いた免疫系ヒト化マウスを作製することができる。ヒトPBMCの移植には一般にNOGマウスが用いられるが、移植片対宿主病(GVHD)が高率で発症することがしばしば問題となる。これに対しNOG-MHC I/IIの構成遺伝子であるbeta-2 microglobulin (B2m)遺伝子とI-A beta chain遺伝子をダブルノックアウトしたマウス(dKO-tm)は、重篤なGVHDを発症しないことが報告されている。しかしながらdKO-tmは繁殖能が低く、ヒト細胞のキメリズムが低いことが報告されている。本研究では、CRISPR/Cas9を使用して新しいB2m KOマウスモデルを確立した。従来のdKO-tmマウスはB2mおよびI-Ab KOマウスをNOGマウスに戻し交配することで作製したのに対し、改良dKO-emマウスではCRISPR/Cas9ゲノム編集により作製したNOG B2m KOマウスとNOG I-Ab KOマウスを交配し樹立した。NOG、dKO-tm、改良dKO-emの3系統における繁殖成績、GVHDスコア、ヒトPBMCの生着効率を比較した。改良dKO-emマウスでは従来のdKO-tmマウスと比較し、食殺行動の発生率が低く、離乳子数と離乳率がわずかに向上した。PBMC移植後における改良dKO-em のGVHDのスコアはNOGマウスよりも有意に低く、dKO-tmマウスと同等であった。ヒト細胞の生着効率を比較したところ、末梢血のヒトCD45+白血球の割合および脾臓のヒトCD3+T細胞の割合は、改良dKO-emマウスの方がdKO-tmマウスよりも高かった。以上のことから、本研究で樹立した改良dKO-emマウスはヒト化効率の高い有望なマウスモデルになると結論づけられた。改良dKO-emマウスにヒト糞便を移植することで、各患者の免疫状態と腸内細菌叢を反映した疾患モデルを構築できると考えられる。
本研究では腸内細菌叢と免疫系の2つをヒト化したデュアルヒト化マウスの樹立に向けた研究基盤を構築した。本研究で得られた知見を組み合わせることにより、デュアルヒト化マウスを用いた腸内細菌叢の基礎研究を推進させることができると考えられた。doctoral thesi
イヌとオオカミにおける新奇刺激に対する反応性および学習形態の解明
Get PDF麻布大学博士（学術）【背景・目的】
人類にとって最古の伴侶動物であるイヌ（Canis familiaris）は、その家畜化過程で行動形質の変化を経験してきた。たとえば祖先型のオオカミ（Canis lupus）との比較認知研究を通じ、新奇恐怖の減弱や、新奇刺激に対する感受性の低下が示されてきた（Moretti et al., 2015; Wheat, van der Bijl, & Temrin, 2019）。しかしながら、家畜化過渡期の「イヌ」個体がヒト集団へ流入する際の形質変化については、依然として不明のままである。現在のイヌでは新奇刺激に対する反応性が減弱しているが、その家畜化過渡期においては祖先型のオオカミに見られるような強い内集団の繋がりがゆるみ（つまり既知物への反応性が低下し）、相対的に新たな外集団への探索傾向が強いような個体の選択があったと考える（仮説1）。のちにヒト集団へ定着すると、新奇刺激に対する感受性が低下するよう人為選択があり、イヌは多様な社会的存在と分け隔てなく相互作用することが可能になったと考えられる（仮説2）。このように家畜化には、ヒト集団へ動物が流入する際の自然選択と、積極的な人為選択の2段階が存在する。本研究では、イヌにおいて上記のような段階的変化があるかどうか検証するため、野生種のオオカミと、一般家庭犬のなかで家畜化の程度に差のある和犬種、欧米犬種を調査対象とし、3群間比較をおこなった。また、その基礎的認知能力から差異が存在するかどうか検証するため、物体刺激を用いた行動実験を考案した。
まずは仮説1に依拠し、一般家庭犬において既知／新奇刺激の選好を調べる行動実験系を確立した（Shinoda et al., 2022 1）。また、一般的に家畜化された動物では、ストレス応答の指標であるコルチゾール（Corti）の分泌減少が見られ、イヌでも同様の変化が起きていることが予測されるものの、現状として結果は錯綜している（Wirobski et al., 2021）。そのため、研究1としてShinoda et al. の方法を一部改変した行動課題を実施し、イヌにおいてはその結果と尿中Corti濃度、ならびに個体の気質アンケートであるC-BARQスコアの相関解析を行った。また家畜化の影響を考慮するため、参加犬種についてオオカミからの遺伝的距離（Dutrow, Serpell, & Ostrander, 2022）と行動ならびに内分泌状態との相関解析を実施した。
つぎに仮説2を検証するため、研究2として、新奇刺激についての学習形態に着目し、特に動物の概念形成に関わる機能的等価性の成立を、上記の3群間で比較した。機能的等価性は、同カテゴリに分類された一部の刺激の強化随伴性を変化させたとき、その変化が他の刺激に即座に及ぶことが確認できると、成立したと見なされる（実森・中島，2019）。この種の認知能力は動物にとって、新たに遭遇する刺激についての学習効率を上げるという重要な側面をもつ。また、このような学習は、相対的に新奇刺激が多く存在する環境や、そのような刺激の主観的明瞭度が高い状態で起こりやすいと考えられる。前述のとおり、家畜化における人為選択はイヌの新奇刺激への感受性を弱め、結果として新たな刺激同士の即座の連合や分類を生じさせづらくしたかもしれない。つまり、このような過程を減弱させることは、イヌが新奇物に対しなんらかの評価をくだしづらいことに繋がると考えられる。このような変化は、最終的にイヌにおいて、内外集団の区別をつけない「社会性」を高めるようはたらくと考えられる。したがって本研究では、恣意的なカテゴリ内の刺激群が等価性を獲得するかどうかについて、Wasserman et al.（1992）の手続きに倣った見本合わせ課題をイヌ・オオカミ用に考案し、この仮説を検証した。
【研究1: 既知/新奇刺激に対する反応配分の検証】
（方法）被験体は一般家庭犬45頭（オス26頭、平均68.7±41.8か月齢）とオオカミ2頭（いずれもメス、90か月齢）であった。行動実験は、訓練とテストの2フェイズからなる並立視覚弁別課題を実施した。訓練では被験体に2ペアの視覚刺激を弁別させ、基準に達した個体のみ、テストを2セッションおこなった。テストでは通常の訓練試行にくわえ、訓練でつねに強化された正刺激と新奇刺激をペアで呈示するプローブ試行を計6試行実施した（強化確率は両刺激ともに50 %）。プローブ試行における既知ならびに新奇刺激の選択数を記録した。また個体の新奇恐怖の程度について、テスト1セッション目までの選択反応潜時における中央値と、新奇刺激を呈示した1試行の反応潜時の差分とした。内分泌状態に関しては、3日間の朝一番に採取した尿サンプルについて、Corti濃度をELISA法にて測定し、その平均値およびSDを解析に使用した。この際、コルチゾール濃度の平均値をHPA軸活性の平均的基礎値、SDをその基礎値のばらつきの程度の指標とした。C-BARQスコアは、行動実験をおこなう前、被験体の飼い主がwebあるいは紙上で回答したものを用いた。
（結果）オオカミにおいては、訓練フェイズで選択反応が起こらなくなったため、テストを実施しなかった。イヌにおいては19個体がテストに移行した。全プローブ114試行のうち78試行で既知刺激が選択され、これは新奇刺激の選択数より有意に多い値であった。しかしながら欧米犬種群では、選好が生じなかった1頭をのぞき全頭が既知刺激を選好した一方で、和犬種群では8頭中3頭が半分以上の試行で新奇刺激を選択した。また、尿中Corti濃度のSDはオオカミからの遺伝的距離と正の相関、新奇刺激選択数と負の相関を呈した。これらの結果は、現在投稿準備中2である。
【研究2: 機能的等価性の成立の程度に関する検証】
（方法）被験体は一般家庭犬7頭（平均70.9 ± 27.2か月齢、オス3頭）と、オオカミ5頭（84.2 ± 14.4か月齢、オス2頭）であった。訓練と逆転、テストの3フェイズからなる同時同一／非見本合わせ課題を2日に分けて実施した。概要として、1日目の訓練フェイズで、記号である複数の見本刺激に対し、それらが属するカテゴリにより異なる比較刺激（見本刺激と形が同一あるいは異なる刺激）へ反応させた。すべての見本刺激は、互いに物理的に乖離した形のものを選定した。2日目、前日学習した内容に関するリマインド試行を実施したのち、カテゴリ内の一部の刺激について上記の学習を逆転した（逆転フェイズ）。たとえば、訓練フェイズにおいて、見本刺激と同一の形の比較刺激がS+であった場合、いまや形の異なる刺激がS+になるよう学習を変更した。最後にテストフェイズにおいて、直接的に逆転学習を受けなかった見本刺激を呈示し、それらと同カテゴリに属する刺激に関する学習の変更が般化（機能的等価性が成立）するかどうか観察した。
（結果）実験に参加した全ての個体においてテストを実施した。課題の理解度に関して、リマインド試行の正反応率を指標としたが、全頭の成績はチャンスレベルと有意差がなかった。しかしながら個体別に確認すると、オオカミ、和犬種群のうちそれぞれ1頭ずつが100 %の正反応率を呈した。これらの個体の機能的等価性の成立の程度はそれぞれ83.3 %と33.3 %であった。また、群（オオカミ、和犬種、欧米犬種）は訓練、リマインド、逆転フェイズの選択反応に有意に影響しなかった。機能的等価性の成立の程度に関して、3群比較の結果、有意差は得られなかった。しかしながら、上記のリマインド試行の正反応率が100 %であった2個体における機能的等価性の成立の程度を比較すると、オオカミ群の個体の方が高かった。
【総合考察】
本研究では2つの行動課題を実施したが、いずれの課題も動物にとって難しいものであったと考えられる。実験環境等の制約上難しいが、訓練にかける時間を追加するか、呈示する刺激モダリティについて検討する必要がある。研究1の尿中Corti濃度SDは、夜間のHPA軸活性パターンに関する日々の一貫性を示す可能性があることから、家畜化によるストレス応答の変化の指標と考えられるかもしれない。この値の新奇刺激選択数との関連については、まず、既知刺激が実験の開始時点では新奇刺激であったと考えると、ストレス応答性が低い個体では、比較的に早い段階でこれに対する馴化か飽和化が生じた可能性がある。そのような学習が、視覚的に類似した（プローブ試行での）新奇刺激に般化し、個体にとってサンプリングする動機づけが低減したことで、既知刺激の方が選好されたと考えられる。また、欧米犬種群では研究2の課題において、他の群と異なって訓練での学習が成立したといえる個体はおらず、したがって機能的等価性も成立し得なかった。これは、家畜化が進むほど新奇刺激、および実験事態への注意が低下していることを示すかもしれない。機能的等価性の成立の程度については、比較できる個体数が少ないため強い言及は控えるが、家畜化は、イヌにおいて新たな刺激同士の即座の連合や分類を生じさせづらくし、変化に富んだ人工環境への適応を促したかもしれない。doctoral thesi
犬の短頭種気道症候群の治療標準化を目的とした新規定量的病態評価法の確立
Get PDF麻布大学博士（獣医学）パグやフレンチ・ブルドッグ、ペキニーズなどの短頭⽝種は、選択的交配により短い顔面頭蓋など特徴的な解剖学的構造を有する結果として、上部気道閉塞を主訴とする短頭種気道症候群（Brachycephalic Airway Syndrome：BAS）を発症しやすいことが知られている。BAS は鼻腔や咽頭、喉頭、気管から構成される上部気道の閉塞を引き起こす進行性の病態であり、外鼻孔の狭窄や過剰な軟口蓋などの解剖学的異常に起因する。これらの一次病変を放置すると、咽頭や喉頭の虚脱といった二次病変が不可逆的に進行し治療が困難となるだけでなく、上部消化管や肺にも影響を及ぼし、長期的に生活の質が低下する可能性がある。こうした状況に対処するため外鼻孔拡大術や軟口蓋切除術などの外科的手法が実施され、術後に多くの症例で症状の改善が確認されている。しかしどの解剖学的異常がどの程度気道閉塞に関与しているかを特定することが困難であるため、症例ごとに最適な術式の選定が困難であり、標準的な治療法の確立には至っていない。また重症度や治療効果の客観的指標が存在しないため、評価は主観的な要素に依存しており、治療標準化の障害となっている。このような背景から本研究ではBASの治療の標準化に向け、客観的かつ定量的な病態評価法の確立を目的とした。そこで上部気道を構成する解剖学的構造のうち、第1章および第2章では吻側の鼻腔、第3章および第4章では尾側の咽頭と軟口蓋にそれぞれ着目し研究を行なった。
第1章 コンピューター断層画像による短頭犬種の鼻腔内構造の比較
短頭犬種は顔面頭蓋の短縮によって生じた鼻腔内の構造異常が気道閉塞に関与していると考えられているが、これを定量化する方法は限られている。本章では鼻腔の総断面積に対する気道面積比（The ratio of the airway cross-sectional area to the total nasal cavity area: AA/NC 比）の測定が犬の鼻腔内構造の定量的評価法として使用し、複数の短頭犬種間の鼻腔内構造に違いがあるかを検証した。また犬の頭蓋骨形状を表す値とAA/NC比の相関を調査し、頭蓋形状が鼻腔内構造の測定に与える影響について考察した。
【材料と方法】
50 頭の短頭犬種（パグ：20頭、フレンチ・ブルドッグ：20頭、シー・ズー：10頭）の頭部コンピューター断層（Computed Tomography: CT）画像を使用した。第一切歯レベル、犬歯レベル、硬口蓋水平板レベル、眼窩下孔レベルの4つの断面における略AA/NC比を求め、犬種間で比較した。また頭蓋指数 (Skull Index: SI), 顔面頭蓋指数 (Facial Index: FI), 脳顔面頭蓋角(Craniofacial Angle: CFA)を算出し、CT画像上で指定した断面におけるAA/NC比との相関を求めた。
【結果】
第一切歯および犬歯レベルのAA/NC比はシー・ズーがフレンチ・ブルドッグおよびパグよりも有意に大きく、眼窩下孔レベルのAA/NC比はフレンチ・ブルドッグがシー・ズーおよびパグよりも有意に大きかった（P < 0.05）。またパグにおいて眼窩下孔レベルでのAA/NC比とCFAの間に正の相関がみられたが、その他の頭蓋形状指数とAA/NC比の間に相関はみられなかった。
【考察】
犬の鼻腔内構造は頭部CT横断像により得られたAA/NC比を用いて面積が狭い箇所は短頭犬種間で異なることが示された。また頭蓋骨の 形状とAA/NC比との関連性はわずかだった。よって犬種間におけるBASへの治療反応の差は鼻腔内における気道の狭窄箇所の違いに起因する可能性が考えられた。
※本章の結果はOshita, R., Katayose, S., Kanai, E., Takagi, S.: Assessment of Nasal Structure Using CT Imaging of Brachycephalic Dog Breeds. Animals (Basel), 12(13):1636, 2022 Jun 25 として発表した。
第2章 3Dプリンターモデルを用いた犬の鼻腔内通気度における客観的評価
第1章において、鼻腔内構造の違いがBASにおける臨床徴候の重症化に強く関連していると考えられた。そのため実際の症例における治療では、鼻腔内で最も気道抵抗が大きい部位を外科的に切除し、気道を拡大することが⼀定の治療効果をもたらすと考えられるが、鼻腔内の通気度や気道抵抗を定量化するための方法は確立されていない。本章ではBASに対する外科的治療を行なったフレンチ・ブルドッグの術前および術後頭部モデルを3Dプリンターで作成し風洞実験を行うことで、鼻腔内通気度と手術による改善を定量化できるか検討した。
【材料と方法】
BASの精査および治療を目的に麻布大学附属動物病院を受診し、腹側鼻甲介の⼀部を外科的に切除したフレンチ・ブルドッグ（6歳、去勢雄）のCT画像をもとに、3Dプリンターで術前、術後の頭部モデルを作成した。頭部モデルを含めた風洞装置を作成し、内部の流体の持つ圧力を測定することで流速を求め、術前および術後で比較した。
【結果】
風洞装置の内部における流速の平均値は術前モデルで3.59m/s、術後モデルで3.61m/sだった。よって術後モデルでわずかな流速の増加がみられたが、統計解析の結果では手術の前後で有意差はなかった。
【考察】
3Dプリンターで作成した頭部モデルは実際の症例の鼻腔内構造が一定の精度で反映され、現時点では実験段階であるものの犬の鼻腔内通気度を評価する有用なツールの1つである可能性が考えられた。しかし術前後の流速に統計学的有意差は認められず、気道表面の材質や詳細な骨構造の再現などモデルの精度に関する検討、流体力学的シミュレーションを利用した包括的な解析が必要だと考えられた。
第3章 犬の軟口蓋の変形に関する定量的測定法の検討
本章では上部気道の尾側に位置する咽頭および軟口蓋に着目した。短頭犬種の軟口蓋は先天的もしくは後天的に肥厚・伸長し、呼吸運動に伴って動的に咽頭を閉塞させることが知られているが、この現象を軟口蓋の変形に着目して定量化した報告はない。このような背景から本章では、X線連続透視装置を用いて犬の咽頭構造の変形を定量化することを試みた。そこで正常ビーグル犬と、軟口蓋の異常による呼吸器症状を呈しやすい犬種で各呼吸相における軟口蓋面積および咽頭面積の変化を X 線連続透視画像で比較した。
【材料と方法】
短頭犬2犬種 （フレンチ・ブルドッグ、チワワ）と対照群（ビーグル）の側方より撮影した頭部 X 線連続透視画像を前向きに収集し、吸気および呼気における軟口蓋および咽頭空間の面積を測定した。その後、咽頭空間における軟口蓋占有率および咽頭空間面積率を算出し、呼吸による変化率を犬種間で比較した。
【結果】
全犬種で吸気時における軟口蓋面積の有意な増加が見られた（P<0.05）。また吸気時における軟口蓋占有率の有意な増加および咽頭空間面積率の有意な減少が見られた（P<0.05）。この現象は短頭犬種において顕著に観察された。
【考察】
短頭犬種で観察される軟口蓋による咽頭の動的な狭窄は、吸気時に軟口蓋が膨張することで発生する可能性が示唆された。面積変化に着目した軟口蓋の変形の定量化は、犬の上部気道閉塞の病態評価に有用である可能性がある。
第4章 上部気道拡大手術が軟口蓋および咽頭構造の定量化に与える影響
第3章より呼吸による軟口蓋の膨張を抑制することは上部気道閉塞の改善につながると考えられる。気道閉塞を起こす軟口蓋の異常に対しては軟口蓋切除術が適応となる場合が多いが、手術が軟口蓋の変形に与える影響は不明である。本章では上部気道拡大手術が軟口蓋および咽頭の面積変化に与える影響を調査した。
【材料と方法】
軟口蓋切除術を含む上部気道拡大手術を受けた犬11頭（チワワ：1頭、ブルドッグ：1頭、フレンチ・ブルドッグ：9頭）の頭部X線透視画像を術前後で撮影した。第3章で定義した軟口蓋占有率、咽頭空間面積率をそれぞれ求め、呼吸による変化率を術前後で比較した。
【結果】
11 頭の対象犬すべてで術後の主観的重症度グレードが改善した。軟口蓋占有率および咽頭空間面積率の呼吸による変化率は術後で有意に減少した（P<0.05）。
【考察】
上部気道の手術が軟口蓋の可動性を抑制し、咽頭閉塞を改善する可能性が示唆された。また面積変化に着目した軟口蓋の変形の定量化は上部気道の手術の治療効果判定に利用できる可能性がある。
本研究で開発および検討した定量的評価法はBASにおける病態理解を深め、重症度評価や治療効果判定における客観的指標として有用であることが期待される。また、今後さらに様々な年齢・重症度の症例を本評価法にて解析することによりどの犬が将来的に重症化しやすいかということや、治療効果の主観的評価法との比較検討を行うことで、より効率的なBAS治療法の確立が期待される。doctoral thesi
Mechanisms of site-specific tumorigenesis in the rat kidney treated with madder color
Get PDF麻布大学博士（獣医学）Chapter 1 Introduction
Madder color (MC) has been used in various foods and drinking water for coloring purposes, but a 2-year carcinogenicity study using F344 rats revealed that MC is carcinogenic and toxic specifically to the outer strip of outer medulla (OSOM) of the kidney. The lucidin glycoside (LuP), a component of MC, is metabolized to lucidin and rubiadin (Rub), which show strong mutagenicity, suggesting that genotoxicity of LuP may play an important role in the carcinogenicity of MC. Based on the facts, the OSOM site-specific renal carcinogenicity of MC may be associated with the distribution of LuP or its metabolites in the kidney, however, no studies have evaluated the distributions of these anthraquinone compounds in the kidney. In this study, we aimed to clarify the mechanism of site-specific carcinogenesis of MC in the rat kidney. First, in Chapter 2, we visualized the distribution of anthraquinones in the rat kidney after a single dose of MC using desorption electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry imaging (DESI-Q-TOF/MSI). Then, in Chapter 3, we examined the distribution of Rub and its metabolites in the kidneys of gpt delta rats treated with Rub, a metabolite of LuP, for 28 days, along with histopathological analysis of the kidneys, immunohistochemical staining, and reporter gene mutation assays to search for a role for Rub in MC renal carcinogenesis.
Chapter 2 Visualization of the distribution of anthraquinone components from madder roots in rat kidneys by desorption electrospray ionization-time-of-flight mass spectrometry imaging（DESI-Q-TOF/MSI）
Liquid chromatography-quadrupole time-of-flight/mass spectrometry (LC-Q-TOF/MS) and tandem mass (MS/MS) analysis of rat serum 1 h after a single dose of MC revealed the detection and identification of alizarin, lucidin, munjistin, nordamnacanthal, purpurin, pseudopurpurin, Rub and its metabolites. These components were subjected to DESI-Q-TOF/MSI analysis to visualize the distribution of anthraquinones in MC components in the kidney over time. Ion images of anthraquinone components detected in the kidneys of rats after MC administration showed a characteristic distribution according to their chemical structure.
Among the anthraquinone components, lucidin and Rub, which were known to be mutagenic, were specifically distributed in the OSOM, a carcinogenic target site of MC, suggesting that these two anthraquinones induces gene mutation to the OSOM via formation of DNA adducts and may be directly involved in the OSOM site-specific renal carcinogenesis of MC. Alizarin and purpurin were also distributed in the OSOM, suggesting that these two anthraquinones may play an important role in the OSOM site-specific renal carcinogenesis of MC through indirect mechanisms such as their carcinogenic promotional actions or actions as epigenetic mutagens.
The results of quantification of anthraquinone compounds by LC-ESI/MS/MS analysis indicated that DESI-Q-TOF/MSI analysis can detect anthraquinones on tissue sections with high sensitivity at concentrations of at least several tens ppb.
Chapter 3 Site-specific genotoxicity of Rub: localization and histopathological changes in the kidneys of rats
DESI-Q-TOF/MSI analysis revealed that Rub localized to the OSOM even after repeated administration of Rub. In addition, Rub-sulfate conjugate and lucidin were also detected in the OSOM. Since lucidin is a genotoxic intermediate metabolite of Rub, its localization to the OSOM may be responsible for site-specific genotoxicity.
Consistent with the localization site of Rub and its metabolites, lucidin, histopathological examination revealed that karyomegaly and vacuolar degeneration of microvesicles were observed in the proximal tubular epithelial cells of the OSOM in the Rub high dose group. In addition, γ-H2AX, double strand brake marker, and p21, which contributed to cell cycle arrest, positive cells were also detected immunohistochemically in the OSOM rather than in the cortex.
The gpt mutant frequencies (MF) increased in a dose-dependent manner in all Rub groups compared to the controls in both the medulla and cortex, but the gpt MF in the medulla was clearly higher than that in the cortex. Spectrum analysis revealed a characteristic MF of A:T-T:A transversion, which was consistent with the mutational pattern of MC or RuP administration. Spi- assay revealed a medullary specific increase in red/gam MF. The spectrum analysis of red/gam mutants showed that Rub increased red/gam MF by single base mutations but not large deletion.
Considering these results, the distribution of Rub and its metabolites, lucidin, to the OSOM induces site-specific histopathological changes, DNA damage, and gene mutation, which directly contribute to site-specific renal carcinogenesis of MC.
Chapter 4 Summary
To elucidate the mechanism of site-specific carcinogenicity of MC in rat kidney, we examined the distribution of MC components and Rub, a metabolite of MC components, histopathological analysis, and mutagenicity. In the distribution analysis, the ion images of MC components and their metabolites showed a charastaristic distribution according to their chemical structure. The MC components and their metabolites were localized to the OSOM, a carcinogenic target site, suggesting direct or indirect contribution to carcinogenesis.
In the distribution analysis of Rub, Rub and its metabolites were localized to the OSOM in the kidneys of rats treated with Rub for 28 days, suggesting that the distribution of Rub and its metabolite, lucidin, to the OSOM induces site-specific histopathological changes, DNA damage and gene mutation, which directly contribute to site-specific renal carcinogenesis of MC.
In this study, we visualized the tissue distribution of anthraquinone compounds and their metabolites in MC components in the kidney, and combined them with site-specific mutagenicity analysis in a novel approach that greatly contributed to the elucidation of the mechanism of OSOM site-specific renal carcinogenesis of MC. This approach will be a powerful tool for exploring the mechanisms of carcinogenesis by other carcinogens in other organs.第1章 緒言
アカネ色素（MC）はアカネ科セイヨウアカネ（Rubia tinctorum L.）の根から抽出された赤紫色を呈する着色料であり、ハム、ソーセージ等の畜肉加工品、かまぼこ等の水産加工品、菓子類、清涼飲料水、麺類及びジャムなどの着色に使用されていた。しかし、F344ラットを用いた2年間がん原性試験においてMCは腎臓及び肝臓に強力な発癌性を有することが明らかとなった。当試験における腫瘍の発生率は腎細胞腺腫/がんでは雄50匹中43匹、雌50匹中13匹、肝細胞腺腫/がんでは雄50匹中11匹、雌50匹中6匹であり、腎臓が主要な発癌標的臓器であることが示唆されている。興味深いことにすべての腎腫瘍及び前腫瘍性病変は、腎臓の髄質外層外帯（OSOM）に認められた。MCのOSOM部位特異的な腎発癌性は、発がん原因成分と考えられているアントラキノン成分の腎臓における分布と関連している可能性があるが、アントラキノン化合物の腎臓における分布、部位特異性を評価した研究はこれまでに報告されていなかった。そこで本研究では、MCのラット腎臓におけるOSOM部位特異的な発癌性の発生機序を解明することを目的とした。まず第2章では、MCのOSOM部位特異的腎発癌におけるMCの成分と代謝物の役割を明らかにするためラットの腎臓におけるアントラキノン類の分布を脱離エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析イメージング（DESI-Q-TOF/MSI）を用いて可視化した。次に第3章では、MCのOSOM部位特異的腎発癌におけるルビアジン（Rub）の役割を明らかにするため、DESI-Q-TOF/MSI解析を用いて、Rubを28日間投与したgpt deltaラットの腎臓におけるRub及びその代謝物の分布を検索することに加え、腎臓の部位特異的な病理組織学的解析及びレポーター遺伝子変異アッセイを実施した。
第2章 脱離エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析イメージングを用いたアカネ色素に由来するアントラキノン類の分布の可視化
MCの単回投与1時間後のラット血清について液体クロマトグラフィー-四重極飛行時間型/質量分析（LC-Q-TOF/MS）及びタンデムMS（MS/MS）で解析し、文献値をもとに、アリザリン、ルシジン、ムンジスチン、ノルダムナカンタール、プルプリン、プソイドプルプリン、Rub及びその代謝物を検出、同定した。次に、これら成分をDESI-Q-TOF/MSI分析の対象として腎臓におけるMC成分中のアントラキノン類の分布を経時的に可視化した。その結果、MC投与後のラットの腎臓から検出されたアントラキノン成分のイオン画像は、化学構造に応じた特徴的な分布を示した。まず、1,3-ジヒドロキシアントラキノンのC-2位にヒドロキシメチル基、メチル基及びアルデヒド基を持つルシジン、Rub及びノルダムナカンタールはOSOMでのみ検出された。次にアントラキノン構造のC環にヒドロキシル基のみを持つアリザリン及びムンジスチンは、皮質よりもOSOMで高頻度に検出された。最後に、アントラキノン構造のC-2位がカルボキシル基で置換されているプソイドプルプリン及びプルプリンは、皮質とOSOMで同等に検出された。
アントラキノン成分のうち、変異原性が知られているルシジン及びRubはMCの発癌標的であるOSOMに特異的に分布していたことから、これら2つのアントラキノンがDNA付加体の形成を介してOSOMへの遺伝子突然変異を誘発し、MCのOSOM部位特異的腎発癌に直接関与している可能性が示唆された。また、アリザリン及びプルプリンもOSOMに分布していたことから、これら2つのアントラキノンはその発癌プロモーション作用あるいはエピジェネティック変異原物質としての作用など間接的なメカニズムを通じてMCのOSOM部位特異的腎発癌に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。
第3章 ルビアジンの腎臓における局在と病理組織学的変化が示す部位特異的な遺伝毒性
Rubをgpt deltaラットに28日間反復投与した後に摘出した腎臓をDESI-Q-TOF/MSIにより解析した結果、Rub、ルビアジン-硫酸抱合体及びルシジンがOSOM特異的に検出された。ルシジンは変異原性を持つRubの中間体代謝物として知られていることから、OSOMに局在することで、部位特異的な遺伝毒性が生じた可能性が示唆された。Rub及びその代謝物であるルシジンの局在部位と一致して、病理組織学的検査では、Rub高用量群において、OSOMの近位尿細管上皮細胞にカリオメガリー及び微小小胞の空胞変性が認められた。同群の免疫組織化学検査では、二重鎖切断のマーカーであるγ-H2AX及び細胞周期阻害に寄与するp21の陽性細胞も皮質よりもOSOMに高頻度に検出された。γ-H2AX陽性細胞が増加したことによりRubがOSOM特異的なDNA損傷を引き起こしたことが示唆された。p21の陽性細胞はカリオメガリーを伴っていたことから、カリオメガリーの形成には細胞周期阻害が寄与する可能性が示唆された。gpt アッセイでは変異体頻度（MF）は、髄質、皮質いずれの部位も、対照群と比較して全てのRub投与群で用量依存的に増加したが、髄質におけるgpt MFは皮質より明らかに高かった。さらにスペクトラム解析の結果、A:T-T:A transversionのMFの増加が最も特徴的であった。Spi-アッセイではred/gam MFが髄質、皮質いずれの部位も、対照群と比較して全てのRub投与群で用量依存的に増加したが、髄質におけるgpt MFは皮質より明らかに高かった。さらにred/gam変異体のスペクトラム解析の結果、red/gam MFの増加には、欠失、置換等の一塩基変異が大きく寄与しており、大型の欠失変異を引き起こさないことが示された。gptアッセイ及びSpi-アッセイで認められた皮質におけるMFの増加は皮質成分による髄放線によるものと考えられた。
第4章 総括
MCのラット腎臓におけるOSOM部位特異的な発癌性の機序解明を目的として、MCの分布解析を実施した。続いて発癌の直接的な原因と考えられるRubの役割を検索するため分布解析、病理組織学的解析及び変異原性解析を実施した。
MC成分の腎臓における分布解析では、MC成分及びその代謝物の3つの特徴的な分布パターンを示したことで、OSOM部位特異的腎発癌性を有するMCの代謝及び分布の解明に大きく寄与した。MC成分及び代謝物の一部は発癌標的部位であるOSOMに分布しており、直接又は間接的な発癌への寄与が示唆された。今回の可視化技術によって、複数のアントラキノン化合物及びその代謝物が、MCの発癌標的部位であるOSOMに分布し、直接的あるいは間接的なメカニズムで複合的にMCのOSOM部位特異的腎発癌に寄与している全体像が初めて明らかになった。
Rubの反復投与後の腎臓における解析において、RubのOSOM特異的な変異原性を明らかにした。分布解析では、RubがOSOMに局在していることを明らかにした。さらに、Rubの代謝物であるルシジンもOSOMに検出されたことから、OSOMに局在することで、部位特異的な変異原性が生じた可能性が示唆された。Rub及びその代謝物の局在部位と一致して、病理組織学的検査では、Rub高用量群のOSOMの近位尿細管上皮細胞において、カリオメガリーが認められ、免疫組織化学染色では、γ-H2AX及びp21の陽性細胞がOSOMにおいて認められた。これらの結果から、Rub及びその代謝物のルシジンがOSOMに分布することで、DNA付加体の形成を起点に、DSBのような重度のDNA損傷及びDNA損傷応答を介したカリオメガリーを引き起こし、同部位の発癌にも関与していることが示唆された。本結果は、カリオメガリーのDNA損傷及び細胞周期異常による機序を強く裏付けるものであり、カリオメガリー研究の新たなモデル化合物としてのRubの有用性を示すものであった。gpt アッセイでは、髄質におけるgpt MFの増加が明らかとなり、ルシジン由来のDNA付加体が原因と考えられるA:T-T:A transversionが特徴的であったことから、Rub由来のDNA付加体に加えて代謝物のルシジン由来のDNA付加体もRubの変異原性に寄与していることが示唆された。Spi-アッセイではred/gam MFが髄質で増加しており、red/gam変異体のスペクトラム解析から、Rubは一塩基変異によってred/gam MFを増加させたが、大型の欠失変異を引き起こさないことが示された。このように、腎臓を髄質と皮質に切り分けてそれぞれ変異原性を解析する手法によって、RubがOSOM部位特異的な変異原性を有する事を明らかにした。
また、本研究ではRubがOSOMに局在するメカニズムは不明であった。OSOMは近位尿細管のS3領域の集中する部位であり、特にアントラキノン類のような脂溶性の低分子化合物は糸球体から濾過され尿細管へ分泌され蓄積することが想定されるが、アントラキノン骨格を有する化合物を輸送する報告はこれまでにない。Rubと同様に近位尿細管のS3領域に傷害を示す化合物であるオクラトキシンAはアニオン薬物の輸送担体であるOAT1及びOAT3への関与が知られ、いずれも血管側から尿細管の基底膜側にオクラトキシンAを輸送し、S3への障害を引き起こすと考えられている。また、OAT1及びOAT3は本研究で用いた動物種であるラットにおいて、尿細管の基底膜側のS3領域にも発現する報告があり、アントラキノン化合物に類似したステロイド骨格構造を有する化合物を輸送することも知られている。これらのトランスポーターの基質特異性が極めて低いことを踏まえると、Rubが血管側からOAT1及びOAT3を介して尿細管側の基底膜側に取り込まれS3領域に分布し発癌を引き起こす可能性が考えられた。一方で、S3領域に特異的に新たなトランスポーター分子種が見出される可能性もある。今後、アントラキノン類に関わる薬物トランスポーターの基質特異性を明らかにすることで、MCの発癌メカニズムの解明は飛躍的に進むものと考えられる。
本研究では、MC成分であるアントラキノン化合物及びその代謝物の腎臓における組織内分布を可視化し、部位特異的な変異原性解析を組み合わせる新たな手法により、MCのOSOM部位特異的腎発癌の機序解明に大きく寄与した。この研究手法は他の発癌物質による他臓器の発癌機序の解明にも強力なツールとなるものである。doctoral thesi
科学的根拠に基づいた抗菌剤選択の実現に向けた牛乳房炎の検査法と実践的な治療法の検討
Get PDF麻布大学博士（獣医学）The recent expansion of antimicrobial resistance is of urgent international concern. In response to this concern, the World Health Organization General Assembly adopted a Global Action Plan in 2015 that outlines a framework for combating antimicrobial resistance, and many countries are now taking action. Resolving the problem of antimicrobial resistance will require a comprehensive approach encompassing human medicine, veterinary medicine, and the environment, that is, a “one-health” approach. The livestock industry, which has a high rate of antimicrobial use, is an important component of the one-health approach. The National Action Plan on Antimicrobial Resistance (AMR) 2023-2027 for Japan includes species-specific numerical goals regarding reductions in resistance rates and antimicrobial use in livestock production.
Bovine mastitis is characterized by inflammation of the mammary tissue due to microbial infection, and the condition is primarily treated with antimicrobial agents. Treatment of bovine mastitis accounts for the majority of antimicrobial agent use in dairy farming. This study examined several challenges to achieving science-based antimicrobial selection for treating bovine mastitis.
Evidence-based antimicrobial selection is necessary to reduce antimicrobial resistance and requires determination of the drug susceptibility of clinical isolates. However, Japan has adopted a simplified method (simplified-ADD) for diagnosing bovine mastitis for antimicrobial susceptibility testing. Simplified-ADD differs from international guidelines, and its validity has not been confirmed. The present study found a high correlation between the simplified-ADD and the method specified by international guidelines, thus demonstrating the usefulness of the simplified-ADD as an antimicrobial susceptibility test. We confirmed that the results differ depending on the test method, indicating the importance of developing specific criteria for each method. To date, no criteria have been established for the simplified-ADD. Therefore, reference breakpoints for humans and other animals specified in criteria adapted from international guidelines, which differ in terms of testing methods, have been utilized instead. Even within the criteria adapted from international guidelines, only five drugs are included for which breakpoints have been established for bovine mastitis, and because all of these drugs differ from those used in Japan, essentially no reference criteria exist. Therefore, we surveyed the distribution of antimicrobial susceptibility among isolates of bovine mastitis–causing bacteria over a wide area of Japan. We also calculated epidemiological breakpoints based on the antimicrobial susceptibility distribution results and developed new criteria for adapting disk diffusion assays to the simplified-ADD. Although these criteria are limited, in that they are epidemiological breakpoints and therefore do not directly predict clinical efficacy, they are based on scientific evidence regarding bovine mastitis, unlike previous criteria based on reference cut-off values for humans or other animals. We therefore believe the new method has some merit. The epidemiological breakpoints developed in this study provide important basic data for the future development of new breakpoints for clinical applications. Compared with previous criteria, the newly developed criteria include relaxed standards for many antimicrobial agents. It has been suggested that an increase in the variety of antimicrobial agents available for selection could increase the opportunity for selecting narrower-spectrum antimicrobial agents and thereby reduce the use of medically important broad-spectrum antimicrobial agents. In addition, a wide-area survey of the distribution of antimicrobial susceptibility among bovine mastitis–causing isolates in Japan showed that the organisms were generally susceptible to the major antimicrobial agents used for mastitis treatment. However, a trend toward resistance to some antimicrobial agents was observed, suggesting the need for continued monitoring.
Cases of bovine mastitis are generally treated with an antimicrobial agent from the time of initial diagnosis. However, a new concept for selective antimicrobial treatment has been established, in which cases for antimicrobial therapy are selected based on the results of bacteriological examinations. Nevertheless, this selective antimicrobial treatment approach involves leaving mastitis cows untreated and observing them for several days until the results of bacteriological examinations are obtained. An alternative to the use of antimicrobial agents is thus needed for initial treatment. For this purpose, the present study examined the effectiveness of glycyrrhizin, an anti-inflammatory agent, when administered at the time of initial diagnosis. Administration of glycyrrhizin at the time of first diagnosis was effective in promoting more-rapid reversal of udder symptoms, highlighting its potential as a novel alternative to the use of antimicrobial agents at initial diagnosis. We believe that combining selective antimicrobial treatment with glycyrrhizin will promote more widespread adoption of evidence-based antimicrobial selection due to rapid symptom relief and satisfaction of the desire of farmers to start treatment early.
In vitro and in vivo analyses of the anti-inflammatory mechanism of glycyrrhizin in bovine mastitis showed that glycyrrhizin downregulates the relative gene expression levels of inflammatory cytokines. An inhibitory effect of glycyrrhizin on intracellular invasion of Staphylococcus aureus was also suggested, and new possibilities for clinical applications other than for anti-inflammatory purposes were discovered.
This study demonstrated the validity of the method for antimicrobial susceptibility testing in bovine mastitis in Japan and established novel criteria for antimicrobial selection. The study also demonstrated the efficacy of glycyrrhizin as a new alternative to antimicrobial agents for initial treatment, which has represented a challenge to implementing antimicrobial selection based on bacteriologic testing results. These findings partially resolve the challenges associated with science-based antimicrobial selection. However, other challenges must be overcome to achieve evidence-based antimicrobial treatment of bovine mastitis, including the establishment of a system to obtain bacteriologic test results more rapidly, the development of clinical breakpoints, and the dissemination of knowledge to clinical veterinarians and dairy farmers regarding correct diagnosis and treatment. The most important objective is to reduce the incidence of mastitis and thereby dramatically reduce the use of antimicrobial agents. Further research and actions are needed in order to reduce antimicrobial resistance, particularly with regard to approaches for both mastitis control and antimicrobial agent selection.薬剤耐性菌の拡大は国際的な喫緊の課題である。薬剤耐性菌の急速な拡大を受けて、2015年には世界保健機関（WHO）の総会で薬剤耐性菌対策の枠組みを示したグローバル・アクションプランが採択され、各国において対策が進められている。薬剤耐性菌問題の解決には、ヒト医療領域、獣医領域、そして環境を含めた包括的な取り組み、すなわちワンヘルス・アプローチが重要であり、獣医領域の中でも抗菌剤使用量の多い畜産領域は、ワンヘルス・アプローチの重要な要素と位置付けられている。日本において策定された薬剤耐性（AMR）対策アクションプラン（2023‐2027）では、畜産における畜種別耐性率、抗菌剤使用量について、具体的な数値目標が設定されている。
牛乳房炎は微生物感染に起因する乳腺組織の炎症であり、その治療は主として抗菌剤投与により行われているため、牛乳房炎治療における抗菌剤使用は酪農における抗菌剤使用の主要な要因となっている。そこで本研究では、酪農における抗菌剤使用の大部分を占める牛乳房炎において、科学的根拠に基づいた抗菌剤選択を実現する上で課題となっているいくつかの問題点に着目した。
薬剤耐性を低減するためには、エビデンスに基づいた抗菌薬の選択が必要である。エビデンスに基づいた抗菌剤の選択には、臨床分離株の薬剤感受性を判断することが不可欠である。日本における牛乳房炎の診断には国際的なガイドラインとは異なる薬剤感受性試験法として簡易的な方法（簡易ディスク拡散法）が広く採用されているが、本法の妥当性はこれまで確認されてこなかった。本研究において、国際的ガイドラインに準拠した方法と簡易ディスク拡散法の高い相関が確認され、薬剤感受性試験としての簡易ディスク拡散法の有用性が明らかとなった。また、試験方法により結果が異なることも改めて確認され、試験法ごとに判定基準を策定することの重要性が示された。これまで簡易ディスク拡散法に適応した判定基準は策定されておらず、試験法の異なる国際的ガイドラインに適応した基準におけるヒトやその他動物の基準値が代用されてきた。国際的ガイドラインに適応した基準に関しても、牛乳房炎に対する基準が設定されている薬剤はわずか5薬剤のみで、そのいずれの薬剤も日本で使用されている薬剤とは異なることから、実質的に基準値が存在しない状態であった。そこで、日本における牛乳房炎分離株の薬剤感受性分布を広域に調査し、得られた薬剤感受性分布の結果から疫学的ブレイクポイントを算出し、簡易ディスク拡散法に適応した新たなディスク法判定基準を策定した。本基準は疫学的ブレイクポイントであるため直接臨床的効果を予測するものではない点に一定の限界があるが、これまで代替的に使用してきた国際的ガイドラインにおけるヒトやその他動物の基準値と異なり、牛乳房炎に関する科学的根拠に基づいており、一定の価値を有するものと考える。本研究で策定した疫学的ブレイクポイントは、今後臨床的なアプローチを加えたブレイクポイントを策定していく上で重要な基礎データとなる。また、新たに策定した基準では多くの薬剤で従来代替的に使用していた基準と比較して基準が緩和された。選択可能な抗菌剤の種類が増えることは、より狭いスペクトルの抗菌剤の選択機会を増やし、医療上重要な抗菌剤の使用量の低減につながる可能性が示唆された。加えて、日本における牛乳房炎分離株の薬剤感受性分布を広域に調査した結果、牛乳房炎分離株は治療に使用されている主要な抗菌剤に対し概ね感受性であるが、一部の抗菌剤では耐性傾向を示唆する結果となったため、今後も継続的にモニタリングを行う必要があると考える。
これまで牛乳房炎は全症例一律に初診時より抗菌剤治療が行われてきた。それに対して近年、細菌学的検査に基づいて抗菌剤治療の適応症例を選択する、選択的抗菌剤治療の考えが確立されてきている。しかし、選択的抗菌剤治療において細菌学的検査の結果が得られるまでの数日間は無処置のまま経過観察とされており、抗菌剤に代わる初診時の治療方法は確立されていない。そこで、本研究では抗炎症剤であるグリチルリチンに着目し、初診時投与の効果について検証を行った。その結果、初診時のグリチルリチン製剤投与は乳房局所徴候の早期回復効果を示し、抗菌剤に代わる新たな初診時の治療方法としての可能性が示された。選択的抗菌剤治療にグリチルリチン製剤の単剤投与を組み合わせることで、臨床徴候の緩和効果や早期に治療を開始したい農家の意向を満たし、根拠に基づいた抗菌剤使用の普及に貢献するものと考える。加えて、牛乳房炎におけるグリチルリチンの作用機序に関するin vitroおよびin vivoの実験では、グリチルリチンが炎症性サイトカインの相対的遺伝子発現量を低下させる可能性が示唆され、グリチルリチンの抗炎症作用のメカニズムが部分的に明らかになった。また、Staphylococcus aureusの細胞内侵入に対するグリチルリチンの阻害効果が示唆され、抗炎症効果以外の臨床応用の可能性が新たに発見された。
本研究では牛乳房炎における薬剤感受性試験の試験方法の妥当性が証明され、これまで不在であった判定基準の策定を行った。また、細菌学的検査に基づいて抗菌剤選択を実施する上で課題となっていた抗菌剤に代わる新たな初診時の治療方法についてグリチルリチンの有効性を示した。これらの知見は、科学的根拠に基づいた抗菌剤選択を行う上での課題を部分的に解消するものであり、その普及に貢献するものであると考える。牛乳房炎においてエビデンスに基づいた抗菌剤選択を実現するためには、他にもいくつかの課題がある。迅速に細菌学的検査結果を得られる体制作りや、臨床的ブレイクポイントの策定、臨床獣医師や酪農家への正しい診断、治療に関する知識の普及など、クリアすべき課題は多い。また、抗菌剤使用量を根本的に低減させる方法として、そもそも乳房炎の発生を減らすことが前提として最も重要である。薬剤耐性の低減に向け、乳房炎防除法と抗菌剤選択方法の両方のアプローチから、さらなる研究と対策が望まれる。doctoral thesi
イヌ歯周病の原因細菌であるPorphyromonas gulaeの遺伝子型に関する研究 〜イヌの年齢、品種、疾患との関連について〜
Get PDF麻布大学博士（獣医学）Periodontal disease is an oral inflammatory disease caused by infection with periodontopathogens and affects approximately 80% of adult dogs. The progression of periodontal disease begins with the formation of periodontal furrows, followed by the establishment of periodontopathogens, and the development of gingivitis. As gingivitis becomes chronic, the inflammatory area expands, and irreversible periodontal pockets are formed in the gingiva and periodontal furrow. As a result, tooth loss and alveolar bone degradation occur, suggesting that chronic periodontal disease is not confined to the oral cavity but may be directly or indirectly associated with other systemic diseases.
In humans, bacteria classified in the Red Complex, namely Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythensis, are known to be highly pathogenic as periodontal disease-causing bacteria. It is becoming clear that Porphyromonas gingivalis and its close relative Porphylomonas gulae (hereafter referred to as P. gulae) play an important role in the progression of periodontal disease in dogs. One of the virulence factors of P. gulae is FimA, a polymerized filamentous structure of 41 kDa protein, which can be classified into three genotypes: A, B, and C (hereafter referred to as FimA lineage genotypes). Genotype C is the most virulent of the three, and significant infection has been observed in dogs with severe periodontal disease. Since the alveolar bone melting and tooth loss associated with periodontal disease are irreversible changes, early detection and early treatment are necessary, and clarification of the timing and mechanism of periodontal disease onset is urgently needed.
Most of the surveys of canine periodontal disease have been conducted overseas and have targeted mainly medium- to large-sized dogs, making it difficult to apply them to the actual situation in Japan, where many are small-sized dogs. The methods used were often inadequate compared to those used in human epidemiological surveys, and the difficulty of isolating and culturing the Red Complex bacteria, which are biochemically anaerobic, was also a factor in the difficulty of epidemiological surveys. Recently, a highly sensitive detection method using polymerase chain reaction (PCR) has been established.
Therefore, the purpose of this study was to conduct a large-scale survey of dogs weighing 10 kg or less in a more sensitive manner that is consistent with the current situation in Japan. We focused on P. gulae, which has been suggested to be associated with periodontal disease in dogs and investigated the relationship between the timing of its establishment, possession of the FimA lineage genotype and periodontal severity, and the relationship between existing diseases and periodontal severity, P. gulae expression status, and possession of the FimA lineage genotype.
In Chapter 1, we investigated the detection of P. gulae and its correlation with FimA lineage genotype and periodontal severity at each age in canines weighing 10 kg or less. Periodontal pathology and P. gulae infection status were investigated and classified at each age in 665 dogs that visited 77 veterinary hospitals in Japan between 2015 and 2022. The detectability of P. gulae and FimA lineage genotypes were identified by PCR method using a microbrush to collect dental plaque samples from the tooth-gingival border. FimA lineage genotypes were classified into eight groups, including non-detects: type A alone, type B alone, type C alone, type A and B, type A and C, type B and C, and all types A, B, and C were detected. Periodontal severity was classified into scores 1 through 4, defined as no periodontal disease, mild, moderate, and severe in descending order of score. The results showed that P. gulae was detected in 554 of 665 (81.8%) of the animals after the age of 1 year. Periodontal severity scores averaged less than 2 at ages 0 and 1 year, and slightly advanced symptoms at ages 2 to 5 years, averaging less than 2.5, which is between mild and moderate. At 6 years or older ages, the mean scores were between 2.5 and 3.0, except for the 14- and 17-year-olds, suggesting that the progression of symptoms slowed down after a certain age. All combinations of FimA lineage genotypes were detected in less than 20% of cases except for the proportion of single A and B genotypes detected in some age groups, and the detection rate increased significantly with increasing age. Periodontal severity scores in the P. gulae non-detected group were significantly lower than those in the detected group. Both the detection rate of the FimA lineage genotype and the mean periodontal severity score increased with advancing age, and the correlation between the two increased with advancing age. This suggests that dogs weighing less than 10 kg should be tested for P. gulae at least 1 year of age, and that P. gulae should be tested periodically until 6 years of age or older to check for the presence of the organism.
In Chapter 1, various breeds weighing 10 kg or less were evaluated, however, it is conceivable that there may be cases in which marked differences appear among the breeds, and conversely, cases in which they do not. In Chapter 2, we focused on toy poodles, dachshunds, and chihuahuas, which are particularly numerous in Japan, and investigated the correlation between P. gulae detection, FimA lineage genotype, and periodontal severity, and analyzed differences by breed. There were 226 toy poodles, 192 dachshunds, and 76 chihuahuas used in the analysis. The analysis showed that 5% of the animals had no periodontal disease, that is score 1. The periodontal severity score was highest in dachshunds, with a significant difference between dachshunds and toy poodles, and the correlation between FimA lineage genotype and periodontal severity score was significant in chihuahuas, where FimA lineage genotype B was detected alone, compared to the group without P. gulae detection. In toy poodles, periodontal severity scores increased as the number of FimA lineage genotypes of P. gulae increased, and when all FimA lineage genotypes A, B, and C were detected, there was a significant difference in periodontal severity scores compared to the P. gulae non-detection group. No correlation was found between P. gulae detection and FimA lineage genotype and periodontal severity score in dachshunds. These results indicate that there are differences in the status of periodontal deterioration and detection of P. gulae among breeds and suggest the need for different methods of coping with periodontal disease.
In Chapter 3, the detection of P. gulae in individuals with missing teeth and its correlation with FimA lineage genotype and periodontal severity were investigated based on the classification methods used in Chapters 1 and 2. Tooth loss was classified with 0, 1-10, 11-20, and 21 or more teeth lost. The number of individuals in each group was 74, 69, 24, and 21, respectively. The results of the analysis showed that almost all individuals with periodontal severity score 1 concentrated on 0 tooth loss. The number of individuals with a periodontal severity score of 2 decreased as the number of teeth lost increased. Among the periodontal severity score 2 individuals, the proportion of dogs with 0 tooth loss was significantly higher than those with 11 to 20 teeth loss and those with 21 or more teeth loss. The number of dogs with periodontal severity score 4 increased with the number of missing teeth. There were no significant differences between groups except for periodontal severity score 3, where P. gulae was more frequently detected in the group with less tooth loss. The number of FimA genotypes was significantly higher in the missing tooth group with 11 to 20 missing teeth for the group in which only the C genotype was detected, and in the group with 21 or more missing teeth for the group in which all the A, B, and C genotypes were detected. The reason for the lack of significant differences in the detection of FimA genotypes in this study may be that the number of dogs in each group was insufficient due to the segmentation of the study population, and that the samples were collected from the areas with remaining teeth. Therefore, it is necessary to increase the number of cases and reexamine the relationship between the detection of P. gulae and the FimA lineage genotype and tooth loss.
In chapter 4, the correlation of preexisting disease with P. gulae detection, FimA lineage genotype, and periodontal severity was investigated. In the history of the 665 animals included in Chapter 1, mitral regurgitation (MR) was the most frequently described case (65 dogs) among the 490 animals with a stated history. The presence or absence of MR was classified based on the reported history. Periodontal severity scores, P. gulae detection, and FimA lineage genotype were as in previous chapters. The age of dogs affected by MR was significantly different from that of healthy dogs. Periodontal severity scores were higher than in healthy dogs, but there were no significant differences in either P. gulae detection or FimA lineage genotype detection status. In the present comparison, there was no correlation between periodontal status or periodontopathogens in the development of MR. This may be since there was a significant difference in the age between the onset and non-onset groups in the comparison of mitral regurgitation, the incidence of which increases with age, and that the number of n for each group was not necessarily large because each group was subdivided into smaller groups.
In this study, the time of establishment of periodontopathogens was studied in greater detail than in the past, and it was confirmed that they are established by the age of 6 years and affect periodontal status. However, the effects of periodontopathogens on certain breeds of dogs were found to vary. No correlation was found between the presence of periodontopathogens and tooth loss or MR. Since it is becoming clear that the oral microflora in humans differs depending on the living environment and specific diseases, it is suggested that other bacteria other than P. gulae or factors on the host side may be influential in individuals who had both periodontal disease and other diseases. Therefore, it is necessary to conduct more detailed analysis for each breed, to conduct further large-scale surveys of cases with specific diseases as the main complaint, to reconsider the method of wood sampling, and to study host-side factors.歯周病は歯周病原因菌の感染により生じる口腔内の炎症性疾患で、成犬の約80%が発症すると言われている。歯周病の進行は歯周溝の形成、歯周病原性細菌の定着そして歯肉炎の発生が端緒となり、歯肉炎が慢性化することで炎症部位が拡大し、歯肉ならびに歯周溝内に不可逆的な歯周ポケットが形成される。その結果、歯牙の喪失や歯槽骨の融解につながり、慢性の歯周病は口腔内に留まらず直接的・間接的に他の全身疾患との関連する可能性が示唆されている。
ヒトでは、Porphyromonas gingivalis、Treponema denticola、Tannerella forsythensisと言われるRed Complexに分類される細菌が歯周病原因菌として高い病原性を有する事が知られているが、イヌでもPorphyromonas gingivalisの近縁種であるPorphylomonas gulae（以下、P. gulae）が歯周病進行に重要な役割を示すことが明らかになりつつある。P. gulaeの病原因子の一つに、41kDaのタンパク質が重合した糸状構造体であるFimAがあり、A、B、Cの3種類の遺伝子型（以下FimA線毛遺伝子型）に分類できる。中でもC型は病原性が高く、重度の歯周病罹患犬で有意な感染が確認できている。歯周病に伴う歯槽骨の融解や歯牙の喪失は、不可逆的な変化であることから、早期発見および早期対処が必要であり、歯周病の発症時期と機序の解明が急務である。
これまでに実施されたイヌにおける歯周病の実態調査は、海外で実施されたものが多く、主に中～大型犬を対象としている事から、小型犬が主体となる日本の実態に当てはめる事が難しい。その方法も人間の疫学調査と比較すると不十分なものが多く、Red Complexに該当する菌は、偏性嫌気性である事から単離培養の困難さも疫学調査が難しかった要因である。近年では、ポリメラーゼ連鎖反応（以下PCR法）を用いた、感度の高い検出法が確立されている。
そこで本研究は、日本の現状に合致した小型犬を対象とした大規模調査をより感度の高い方法で実施する事を目的とした。その際、イヌでの歯周病との関連が示唆されるP. gulaeに着目し、その定着時期、FimA線毛遺伝子型の保有状況および歯周重症度との関連、既存疾患と歯周重症度・P. gulaeの発現状況・FimA線毛遺伝子型の保有状況の関連について調査を実施した。
本研究では、国内にある77の動物病院に2015年から2022年の間に来院した小型犬665頭を対象とした。歯と歯肉の境界からマイクロブラシを用いて採材した歯垢サンプルからDNAを抽出し、P. gulaeの検出およびFimA線毛遺伝子型をPCR法によって決定した。FimA線毛遺伝子型は非検出、A型単独、B型単独、C型単独、A型およびB型、A型およびC型、B型およびC型、A型とB型およびC型の全てが検出された8つの群に分類した。歯周重症度はスコア1～4に分類し、スコアが低い順に歯周病無し、軽度、中等度、重度と定義した。
第1章では、体重10kg以下のイヌの各年齢におけるP. gulaeの検出、FimA線毛遺伝子型および歯周重症度との相関を調査した。その結果、P. gulaeは1歳齢以降で665頭中554頭（81.8%）に検出された。歯周重症度スコアは0歳齢および1歳齢では軽度を表すスコア2以下、1～5歳齢までは症状がやや進行し軽度と中等度の間である平均2.5以下であった。6歳齢以降では14歳齢および17歳齢を除いて平均が2.5以上3.0未満に収まったことから、6歳になると症状の進行が緩やかになることが示唆された。FimA線毛遺伝子型はA型が単独検出される割合以外は全ての組合わせが20%以下であり、年齢の上昇に伴い各線毛遺伝子型の検出率は単独・複数型に関係なく有意に上昇した。P. gulae非検出群に対してB型単独、C型単独群が歯周重症度スコアが有意に高かった。P. gulae非検出群とA型・B型・C型を含む群との比較、単独検出・複数検出・3種類検出群との歯周重症度スコアの比較においても有意差が見られた。P. gulae非検出群は年齢の上昇に伴い有意に減少する一方、FimA線毛遺伝子型が検出される割合と歯周重症度スコアの平均値はいずれも年齢が上昇するにつれて上昇し、高い相関性が認められた。このことから体重10kg以下のイヌにおいて1歳齢以上でP. gulaeの検出が認められ、また同菌の定着状況を確認するために6歳齢以降までの定期的な検査を行う必要がある事が示唆された。
第2章では、品種の違いによるP. gulaeの検出、FimA線毛遺伝子型および歯周重症度との相関について解析した。特に日本での飼育頭数が多い、トイプードル、ダックスフント、チワワに着目して解析した。トイプードル226頭、ダックスフント192頭、チワワ76頭であった。解析の結果、歯周病重症度1の個体は全体の5%であった。歯周重症度スコアはダックスフントが最も高く、トイプードルとの間に有意差が見られた。チワワではFimA線毛遺伝子型B型が単独で検出された群とP. gulae非検出群との間に有意差が見られた。トイプードルではP. gulaeのFimA線毛遺伝子型の検出種類が増えるほど歯周重症度スコアが上昇し、FimA線毛遺伝子型A、B、C全ての型が検出される場合はP. gulae非検出群に比べて歯周重症度スコアが有意に増加した。ダックスフントではP. gulaeの検出およびFimA線毛遺伝子型と歯周重症度スコアには相関性が見られなかった。これらの結果により、品種によって歯周病の悪化状態とP. gulaeの検出状況に差が見られることが分かった。今回は体重10kg以下の小型犬かつ日本国内で著名な品種という分類で解析を行った。チワワは上顎の歯並びが他の品種とは異なる短頭種に分類されることもある。一方でダックスフントのように上顎が長く歯並びに影響が少ない品種もある。今後は小型犬における品種だけでなく、解剖学的な特徴に着目して歯周病を研究する必要があるかもしれない。
第3章では、僧帽弁閉鎖不全症の既往歴を持つイヌおよび歯牙を喪失したイヌについて、P. gulaeの検出、FimA線毛遺伝子型および歯周重症度との相関について解析した。
ヒトでは歯周病原性細菌が弁膜に到達し感染性心内膜炎を起こすことで僧帽弁閉鎖不全症に進行することが報告されている。本研究では前章までの665頭を含む1710頭まで母集団を増やし、そのうちトイプードル385頭、ダックスフンド273頭、チワワ135頭の8歳～15歳齢の範囲で僧帽弁閉鎖不全症とP. gulaeの検出および歯周重症度スコアの間の相関性を解析した。僧帽弁閉鎖不全症の有無については既往歴の申告をもとに分類した。その結果、解析を行った3品種における僧帽弁閉鎖不全症の有病率とP. gulaeの保有率との間には有意差は見られなかった。歯周重症度スコアとの関連についてトイプードルでは歯周重症度スコア3以上の群は2以下の群と比べて僧帽弁閉鎖不全症の有病率が有意に高かった。この結果は、イヌの僧帽弁閉鎖不全症の発症にはP. gulaeの関与は低いものの、品種によっては歯周状態が影響を与えることを示唆した。ヒトではP. gulaeの近縁種であるP. gingivalisをはじめとした歯周病原性細菌が引き起こす口腔環境の問題が、僧帽弁閉鎖不全症といった循環器系の疾患だけでなく糖尿病などの様々な全身疾患にも関与していることが報告されている。今後はイヌにおいても全身疾患との関連を検討する。
歯牙の喪失については、用いた665頭のうち残存歯数の記録がある188頭について喪失本数0本、1～10本、11～20本、21本以上の群に分類した。各群の個体数はそれぞれ74頭、69頭、24頭、21頭であった。これらの個体の歯周重症度スコアと歯牙喪失との関連について解析した結果、歯周重症度スコア3の個体では有意差はつかなかったものの、重症度スコア1、2、4のいずれにおいても歯牙喪失が無い群もしくは1～10本の喪失群と比べて11～20本及び21本以上の喪失群では有意に多かった。このことから歯周重症度スコアは歯牙の喪失と深い関係があることが示唆された。
FimA線毛遺伝子型と歯牙喪失との関連について、C型単独検出群では11～20本の歯牙欠損群が有意に増加し、A・B・C型の全てが検出された群では歯牙喪失20本以下の3群と比べて21本以上の歯牙喪失群が有意に多かった。このことから、歯牙喪失にはC型の影響が強く、また3つの線毛遺伝子型が揃うことでさらにその影響が強くなることが考えられた。
本研究では歯が残存している部位からP. gulaeの検出を行ったため歯牙喪失との相関を見出せなかった可能性がある。今後は歯牙を喪失した部位からの採材やP. gulaeが検出された歯牙が実際に喪失するのかといった研究などを通じてP. gulaeが歯牙喪失に与える影響の調査が必要だろう。
本研究では歯周病原性細菌の代表的細菌であるP. gulaeに注目して、小型犬におけるその定着時期について詳細に研究を行い、6歳齢頃までに定着し歯周状態にも影響を及ぼすことが確認できた。また、品種によってP. gulaeの存在と歯周病重症度に差が見られることが判明した。P. gulaeの存在と歯牙喪失および僧帽弁閉鎖不全症については相関性が認められなかった。今後は他の疾患とP. gulaeの存在との関連を調べる。doctoral thesi