Tokyo University of Agriculture Repository / 東京農業大学リポジトリ

本間, 颯太

HONMA, Sota

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氏 名   本 間 颯 太 
学位（専攻分野の名称）   博 士（農学） 
学 位 記 番 号   甲 第 881号 
学位授与の日付   令和 5年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   放線菌 Streptomyces coelicolor A3(2) M145株における一酸化窒 
素シグナル伝達機構の解明 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農学） 朝 井   計 
               教 授・博士（農学） 矢 嶋 俊 介 
               准 教 授・博士（農学） 佐々木 康 幸 
                    博士（農学）  上 田 賢 志＊ 
                    博士（農学） 高 谷 直 樹＊＊ 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
 NO は分子内に不対電子を 1 つ保持するフリーラジカルであり，容易に細胞膜を透過し生
体分子と相互作用することで細胞内の様々な生理機能をコントロールするシグナル伝達物
質として機能する。細菌における NO は，バイオフィルムの拡散・形成，セカンドメッセ
ンジャーcyclic di-GMP (c-di-GMP)の生産を制御する。 
放線菌は抗生物質をはじめ抗がん剤，農薬，抗寄生虫剤など多種多様な二次代謝産物を生
産することが知られており，それ故，「生理活性物質の宝庫」と呼ばれている。また，多く
の放線菌はカビのように糸状に生育し胞子を形成する複雑な形態分化を示す。その一方，結
核の原因菌 Mycobacterium tuberculosis，ノカルジア症の Nocardia farcinnica など様々な
病原性放線菌が知られている。これらのことから，本菌群の二次代謝および形態分化を含む
発生過程の制御機構についての多くの理解は，産業面および臨床面おいて重要な意味を持つ。
しかしながら，本菌群のこれらの制御機構の詳細は未だ明らかになっていない点が多い。 
これまで所属研究室において，全ゲノム解読済みのモデル放線菌 Streptomyces coelicolor 
A3(2) M145 株が硝酸，亜硝酸（NO2-），一酸化窒素（NO）を合成し，硝酸還元酵素（Nar）
と NO ジオキシゲナーゼ（フラボヘモグロビン, Fhb）を介して順次循環させていることが
見出された。また本窒素酸化物代謝サイクルから生産される NO は，本菌の二次代謝と形
態分化に対して影響を及ぼすシグナル分子として機能することが示唆された。しかしながら，
どのようにして NO がこれらの生理的機能を制御しているかは明らかになっていない。そ
こで本研究では，内在的に生産された NO による二次代謝と形態分化の制御機構の解明を
試みた。        
 これまでの研究で，Nar の欠損（nar）株は NO 生産能が著しく減少することが確認さ
れており，本菌株を NO 低生産変異株として使用した。第一章では，nar 株の青色色素性
 ＊日本大学応用生物科学科教授 
＊＊筑波大学院生命環境科学研究科教授 
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抗生物質 Actinorhodin（ACT）の生産量および ACT 生合成における経路特異的促進転写因
子 ActII-ORF4 をコードする遺伝子の発現量を調べた。その結果，nar 株における ACT 生 
産量とactII-ORF4発現量はM145株と比較して顕著に減少することを本培養条件で確認した。
NO による直接的な ACT 生産活性への影響を検証するために，NO 発生剤を短時間暴露後
の ACT 生産量と actII-ORF4 発現量の変化を検証した結果，M145 株では有意に減少した
のに対し，nar 株では増大することが明らかとなった。これらの結果から，内在的に生産
された NO は正と負に ACT 生産活性に影響を及ぼすことが示唆された。これまでの研究に
より，ヘム含有型ヒスチジンキナーゼ DevS とそのレスポンスレギュレーターDevR から構
成される二成分制御系は，NO 濃度に依存して活性が切り替わることが明らかになっている
ことに加え，本二成分制御系は二次代謝に関与することが示唆されている。そのため，
DevS/R 二成分制御系は，NO 依存的な ACT 生産活性を制御する可能性が考えられた。そ
こで，本培養条件における devS 破壊株（devS）および devR 破壊株（devR）の ACT 生
産量を調べた結果，M145 株と比較して有意に減少することを確認した。また，devR 株に
おける actII-ORF4 発現量は，M145 株と比較して有意に減少しており低いままであった。
今回の研究により，NO 発生剤の短時間暴露は，M145 株の ACT 生産活性を減少させ，nar
株では増大することが確認されたが，これらの表現型は，devR 遺伝子の欠損により消失す
ることが明らかになった。これらことから，NO は DevS/R 二成分制御系を介して ACT 生
産活性を制御することが示唆された。転写制御因子 DevR と actII-ORF4 の直接的な関連性
を検証するために，DevR と actII-ORF4 のプロモーター領域（actII-ORF4p）の相互作用
についてゲルシフトアッセイを用いて in vitro で調べた結果，DevR は actII-ORF4p と相
互作用することが明らかになった。また，ChIP-qPCR により in vivo での相互作用を調べ
た結果，devR-FLAG 株の培養中期においても DevR は actII-ORF4p と相互作用して
おり，以降の培養時間では相互作用しないことが明らかになった。一方で，NO 低生産株で
あるnar/devR-FLAG 株では培養中ほとんど相互作用を示さないことが明らかになった。
そこで，NO による直接的な DevR と actII-ORF4p の相互作用への影響を検証するために，
NO 発生剤暴露後の本相互作用の変化を調べた。その結果，devR-FLAG 株における
本相互作用は有意に減少したのに対し，nar devR-FLAG 株では増大した。これらの結果
から，NO は Dev/R 二成分制御系を介して ACT 生産活性を制御することが示唆された。                                   
典型的なレスポンスレギュレーターの転写活性においてリン酸化は重要である。そこで，
細胞内における DevR の継時的なリン酸化状態をリン酸基補足機能性分子 Phos-tag を用い
たウエスタンブロッティングにより調べた。その結果，devR-FLAG 株の培養 48-96 h
において最上部に DevR-FLAG のバンドが検出され，120, 144 h では最上部の下にもバン
ドが検出された。一方で，168 h 培養後は，最上部のバンドは消失し，新たに最下部にバン
ドが検出され，培養中 DevR-FLAG のバンドは 3 箇所に検出された。この結果から，DevR
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は DevS のリン酸基転移活性を介して複数箇所リン酸化されることが示唆された。一方，
nar devR-FLAG 株では培養前期にのみ最上部に少量のバンドが検出され，以降の培養時
間では検出されなかった。この結果から，DevS のリン酸化において NO は必須でないこと
が示唆された。devR の発現は DevS の活性を介してリン酸化された DevR 自身により直接
促進される。今回の研究により，NO 発生剤短時間暴露後の devR 発現量は，M145 株では
有意に減少するのに対し，nar 株では増大することが確認された。この結果は，NO 発生
剤暴露後の ACT 生産活性の変化と一致しており，この結果から，細胞内においても NO は
低濃度で DevS の自己リン酸化を安定させる一方で，高濃度では不活化することが確認され
た。 
 本菌の ACT 生産は複数の転写制御因子により制御されており，DevR もこれらのレギュ
レーターの一つである。そこで，本菌の ACT 生産制御機構における NO の重要性を検証す
るために，ACT 生産のネガティブレギュレーターWblA の欠損株が示す過剰な ACT 生産活
性に対する DevR の影響を調べた。その結果，wblA 欠損（wblA）株の過剰な ACT 生産
活性は devR の欠損により顕著に抑制され，ほとんど ACT 生産を示さないことが明らかに
なった。この結果から，NO シグナル伝達は，本菌の ACT 制御機構において非常に重要で
あることが示唆された。本菌において DevR は重要な転写制御因子であることが明らかとな
ったため，DevR の分子作用機構について検証した。Phos-tag ウエスタンブロッティング
により，DevR は複数箇所のリン酸化部位を保有していることが示唆されたため，その同定
を試みた。既にリン酸化部位が同定されている Mycobacterium 属細菌の DevR ホモログと
の相同性を調べた結果，DevR の Asp66 (D66), Thr196 (T196), T221 が推定リン酸化部位
として保存されていることが明らかになった。そこで，推定リン酸化部位をそれぞれリン酸
化しないアミノ酸残基に変異させた devRS オペロンをdevR 株にそれぞれ相補させた株
（D66V, T196A, T221A）を用意し，作製した相補株における DevR の標的遺伝子の継時的
な発現量を調べた。その結果，D66V 株および T196A 株における各標的遺伝子の発現量は
顕著に減少しており，devR 株と同程度であったのに対し，T221A 株では減少せず回復を
示した。この結果から，標的遺伝子の発現制御において DevR の D66 と T196 の両方のリ
ン酸化が重要であることが示唆された。一方，actII-ORF4 発現はこれらの標的遺伝子の発
現パターンと異なっており，T221A 株においても発現量が減少傾向にあった。この結果か
ら，DevR による actII-ORF4 の発現制御において T221 も関与することが示唆されたが，
その詳細は不明なままである。DevR の標的遺伝子の一つである narG2 は Nar をコードす
る遺伝子であるため，本菌の NO 恒常性維持機構として機能する。そこで，DevR のリン酸
化による NO 恒常性維持への影響を検証するために，作製した D66V, T196A, T221A 株に
おける亜硝酸生産活性を亜硝酸検出剤であるグリース試薬を用いて調べた。その結果，
D66V 株と T196A 株の亜硝酸生産活性はdevR 株と同程度まで減少していた。これまでの
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研究により，NO 低生産株であるnar 株は M145 株と比較して早期に気中菌糸を形成する
ことが明らかになっている。このことから，DevR のリン酸化による NO 恒常性維持の制御
は，本菌の気中菌糸形成の制御においても重要であることが示唆された。そこで，D66 と
T196 を介したリン酸化が及ぼす NO シグナル伝達への影響を調べるために，各菌株におけ
る気中菌糸形成を継時的に調べた。その結果，D66V 株と T196A 株は M145 株と比較して
早く気中菌糸を形成し，devR 株と似た表現型を示した。この結果から，DevR の D66 と
T196 の両方のリン酸化は，適切な NO シグナル伝達を成立させる上で非常に重要であるこ
とが示唆された。 
 第一章の研究により，NO は DevS/R 二成分制御系を介して ACT 生産を制御することが
明らかとなった。また，リン酸化された DevR は，NO 依存的に細胞内 NO の恒常性を維持
しており，これは気中菌糸形成の制御において重要であることが示唆された。しかしながら，
内在的に生産された NO による気中菌糸形成の制御機構の詳細は不明である。これまでの
研究により，NO 低生産株であるnar 株は早期に気中菌糸を形成することが確認されてい
たため，本培養条件においてその確認を行った。その結果，培養 120 h 後，nar 株は気中
菌糸の形成を開始し，以降の培養時間で菌糸の量が増大することが確認された。NO による
直接的な気中菌糸形成への影響を検証するために，NO 発生剤存在下で培養後の M145 株と
nar 株の表現型を比較した。その結果，nar 株の早期の気中菌糸形成は，NO 発生剤存在
下で抑制される傾向を示した。これらの結果から，本培養条件においても NO は気中菌糸
を形成するシグナル伝達物質であることが示唆された。Streptomyces 属細菌の気中菌糸形
成において Bld タンパク質群が必須因子であるため，M145 株とnar 株におけるこれらの
タンパク質をコードする遺伝子の継時的な発現量を比較した。その結果，オーファンレスポ
ンスレギュレーターをコードする bldM の発現量が，M145 と比較してnar 株では有意に
増大するポイントが複数存在しており，これは NO 発生剤存在下で培養することで減少す
ることが明らかとなった。これらの結果から，NO は bldM の発現調節を介して気中菌糸形
成を制御することが示唆された。nar 株の早期の気中菌糸形成に対する bldM 発現の影響
について検証するために，nar 株における bldM を欠損させた株を作製し，その表現型を
比較した。その結果，nar 株の早期の気中菌糸形成は，bldM の欠損により消失したこと
から，bldM の発現は気中菌糸形成において重要であることが示唆された。近年の研究によ
り，bldM の発現は c-di-GMP 依存性転写制御因子 BldD により直接抑制されることが明ら
かとなっている。そこで，細胞内における NO と BldD の関連性について検証するために，
in vivo での BldD と bldM プロモーター領域（bldMp）の相互作用を ChIP-qPCR を用いて
調べた。その結果，本培養条件においても M145/bldD-FLAG 株で BldD は bldMp と相互
作用することが確認された。一方，NO 低生産株であるnar/bldD-FLAG 株における本相互
作用は，M145/bldD-FLAG 株と比較して有意に減少しており，これは NO 発生剤存在下で
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培養することで回復した。BldD の DNA 結合活性は細胞内 c-di-GMP 量に依存しており，
高濃度 c-di-GMP 存在下では DNA 結合活性が増大する一方，低濃度では低下する。このこ
とから，内在的に生産された NO は細胞内の c-di-GMP 量を調節することで，BldD の DNA
結合活性を制御することが示唆された。そこで，M145 株とnar 株における継時的な
c-di-GMP 量を比較した結果，M145 株と比較して，nar 株における c-di-GMP 量が有意に
減少する培養時間のポイントが複数存在し減少傾向にあった。加えて，NO 発生剤存在下で
培養後のnar 株における c-di-GMP 量は有意に増大することが明らかになった。これらの
結果をまとめると，内在的に生産された NO は細胞内の c-di-GMP 量の調節を介して BldD
の DNA 結合活性をコントロールし，気中菌糸形成を制御することが示唆された。 
本研究により，S. coelicolor A3(2) M145 株において内在的に生産された NO シグナル伝
達機構の一端が明らかとなった。本研究成果は，放線菌を利用した発酵産業の改善および病
原性放線菌の臨床戦略の確立において NO が有効なツールとなり得ることを示しており，
NO を基盤とした生物学および医学に対して重要な視点を提供するものである。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
放線菌は多種多様な二次代謝産物を生産することに加え，カビに似た複雑な形態分化を示
す細菌群である。これまでに，放線菌 Streptomyces coelicolor A3(2) M145 株が一酸化窒素
（NO）を内在的に生産することが初めて見出され，NO は本菌の二次代謝と形態分化を制
御することが示唆された。しかし，NO による制御機構の詳細は不明であった。本研究によ
り，内在性 NO は DevS/R 二成分制御系を介して抗生物質アクチノロージンの生産および細
胞内 cyclic di-GMP 量の調節を介して気中菌糸の形成を制御することが明らかとなった。 
これらの研究成果等を詳細に検討した結果，審査員一同は博士（農学）の学位授与に値す
ると判断した。 


Japanese

放線菌Streptomyces coelicolor A3(2) M145株における一酸化窒素シグナル伝達機構の解明

Dhakal, Dipendra

English

Impacts and responses of disaster on the livelihood of local people focusing on socioeconomic conditions in rural Nepal.

東京農業大学博士（生物産業学

井上, 紘佑

INOUE, Kousuke

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氏 名   井 上 紘 佑 
学位（専攻分野の名称）   博 士（生物産業学） 
学 位 記 番 号   甲 第 876号 
学位授与の日付   令和 5年 3月 17日 
学 位 論 文 題 目   北海道オホーツク海沿岸域における植物プランクトンのサイズ 
構造と新生産―水産資源の豊かさを支える仕組み―
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・水産学博士 塩 本 明 弘 
               教 授・博士（学術、生物資源学） 西 野 康 人 
               教 授・博士（農学） 中 川 至 純 
                    博士（環境科学）  栗 林 貴 範＊ 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
【第１章：序論】 
北海道オホーツク海沿岸域は漁業生産性が高く，それを支えているのは生態系の基礎とな
る植物プランクトンの増える力である。大型の植物プランクトンが生態系の基礎となる場合
は水産資源の豊かさにつながる。しかしながら，本海域において植物プランクトンのサイズ
構造に関する知見は乏しい。また，植物プランクトンが増える際，二酸化炭や窒素態栄養塩
を必要とする。窒素態栄養塩のうち硝酸塩の利用による基礎生産は新生産と呼ばれ，その割
合が高いほど，水産資源の豊かさにつながる。しかしながら，本海域では新生産に関する研
究はなされておらず，なぜ本海域で水産資源が豊かなのか不明な点が多い。そこで本研究で
は，豊かな海である北海道オホーツク海沿岸域の高い漁業生産性を支える仕組みを明らかに
するために，本海域の豊かさは，“周年において大型の植物プランクトンが主たる基礎生産
者である”ことと“周年において植物プランクトンによる新生産の割合が高い”ことによっ
て支えられているという２つの仮説を立てた。これらの仮説を検証するために，北海道オホ
ーツク海沿岸域に位置する網走沖において，サイズ別クロロフィル a濃度（植物プランクト
ンの現存量の指標）と基礎生産力並びに新生産の割合の季節変動（非結氷期：４～12 月）
を調べ，得られた結果から豊かさを支える仕組みを明らかにすることを目的とした。 
 
【第２章：海洋環境】 
北海道オホーツク海沿岸域に位置する網走沖の物理・化学的海洋環境の季節変動を把握す
るために，水温，塩分，栄養塩濃度，栄養塩濃度比，植物プランクトンの生産力に及ぼす光
と栄養塩の影響の季節変動を明らかにした。その結果，本海域には，高温・高塩分で貧栄養
な宗谷暖流水と，低温・低塩分で比較的栄養豊かな東樺太海流水という性質の異なる２つの
 ＊北海道立総合研究機構水産研究本部中央水産試験場資源管理部海洋環境グループ主査 
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水塊が夏季～秋季，冬季～春季にそれぞれ存在することが確認された。本海域は宗谷暖流水
がみられる夏季～秋季において貧栄養な状態であり，窒素態栄養塩が植物プランクトンの制
限要因になり得ることが考えられた。一方で，東樺太海流水がみられる冬季～春季において
は，栄養塩が比較的豊富に存在し，この時季は窒素態栄養塩が植物プランクトンの制限要因
になり得ないことが考えられた。 
 
【第３章：植物プランクトンのサイズ別クロロフィル a濃度と基礎生産力】 
本海域における植物プランクトン現存量（クロロフィル a濃度）のサイズ構造については
過去にいくつかの研究が行われている。しかしながら，サイズごとの基礎生産力に関する研
究はみられない。そこで，本章では，どのサイズの植物プランクトンが主たる基礎生産者で
あるのかを明らかにした。その結果，大型（>10μm）の植物プランクトンが現存量と基礎生
産力に占める割合は，春季で 80～90％，夏季～秋季では，8 月の 33％と 48％を除けば，50
～70％であった。春季はもとより，一般に中・小型が多いとされてきた貧栄養状態となる夏
季～秋季においても大型の植物プランクトンが主たる基礎生産者であることが示された。春
季～秋季の結果から 1つ目の仮説が強く支持された。一方で，冬季においては，中・小型（<10
μm）の植物プランクトンの占める割合が高く，現存量と基礎生産力の 70～80％を占め，中・
小型の植物プランクトンが主たる基礎生産者であることが示された。しかしながら，単位ク
ロロフィル a当たりの基礎生産力（成長速度の指標）にサイズ間で有意な差がみられなかっ
たことから，カイアシ類による大型の植物プランクトンへの摂食圧が高かったために大型の
植物プランクトンの占める割合が低かったと考えられた。冬季においても大型の植物プラン
クトンが主たる基礎生産者である可能性がある。 
 
【第４章：植物プランクトンによる窒素態栄養塩の利用特性】 
新生産の割合は水産資源の豊かさの指標となるが，本海域において新生産に関する研究は
みられない。本章では，水産資源の豊かさを支える仕組みを考えるために立てた 2つ目の仮
説を検証するために，植物プランクトンによる硝酸塩とアンモニウム塩の取り込み速度を測
定し，新生産の割合を求めた。その結果，新生産の割合の平均値と最大値は，春季で 0.44
と 0.78，夏季～秋季で 0.28と 0.74であった。春季や夏季～秋季では高い値（約 0.8）がみ
られた。さらに，夏季～秋季では，貧栄養な宗谷暖流水がみられたにもかかわらず，新生産
の割合は従来の貧栄養な海域において報告されている値（0～0.4；中央値：0.2）と比べて
高かった。また，冬季においては，新生産の割合の平均値と最大値は 0.26 と 0.38 であり，
比較的栄養塩の濃度が高い海域での値（0.2～0.6）の範囲内にあった。本海域における新生
産の割合を他の海域と比較した場合，周年にわたり（結氷期を除く）比較的高いと判断され
ることから，２つ目の仮説が強く支持された。 
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【第５章：植物プランクトンによる炭素と窒素の取り込み速度の比と成長速度】 
豊かな海を支えるため，多くの植物プランクトンが存在するためには炭素（C）や窒素（N）
といった体を構成する元素をバランスよく取り込む必要がある。バランスの基準となるのは
レッドフィールド比（C/N比：6.6）である。4～12月において炭素の取り込み速度（基礎生
産力）と窒素の取り込み速度（硝酸塩とアンモニウム塩の取り込み速度）を測定し，炭素と
窒素の取り込み速度の比を求めた。炭素と窒素の取り込み速度の比は春季ではレッドフィー
ルド比に近い値がみられ，夏季～秋季にはレッドフィールド比よりも低くかった。窒素制限
となる場合，取り込み比がレッドフィールド比よりも低くなる場合があることが報告されて
いる。植物プランクトンの成長速度は春季では高く（最大成長速度のおよそ 1/2），夏季～
秋季に低い値（最大成長速度の 1/10 以下）がみられた。これらから，夏季～秋季では窒素
が制限となっていることが考えられた。一方，冬季では，炭素と窒素の取り込み速度の比は
レッドフィールド比よりも高い値がみられ，成長速度は比較的高かった（最大成長速度の
1/5～2/5）。冬季において，現場の窒素態栄養塩が比較的豊富にあるので，植物プランクト
ンの窒素への要求量が少なく，取り込み比が高くなったのかもしれない。 
 
【第６章：まとめ】 
本海域における豊かさは“大型の植物プランクトンが主たる基礎生産者である期間が長
い”ことと，“新生産の割合が周年にわたり（結氷期を除く）比較的高い”ことに支えられ
ていると考えられ，本海域における豊かさを支える仕組みに対する 2つの仮説が強く支持さ
れた。以上に加えて，本海域において中・小型の植物プランクトンの現存量が他の海域に比
べ比較的高かった。本海域では，大型の植物プランクトンが優占する生態系に加えて，中・
小型の植物プランクトンが支える生態系も他の海域に比べて発達していることも水産資源
の豊かさを支える仕組みとなっていることが考えられた。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
北海道オホーツク沿岸域は豊かな海として知られているが，豊かさ（高い漁業生産力）を
支える仕組みについては分かっていない。その仕組みを明らかにするため，これまでの知見
をもとに，１）大型（>10μm）の植物プランクトンが主たる基礎生産者である，２）植物プ
ランクトンによる新生産（硝酸塩を利用する基礎生産）の割合が高い，という２つの仮説を
たて，検証のため非結氷期（4～12月）に網走沖において調査を行った。春季はブルームに
より大型が優占し，貧栄養である夏季～秋季でも大型が優占した。新生産の割合は春季で高
い値がみられ，夏季～秋季では貧栄養な他の海域に比べて高い値がみられた。冬季は，中・
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小型が優占し，新生産の割合は高くはなかった。非結氷時において長い期間（春季～秋季），
大型が優占し，新生産の割合も高いことが明らかとなり，２つの仮説が支持された。本海域
における豊かさを支える仕組みの一端が初めて明らかとなった。また，夏季～秋季のサイズ
構造や新生産に関する成果は貧栄養状態でこれまでに報告されたことのない新しい知見で
あった。これらの研究成果等を詳細に検討した結果，審査員一同は博士（生物産業学）の学
位を授与する価値があると判断した。 
 


北海道オホーツク海沿岸域における植物プランクトンのサイズ構造と新生産―水産資源の豊かさを支える仕組み―

Sk, Rahul

The molecular analysis of sensor histidine kinase responsible for desiccation tolerance in the moss Physcomitrium patens

張, 可

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氏 名   張  可 
学位（専攻分野の名称）   博 士（農学） 
学 位 記 番 号   甲 第 885号 
学 位 授 与 の 日 付   令和 5年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   Development of Methods for Crop Growth Assessment Using UAV 
 Aerial Images 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（地球環境科学） 島 田 沢 彦 
               教 授・博士（農学） 岡 澤   宏 
               准 教 授・博士（農業工学） 関 山 絢 子 
                    博士（国際協力学）  林  希一郎＊ 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
The use of small unmanned aerial vehicles (UAVs) in agriculture is rapidly 
progressing in the last decade. However, many of the previous studies to date have 
applied traditional remote sensing analysis methods to UAV images and compared their 
accuracy with satellite images, while the features in the field which became visualized 
due to the high resolution of UAV imagery are not yet fully considered. The crop height, 
vegetation coverage, and vegetation index are important indicators for determining the 
additional fertilization of crops. Most previous studies were based on single specific 
indices such as height, vegetation coverage, and vegetation index, instead of combining 
the indices, and there is no research that proposes an optimal evaluation method 
according to the growth stage of crops. Based on the above, this study first proposes an 
optimal Ground Control Point (GCP) installation method in agricultural areas as a 
preliminary preparation for optimal UAV aerial photography, and then examines the 
optimal analysis method for estimating crop height, vegetation coverage, and vegetation 
index. The purpose was to establish an integrated management method for vegetation 
evaluation and farmland management based on UAV aerial images. 
At this paper, Chapter 2 examines the preparation method for UAV aerial 
photography. Chapter 3 to Chapter 5 examine the growth evaluation of crops, Chapter 6 
examines the suitability of UAV images for farmland management, and Chapter 7 
proposes an integrated management method using UAV images that integrates 
vegetation evaluation and farmland management. This research presented four 
perspectives: optimum position correction method for UAV aerial images in farmland, 
 ＊名古屋大学未来材料・システム研究所教授 
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study and comparison of methods for estimating crop height and ground volume, 
relationship between vegetation index and coverage ratio, and discrimination of 
features in farmland.  
The utilization of UAV aerial images for farmland management was investigated in 
an integrated manner. As a result, it was found that 6 or more GCPs surrounding the 
field are the most sufficient, but when less GCPs are used, suitable accuracy could be 
obtained if GCP Distribution Index (GDI) is above 3 for UAV aerial photography in 
farmland.  
When using of Digital Surface Model (DSM) to estimate crop height, it was found that 
the foliage morphology of the crop affected the estimation accuracy, and regression 
models suitable for the target crops were necessary. On the other hand, point cloud data 
is suitable for extracting detailed crop heights at specific positions for determining the 
lodging of crops, as it faithfully reproduces the details of the crops. It was found that 
DSM, which has high versatility and is relatively easy to process, is suitable for 
estimating above-ground volume of crops.  
Since the ground resolution of aerial imagery does not significantly affect the 
relationship between NDVI and Canopy Cover (CC), it is possible to use aerial imagery 
from different platforms for conversion between NDVI and CC. In addition, features 
other than vegetation and soil in farmland adversely affect crop growth evaluation by 
NDVI, and feature discrimination in farmland is important.  
In this study, a comparative study of different vegetation indices was carried out, and 
the optimal classification method for distinguishing different features was proposed. 
From the above, it became clear that it is possible to perform growth evaluation 
according to the growth stage of crops by utilizing the high resolution and point cloud 
data, which are the advantages of UAV aerial images. By performing integrated crop 
evaluation and field management using UAV that integrates these results, we were able 
to establish a more precise evaluation method using UAV aerial images. 
 
近年，小型無人航空機（UAV）の農業利用が進んでいる。UAV 空撮画像を用いて農作物
の生育状態を把握する研究や収穫量を予測する研究は世界中で行われてきた。作物高，植被
率および植生指数は作物の追肥時期・施肥量を決定する上で重要な指標であり，正確な生育
状況の把握は農家の収入向上に繋げられる。しかし，今までの研究では伝統リモートセンシ
ングの解析手法を UAV 画像に適用し，精度を衛星画像と比較検討するものが多く，UAV 画
像の特徴である高解像度による独特な課題（作物の茎葉形態，圃場内の地物等は可視化され，
- 3 - 
 
リモートセンシングの結果に影響を及ぼす）は検討されてこなかった。また，高さ，植被率，
また植生指数という特定な指標による生育評価が多く，作物の生育段階に応じて最適な評価
方法を提案した研究はまだない。以上を踏まえ，本研究はまず最適な UAV 空撮の前準備と
して農業地域における最適な地上基準点（GCP）の設置方法を提案し，さらに作物高，植
被率および植生指数を推定する最適な解析手法を検討することにより，UAV 空撮画像に基
づいた植生評価と農地管理の統合的管理手法を確立することを目的とした。 
なお，本論文は 7 章から構成されており，2 章では UAV 空撮に関する作成方法の検討，3
章，4 章，5 章では作物を対象として植物体の成長評価の検討，6 章では農地管理に関する
UAV 画像の適合性を検討し，7 章では植生評価と農地管理を統合させた UAV 画像による統
合管理手法を提案する。また本論は農地における UAV 空撮画像の最適な位置補正方法，作
物高と地上部体積の推定方法の検討と比較，植生指数と被覆率の関係，そして農地内の地物
判別という四つの視点から，UAV 空撮画像の農地への利用方法を統合的に検討した。その
結果，農地における UAV 空撮には圃場を囲む 6 個以上の GCP で十分であり，6 個以下を
使用場合には GCP 分布指数（GDI）により補正精度を予測し，GDI が 3 以上の場合には農
地調査に適す補正精度が得られることがわかった。作物高を推定するため，数値表面モデル
（DSM）を使用する場合には作物の茎葉形態が推定精度に影響を与え，対象作物に適した
回帰モデルを使用することがわかった。一方，点群データは作物の細部の特徴を忠実に復元
し，倒伏判別等のために特定位置の詳細な作物高を抽出するに適している。作物の地上部体
積を推定する際に，通用性が高く処理が比較的簡単な DSM が適すことがわかった。また，
空撮画像の地上解像度は NDVI と作物被覆率（CC）の関係に有意な影響を与えないため，
NDVIとCCの換算に異なるプラットフォームによる空撮画像を使用することが可能である
ことがわかった。さらに，農地内の植生と土壌以外の地物は NDVI による作物生育評価に
悪影響を与え，農地内の地物判別が重要であるため，本研究は RGB 画像またはマルチスペ
クトル画像による地物分類方法を比較検討し，異なる地物の判別に最適な分類方法を提案し
た。以上のことから，UAV 空撮画像の利点である高解像度と点群データを活用することで，
作物の生育ステージに応じた成育評価を行うことが可能であることが明らかになった。また，
圃場の管理をする上で，対象物に応じた画像の選択を行うことが重要であることが示された。
これらの成果を統合した UAV による統合型作物評価・圃場管理を行うことでより精密な
UAV 空撮画像による評価手法を確立することができ，新たな評価手法を提案することがで
きた。 
 
 
 
 
- 4 - 
 
審 査 報 告 概 要 
 
本研究は，農作物の生育評価のための最適な UAV空撮手法を提案し，作物高，植被率およ
び植生指数を推定する最適な解析手法を検討することにより，UAV空撮画像に基づいた植生
評価の手法と画像診断による作物生育の改善策を明らかにした。その結果，農地における
UAV空撮には圃場を囲む GCPの配置と個数が重要となり，新たに定義した GCP分布指数（GDI）
によって GCP配置が基準化できること，作物生育指標である作物高を UAV画像から評価する
には DSMよりも点群データが効果的であること，作物の地上部体積を推定するには通用性が
高く処理が比較的簡単な DSMが適すことを明らかにした。さらに，RGB画像またはマルチス
ペクトル画像による地物分類方法を比較検討し，植生，土壌，プラスチック・金蔵など異な
る地物の判別に最適な分類方法を提案した。以上のことから，UAV空撮画像の利点である高
解像度と点群データを活用することで，作物の生育ステージに応じた成育評価を行うことが
可能であることが明らかになった。これらの研究成果等を詳細に検討した結果，審査委員一
同は博士(農学)の学位を授与する価値があると判断した。 


Development of Methods for Crop Growth Assessment Using UAV Aerial Images

中村, 皓毅

NAKAMURA, Koki

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氏 名   中 村 皓 毅 
学位（専攻分野の名称）   博 士（農学） 
学 位 記 番 号   甲 第 895号 
学位授与の日付   令和 5年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   天然由来 C-P 化合物の合成研究 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農学） 松 島 芳 隆 
               教 授・博士（農学） 横 田 健 治 
               教 授・博士（農学） 須 恵 雅 之 
               教 授・博士（農学）  石 神   健 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
背景・目的 
天然にはリン元素を含む多様な有機化合物が存在する。最も一般的なのはリン酸エステル
であり，細胞膜や DNA の構成成分などとして生物に普遍的に存在する。一方，なかには酸
素を介さずに炭素とリンが直接結合した C–P 化合物も存在する。単離報告例は約 40 種類ほ
どとまだ少ないが，医薬・農薬としての利用例もあり，商業化率は高い。近年，生合成遺伝
子に着目したゲノムマイニング研究により，多くの未同定 C–P 化合物の存在が示唆されて
おり，生合成経路は推定されているものの化合物の単離には至っていない例も最近報告され
ている。C–P 化合物はリン酸エステルやカルボン酸などの生体分子を模倣（mimicking）す
ることで興味深い生物活性を示すことが特徴的である。これらの生物活性の作用機構を解明
するためには，ミミッキングターゲットを明らかにする必要があり，それには構造活性相関
の情報が重要である。そこで，本研究では天然由来 C–P 化合物およびその類縁体の合成研
究を行う。 
 
1. 除草活性を有する phosphonothrixin（PTX）の合成研究 
 PTX (1)は放線菌 Saccharothrix sp. ST-888 から単離された除草活性を有するホスホン酸で
ある。天然型の S 体を葉面投与した場合にのみ非選択的に葉にクロロシスを誘発するが，そ
の詳細は明らかになっていない。一般的な白化型除草剤（PPO 阻害剤，カロテノイド生合成
阻害剤）とは異なる構造的特徴から新たなターゲット酵素の阻害が期待されている。この興
味深い作用機構の解明には化合物の安定的な供給が必要である。しかし，過去に報告されて
いる光学活性体合成は出発物質の調製に問題があることが報告されている。そこで，PTX
の効率的な新規光学活性体合成経路の開発を行うこととした。 
 まず初めに合成経路確立のためラセミ体合成を行った。前述の過去の合成における問題点
- 2 - 
 
を回避するため，容易にラセミ体を大量合成可能なエポキシケトン 6 を出発物質に用い，
Wittig 反応を含む三工程によりオレフィン 3 へと変換した。その後，鍵反応である C–P 結
合形成反応を含む既知の三工程を経て，PTX (1)のグラムスケールでの合成を達成した。こ
の C–P 結合形成反応において，試薬であるジベンジルホスファイトの入手先によって反応
の様子が異なることを見出した。原因は明確ではないが，微量の不純物の違いによるもので
あると考察している。 
 次に，確立したラセミ体合成を光学活性体合成に適用するため，出発物質のエポキシケト
ン 6 を高い光学純度で得る検討を行った。不斉エポキシ化，ジアステレオマー法による光
学分割，酵素法による速度論的光学分割を試したところ，酵素法が最も効果的であった。得
られたエポキシケトン (R)-6 はヒドロキシ基を PNB エステルに変換し，再結晶法を行うこ
とでさらに光学純度を高めることができた（>99% ee）。得られたPNBエステル(S)-16はWittig
反応と続くメタノリシスによってオレフィン(R)-3 へと変換し，その後既知の三工程を経て
PTX (1)の光学活性体合成を達成した（八工程，総収率 6％）。 
さらなる合成の効率化を狙って PNB エステル(S)-16 のカルボニル基をオレフィンではな
くアセタールに変換する経路に関しても検討した。特筆すべきはこの C–P 結合形成反応に
おいて，基質のアセタール(R)-12 のエポキシドにジベンジルホスファイトの塩化マグネシウ
ム塩が求核攻撃することで C–P 結合が導入された後，1 級アルコキシドが分子内のホスホン
酸エステルに求核攻撃することで，phostone と称される 5 員環の環状ホスホン酸エステルが
得られることを見出した。得られた phostone (S)-21 は 40 °C で加水素分解を行うことで，一
工程で PTX (1)へと導くことができた。この経路は前述のオレフィン化を行う経路よりも工
程数，収率の面で効率的であり（七工程，総収率 15％），1.0 g の PTX (1)を合成することが
できた。また，ヨウ素を用いたマイルドな条件にて phostone (S)-21 のアセタールをカルボニ
ル基へと変換した後，0 °C で加水素分解を行うことで，PTX の環状誘導体といえる cyclic 
PTX (24)を新たに合成することができた。 
 
2. Phostone 形成の基質適応範囲の検討 
 PTX 合成の際に見出した C–P 結合形成反応における phostone 形成は置換基 R がオレフィ
ンの場合には見られず，アセタールの場合でのみ引き起こされた。どのような要因によって
この環化反応が制御されているのかは非常に興味深い観点である。そこで，この反応の基質
適応範囲について検討することとした。前述の二つの基質に加え，置換基 R が環状アセタ
ール，ヒドロキシメチル，水素の 3 種類の基質を検討したところ，アセタールの場合でのみ
環化がみられた。このとき中間体のホスホン酸エステルが得られないことから，この環化は
C–P 結合形成後，速やかに引き起こされることが分かった。また，置換基 R が水素の場合
にのみラセミ化が引き起こされることも分かったが，機構の解明までは至っていない。環化
- 3 - 
 
反応およびラセミ化の機構解明のためにはさらなる検討が必要である。 
 
3. PTX 類縁体の除草活性試験 
 Phostone 形成の基質適応範囲の検討において得られたホスホン酸エステルに対して，加水
素分解を行うことで側鎖がイソプロピル基，ヒドロキシメチル基，水素の 3 種類の PTX 類
縁体を新たに合成することができた。この 3 種に PTX (1) ，cyclic PTX (24)を加えた 5 種類
の基質をシロイヌナズナに対する除草活性試験に供した。結果的には PTX (1) ，cyclic PTX 
(24)で白化がみられた。また，両者を比較すると若干 cyclic PTX (24)の方が活性は低かった。
環化によるコンフォメーションの固定は活性の低下を引き起こすことが分かった。一方で，
カルボニル基周辺に注目すると，メチルケトンに比べ，ヒドロキシメチルではまったく活性
を示さなかった。過去に報告されている構造活性相関も踏まえると，カルボニル基は活性に
重要な部分構造であることが示唆された。ミミッキングターゲットを明らかにするためには，
さらなる類縁体を合成し，活性試験を行う必要がある。 
 
4. Valinohos および DHPPA ジペプチドの合成研究 
Valinophos (33)は PTX 生合成中間体である DHPPA (27)（3.の活性試験にて用いた側鎖が水
素のホスホン酸）と N-Ac-L-Val が縮合したホスホン酸で，Streptomyces durhamensis から単
離・構造決定された。最近，詳細な生合成経路が報告されたが，そこで Val にアセチル基で
はなくもう一つアミノ酸が縮合した DHPPA ジペプチド (35)が真の生成物であることが示
唆された。この二つ目のアミノ酸の縮合を触媒する酵素は特に Ala，Leu，Ile，Ser，Gln，
His に対して活性が高いことが報告されている。この DHPPA ジペプチド (35)の生物活性や
その生理的意義は非常に興味深い。しかし，valinophos (33)は単離量が少なく，DHPPA ジペ
プチド (35)は未だ単離されていない。そこで，これらの合成研究を行うこととした。 
当初は(R)-glycidol (25)に対する C–P 結合形成反応を行い，得られた DHPPA ジベンジル保
護体 26 に対してアミノ酸の縮合を行う計画を立案していた。しかし，2.の基質適応範囲の
検討にて得られた DHPPA ジベンジル保護体 26 ではラセミ化がみられた。原因については
分かっていないが，現状ラセミ化はこの基質でのみ引き起こされている。そのため，
(R)-glycidol (25)の 1 級アルコールを保護した基質を用いることで，DHPPA ジベンジル保護
体 26 の等価体を合成し，その際ラセミ化を抑制することができるか検討した。アセチル基，
TBS 基，N-Ac-L-Val，N-Fmoc- L-Val，N-Boc- L-Val を結合させた５種類の基質について検討
した。結果的には，Val を縮合させた基質を用いた場合に目的とするホスホン酸が得られ，
このときラセミ化はみられなかった。収率は N-Ac-L-Val を縮合させた基質を用いた場合が
最もよかったが，基質の調製においてアミノ基のエピ化を抑制することができないという問
- 4 - 
 
題があった。そこで，N-Fmoc- L-Val を縮合させた基質を用いた条件に関して，さらなる収
率向上を目指し検討を行った。結果的に低温条件下でシアン化銅を添加することよって中程
度の収率ではあるが，目的とするホスホン酸エステルを得ることができた。残る課題として
はもう一分子のアミノ酸の縮合および保護基の除去があり，今後さらなる検討が必要である。 
 
総 括 
 本研究では，天然物に珍しい C–P 化合物の C–P 結合と特徴的な生物活性に興味を持ち，
PTX (1) ，valinophos (33) ，DHPPA ジペプチド (35)について合成研究を行った。PTX 合成
では容易に大量合成可能なラセミ体のエポキシケトン 6 を出発物質に用い，グラムスケー
ルでのラセミ体合成と光学活性体合成を達成した。特筆すべきは，鍵反応である C–P 結合
形成反応において，基質にアセタール(R)-12 を基質に用いた場合に興味深い環化反応が連続
して進行することで，phostone (S)-21 が得られたことである。この phostone (S)-21 に対して
40 °C で加水素分解を行うことで PTX (1)を，アセタールの脱保護と続く 0 °C での加水素分
解を行うことで cyclic PTX (24)を合成した。 
さらに，この興味深い環化反応の基質適応範囲についても検討した。結果的には側鎖がア
セタールの場合に環化反応がみられた。また，側鎖が水素の場合のみラセミ化が引き起こさ
れることを見出した。現状この phostone 形成およびラセミ化の機構は明らかではなく，さ
らなる検討が必要である。得られたホスホン酸は加水素分解を行うことで PTX 誘導体へと
導いた。これらと cyclic PTX (24)をそれぞれシロイヌナズナに対する除草活性試験に供した
ところ，cyclic PTX (24)でのみ白化誘導がみられたが，その活性は PTX (1)に比べ若干低かっ
た。C–O–P 結合によるコンフォメーションの固定は活性の低下を引き起こすことが分かっ
た。 
 また，valinophos (33)および DHPPA ジペプチド (35)の合成に関しては，(R)-glycidol (25)
と N-Fmoc-L-Val を縮合させた基質を調製し，C–P 結合形成反応を行うことで鍵中間体であ
るホスホン酸エステルを得ることができた。最終的に導入する必要のある Val を先に縮合さ
せることで，ラセミ化の抑制も同時に達成することができた。今後，さまざまなアミノ酸の
縮合したジペプチドを合成し，抗菌活性などを評価していく必要がある。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
本論文は，炭素とリンが直接結合した C-P 化合物，除草活性を有する phosphonothrixin 
(PTX)のほか，valinophos や DHPPA ジペプチドを対象に，これらの物質供給や活性メカニズ
ムの解明を目指し，C-P 化合物およびその類縁体の効率的な合成を達成することを目的とし
- 5 - 
 
ていた。結果，①PTX のラセミ体，および光学活性体，また cyclic-PTX の合成を達成し，
②phostone 形成における基質の構造に関する知見，③PTX および類縁体の除草活性に関す
る構造活性相関，④valinophos や DHPPA ジペプチドの合成に関する情報，の取得に成功し
た。PTX の合成はグラムスケールで達成されており，PTX および類縁体の除草活性に関す
る情報も得ることができ，それまで知見のなかった phostone 形成の発見とともに，有機合
成化学的にも，農薬学的にも学術的価値の高いものと判断された。これらの研究成果等を詳
細に検討した結果，審査委員一同は博士（農学）の学位を授与する価値があると判断した。 


天然由来C-P　化合物の合成研究

伊藤,洵

ITO, Jun

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氏 名   伊 藤  洵 
学位（専攻分野の名称）   博 士（農学） 
学 位 記 番 号   甲 第 899号 
学位授与の日付   令和 5年 3月 21日 
学 位 論 文 題 目   加齢による終末糖化産物の蓄積が凍結融解後の胚のミトコンド 
リア品質管理に及ぼす影響 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農学） 白 砂 孔 明 
               教 授・博士（農学） 岩 田 尚 孝 
               教 授・博士（医学） 庫 本 高 志 
                    博士（農学）  塚 本 智 史＊ 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
卵子や胚の凍結保存は，ヒト生殖医療分野や動物生産分野など幅広く用いられている基盤
技術である。一方で，この技術には不確定要素も多く残されており，凍結胚移植により産子
体重の増加や妊娠合併症のリスクが増加することが指摘されている。さらに凍結保存そのも
のがミトコンドリア(Mt)に機能障害を引き起こす。しかし，融解後の卵子や胚では，障害を
受けた Mt は除去および新規合成によるミトコンドリア品質管理(MQC)を介して回復し，卵
子や胚の発育を支持する。この MQC は加齢によって影響を受けることが知られているが，
その原因は明らかではない。一方で，MQC を制御するタンパク質としてヒストン脱アセチ
ル化酵素である SIRT1 が知られており，このタンパク質の活性を調整することで MQC が
亢進するという報告がある。 
本研究では，ブタ卵子とウシ初期胚を用いてレスベラトロールによる SIRT1 の活性化が
卵子や胚のガラス化保存に起因する障害からの回復を助けるのかどうかに取り組んだ。また
若齢と加齢雌ウシおよびマウスを用いて，ガラス化加温処理後の Mt の回復過程に差がある
のかを比較した。最後に，若齢と加齢の回復機構の差として SIRT1 の活性化状態に差があ
ることに着目し，その原因因子が終末糖化産物(AGEs)の蓄積に起因すると想定し，検証し
た。 
レスベラトロールはガラス化加温処理後の卵子の SIRT1 を活性化させ，Mt 合成の活性化
を介して，Mt 機能低下や卵子の生存率を改善することが明らかになった。また，ウシ初期
胚のガラス化保存前のレスベラトロール処理は加温後の Mt の分解・除去を活性化させ，胚
発育能力を改善することが明らかになった。 
一方，加齢ウシ由来の卵子を用いて作成した胚では，若齢由来胚と異なり，ガラス化加温
後の障害を受けた Mt の除去が低調になることが明らかになった。同様に，マウス胚におい
 ＊国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構放射線医学総合研究所 主任研究員 
- 2 - 
 
ても加齢に伴って加温後の障害 Mt の除去が低調になることが明らかになった。さらに，若
齢マウス由来胚ではガラス化加温処理後に SIRT1 の発現上昇が認められたが，加齢由来胚
では，この SIRT1 発現上昇は認められなかった。また，どちらの種においても加齢由来卵
子内に AGEs が蓄積していることが明らかとなり，この AGEs の蓄積がガラス化保存に対
する SIRT1 の応答，それに続く MQC を阻害している可能性が示された。 
そこでメチルグリオキサールを用いて AGEs 蓄積モデルマウスを作成し，ガラス化加温
処理後の SIRT1 の応答性と Mt 動態を観察すると，AGEs の蓄積が SIRT1 の発現上昇を阻
害し，障害 Mt の蓄積を増加させることが明らかになった。 
これらの研究結果から，人為的な SIRT1 の活性化処理はガラス化に起因する障害 Mt の
回復および卵子や胚の品質を改善することが明らかになった。また，母体の加齢に伴ってガ
ラス化加温後の MQC が低調になっている原因として，卵子や胚に蓄積される AGEs があ
ることが明らかになった。得られた知見は，ヒトの生殖医療分野の発展や畜産振興に貢献で
きると考えている。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
胚の凍結技術は家畜生産やヒトの生殖補助に広く使われている。凍結保存は細胞内のミト
コンドリアに損傷を起こす。ミトコンドリアの質や数は厳密に管理されているがこのメカニ
ズムは外部から刺激することができ，また加齢によって弱まる。本研究では，損傷を受けた
ミトコンドリアの回復を外部から亢進させる手法を開発した。また加齢に伴いミトコンドリ
アの回復機構が弱くなることを示している。さらにその原因として，終末糖化産物の蓄積が
胚中の SIRT1を阻害することにあることを明らかにしている。この発見は新規であり，さら
に汎用性が広く，研究会や産業に与える恩恵が大きい。これらの研究成果等を詳細に検討し
た結果，審査委員一同は博士(農学)の学位を授与する価値があると判断した。 


加齢による終末糖化産物の蓄積が凍結融解後の胚のミトコンドリア品質管理に及ぼす影響

黄, インシユン

KOU, Inshun

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氏 名   黄  イ ン シ ユ ン 
学位（専攻分野の名称）   博 士（農学） 
学 位 記 番 号   甲 第 874号 
学位授与の日付   令和 5年 3月 17日 
学 位 論 文 題 目   ボツリヌス D 型毒素複合体の上皮細胞に対する細胞毒性と腸管 
組織への影響に関する研究 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（生物産業学） 相 根 義 昌 
               教 授・博士（獣医学） 丹 羽 光 一 
               教 授・博士（農芸化学） 中 澤 洋 三 
               名誉教授・博士（農芸化学） 渡 部 俊 弘 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
Clostridium botulinum は 150 kDa のボツリヌス神経毒素（BoNT）を産生する。BoNT
は，抗原性の差異により 7 つの異なる血清型（A-G）に分類される。A，B，E および F 型
は主にヒトのボツリヌス中毒を引き起こすが，C および D 型は動物や鳥類のボツリヌス中
毒の原因物質である。汚染食品に含まれる BoNT を経口摂取すると，消化管を経て腸壁に
到達し，腸壁のバリア機能を通過し循環器系に輸送される。亜鉛依存性プロテアーゼ活性を
持つ BoNT は，受容体介在エンドサイトーシスにより神経細胞に入り，神経伝達物質の放
出に関与する SNARE 複合体の標的タンパク質を血清型依存的な特異性に従って切断す
る。この過程で，ヒトや動物において筋肉の麻痺を引き起こす。 
 自然界で，BoNT は非毒非血球凝集素（NTNHA）や血球凝集素（HA; HA-33，HA-17，
HA-70）などの神経毒素関連タンパク質（NAP）群と会合して毒素複合体（PTC）の一部
として存在する。PTC は純粋な BoNT よりも高い経口毒性を示すため，NAP は食中毒に
おいて重要な役割を担っているものと考えられている。経口摂取された BoNT が小腸から
吸収されるまでの過程において，BoNT は，いくつかの障壁に遭遇することとなる。その
うちの一つの障壁として小腸壁が挙げられる。先の研究において，HA タンパク質を含まな
い遊離の BoNT 分子や BoNT/NTNHA 複合体であっても，小腸の上皮細胞を透過して輸送
されることが示されている。一方，HA を有する成熟体 PTC（L-PTC）では，HA-70 と HA-33
タンパク質上の 9 つの糖鎖結合部位の機能により，小腸上皮組織における毒素の透過が顕著
に促進されることが示されている。 
 先の研究において，Lee らは，A 型菌の産生する L-PTC が小腸上皮細胞間のカドヘリン
を切断し，上皮細胞間の細胞間相互作用を緩めることを示した。一方，Sugawara らは，C
型菌由来の HA 複合体が MDCK-I 細胞の細胞生存率に影響を与えることを示した。また，
Miyashita らは，D 型 L-PTC 由来の NTNHA/HA 複合体が in vivo で小腸絨毛に毒性を示
- 2 - 
 
すことを報告した。すなわち，ボツリヌス PTC は，小腸上皮細胞間の細胞間相互作用を低
下させる，あるいは上皮細胞に対する細胞毒性によって，上皮組織に対する通過輸送を促進
している可能性がある。また，C および D 型の L-PTC がラット小腸上皮細胞株 IEC-6 に対
して細胞質内の空胞化を伴う細胞死が引き起こすことが示されたが，これらの細胞毒性の機
構は未だ不明である。 
 本論文では，ボツリヌス PTC が，上皮細胞あるいは，小腸上皮に与える影響に着目し，
培養細胞やマウスを用いて研究を行なった。第 1 章では，A〜D 型 L-PTC の上皮細胞に及
ぼす影響について検討した。第 2 章では，D 型 PTC が，上皮細胞 NRK52-E 内の各種オル
ガネラに与える影響について検討した。さらに，第 3 章では，PTC のマウス小腸への影響
について検討した。 
 
第 1章 ボツリヌス PTC が各種上皮細胞株に与える影響 
本章では，A〜D 型由来 L-PTC が，各種上皮細胞株（ラット腸管上皮細胞株 IEC-6，ラ
ット正常腎臓細胞株 NRK-52E およびヒト咽頭癌由来細胞株 Hep-2）に与える影響を調べる
ため，毒素添加後の細胞の形態と生存率に及ぼす影響を評価した。その結果，C および D
由来 L-PTC から分離した NAP 複合体が，IEC-6 の細胞死と細胞質空胞形成の両方を誘導
することを明らかにした。一方，C および D 型 NAP 複合体は，NRK-52E において，細胞
生存率を顕著に低下させることなく空胞化のみを誘導することを明らかにした。A および B
型 NAP 複合体は，IEC-6 および NRK-52E 細胞の細胞生存率および細胞形態に影響を与え
なかった。また，いずれの型の NAP 複合体も Hep-2 細胞の細胞生存率および細胞形態に影
響を与えなかった。さらに，成熟型 L-PTC よりも HA-33/HA-17 三量体の少ない中間体
L-PTCの IEC-6とNRK-52E細胞における細胞生存率と細胞質空胞化への影響を評価した。
その結果，HA-33/HA-17 三量体の数が最大である成熟 L-PTC が最大の細胞毒性あるいは空
胞化活性を示した。すなわち，細胞生存率の低下と空胞化の誘導は，PTC 中の HA-33/HA-17
三量体の数に関係していることが明らかとなった。本研究では，C および D 型 L-PTC が
NRK-52E 細胞に対し，顕著な細胞死を引き起こすことなく細胞内空胞を誘導すること，す
なわち，緩慢な細胞毒性を示すことを明らかにした。C および D 型 L-PTC に対し，緩慢な
細胞毒性を示す上皮細胞モデルの発見は，毒素の経上皮輸送に重要な役割を果たす PTC の
未知の細胞毒性を解明するのに役立つと考えられる。 
 
第 2章 D 型 L-PTC 由来 NAP 複合体が NRK-52E 細胞のオルガネラに与える影響 
先の研究において，C および D 型 L-PTC 由来の HA 複合体や NAP 複合体が，いくつか
の上皮細胞に対し，細胞死や細胞内空胞形成を引き起こすことが明らかにされているが，こ
れらの細胞毒性のメカニズムについては，不明のままである。そこで，本章では前章におい
- 3 - 
 
て新たに見出した上皮細胞モデル NRK-52E を用いて，D 型 NAP 複合体が誘導する緩慢な
細胞毒性における NRK-52E 細胞内のオルガネラへの影響を検討した。まず，各種細胞内オ
ルガネラに特異的なマーカータンパク質と GFP 蛍光タンパク質の融合タンパク質を
NRK-52E 細胞内に発現させる系を構築した。これらの細胞に，D 型 NAP 複合体を添加し，
各オルガネラの形態の変化を観察した。その結果，D 型 NAP 複合体によって誘導された空
胞膜は，初期エンドソームあるいは後期エンドソームのマーカータンパク質と共局在してい
たことから，これらのエンドソームが巨大化することで空胞が形成されることが示唆された。
さらにゴルジ体の細胞内での局在にも変化が見られたことからNAP複合体がゴルジ体とエ
ンドソーム間の輸送にも影響を与えている可能性が示唆された。また，NAP 複合体が侵入
した細胞において，オートファゴソームのマーカータンパク質である LC3 が増加している
ことが示されたが，空胞膜と LC3 の共局在は見られなかった。このことは，NAP 複合体が
NRK-52E のオートファジーを誘導するが，空胞はオートファゴソーム由来ではないことを
示している。一方，小胞体やミトコンドリアなどのオルガネラには，影響が見られなかった。
また，空胞の膨張によると考えられるアクチンフィラメントや微小管などの細胞骨格に変化
が見られた。本研究において，D 型 NAP の細胞への侵入はエンドサイトーシスを介して侵
入しオートファジーを誘導することが示唆した。 
 
第 3章 D 型 L-PTC 由来 NAP 複合体のマウス小腸上皮組織への結合および侵入 
ボツリヌス L-PTC は，NAP 複合体を介して，動物の小腸上皮の特異的な細胞を認識し，
その細胞層を通過するものと考えられている。先の報告では，A 型 L-PTC 由来の NAP 複
合体は，小腸上皮の M 細胞上の GP2 タンパク質と結合し，腸管上皮細胞層を透過すること
が明らかとなっている。一方で，D 型 L-PTC 由来 NAP 複合体については，小腸上皮のど
の部位から侵入するのかについては，未だ不明のままである。本章ではマウス腸管結紮ルー
プモデルと免疫蛍光染色法を用いて，D 型 NAP 複合体が結合および侵入する腸管組織上部
位の特定を試みた。その結果，D 型 NAP 複合体は，絨毛の先端部領域において組織内への
侵入が確認された。一方で，M 細胞が豊富なパイエル板組織周辺において，D 型 NAP 複合
体の侵入は観察されず，GP2 タンパク質との共局在も確認されなかった。これらの結果は，
D 型 NAP 複合体は，A 型のそれとは異なる領域から吸収されていることを示している。ま
た， D 型 NAP 複合体は，A 型のそれと異なり，小腸上皮細胞上のカドヘリンや，細胞間
タイトジャンクションに影響を与えなかった。 
 
 著者は本研究により，未だ不明な点の多いボツリヌス PTC の動物体内への侵入機構に重
要な知見を示した。すなわち，ボツリヌス C および D 型 PTC 由来 NAP 複合体が，各種上
皮細胞に対し，異なる強度で細胞毒性を示すことを明らかにするとともに，NRK52-E 細胞
- 4 - 
 
が毒性メカニズムの解明に有用な上皮細胞モデルであることを示した。さらに，NRK52-E
細胞にマーカータンパク質と GFP 蛍光タンパク質の融合タンパク質を発現させる系を構築
し，これを用いることで D 型 NAP 複合体が上皮細胞内のオルガネラに与える影響を明らか
にした。最後に，マウス腸管結紮ループモデルと免疫蛍光染色法を用いて D 型 NAP 複合体
が，腸管組織のどの領域から体内へと侵入するかについて解明する手法を開発することに成
功した。 
 C および D 型ボツリヌス毒素複合体は，現在でも世界中で散発する家畜ボツリヌス症の
原因物質であり，その体内侵入メカニズムの解明は，家畜ボツリヌス症の予防や治療に繋が
る重要な知見となるものと期待される。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
本研究は，ボツリヌス菌が産生する毒素複合体が上皮細胞のモデル細胞と小腸上皮組織に
与える影響について，詳細に調べたものである。黄氏は，D型毒素複合体が特定の上皮細胞
に対して細胞毒性を示すことを明らかにした一方で，NRK-52E細胞に対しては，顕著に細胞
生存率を低下させることなく緩慢な細胞毒性すなわち空胞化のみを誘導することを示した。
これにより，毒素複合体が上皮細胞に与える影響について観察するに適した細胞モデルを提
案した。また，この細胞モデルを用い，細胞内小器官のマーカータンパク質を可視化するこ
とに成功し，細胞内に侵入した毒素が初期・後期エンドソーム，ゴルジ体に影響を与えるこ
と，さらにオートファジーを引き起こすことを明らかにした。さらに，マウス腸管を用いた
実験では，毒素複合体が，小腸絨毛の先端部分から侵入することを初めて示した。 
このように本論文は，現在，世界中で散発する家畜ボツリヌス症の原因物質である D型ボ
ツリヌス毒素複合体が生体内に侵入する作用機序の一端を解明するものであり，これらの研
究成果等を総合的に評価した結果，審査委員一同は博士（農学）の学位を授与する価値があ
ると判断した。 


ボツリヌスD型毒素複合体の上皮細胞に対する細胞毒性と腸管組織への影響に関する研究

武藤, 直氣

MUTO, Naoki

ダイコン(Raphanus sativus L.）におけるCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集育種の技術開発

Norma, Gecolea, Medina

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氏 名   Norma Gecolea Medina 
学位（専攻分野の名称）   博 士（農学） 
学 位 記 番 号   甲 第 886号 
学位授与の日付   令和 5年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   Evaluating growth and development of Ardisia pyramidalis (Cav.) 
 Pers. to tolerance to alkaline soil condition for introducing native 
 species in urban area, Manila City, Metro Manila, Philippines 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農学） 高 橋 新 平 
               教 授・博士（農学） 鈴 木 貢次郎 
               准 教 授・博士（農学） 田 中   聡 
                    博士（生物環境調節学）   Fernando C. Sanchez, Jr＊ 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
Urbanization has transformed the cityscape into a concrete jungle causing adverse environmental 
impacts on biodiversity, climate change, air quality, soil health and vegetation cover. This leads to a 
highly fragmented habitat with a low biodiversity; with the loss of some native species and replaced 
by non-native or exotic species. Soil environment is highly altered in urban area making it heavily 
compacted, excessively stony, and sandy soils causing limited, or inferior nutrient profiles needed for 
tree growth. This affects the soil pH as it becomes generally higher in urban than native area. This 
study aims to gain understanding on the utilization and growth performance of selected Philippine 
species, Ardisia pyramidalis (Cav.) Pers. in urban soil condition to boost its potential in achieving a 
resilient environment. Specifically, the study aims to identify and characterize the native and planted 
growing condition of A. pyramidalis in the Philippines; assess distribution and utilization of native 
and exotic species in the urban landscape; evaluate growth performance of A. pyramidalis to 
tolerance in alkaline soil condition; recommend or provide necessary information on the kind of 
species that can be planted in an urban landscape given the characteristics of the soil environment 
especially that the use of native species is still poorly understood in urban areas. 
 
Flow of the study In Introduction, a background about this study, utilization of native and exotic 
species in the urban landscape, gap of condition between urban area and natural area where native 
plants is distributed is discussed. In material, the reasons to select A. pyramidalis for this study. How 
to collect data of this study about soil pH of natural area and urban area through field survey, and 
field experiments were written in Methods and the original data that author had gotten in Results. 
 ＊フィリピン大学ロスバニオス校教授 
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The lack of data added to the results with references in Discussion. Conclusion is made based on the 
survey, experiment results and references in discussion. The original data that author had gotten were 
(1) soil pH where A. pyramidalis were distributed at pH range of 4.1-6.2 in San Mateo and Antipolo, 
Rizal and 6.7-7.0 in Agdangan, Quezon. (2) Urban soil pH, on the other hand, reaches around over 
7.0 to as high as 8.3. (3) Planted A. pyramidalis grows well at pH range of 5.1-7.5, and (4) For pot 
experiments, results showed pH ranging from 7.5-7.7 for control (untreated) and 8.3-8.7 for soil with 
lime addition. 
 
Plants material Ardisia pyramidalis (Cav.) Pers. is one of the Philippine native plants that has 
strong potential as landscape tree and high ornamental value because of its attractive flowers, and 
functional characteristics to enrich biodiversity. It is a slow-growing, evergreen small tree to 7m high. 
It has purplish-pink flowers in terminal panicles. It is commonly found and representative species in 
primary and secondary forest of low altitudes like Mt. Makiling in UPLB and in other areas in Luzon, 
Philippines like Antipolo and San Mateo, Rizal province. It is commonly used as an ornamental tree 
and is slowly being cultivated because of its potential in landscaping and ornamental value. A. 
pyramidalis was selected as they represent one of the native species that has strong potential as an 
ornamental tree in the urban landscape; as food because of its edible leaf; and as a medicinal plant 
because of its pharmacological properties as plant-based antiangiogenic agents as possible source of 
chemotherapeutic agent against tumors.     
 
Results of this study and discussion using with reference survey  
1. Metro Manila has several parks planted with different plant species and a mixture of native and 
exotic species. In some studies on selected urban parks, around 32% native and 50% exotic species 
were recorded, while others have documented 52% native species. 
2. Soil pH where A. pyramidalis was growing on field was obtained through field survey in 
coordination with expert and authorized people who can go to the site. A. pyramidalis is found to be 
naturally growing in Antipolo and San Mateo, Rizal and Agdangan, Quezon at pH range of 4.1-7.0. 
Antipolo soil series has parent material that is basalt and with clayey type of soil, low organic matter 
content and pH range of 3.5-4.9 while Agdangan belongs to Bigaa soil series. A. pyramidalis is 
known to be distributed in the Philippines and commonly found in secondary Dipterocarp Forest. 
Soil pH in the Philippines is characterized to be acidic area in upland areas with topsoil of pH of 
5.0-5.5 and even <5.0. The variation in the soil pH for the native soil can be attributed to the 
topographical features and vegetation found in the area.  
3. Depending on the parent material, soil pH varies and generally higher in urban soils than the 
- 3 - 
 
native soil and mostly in alkaline range from pH 7.0 to 8.6. In some countries like USA, pH ranges 
from 6.0-7.9; for China, pH ranges from 6.5-9.3. In the Philippines, City of Manila being one of the 
highly urbanized areas in the capital, has urban soil pH range of 6.7 - 8.3. The variations in the soil 
pH due to alterations in the natural landscape is one of the challenges in dealing with introducing 
new plant species in the area.  
4. Soil pH of planted growing condition of A. pyramidalis in Los Baños areas ranges from 5.1-7.5 
where they are also growing with other tree species.  
5. For field experiment on A. pyramidalis, two experimental set ups with alkaline soil conditions 
were done inside the University of the Philippines Los Baños, College, Laguna Philippines from 
October 2020 to December 2021. According to the experimental results, the change in the number of 
leaves, tree height and leaf sizes manifested a sharp decline in the early period of observation in both 
experiments which may be due to higher pH. The A. pyramidalis was able to grow well until soil pH 
7.5-7.7. However, the number of deaths were increased, number of leaves, tree height and leaf area 
were decreased at soil pH range of 8.3-8.7. As the amount of lime increases, it decreases the number 
of days after transplanting to maintain at least 50% of plants with more than one leaf. In some period 
of observation, though plants manifested poor performance, they were able to show some signs of 
growth like new shoots at higher pH (8.3-8.7).  
 
Conclusion High pH in the urban environment greatly influences the growth of plants particularly 
native species. A. pyramidalis is found to be naturally growing in area that showed acidic soil to 
almost neutral, pH 4.1-7.0. The urban soil showed alkaline soil, pH>7.5, sometimes over 8.0. The A. 
pyramidalis can grow well at around soil pH 7.5-7.7. Based on the experiment, the A. pyramidalis 
was able to grow at pH beyond its native soil condition although the number of leaf leaves, tree 
height and leaf area decreased. And pH 8.3-8.7 with lime addition, can be a critical point that may 
affect the survival of native species. Its tolerance to an alkaline soil condition is low as manifested by 
slow growth performance. 
 
都市の造園空間における在来種の活用 
－マニラ市（フィリピン共和国）のアルカリ性土壌下における Ardisia pyramidalisの生育耐
性－ 
生物多様性の向上等を目的として, 都市においても在来植物を造園に用いることが問わ
れている。都市の造園には，これまで多くの外来植物が人為的に用いられたが，都市環境に
在来植物を導入する視点は少なく，課題も多かった。特に都市環境での土壌は，固結化や貧
栄養化などの問題の他，構造物に使われるコンクリート等の影響によってアルカリ性になる
- 4 - 
 
傾向が強く，都市に在来種を植栽した際に多くの問題が起きている。本研究では，マニラ市
（フィリピン共和国）における在来種の利用実態を把握した上で，都市環境の土壌 pH とマ
ニラ市周辺に生育する在来種の生育地の土壌 pH との違いを調査し，都市の土壌 pH 下にお
ける在来種の生育耐性に関する実験を行った。 
［本研究の構成］本論は，研究目的，材料および方法，結果，考察，結論の構成になって
いる。研究目的では，フィリピン共和国マニラ市における造園に用いる植物材料の問題や，
生物多様性，都市と在来種の生育地との土壌環境の違いをあげた。そして在来種を都市空間
に導入する際の求めるべき課題を述べた。材料の章では，マニラ市に導入できる可能性の高
い在来種として Ardisia pyramidalis を選び，その理由について述べた。方法と結果では，自
ら行った実験や現地調査についてそれぞれ述べた。考察では，結果の知見に従来の知見を加
えて議論し，結論で本研究の成果をまとめた。 
［研究対象植物］都市に導入する在来植物として，マニラ市近郊に多く生育していること，
葉，花の形態，繁殖力，食用（料理用）としての利用の可能性，市場性などから A. pyramidalis
が極めて有望であり，これを研究対象植物とした。 
［結果及び考察］1.マニラ市内では，植栽に用いられている植物の約 50%が外来種であり，
在来種の導入の必要性を論じた。2.マニラ市内の土壌 pH には，東京等，他の国の都市と同
じくアルカリ性（7.0-8.0）を示す場合が多くあり，時に 8.0 を超えることもあった。3. 在来
種の A. pyramidalis が分布する現地土壌の pH は酸性（3.5-4.9）であった。4. 植栽された A. 
pyramidalis は，微酸性から微アルカリ性の土壌（5.1-7.4）で長年（約 10 年），生育，開花，
結実していた。5. 酸性土壌に生育する A. pyramidalis を，都市のアルカリ性土壌下に植栽す
るためには，アルカリ性土壌下における生育耐性を明らかにする必要があり，その実験を行
った。その結果，A. pyramidalis は pH 7.5-7.7 だけでなく pH 8.0 でも生育できた。pH 8.3-8.7
になると全葉を落とすまでの期間が短くなり，再び展葉することも少なくなった。 
［結論］マニラ市における造園において利用されることが少なかった植物材料としての在
来種の導入について，その課題を提示しながら，問題点を解決すべく実験や調査を行った。
マニラ市の土壌はアルカリ性を示す傾向が強い一方，マニラ市近郊に生育する在来種 A. 
pyramidalis の現地土壌の pH は酸性を示した。これらの異なる土壌 pH 下での生育の可否を
探るため，現地土壌を用いて実験を行い，A. pyramidalis は pH8.0 内外までであれば生育で
きるが，その値を超えると困難になることを明らかにした。都市に導入する在来種としての
植物材料の A. pyramidalis について，土壌の問題からの生育耐性を明らかにし，都市におけ
る生物多様性の向上のための在来種の利用の展望を考察した。 
 
 
 
- 5 - 
 
審 査 報 告 概 要 
 
生物多様性の向上を目的として, 都市での在来植物の導入が多く問われている。都市の土
壌は，アルカリ性になる傾向が強く，在来種を植栽した際に生育不良となる問題があげられ
ている。本論では，現地調査や実験，文献調査を行い，①フィリピン共和国マニラ市の造園
に用いられている植物は，概ね 50%が外来植物であること，②マニラ市内の土壌 pH は東京
等と同じくアルカリ性（7.5-8.0）を示すことも多く，時に 8.3 を超えることもあること，③
マニラ市の近郊に多く分布する在来植物の Ardisia pyramidalis が都市の造園に有望であるこ
と，④在来種の A. pyramidalis が分布するフィリピン近郊の現地土壌の pH を調べたところ，
酸性（3.5-4.9）であること，⑤マニラ市郊外の土壌（中性）に植栽された A. pyramidalis は，
長年（約 10 年）に亘って健全に生育・開花していること，⑥A. pyramidalis は pH8.0 内外ま
でであれば生育できるが，その値を超えると全葉を落とすことが多くなることを明らかにし
た。在来種としての A. pyramidalis の土壌 pH の問題に対する生育特性を明らかにしたこと
によって今後の都市における生物多様性の向上のための基礎的な知見を集積できた。これら
の研究成果等を詳細に検討した結果，審査委員一同は博士（農学）の学位を授与する価値が
あると判断した。 


Evaluating growth and development of　Ardisia pyramidalis (Cav.) Pers. Ｔo tolerance to alkaline soil condition for introducing native species in urban area, Manila City, Metro Manila, Philippines

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