Azabu University Science Information Repository / 麻布大学学術情報リポジトリ
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⽝のがん関連線維芽細胞における CXCL12/CXCR4軸によるT 細胞動態の調節
Get PDF麻布大学博士（獣医学）Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a heterogeneous population of stromal cells originating from various sources such as resident fibroblasts, stellate cells, mesenchymal stem cells, and endothelial cells, play a crucial role in remodeling the tumor microenvironment (TME). Recent studies have indicated that CAFs may suppress T cell-mediated anti-tumor immunity by forming a dense extracellular matrix and secreting immunomodulatory factors such as CXCL12 and TGF-β. These factors can physically restrict T cell infiltration into tumor tissues and alter T cell migration dynamics, thereby creating an immune-excluded TME.
Although canine CAFs have been reported to share functional similarities with human CAFs, limited information is available on their immunomodulatory roles in veterinary medicine, especially their effects on T cells.
This study aimed to elucidate the effects of canine CAFs on T cell migration via the CXCL12/CXCR4 axis and to investigate the regulatory role of TGF-β1 in this context.
In Chapter 1, CXCL12 expression was observed in the tumor stroma of various canine epithelial tumors, and some cases exhibited a higher number of stromal T cells compared to intratumoral T cells. Additionally, serum CXCL12 levels and the proportion of CXCR4-positive peripheral blood T cells were significantly elevated in tumor-bearing dogs. CAFs isolated from tumor tissues secreted more CXCL12 compared to normal fibroblasts (NFs) from healthy skin.
Chapter 2 demonstrated that CXCL12 secreted by CAFs facilitated the migration of CXCR4-positive canine T cells toward CAFs in vitro. This chemotactic effect was observed even in the presence of tumor cells, suggesting that CAFs play a dominant role in gathering T cells via the CXCL12/CXCR4 axis.
In Chapter 3, canine CAFs were found to secrete higher levels of TGF-β1 compared to NFs, and this TGF-β1 secretion was positively correlated with CXCL12 production. The inhibition of TGF-β1 signaling led to a reduction in CXCL12 secretion, suggesting that TGF-β1 regulates CAF activation and their production of CXCL12.
Chapter 4 investigated the ability of TGF-β1 to induce a CAF-like phenotype in NFs. Stimulation with recombinant human TGF-β1 enhanced CXCL12 secretion in NFs, mimicking CAF-like behavior. Conditioned media from CAFs showed partial effects, though results varied, suggesting that further refinement of experimental models—such as co-culture of CAFs and NFs or spheroid systems—may be required to clarify these mechanisms.
Overall, these findings suggest that canine CAFs modulate T cell migration through the CXCL12/CXCR4 axis under the regulation of TGF-β1 signaling. Given that blockade of the CXCL12/CXCR4 axis has been shown to enhance T cell infiltration in tumors, these results highlight the potential of targeting CAF-mediated immune suppression to improve cancer immunotherapy. A deeper understanding of this regulatory axis may contribute to the development of novel therapeutic strategies in veterinary and comparative oncology.背景
獣医療の進歩により犬の平均寿命が大幅に延長したことに伴い、加齢に関連した疾患の発症率が上昇しており、悪性腫瘍は高齢犬における主要な死因となっている。外科手術、化学療法、放射線照射が標準的な治療である一方、転移・浸潤を伴う進行した固形がんに対しては、依然として有効な治療法が乏しい。
この背景として腫瘍を構築するがん微小環境の存在が影響していると考えられ、なかでもがん関連線維芽細胞 (cancer-associated fibroblasts; CAFs)はその主要な構成要素である。人においては CAFsがケモカインやサイトカインなどの液性因子を介し、抗腫瘍免疫の要であるT細胞の機能を抑制することが報告されている。さらに、CAFsが豊富な腫瘍では T細胞の腫瘍中心部への浸潤が抑制される可能性が提言されており、T細胞動態における CAFsの役割が注目されている。C-X-C motif chemokine ligand 12 (CXCL12) は CAFs が分泌するケモカインの1つであり、T細胞膜上のC-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4) と結合して細胞遊走を誘導する。さらに、このCXCL12/CXCR4軸の調節には、同じく CAFs由来のサイトカインであるtransforming growth factor-beta (TGF-β) が関与することが示唆されている。しかし、犬における CAFsがT細胞に与える影響、特にCXCL12/CXCR4軸を介したT細胞の遊走制御機構については、未だ解明されていない。
本研究では、犬由来CAFsがCXCL12/CXCR4軸を介してT細胞の遊走動態に及ぼす影響を評価するとともに、TGF-βを介したこの経路の制御機構を解明することで、犬のがん微小環境における免疫抑制機序の一部を明らかにすることを目的とした。
第1章：担がん犬におけるCXCL12/CXCR4発現の解析
本章では上皮系悪性腫瘍を有する犬におけるCXCL12/CXCR4軸の発現状況を把握するため、以下の解析を実施した。まず免疫組織化学染色を用いてがん間質におけるCXCL12の発現とT細胞の分布を評価し、次いで担がん犬と健常犬の血清CXCL12濃度およびT細胞膜上のCXCR4発現率を比較した。さらに、腫瘍組織および正常皮膚組織からCAFsおよび正常線維芽細胞 (normal fibroblasts; NFs) を分離し、CXCL12分泌量をELISAにより比較した。
犬の上皮系悪性腫瘍9種70組織の解析により、8種の上皮系悪性腫瘍でCXCL12 陽性が確認された。また、CXCL12陽性症例の一部において、がん間質領域にT細胞の集簇が認められた。上皮系悪性腫瘍に罹患した24症例の末梢血T細胞におけるCXCR4発現率は、健常犬と比較して有意に高かった。18症例からCAFsの分離に成功し、十分な細胞数が得られた10症例のCAFsを本実験に使用した。分離した細胞は間葉系細胞のマーカーであるvimentin陽性かつ上皮系細胞のマーカーであるcytokeratin陰性だった。CAFsは NFsと比較してα-SMAおよびCXCL12の発現が強い傾向が認められた。さらに、CAFs培養上清 (CAFs-CM) 中のCXCL12 濃度はNFsよりも有意に高値を示した。
以上の結果より、犬においてもがん間質にCXCL12が発現し、犬由来CAFsがCXCL12を分泌すること、さらに担がん犬においてCXCR4陽性T細胞が存在することが明らかになった。
第2章：CAFs由来CXCL12が T細胞遊走に与える影響の評価
本章では、CXCR4アンタゴニストであるAMD3100を用いて、犬由来CAFsがCXCL12/CXCR4 軸を介してT細胞の遊走を促進するかをBoyden chamber assay で検討した。加えて、腫瘍細胞株との三者共培養系を用いて、CAFsががん細胞の存在下でT細胞動態に与える影響を評価した。
その結果、CAFs-CMによりCD8+ T細胞の遊走が有意に増加し、AMD3100処理によりその遊走は抑制された。三者共培養系においては犬乳腺癌細胞株との共培養下で、CAFs上に接着するT細胞の密度がAMD3100によって有意に減少した。
これらの結果から、犬由来CAFsがCXCL12/CXCR4軸を介してT細胞の遊走動態に寄与する可能性が示唆された。
第3章：CAFs由来TGF-βが CXCL12/CXCR4軸に与える影響の評価
TGF-βは線維芽細胞を含むさまざまな細胞から分泌され、腫瘍進行や免疫抑制に関与するサイトカインである。人における研究ではCAFsはTGF-βを分泌し、それによって自己や周囲の線維芽細胞にCXCL12分泌を促進させる可能性が示されている。また、TGF-βはT細胞上のCXCR4発現を高めることが報告されている。
そこで本章では、犬由来CAFsがTGF-βを介してCXCL12/CXCR4軸に与える影響を評価するために以下の検討を行なった。まず、TGF-β分泌量をELISAで測定し、TGF-β阻害剤であるSB431542を用いた際のCXCL12分泌およびCXCR4発現への影響を評価した。
その結果、CAFs-CM中のTGF-β濃度はNFsよりも有意に高く、SB431542の添加によりCAFsのCXCL12分泌は有意に減少することが明らかとなった。さらに、TGF-βやCAFs-CMで培養したT細胞ではCXCR4発現率は有意に増加し、SB431542によりこの増加が抑制され た。
これらの結果から、犬CAFsはTGF-βを介して、がん微小環境におけるCXCL12/CXCR4軸を制御している可能性が示唆された。
第4章：CAFs由来TGF-βがNFsに与える影響の評価
人の創傷治癒において、TGF-βは線維芽細胞の活性化に寄与することが知られている。近年、CAFsが TGF-βを介して周囲の正常線維芽細胞を刺激しCAFs様の活性化細胞への変化を誘導することにより、T細胞の機能抑制に関与する可能性が示唆されている。
そこで犬においても同様の現象が認められるかを調べるため、本章ではTGF-βやCAFs-CMが犬由来のNFsに与える影響、特に形態変化及びCXCL12分泌への影響を評価した。
TGF-β処理によりNFsはCAFsに類似した細長い細胞形態へと変化し、CXCL12分泌量は有意に上昇した。一方、CAFs-CMで培養したNFsでは、免疫細胞化学染色にてCXCL12陽性細胞は確認されたものの、分泌量の有意な増加は認められなかった。一貫した結果が得られなかった要因として、
NFsの個体差が影響した可能性や、CAFs-CM中にはTGF-βに加えて多様な液性因子が含まれておりTGF-β単独の影響を明確に評価することが困難であった可能性が考えられた。
総括
本研究により、犬由来のCAFsはTGF-βを介してCXCL12/CXCR4軸を制御し、T細胞の動態に影響を及ぼす可能性があることが示唆された。人医療においては、この軸を標的とした治療戦略によりT細胞の腫瘍浸潤を促進し、がん免疫応答を高める試みが進められており、本研究の知見をもとに獣医領域への応用も期待される。本成果は犬のがん微小環境における免疫抑制機構の理解を深めるとともに、がん免疫療法を含む新規治療戦略の構築の一助となることが期待される。doctoral thesi
Detection of Borrelia DNA in ticks collected from large wild animals in Sagamihara, Kanagawa, Japan
Get PDF野生動物から採集したマダニが保有する病原体をPCRにて調査を実施した。336匹（42群、6–10匹／群） のうち、1群から得られたバンドの塩基配列は、Borrelia sp.HMと97％およびBorrelia miyamotoiと93％の高い相同性が確認された。このボレリアの病原性は不明であるが、新興回帰熱と遺伝子的に近いことから、注意が必要と考える。Pathogens in the ticks collected from wild animals were investigated by PCR method. Among the 336 ticks (42 groups, 6–10 ticks each), 1 group was positive in Borrelia and the sequence of the PCR product was determined to be 97% and 93% identical with Borrelia sp. HM and Borrelia miyamotoi, respectively. Although the pathogenicity of this Borrelia is unclear, much attention should be paid because of genetic similarity to Borrelia miyamotoi disease.P(論文)原著論文application/pdfORIGINAL ARTICLEdepartmental bulletin pape
担癌犬における5-FU製剤であるTS-1の抗腫瘍効果についての研究
Get PDF麻布大学博士（獣医学）フルオロピリミジンである5-フルオロウラシル（5-FU）は、1950年代半ばに合成された化学療法剤である。現在、5-FUは最も広く使用されている抗がん剤の一つであり、ヒトの消化器悪性腫瘍、乳がん、頭頸部がん、卵巣がんなど幅広い固形腫瘍に対して効果が示されている。獣医腫瘍学において5-FUの局所投与の有効例は散見されるが、5-FUの全身投与は静脈投与が主であり、その煩雑さと毒性の高さから使用報告は限られているのが現状である。また、5-FUの誤飲は中毒症の発症と関連しており、犬では用量依存性の骨髄抑制、消化器毒性、神経毒性を引き起こす。一方で、猫では中枢神経系に重篤な毒性を示すため禁忌とされている。
TS-1は、5-FUのプロドラッグであるテガフール、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ阻害剤であるギメラシル、オロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤であるオテラシルの3つの有効成分を固定用量で組み合わせた経口薬である。テガフールは体内で5-FUに変換され、ギメラシルは5-FUの分解を防ぐ役割を果たし、オテラシルは腸管における5-FUの活性を低下させることで正常な消化管粘膜への毒性を最小限に抑える。TS-1は1999年に日本国内で販売され、2011年にはヨーロッパでもTeysunoという名称で発売されている。
TS-1の毒性については、健康なビーグル犬を対象とした研究で評価されており、高用量では眼、リンパ組織、生殖器官に毒性を示し、生理的な劣化や免疫機能不全によって死亡に至る可能性があるとされている。ヒトにおいては、TS-1は胃がん、頭頸部がん、大腸がん、非小細胞肺がん、乳がん、膵臓がん、胆道がんの治療に承認されている。犬においても5-FUが腫瘍に対して有効であるとの報告があることから、TS-1も有効であると仮説を立てた。しかしながら、担癌犬におけるTS-1の投与量は未だ明らかではない。
本研究の目的は、腫瘍を有する犬に対するTS-1の有効な投与量を決定することである。
第1章
このパイロットスタディでは、犬のがん治療におけるテガフール/ギメラシル/オテラシルの安全性を評価した。2014年10月から2020年9月の間に麻布大学附属動物病院に来院した症例を対象に本研究を実施した。すべての動物は悪性固形腫瘍の腫瘍切除を受けた後、再発腫瘍が認められていた。 これらの犬に対して、補助療法としてTS-1を投与した。犬種、性別、年齢、体重、診断、治療歴、TS-1投与開始時のTNM分類、用量、投与期間、中止理由、併用抗がん薬の投与、腫瘍反応、ならびに副作用に関するデータを医療記録から取得した。
本研究には、悪性固形腫瘍を有する合計9頭（延べ11頭）の犬が含まれている。TS-1の投与量（平均±標準偏差）は2.3±0.5mg/kg（1.5～3.3mg/kg）であり、1週間に隔日（月・水・金）で1日2回に分けて経口投与した。TS-1の投与期間の中央値は104日であった。投与中止の理由としては、腫瘍の進行（n=6）および有害事象による生活の質（QOL）の低下（n=3）が挙げられた。治療効果として、部分反応（PR）が1頭、安定病変（SD）が1頭、進行病変（PD）が6頭で観察され、3頭は評価不能（NA）であった。評価不能とされた3頭のうち1頭では発作が49日間制御され、もう1頭では症状が4か月間制御されたことから、TS-1の有効性が示唆された。したがって、2頭の犬で効果が確認され、2頭で効果が示唆された。
有害事象は7頭の犬で認められた。これには、強膜の色素沈着（n=6）、嗅覚喪失に関連する食欲不振（n= 2）、皮膚の色素沈着（n=3）、角膜の色素沈着（n=2）、下痢（n=1）、および総ビリルビンの増加（n=1）が含まれていた。ほとんどの有害事象はグレード2（食欲不振、強膜の色素沈着、皮膚の色素沈着）であり、3頭では食欲不振の発症後に飼い主がTS-1の中止を決定した。有害事象は中止後に解消されたが、1頭では半量（0.7mg/kg）で460日間投与を継続した。
担癌犬に対するTS-1の投与では、骨髄毒性が認められず、眼、皮膚、消化器毒性といった分かりやすい副作用が主であった。また、TS-1を週3回（月・水・金）、2.0mg/kg（1日量を2分割）で投与するスケジュールは忍容性が高いことが示された。一部の犬では抗腫瘍効果も確認されており、この薬剤は上皮系悪性固形腫瘍に対する有望な治療オプションとなり得ると考えられた。
第2章
併用化学療法は、2種類以上の治療薬を組み合わせる治療法であり、がん治療の中心的なアプローチとなっている。この方法は、薬剤耐性の進行を遅らせるとともに、腫瘍の増殖や転移能の抑制、有糸分裂活性細胞の停止、がん幹細胞集団の減少、がん細胞のアポトーシス誘導など、抗がん治療において多くの利点を提供する。獣医領域で固形腫瘍に対して併用化学療法が用いられることは少なく、使用される薬剤としてはカルボプラチン、ドキソルビシン、5-FU、リン酸トセラニブなどが挙げられる。
この目的は、TS-1と他の抗がん作用を持つリン酸トセラニブとの併用治療が可能であるかを検討することである。
前臨床試験および臨床試験では、3+3コホート研究を実施した。前臨床試験では、研究目的で飼育された7歳の健康な雌ビーグル犬3頭を使用した。TS-1とリン酸トセラニブを1か月間投与し、その後1か月間休薬するサイクルを繰り返した。前臨床試験の前には、ビーグル犬に対して身体検査、全血球数（CBC）、および血液化学検査を実施した。身体検査は毎日行い、CBCと血液化学検査は2週間間隔で実施した。
臨床試験では、2022年9月から2023年9月の間に麻布大学附属動物病院を受診した鼻腔内腫瘍を有する犬を対象とした。この臨床試験には、固形腫瘍と診断され、第一選択治療（RT）を受けている犬が含まれた。コホート実施中に腫瘍増大（PD）が認められた患者は、次のコホートに進む前に再照射を受けた。腫瘍反応については、放射線治療後3か月以上経過した症例を対象とし、TS-1およびトセラニブリン酸塩の有効性を評価した。特に比較的高用量のTS-1（1.5および2.0mg/kg）を投与してその効果を検討した。
前臨床試験では、リン酸トセラニブと組み合わせたTS-1を4つの計画用量（0.5、1.0、1.5、および2.0mg/kg）で週3回投与する1か月間のスケジュールが遂行可能であることが確認された。どの用量でも、身体検査、CBC、または血液化学検査において有害事象（AE）は観察されなかった。この結果から、正常なビーグル犬においてTS-1（2.0mg/kg）とリン酸トセラニブ（2.4mg/kg）を週3回投与するスケジュールが最適であると判断された。
臨床試験には鼻腔腫瘍の犬（合計13頭が登録）が参加した。治療歴を調査したところ、すべての犬が放射線療法を受けていた。TS-1併用療法前のリン酸トセラニブ投与日数の中央値は43日であり、その後5例ではリン酸トセラニブに反応しなかったため、TS-1が追加で投与された。他の3頭は、リン酸トセラニブとTS-1の同時投与を開始した。この8頭の犬のうち、3頭は1回のTS-1用量増加を受け、1頭は2回の増量が行われた。また、増量を行った犬4頭は、コホート終了時に再照射を受けた。リン酸トセラニブの平均投与量は2.5mg/kgであり、投与期間の中央値は112日であった。投与中止の理由は腫瘍進行（PD）（n=1）または死亡（n=4：腫瘍関連［n=3］、その他［n=1］）であり、その他4例は用量漸増のために次のコホートに移行した。
AEは、結膜および角膜における症状（n = 2）、下痢（n = 1）、食欲不振（n = 1）、嘔吐（n = 1）、好中球減少症（n=1）、ALT値の上昇（n=2）、T-Bil値の上昇（n=1）などの胃腸症状が観察されたが、特定されたAEはいずれもADL（生活日常活動）を損なうことなく、生活の質を著しく低下させるものではなかった。結果として、腫瘍を有する犬にTS-1とリン酸トセラニブを用いて4つの計画用量（0.5、1.0、1.5、2.0mg/kg）で週3回1か月間投与する3+3コホート研究を成功裏に完了することができた。比較的高用量のTS-1（1.5および2.0mg/kg）の治療期間の中央値は103日であり、これらの犬は併用療法によく耐えた。
腫瘍反応は1頭の犬で評価され、同犬は放射線照射およびリン酸トセラニブ投与を受け、再照射後にTS-1 0.5mg/kgから開始して段階的に1.0mg/kg、最終的には2.0mg/kgまで増量された。この結果、TS-1の用量増加後3か月で腫瘍の縮小が観察された。なお、放射線療法を併用したにもかかわらず、重篤なAEは認められなかった。
これらのことから、本研究は鼻腔内腫瘍を有する犬において、TS-1 2.0mg/kgおよびリン酸トセラニブ2.4mg/kgを週3回1か月以上安全に継続できる可能性を示唆している。
以上の研究結果から、TS-1を担癌犬に対して単独で、またはリン酸トセラニブと併用して投与した際の有害事象が明らかとなり、適切な投与量を決定するとともに、一定の抗腫瘍効果を得られることが示唆された。doctoral thesi
Studies on the susceptibility of chickens and mallards to infection with high pathogenicity avian influenza viruses
Get PDF麻布大学博士（獣医学）The H5 subtype of high pathogenicity avian influenza (HPAI) viruses (HPAIVs) derived from A/goose/Guangdong/1/1996 have spread globally and circulated in wild and domestic birds for a quarter of a century. In Japan, HPAIV caused outbreaks in poultry for five consecutive seasons, from the 2020/21 season (autumn 2020 to spring 2021) to the 2024/25 season. In the event of an outbreak in poultry, immediate and appropriate initial response measures are taken in accordance with the Act on Domestic Animal Infectious Diseases Control, such as the slaughter of poultry on the premises and disinfection of contaminated areas, to stamp out the disease. Chickens are the most commonly reared poultry species in Japan, and the damage caused by HPAI in chickens is significant. In Chapter 1, I investigated the susceptibility of chickens to infection with HPAIVs recently isolated in Japan and determined the virological characteristics of HPAIVs that strongly influence the prevalence of HPAIVs in poultry. Migratory water birds are considered to be carriers of HPAIVs. Mallards are often observed in Japan during winter, and HPAIV-infected mallards are known to often shed virus asymptomatically. In Chapters 2 and 3, I investigated the susceptibility of mallards to infection with HPAIVs recently isolated in Japan and evaluated whether they are potential carriers of the viruses. All animal experiments were conducted in Biosafety Level 3 facilities at the National Institute of Animal Health, Japan, in compliance with the institutional protocol reviewed and approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of the National Agriculture and Food Research Organization. The approval number of the protocols are as follows: Chapter 1, 20-066, 20-078, 20-084, 21-001, 21-026; Chapters 2 and 3, R4-I002-NIAH, R4-I002-NIAH-2, R4-I002-NIAH-3.
Chapter 1: The infectivity, virulence, and transmissibility of HPAIVs isolated in Japan during the 2020/21 season in chickens
During the 2020/21 season, H5N8 HPAIVs caused 52 HPAI outbreaks on poultry premises. These viruses were divided into five distinct genotypes (E1, E2, E3, E5, and E7) based on the constellations of all gene segments, and the prevalence of HPAIVs in poultry differed among genotypes. To investigate the cause of these outbreaks, chickens were experimentally infected with five representative strains of each genotype, and the infectivity, virulence, and transmissibility of HPAIVs in chickens were studied. First, to evaluate the infectivity and virulence, 4-week-old chickens were intranasally inoculated with the viruses at several doses ranging from 102.0 to 106.0 50% egg infectious dose (EID50) and the viral doses required for infection, lethality, and viral shedding were examined. The 50% chicken infectious dose (CID50) differed by up to 101.88 times among the five strains, and the titer was lowest for the E3 strain (102.75 EID50), followed by that of the E2 strain (103.50 EID50). The mean death time of chickens inoculated with each virus at a dose of 106 EID50 differed by up to 2.43 days post-inoculation (dpi), and the titer of the E2 strain (3.20 dpi) was the lowest, followed by that of the E3 strain (3.17 dpi). These results indicated that the infectivity and virulence of the E2 and E3 strains were higher than those of the other strains. To evaluate the transmissibility of the viruses in the chicken population, one chicken was intranasally inoculated with the virus at a dose of 106 EID50 and six naïve chickens were cohabited with the inoculated chicken. The E2, E3, and E5 strains transmitted to naïve chickens with high efficiency (>80%), whereas the other strains showed low transmission efficiency (<20%). Associating these findings with the prevalence of HPAIVs in poultry, the E2 and E3 genotypes, which have higher infectivity, virulence, and transmissibility in chickens than the other three genotypes, have caused a large number of outbreaks on poultry premises over a wide area in Japan. In contrast, poultry outbreaks caused by the three low-infectious genotypes, E1, E5, and E7, were limited in number or area, regardless of other virological characteristics. Among the three virological characteristics of HPAIVs analyzed in this study, the infectivity of HPAIVs in chickens may have strongly influenced the prevalence of HPAIVs in poultry in Japan during this season.
Chapter 2: The infectivity and virulence of HPAIVs isolated in Japan during the 2021/22 season in mallards
HPAIV-infected ducks often shed virus asymptomatically. Migratory waterfowl, such as mallards, which are asymptomatically infected with HPAIVs may act as global carriers of the viruses. During the 2021/22 season, H5N1 and H5N8 HPAIVs caused 25 HPAI outbreaks on poultry premises. Through phylogenetic analysis of the hemagglutinin (HA) genes, these viruses were classified into three groups; G2a, G2b, and G2d (the E2 genotype referred to in Chapter 1 was classified in the G2a group). The study of Chapter 2 aimed to determine whether mallards without immunity to HPAIVs can be asymptomatically infected with viruses of these HA groups and carry them over long distances. Naïve mallards were inoculated with three representative strains of each HA group, and the infectivity and virulence of these strains in mallards were studied. Fertilized mallard eggs were purchased from a mallard farm and the mallards were raised until they were 12 weeks old. Serum samples were collected from all mallards before use in animal experiments to ensure that they were serologically negative for influenza A virus. Mallards were intranasally inoculated with the viruses at several doses ranging from 102.0 to 106.0 EID50. The 50% mallard infectious dose (MID50) for the three strains ranged from 102.50 to 103.75 EID50. The corresponding MID50 values were lower than the CID50 values previously reported, indicating higher infectivity of these strains in mallards than in chickens. All mallards infected with the G2a and G2b strains survived and most showed no clinical signs. Some mallards infected with the G2d strain died, but some mallards were asymptomatic, except when inoculated with a high viral dose (106 EID50). Mallards inoculated with each virus at a dose of 106 EID50 shed enough virus to infect others, exceeding the MID50 and CID50 values. This study showed that HPAIVs recently isolated in Japan were highly infectious to mallards, and that most infected mallards shed virus without clinical signs. These results suggest that mallards without immunity to HPAIVs may be long-distance carriers of the HPAIVs recently isolated in Japan.
Chapter 3: Long-term immune responses induced in mallards by infection with HPAIVs isolated in Japan during the 2021/22 season
In Chapter 2, most mallards infected with HPAIVs isolated in Japan during the 2021/22 season showed no clinical signs and survived. HA is a key antigen-inducing antibody in the humoral immune response to AIVs, and the immune response induced by previous AIV infections has been reported to affect subsequent infections. During the 2021/22 season, the G2b group predominated in the first half of the season and the G2d group predominated in the second half of the season. These facts suggest the possibility that the wild mallards pre-infected with viruses of the G2b group must have been exposed to viruses of the G2d group. The question in Chapter 3 is whether individual wild mallards are repeatedly infected with HPAIVs and act as HPAIV carriers multiple times within a season. Twelve-week-old naïve mallards were inoculated with the three strains used in the experiment of Chapter 2 at low viral doses (10 MID50; dose ranged from 103.50 to 104.75 EID50), and the antibody dynamics in the sera were evaluated for 84 days. To test the efficacy of immunity at 84 dpi following the initial inoculation, the mallards were intranasally challenged with homologous or heterologous strains at low doses (10 MID50). Neutralizing (NT) antibody titers against homologous antigens in the three groups peaked between 28 and 56 dpi. The median maximum NT antibody titer in the three groups ranged from 269 to 806, and the median NT antibody titer at 84 dpi ranged from 106 to 395. In the homologous challenge experiments, all mallards were fully protected from the disease based on viral shedding, and their serum antibody titers were not markedly enhanced by the challenge, except for one mallard. This protection was also observed in the heterologous challenge, in which none of the mallards previously infected with the G2b strain shed virus after challenge with the G2d strain. This study demonstrated that a single low-dose HPAIV infection could induce efficacious immunity against a subsequent infection even after 84 days. These findings suggest that repeated infections with homologous and heterologous HPAIV strains do not occur frequently in individual wild mallards within a season, and that the frequency with which they act as carriers may be limited.
These findings can be used to improve surveillance systems for wild birds which are mainly conducted to find HPAIVs. As described in Chapter 2, all mallards infected with the G2a strain survived and most did not shed viruses from the cloaca. The detection of HPAIVs that are not lethal to wild birds and are not excreted from the cloaca of infected birds may be difficult by testing only samples collected from dead birds and fecal samples of water birds. According to the data on serum antibody dynamics described in Chapter 3, it is possible to investigate the infection history by detecting antibodies in serum samples collected from birds infected with the virus at least two to 12 weeks prior. However, it is difficult to identify the strain that caused the infection because some HPAIV strains belonging to different HA groups show cross-reactivity. In the experiments described in Chapters 2 and 3, all infected mallards shed high titers of viruses from their tracheas. The virus in the trachea is excreted into the environment, such as in lakes, via foraging and other activities. The detection of viral genes in environmental water is thought to be a useful method for understanding the prevalence of HPAIVs in wild birds.近年、世界中の家きんや野鳥において高病原性鳥インフルエンザウイルス（HPAIV）が大流行しており、我が国では2020/21 シーズン（2020 年秋から2021年春まで）から2024/25シーズンまで5シーズン連続して家きん飼養施設で高病原性鳥インフルエンザ（HPAI）が発生している。家きん飼養施設でHPAIが発生した場合、家畜伝染病予防法に従った迅速な防疫対応により施設内の家きんは速やかに淘汰される。HPAIの発生が家きん産業に及ぼす被害は甚大であり、我が国では家きんの中でも飼養羽数が多いニワトリにおいて特に被害が大きい。そこで本論文の第1章では、近年に国内で分離されたHPAIVの感染に対するニワトリの感受性を感染試験により解析し、家きんにおけるHPAI 発生状況に強く影響するウイルスの特性の解明を試みた。また、HPAIV は渡り鳥により国内外に拡散されると考えられている。そこで第2章と第 3 章では日本の代表的な冬鳥であるマガモにおいて近年の国内分離株の感染に対する感受性を感染試験により解析し、マガモが近年の国内分離株のキャリアとなり得るかを評価した。全ての動物実験は農研機構病原性動物実験専門委員会の承認を得て（第1章の承認番号：第20-066号、20-078号、第20-084号、第21-001号、第21-026 号、第2章と第3章の承認番号：第R4-I002-NIAH号、第R4-I002-NIAH-2号、第R4-I002-NIAH-3号）、動物衛生研究部門のBSL3施設内で実施した。
第1章：2020/21シーズンに国内で分離された高病原性鳥インフルエンザウイルスのニワトリにおける感染性と致死性、伝播性の解析
2020/21 シーズン、国内の家きん飼養施設ではH5N8亜型のHPAIVによる52件のHPAIが発生した。起因ウイルスは全8分節の遺伝子系統解析によりE1、E2、E3、E5、E7の5つの遺伝子型に分類され、家きんにおけるHPAI発生件数や地域は遺伝子型により異なっていた。本章では、各遺伝子型に属する計5株のHPAIVのニワトリに対する感染性と致死性、ニワトリ群内における伝播性を解析した。そして、これら特性の株間の違いと実際のHPAI発生状況を照らし合わせ、どの特性が発生状況に特に影響するかを考察した。まず、4週齢のニワトリに各遺伝子型のウイルスを102～106 50%発育鶏卵感染量（50% egg infectious dose; EID50）で経鼻接種し、感染成立に必要なウイルス量と感染ニワトリの経過を解析した。その結果、E2 と E3 遺伝子型のHPAIVの50%ニワトリ感染量（50% chicken infectious dose; CID50）は特に低く、それぞれ103.50 EID50と102.75 EID50であり、5株間の差は最大で101.88倍であった。高用量である106 EID50でウイルスを接種したニワトリの平均死亡時間においてもE2とE3遺伝子型のHPAIVの値は特に短く、それぞれ接種3.17日後と3.20日後であり、5株間の差は最大で2.43日であった。これらの結果から、E2とE3遺伝子型のHPAIVの感染性と致死性は他の遺伝子型のウイルスに比べ高いことが示された。次に、106 EID50でウイルスを接種したニワトリ1羽とウイルスを接種していないニワトリ6羽を同居させ、非接種ニワトリの感染率、すなわちウイルスの伝播率を解析した。E2、E3、E5遺伝子型のウイルスの伝播率は80%以上であった一方で、E1 とE7遺伝子型のウイルスの伝播率は20%以下であった。実際のHPAI発生状況と照らし合わせると、本章においてニワトリに高い感染性を示したE2とE3遺伝子型のHPAIVは多数の発生を広い地域（東から南日本）で起こした。一方、ニワトリに高い伝播性を示したE5遺伝子型も含め、低い感染性を示したE1、E5、E7遺伝子型のHPAIVに起因する発生は件数や地域が限定的であった。これらの結果から、本章で解析したウイルスの3つの特性の中で、ニワトリに対する感染性が同シーズンの家きんにおけるHPAI発生状況に強く影響したと考えられた。
第2章：2021/22シーズンに国内で分離された高病原性鳥インフルエンザウイルスのマガモにおける感染性と致死性の解析
HPAIV に感染したカモ類は症状を示さないことが多く、マガモなどの渡り性のカモ類は感染後もウイルスを排出しながら移動することで様々な地域にHPAIVを拡散する。2021/22 シーズン、国内の家きん飼養施設では H5N1 亜型と H5N8 亜型のHPAIVによる25件のHPAIが発生し、起因ウイルスはHA遺伝子の系統解析によってG2a、G2b、G2d の3つのHAグループに分類された（第1章のE2遺伝子型はG2aグループである）。本章の目的は、HPAIVに初めて暴露されたマガモ、すなわちHPAIV に対する免疫を持たないマガモは近年の国内分離株を広域に拡散するキャリアとなり得るかを明らかにすることである。12 週齢のマガモに各 HA グループのHPAIVを102～106 EID50で経鼻接種し、感染性と致死性を解析した。試験に使用したマガモは農場より受精卵で購入し、人工的に孵化・飼育後、A型インフルエンザウイルスに対する血清抗体がないことを試験前に確認している。3株の50%マガモ感染量（50% mallard infectious dose; MID50）は 102.50～103.75 EID50であり、これは以前に報告された同株のCID50より低く、これら3株のマガモに対する感染性はニワトリに対する感染性より高いことが示された。G2aとG2bグループのHPAIVに感染したマガモは全羽生残し、ほとんどの感染マガモは無症状で経過した。一方、G2dグループのHPAIVに感染したマガモの経過は様々であり、低用量で感染したマガモの一部は無症状で経過し、高用量で感染したマガモの一部は死亡した。106 EID50のウイルスを接種したマガモの気管からはMID50と CID50の値を上回る量のウイルスが排出された。これらの結果から、HPAIV に対する免疫を持たないマガモは同シーズンの国内分離株に容易に感染し、感染後にウイルスを排出しながら移動することで広域にウイルスを拡散することが示唆された。
第3章：2021/22シーズンに国内で分離された高病原性鳥インフルエンザウイルスに対するマガモの長期的な免疫応答の解析
第2章において、2021/22シーズンのHPAIVに感染したマガモの多くは無症状で経過し、生残した。一般的に、HPAIV感染により宿主体内にはHAを主要な標的抗原とした体液性免疫が誘導される。野生のマガモは複数回HPAIVに暴露されると想定されるが、過去の感染により獲得した免疫はウイルスに再暴露された際の再感染の成立、そして再感染成立後の病態に影響する。2021/22シーズン、国内ではシーズン前半にG2bグループのHPAIVが主に流行し、後半にG2dグループのHPAIVが主に流行したことから、G2b グループの HPAIV に感染し生残した野生マガモは G2dグループの HPAIV に再び暴露されたことが想定される。第 3 章の目的はマガモがHPAIVに繰り返し感染することにより、1つのシーズン中に何度もHPAIVのキャリアとなり得るかを明らかにすることである。第2章と同じ3株を人工的に孵化・飼育したマガモに低用量（10 MID50; 103.50～104.75 EID50）で接種し、接種後84日間の血清抗体の推移を解析した後、免疫応答の有効性を同じもしくは異なる株を再接種することにより検証した。血清中の接種株に対する中和抗体価は接種28～56日後にピークとなり、3株の最高中和抗体価の中央値は268～806であった。3株の接種84日後の中和抗体価の中央値は106～395であり、接種84日後に同じ株を同じ用量で再接種したところ、全てのマガモにおいて再接種後のウイルス排出は認められず、再接種株に対する抗体価が大きく上昇したマガモも1羽のみであった。また、G2bグループのHPAIVに感染したマガモにG2dグループのHPAIVを再接種した場合においても、ウイルス排出を伴う再感染は認められなかった。これらの結果は、低用量かつ単回のウイルス接種であっても同シーズンのHPAIVはマガモに高いレベルの免疫応答を誘導することを示し、野生下においてマガモがHPAIVに繰り返し感染する頻度は高くなく、1個体が1つのシーズン中にHPAIVのキャリアとなる機会は限られている可能性を提示した。
本論文の結果は、野鳥を対象としたHPAIVのサーベイランス方法の検討に役立てることが出来る。第2章の研究結果では、感染マガモの多くは無症状で経過し、G2aグループのHPAIVに感染したマガモは総排泄腔からのウイルス排出がほぼ認められなかった。死亡野鳥と糞便検体を用いた調査のみでは、野鳥に対して致死性が低い株や感染鳥の糞便中に排出されにくい株の検出は難しい。第3章の研究結果から、少なくとも調査の2～12週間前の感染であれば、血清抗体の検出により感染歴を調べることが可能である。しかし、異なるHAグループに属するHPAIV間で交差反応性を示す場合があるため、感染した株を特定することは困難である。第2章と第3章のどちらにおいても、すべての感染マガモは気管から多くのウイルスを排出した。気管のウイルスは採食などにより湖水などの環境中に排出される。環境水等に含まれるウイルス遺伝子の検出は野鳥におけるHPAIVの流行状況を把握するための有用な手段となると考えられる。doctoral thesi
Validity of the intake of sugars, amino acids, and fatty acids estimated using a self-administered food frequency questionnaire in middle-aged and elderly Japanese: the Japan Public Health Center-based Prospective Study for the Next Generation (JPHC-NEXT) Protocol Area
Get PDFBackground: The Japanese database of food composition was revised in 2020, during which both the number of food items and
the number of food items measured for sugars, amino acids, and fatty acids were increased. We evaluated the validity of
estimated intakes of sugars, amino acids and fatty acids using a long food frequency questionnaire (long-FFQ) among middleaged
and elderly Japanese.
Methods: From 2012 to 2013, 240 men and women aged 40–74 years from five areas in the JPHC-NEXT protocol were asked to
respond to the long-FFQ and provide a 12-day weighed food record (WFR) as reference. The long-FFQ, which included 172
food and beverage items and 11 seasonings, was compared with a 3-day WFR, completed during each distinct season, and
validity was assessed using Spearman’s correlation coefficients.
Results: Percentage differences based on the long-FFQ with the 12-day WFR in men and women varied from −84.4% to 419.6%,
and from −75.8% to 623.1% for sugars, −17.5% to 3.8% and −5.8% to 19.6% for amino acids, and −58.5% to 78.8% and −43.4%
to 129.3% for fatty acids, respectively. Median values of correlation coefficients for the long-FFQ in men and women were 0.52
and 0.42 for sugars, 0.38 and 0.37 for amino acids, and 0.42 and 0.42 for fatty acids, respectively.
Conclusion: The long-FFQ provided reasonable validity in estimating the intakes of sugars, amino acids, and fatty acids in
middle-aged and elderly Japanese. Although caution is warranted for some nutrients, these results may be used in future
epidemiological studies.journal articl
Neurophysiological Mechanisms Underlying the Attenuation of Nociceptive and Pathological Pain by Phytochemicals: Clinical Application as Therapeutic Agents
Get PDFAlthough phytochemicals are plant-derived toxins that are primarily produced by plants as a form of defense against insects or microbes, several lines of studies have demonstrated that phytochemicals (e.g., polyphenols, carotenoids, and amino acids) have several beneficial biological actions for human health, such as anti-oxidative, anti-inflammatory, and cardioprotective effects. Recent studies have demonstrated that phytochemicals can modulate neuronal excitability in the nervous system, including nociceptive sensory transmission, so it is possible that phytochemicals could be complementary alternative medicine candidates; specifically, therapeutic agents against pain. The focus of this review is to elucidate the mechanisms underlying the modulatory effects of phytochemicals on neuronal electrical signals, such as generator potentials, action potentials, and postsynaptic potentials, in the nociceptive pathway neurons resulting in potential local anesthetic effects, intravenous anesthesia and analgesic effects, and inflammatory pain relief effects. In addition, we discuss the contribution of phytochemicals to the relief of nociceptive and/or pathological pain and their potential clinical application on the basis of our recent studies in vivo.journal articl
Comparative analysis based on shared amplicon sequence variants reveals that cohabitation influences gut microbiota sharing between humans and dogs
Get PDFIntroduction: The One Health concept is a comprehensive understanding of the interaction between humans, animals, and the environment. The cohabitation of humans and pets positively affects their physical, mental, and social well-being. It is recognized as an essential factor from the One Health perspective. Furthermore, a healthy balance in the gut microbiome is essential for good health, and the changes in the gut microbiome associated with cohabitation between humans and pets could potentially affect various aspects of the health of both hosts. Therefore, elucidating the sharing of gut bacteria between humans and pets associated with cohabitation is important for understanding One Health. However, most studies have examined sharing at the taxonomic level, and it remains unclear whether the same bacteria are transferred between humans and pets, and whether they mutually influence each other.
Methods: Here, microbiome analysis and shared 16S rRNA gene amplicon sequence variant (ASV) analysis were conducted before the start of cohabitation between humans and dogs, as well as at 2 weeks, 1 month, and 3 months after cohabitation.
Results: 16S rRNA gene ASVs analysis indicated that gut microbes have been transferred between humans and dogs. The overall structure of the gut microbiota within human–dog pairs remained unchanged after 3 months of adaptation. However, 11ASVs were shared within human–dog pairs. Many shared ASVs were highly abundant within each host, and this high abundance may be considered a factor that influences bacterial transfer between hosts.
Discussion: Our results provide important insights into the potential for the transfer of gut bacteria between humans and dogs. These findings are considered crucial for understanding the impact of human–dog cohabitation on various aspects of health.journal articl
Modulation of gut microbiota composition due to early weaning stress induces depressive behavior during the juvenile period in mice
Get PDFBackground The gut microbiota plays an important role in the development of behavior and immunity in infants and juveniles. Early weaning (EW), a form of social stress in mice, leads to increased anxiety and an enhanced stress response in the hypothalamic-pituitary-adrenal axis during adulthood. Early life stress also modulates the immune system and increases vulnerability to infection. However, studies investigating the causal relationships among juvenile stress, microbiota changes, and immune and behavioral deficits are limited. Therefore, we hypothesized that EW alters gut microbiota composition and impairs the development of the nervous and immune systems.
Results EW mice moved longer distances in the marble-burying test and had longer immobility times in the tail suspension test than normal weaning (NW) mice. In parallel, the gut microbiome composition differed between NW and EW mice, and the abundance of Erysipelotrichacea in EW mice at 8 weeks of age was lower than that in NW mice. In an empirical study, germ-free mice colonized with the gut microbiota of EW mice (GF-EW mice) demonstrated higher depressive behavior than GF mice colonized with normal weaning microbiota (GF-NW mice). Immune cell profiles were also affected by the EW microbiota colonization; the number of CD4 + T cells in the spleen was reduced in GF-EW mice.
Conclusion Our results suggest that EW-induced alterations in the gut microbiota cause depressive behaviors and modulate the immune system.journal articl
Coordination of prophage and global regulator leads to high enterotoxin production in staphylococcal food poisoning-associated lineage
Get PDFStaphylococcus species in food produce Staphylococcal enterotoxins (SEs) that cause Staphylococcal food poisoning (SFP). More than 20 SE types have been reported, among which Staphylococcal enterotoxin A (SEA) has been recognized as one of the most important SEs associated with SFP. However, the regulatory mechanisms underlying its production remain unclear. Previously, we identified a major SFP clone in Japan, CC81 subtype-1, which exhibits high SEA production. In this study, we attempted to identify the factors contributing to this phenomenon. Thus, we demonstrated that the attenuation of the activity of endogenous regulator, Staphylococcal accessory regulator S (SarS), and the lysogenization of a high SEA-producing phage contributed to this phenomenon in CC81 subtype-1. Furthermore, our results indicated that SarS could directly bind to the promoter upstream of the sea gene and suppress SEA expression; this low SarS repression activity was identified as one of the reasons for the high SEA production observed. Therefore, we revealed that both exogenous and endogenous factors may probably contribute to the high SEA production. Our results confirmed that SE production is a fundamental and critical factor in SFP and clarified the associated production mechanism while enhancing our understanding as to why a specific clone frequently causes SFP.journal articl