Tokyo University of Agriculture Repository / 東京農業大学リポジトリ

桒田, 恵里

3610

KUWADA, Eri

3611

氏 名 桒 田 恵 里
学位（専攻分野の名称） 博 士（農芸化学）
学 位 記 番 号 乙 第 908 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 27 年 12 月 20 日
学 位 論 文 題 目 アロ MHC遺伝子の転写ターゲティングによるがん遺伝子
治療の新しい戦略―がん抗原遺伝子転写調節領域のがん治療
への応用―
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・農 学 博 士 山 本 祐 司
教 授・博士（農芸化学） 内 野 昌 孝
教 授・博士（農学） 阿 部 尚 樹
博士（薬学） 野 口 活 夫＊
論文内容の要旨
日本人の死亡原因の第 1位であるがんは，罹患者数，
死亡者数ともに年々上昇を続けている。がんの標準的な
治療法は，外科治療，放射線治療，化学療法であるが，
外科治療や放射線治療は局所的な治療であるため，診断
時に発見できなかったがんは治療することが出来ず，す
でに転移している場合には効果がない。また，化学療法
は全身的な治療ではあるが，正常な細胞にもダメージが
あるために強い副作用があり，QOL（Quality of Life :
生活の質）を低下させる上に，効果が見られないケース
が多いことも知られている。
がんの発生には遺伝やウィルスの感染など様々な要因
があり，その主な原因は紫外線や化学物質等による
DNAの損傷である。通常は DNA修復酵素により修復
されることでがん化することはなく，修復が追い付かな
い場合でも免疫機構が働いて変異細胞が排除される。し
かし，免疫力が低下している場合には，がん化した細胞
が排除されることなく増殖し，腫瘍を形成すると考えら
れている。
このような背景のもと，免疫力向上に着目した新しい
治療法の 1つとして注目されているのが免疫療法であ
る。免疫細胞療法は副作用がほとんどなく，全身的な治
療が可能なことで期待されている一方で，即効性がな
く，効果がはっきりしないという課題がある。また近
年，がんが免疫から逃れようとする力，すなわち免疫抑
制能力を持っていることが解ってきており，免疫抑制に
よる治療効果の低下が課題として残っている。このよう
に，これまで，そして現在でも世界中の多くの研究者に
よってがん治療の研究が進められているものの，未だ決
定的な治療法は確立されていない。
我々は，がんの効果的な治療法には ;
a. がん細胞特異的であること，b. 全身治療が可能であ
ること，c. 免疫反応を有効利用すること，d. 免疫抑制
を解除し，免疫誘導機構を効果的に利用すること，が必
要であると考え，これらを解決した有効性の高いがん治
療法を提供することを目的として，本研究を行った。
1． Q5遺伝子のがん細胞特異的発現解析
がん細胞に特異性の高い治療を可能にするために，が
ん細胞特異的に発現する遺伝子の発現調節機構を利用し
た遺伝子治療の可能性を考えた。がん細胞特異的な発現
をする遺伝子の候補としては，Q5抗原が様々ながん細
胞表面に発現し，同系マウスに対してがん抗原性を持っ
ているという江川らのマウスにおける血清学的研究結果
に着目し，Q5遺伝子の発現機構を応用することを考え
た。Q5遺伝子は，マウス第 17番染色体に存在する H-
2複合体，MHCクラスⅠ bの Q遺伝子領域の 5番目に
存在し，免疫学的に重要な機能を営む遺伝子群の中に存
在している。江川らの報告は血清学的試験の結果であっ
たことから，Q5遺伝子の発現ががん細胞特異的な転写
によるものかを確認する為，RT-PCR による遺伝子発
現レベルでの解析をはじめに行った。
まず，様々な系統のマウスの，様々ながん細胞株で Q
遺伝子群の発現について RT-PCR法で調べた結果，Q5
遺伝子のみが発現していることを確認した。正常細胞で
の発現は生体マウス組織を使用して検討し，ほとんどの
組織で発現は認められなかったものの，例外的に一部の
系統（k型）のリンパ球と胸腺のみで Q5遺伝子が発現
していることが示唆された。続いて，マウスにがん細胞
─ 116─
＊明治薬科大学 客員研究員
を皮下移植した担がん状態での発現について検討を行っ
た結果，がんの組織では発現が認められた。また，k型
の正常リンパ球と胸腺で認められた発現は担がん状態で
はほぼ認められなくなり，担がん状態では発現に抑制が
かかり基本的にがん組織のみの発現である事が示唆され
た。
これらの結果から，Q5遺伝子のがん細胞特異的な発
現は転写レベルで制御されている可能性が見出され，そ
の転写調節領域はがん細胞特異的遺伝子治療へ応用でき
る可能性が示唆された。
2． Q5遺伝子発現の転写調節領域の同定
全身的な遺伝子治療に応用することを前提に Q5遺伝
子の転写調節領域の同定を行い，導入効率が高く，安全
性の高いベクターに組み込むことで，特異性の高いがん
細胞特異的発現誘導ベクターの作製が可能と考えた。こ
れを実験的に検証する為に Q5上流 DNAを単離し，3.9
Kbの塩基配列を決定した。決定した配列はデータベー
スへの登録申請を行った（2004年 6月登録）。また，
PAPIAシステムの転写因子検索プログラムを使用して，
既知転写因子結合部位の確認を行った。Weiss等の報告
で既に知られている−203ベースまでの転写開始点上流
には，免疫系で機能することが報告されているクラス
I ・レギュラトリー・エレメント（CRE）と，インター
フェロン・コンセンサス・シークエンス（ICS）を有す
ることが確認できた。続いて，転写調節領域を同定する
ために Q5上流 DNAを様々な長さのフラグメントにな
るように調整し，それらの下流に luc（ルシフェラーゼ）
をレポーターとして配した組換えプラスミド，lacZを
レポーターとして配した組換えアデノウィルスベクター
の作製を行った。組換えアデノウィルスベクターは染色
体への組込み機構を持たず，遺伝子発現が一過性で安全
性が高いことから，治療用ベクターとして使用するには
適していると考えて選択した。
これらのプラスミドを in vitroでマウスの様々ながん
細胞株にトランスフェクションし，ルシフェラーゼアッ
セイで転写誘導活性を調べた。その結果，Q5 上流
DNAの長さの違いによる特徴的な差異はみられなかっ
たが，いずれも，どのがん細胞株においても高い活性を
示した。正常組織はマウス生体を用いて確認した。Q5
転写調節領域を利用した組換えアデノウィルスを尾静脈
から全身投与し，発現が最も高い 2日目に各臓器を採取
して凍結切片を作製し，x-gal染色した結果，どの長さ
も正常組織での発現は認められなかった。続いて，がん
の組織を調べるため，C57BL/6マウスに絨毛がんであ
るM5076細胞を尾静脈から静注して肝転移させた担が
んマウスを使用して検討を行った結果，がん組織ではど
の Q5 上流 DNA の長さでも発現が確認でき，in vitro
だけでなく in vivoでも，レポーターの転写ががん細胞
特異的であることが示唆された。追加確認として RT-
PCRでの確認も行い，これまでの結果と同様にがん組
織のみで lacZの発現を確認した。これらの結果から，
Q5遺伝子の転写調節領域はがん細胞特異的に機能する
ことが証明された。さらに，ヒトでの応用が可能かを確
かめるために，ヒト細胞株でもルシフェラーゼアッセイ
で検討を行った。その結果，がん細胞株では Q5転写調
節領域のどの長さでも高い転写が誘導された。正常 2倍
体細胞株 TIG-114を使用した結果では，Nco I（−829）
から Hind III（−2667）までの領域で転写が抑えられ
ることが判った。既に報告されていた−203ベースまで
では強く転写が誘導されていることから，新たな発見と
なった。また，AML-1結合部位が正常細胞での転写活
性低下に影響している可能性も示唆された。
これらの結果より，Q5転写調節領域と組換えアデノ
ウィルスを組み合わせることで，全身的ながん細胞特異
的発現誘導ベクターとして，がん治療に利用できる可能
性が示唆された。
3． 免疫反応を有効利用する検証
有効性の高い治療を可能にするため，このがん細胞特
異的発現誘導ベクターの Q5転写調節領域下流に配置す
る遺伝子について考えた。我々は MHC（major histo-
compatibility complex）主要組織適合遺伝子複合体に
関する知見から，「MHC class Ia抗原が古典的な移植抗
原として作用し，不適合の場合には移植片の強力な拒絶
反応を示すこと」に着目をした。そして，このアロMHC
遺伝子を治療用ベクターに組み込んで投与し，がん細胞
特異的に発現させることで人工的な拒絶反応を引き起こ
させる免疫遺伝子治療剤になる可能性があると考えた。
そこで，治療実験のモデルマウスに H-2b型，H-2k型
を使用することを前提に，Q5転写調節領域下流にはア
ロMHC遺伝子として BALB/c マウスの H-2Ddを配置
した組換えアデノウィルスベクターの作製（Ad/Q5-H-
2Dd）を行った。組換えアデノウィルスを精製後，その
発現は一過性であることを in vitroで確認した。
全身投与による治療実験は，H-2b型である C57BL/6
マウスにM5076細胞 2×105個を尾静脈から移植した肝
転移モデルを利用した。がん移植 5，7日目に，治療群
には 3×109pfuの Ad/Q5-H-2Ddを投与して経過を観察
した。その結果，無治療群は予備実験通り 14日目まで
─ 117─
に，空ベクター投与群では 15日目までに全例が死亡し
た。一方，Ad/Q5-H-2Dd投与群は有意な生存期間延長
が認められた。そこで，治癒過程での免疫反応を細胞レ
ベルで確認するため，細胞傷害性試験で検討した。標的
細胞には，M5076ワイルドタイプと，M5076に Ad/Q5-
H-2Ddを感作させて H-2Ddを発現させた細胞（M5076/
H-2Dd）を使用した。その結果，正常マウス由来脾細胞
はワイルドタイプに対しても傷害性を示したが，M5076/
H-2Ddに対しては有意に高い細胞傷害性を示し，正常
マウスはアロMHCに対する反応が強いことが確認でき
た。次に，治療実験で生存していたマウスから採取した
脾細胞と担がんマウスの脾細胞を用い，無治療群が全例
死亡した時期の解析を行った結果，ワイルドタイプに対
する細胞傷害性が，先の正常マウスの結果よりも有意に
低く，担がん状態では免疫能が低下していることが認め
られた。一方，M5076/H-2Ddに対しては正常マウスと
同程度であり，アロMHCに対する免疫反応は，無治療
群の担がん状態でも低下していないことが確認された。
これらの結果から，Q5転写調節領域下流にアロMHC
遺伝子を配置した Ad/Q5-H-2Ddの全身投与は，陰性対
象群と比較して有意な生存期間延長を示し，その効果は
最強の免疫誘導機構である同種移植片拒絶反応（アロ
MHCに対する反応）によるものであることが確認され
た。
4． 免疫抑制解除の効果，および二次獲得免疫誘導の検
証
Q5転写調節領域とアロMHC遺伝子を利用した組換
えアデノウィルスの全身投与による遺伝子治療で有意な
生存期間延長が認められたが，さらに治療効果を高める
ことが可能と考えた。近年，担がん状態では免疫が抑制
状態であり，がんの増大や治療効果の低下の原因になっ
ていることが示唆されている。この免疫抑制を解除する
ことが出来れば，より高い治療効果を得られる可能性が
ある。そこで，現在では免疫抑制に関わる抑制性 T細
胞（Treg）の活性を抑制することが明らかにされてい
る Cyclophosphamide（CY）を，副作用の起こらない
低用量を投与することで免疫抑制を解除しつつ，Ad/
Q5-H-2Ddとの併用効果を検討した。M5076肝転移モデ
ルを利用し，治療群はがん移植後 3日目に通常の 1/10
量の CY を腹腔内投与，8，10日目に Ad/Q5-H-2Ddの
全身投与を行った。その結果，無治療群は 14日目まで
に全例が死亡し，CY単独群も 15日目までに全例が死
亡した。一方，CYと Ad/Q5-H-2Dd併用群では 70%の
マウスが 35日以上生存する有意な生存延長が認められ，
併用の効果を確認することが出来た。
ここで，組換えアデノウィルスが全てのがん細胞に導
入されていないにも関わらず，がんが治癒していること
から，生存しているマウスにはM5076ワイルドタイプ
を拒絶するメモリー細胞が誘導されていると考えた。そ
こで，併用の検証で 35日目に生存していたマウスに
M5076ワイルドタイプの再移植を行い，Ad/Q5-H-2Dd
の投与は行わず，腫瘍を拒絶することが可能か検証を
行った。その結果，M5076を再移植して無治療にも関
わらず，治療を行った時と同様の有意な生存期間延長が
認められた。この治癒過程での免疫反応を確認するため
に，再移植約 3週間後に生存していたマウスを用いて解
析を行った。NK（Natural Killer）細胞や細胞傷害性
T細胞（cytotoxic T lymphocyte : CTL）など細胞性免
疫誘導の指標である IFN-g，抗体産生等に関わる液性免
疫誘導の指標である IL-4，Treg誘導等に関わる免疫抑
制の指標である IL-10の産生細胞について，各脾細胞を
用いた ELISpot assay で調べた。その結果，併用群で
は細胞傷害性に関与する IFN-g，及び IL4産生細胞が
多く，IL-10の産生細胞は少ないことが確認出来た。こ
の結果から，CY により Treg の活性が抑制され，誘
導・獲得された免疫が効果的に働いているものと考えら
れた。続いて，細胞傷害性の検証を行った。NK細胞の
表面マーカーである CD49，CTL が存在するかを確認
するためのキラー T細胞の表面マーカーである CD8a，
其々のビーズで脾細胞の選別を行い，標的細胞にM5076
ワイルドタイプを使用した。その結果，NK細胞の細胞
傷害性は正常マウスと治癒マウス共に高く，有意差はな
かった。一方，CD8＋T細胞の細胞傷害性は治療マウス
が有意に高く，ワイルドタイプが元々発現しているがん
抗原を認識している，つまり CTLが誘導されているも
のと考えられた。
これらの結果から，がん細胞特異的アロMHC発現遺
伝子治療剤の効果と，免疫抑制解除による治療効果の増
強が明らかとなった。その機序として，治療初期反応は
がん細胞特異的な同種移植片拒絶反応によるものであ
り，その後，二次的に誘導・獲得されたがん抗原を標的
とした抗腫瘍免疫反応の結果によるものであることが示
唆された。
総合考察
本研究により，がん細胞特異的な遺伝子発現機構と免
疫反応の有効利用による新しい免疫遺伝子治療を考案
し，それによって全身投与可能でがんの再移植も拒絶す
る高い治療効果を示すことが出来た。特に，再移植した
─ 118─
がん細胞を排除できたことから，臨床における再発予防
効果をも付与できる革新的な治療法になりうることが予
想される。現在では，遺伝子治療だけではなく，再生医
療にも応用される安全性の高いウィルス由来高分子や，
ナノテクノロジーに基づくさらに安全性の高い材料の
DDS開発も精力的に進められていることから，将来，
この新しい治療概念に基づく製剤が実用化されることが
期待される。
審査報告概要
本研究は，がん細胞特異的な遺伝子発現機構と免疫反
応の有効利用による新しい免疫遺伝子治療を考案し，そ
れによって全身投与可能でがんの再移植も拒絶する高い
治療効果を示すことを期待し，実験を進めた。その結
果，十分な効果が確認され，特に，再移植したがん細胞
を排除できたことから，臨床における再発予防効果をも
付与できる革新的な治療法になりうることが予想され
る。現在では，遺伝子治療だけではなく，再生医療にも
応用される安全性の高いウィルス由来高分子や，ナノテ
クノロジーに基づくさらに安全性の高い材料の DDS開
発も精力的に進められていることから，将来，この新し
い治療概念に基づく製剤が実用化されることが期待され
る。本研究は，がんに対する免疫療法を分子のレベルで
明らかにし，その新規性を評価した。
よって，審査員一同は博士（農芸化学）の学位を授与
する価値があると判断した。
─ 119─


アロMHC遺伝子の転写ターゲティングによるがん遺伝子治療の新しい戦略―がん抗原遺伝子転写調節領域のがん治療への応用―

田崎, 秀尚

TASAKI, Hidetaka

氏 名 田 崎 秀 尚
学位（専攻分野の名称） 博 士（畜産学）
学 位 記 番 号 甲 第 697 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 27 年 3 月 21 日
学 位 論 文 題 目 ブタ卵母細胞顆粒層細胞複合体の体外発育条件に関する研究
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士（農学） 岩 田 尚 孝
教 授・博士（畜産学） 桑 山 岳 人
助 教・博士（農学） 白 砂 孔 明
博士（農学） 塚 本 智 史＊
論文内容の要旨
卵母細胞の発育は顆粒層細胞との相互作用の下行われ
るが，大型の哺乳動物では発育に要する時間が長く，未
熟な卵胞卵母細胞を効率よく発育させる体外培養条件は
未だ確立されていない。本研究では，ブタをモデルに未
熟な卵母細胞顆粒層細胞複合体（OGCs）の体外培養条
件を改善するため，1）現状の体外培養にて得られる発
育卵子が，体内発育ではどのサイズの卵胞に該当するの
か，2）該当した卵胞サイズへの発育過程で，体内では
どのような変化が起こっているのか，3）解糖系が卵胞
発育中に亢進することを受け糖の効果と意義，4）ステ
ロイド合成が亢進することを受けエストラジオールの効
果と意義の解明に取り組んだ。
1） 体内及び体外で発育したブタ卵母細胞の比較
まず，生体内におけるブタ卵母細胞が発育に伴いどの
ように変化するのかを把握するため，卵巣より様々なサ
イズの卵胞を切り出し，内包される卵母細胞のサイズ，
クロマチンの形状および核成熟能力を比較した。次に，
前胞状卵胞（直径 0.2-0.3mm）と初期胞状卵胞（直径
0.5-0.7mm）から OGCsを切り出し，それぞれ 16日お
よび 28日間体外発育培養を行い，培養後に内包する卵
母細胞の直径，クロマチンの形状および体外成熟培養後
の核成熟率を比較した。その結果，前胞状卵胞由来で，
体外発育した卵母細胞は，直径 2mm，初期胞状卵胞由
来では直径 3mmの卵胞に内包される卵母細胞に相当す
ることが示された。そこで次に，これらの卵胞内の顆粒
層細胞群の特徴を調べるため，直径 0.5-0.7（培養前の
卵子に該当），1-3（培養後の卵子にに該当）および 5mm
以上（完全に発育した卵子に該当）の卵胞から OGCs
を取り出し，それらの顆粒層細胞を対象に網羅的遺伝子
解析を行った。その結果，卵母細胞を取り巻く顆粒層細
胞に起こる変化では，OGCsの発育に伴い解糖系が有意
に増加することやエストラジオール（E2）の合成に関
わる遺伝子群の有意な亢進が認められた。OGCsの体外
培養に用いられる基礎培地は塩類，アミノ酸，糖，そし
てステロイドホルモンから構成される。そこでまず，糖
の利用および E2に着目して検討を進めることにした。
2） エネルギー環境がブタ卵母細胞に及ぼす影響
卵胞液中に含まれるグルコース濃度はおよそ 5.5mM
であり，これは一般に OGCsの培養に用いられる培地
（aMEM）の含有量と等しい。しかし，血流の無い培養
容器中では OGCs近位部でグルコース濃度が低くなっ
ていると考えられる。また，糖尿病モデルのマウスの卵
子は小さく，減数分裂時に異常が起こることが示されて
いるが，高濃度のグルコースが OGCsの発育を促進す
るのか逆に卵子の質低下を招くかは不明である。そこで
高グルコース濃度条件として 11mMを設定し，これと
5.5mM（通常グルコース濃度）の間で卵母細胞の発育
を比較することにした。卵胞液の蓄積が開始した初期胞
状卵胞を対象とし，採取した OGCsを 2つのグルコー
ス濃度で培養した。すると高グルコース濃度条件は通常
濃度に比べ細胞のグルコース消費量を有意に増やし，培
養中の腔形成も向上させる傾向が観察された。しかし，
体外発育後の卵母細胞の直径，クロマチンの形状，ヒス
トンのアセチル化状態，核成熟および活性化処理による
発生率のいずれの指標においても 2つのグルコース濃度
間に差は観察されなかった。このため，高グルコース濃
度条件は OGCsの体外発育を大きく改善させる効果が
少ないと考えた。一方で，体内発育を終了した直径 3-5
mmの胞状卵胞由来卵母細胞の体外成熟培養時には，
高グルコース濃度条件は卵子の活性酸素含量を有意に増
─ 53 ─
＊独立行政法人 放射線医学総合研究所 主任技術員
加し，さらに胚盤胞期胚への発生能力を低下させた。こ
のことから，高グルコースの濃度の障害は，卵母細胞の
体外発育時よりも，後期の減数分裂再開以降に起こるこ
とが明らかになった。
3） ステロイドホルモンがブタ卵母細胞の体外発育に及
ぼす影響
卵母細胞の発育は前胞状卵胞以降に，形態的に大きな
変化が起こりその特徴として，ステロイドホルモン産生
と卵胞腔の形成がある。特にステロイドホルモンである
E2は，卵胞の発育に伴い卵胞液中に蓄積し，これは体
外で OGCsを培養した場合にも観察される。一方で，
E2の前駆体であるアンドロステンジオン（A4）の添加
が未発育卵胞の発育を促進する報告もあり，E2の卵胞
発育に対する効果に対しては E2そのものなのか，A4
なのか議論が分かれている。そこで，前胞状卵胞由来の
OGCsを対象に E2または A4が体外発育に及ぼす影響
を調査した。前胞状卵胞由来 OGCsの腔の形成は，E2
1mg/ml，A4 0.1mg/ml 添加時にそれぞれ最大の促進効
果が観察された。また，A4添加培地では，腔の形成以
前に既に多くの E2を産生している OGCsにその後高い
発育能力が認められることが明らかとなった。さらに，
E2レセプターの阻害剤であるフルベストラントの添加
によって，E2，A4共に腔形成促進効果が阻害されたこ
とから，添加もしくは分泌した E2が OGCsの発育に重
要な役割を持つことが示された。この E2の感受性には
卵胞のステージ間で差が認められ，卵胞形成を開始した
初期胞状卵胞由来 OGCsの場合，E2非添加条件におい
て発育が観察された。そこで E2は腔形成を惹起し，一
度刺激されると必要性が低下するのではないかと考え
た。前胞状卵胞由来 OGCsを培養初期の 4日間だけ E2
暴露したところ，予想どおりその後 E2非添加の条件下
でも発育した。さらに，E2非添加条件で 4日間培養後
に E2を添加した場合では，腔の形成を含む発育が 4日
の遅延が見られたことから，E2は OGCsの発育のきっ
かけとして働くことが明らかとなった。
審査報告概要
大動物の未熟な卵胞卵子を体外で効率的に発育させる
培養系は確立されておらず，卵子の発育に必要な要因や
その意義は明らかにされていない。本研究では，ブタの
未熟な卵胞卵子の体外培養条件を新たに設定し，体内で
発育した卵胞卵子とクロマチンの状態，ヒストンの修
飾，卵子の直径等形態的指標と網羅的な遺伝子発現解析
を用いて，グルコース濃度やエストラジオールが卵胞発
育に重要な要因であることを明らかにした。さらにグル
コース濃度の増加は，初期胞状卵胞卵子の培養初期では
解糖系を亢進させることが必要であるため正の，減数分
裂を行う後期では負の効果を持つことを見出した。ま
た，エストラジールやその前駆体及び阻害剤の組み合わ
せにより卵胞形成はエストラジオールに暴露されること
が起点となっていること，エストラジオールには卵胞発
育を促進する効果がある事を明らかにした。本研究では
大動物の卵胞培養方法の改善に関して新規性のある知見
を得た。
よって，審査員一同は博士（畜産学）の学位を授与す
る価値があると判断した。
─ 54 ─


In vitro growth of porcine oocyte-granulosa cell complexes

御手洗, 洋蔵

MITARAI , Yozo

園芸ボランティア活動における参加者特性と活動展開の方策について　―厚木市と札幌市を事例として―

東京農業大学博士（バイオサイエンス

望月, 大地

MOCHIZUKI , Daichi

Amphibacillus xylanusの好気代謝系に関する研究

石川, 裕太

ISHIKAWA, Yuta

牛糞堆肥を施用した畑地における大腸菌の流出抑制に関する研究

東京農業大学博士（農業経済学

Ou, Ratanak

Using Choice Experiments to Estimate the Values of Community Based Natural ResourceManagement in Cambodia

中村, 彰宏

NAKAMURA , Akihiro

氏 名 中 村 彰 宏
学位（専攻分野の名称） 博 士（バイオサイエンス）
学 位 記 番 号 甲 第 664 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 26 年 3 月 20 日
学 位 論 文 題 目 マウスにおけるリン酸飢餓ストレスに対する生体反応に関す
る研究
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・農 学 博 士 河 野 友 宏
客員准教授・博士（理学） 宮 戸 健 二
博士（理学） 乾 雅 史＊
博士（理学） 中 林 一 彦＊
博士（理学） 松 田 明 生＊
博士（理学） 岡 本 龍 史＊＊
論文内容の要旨
【目的・背景】
リンは生命にとって欠かすことのできない元素でカル
シウムやマグネシウム，ナトリウムなどとともに必須元
素の一つとされている。生体内でリンは遺伝情報の保
存・伝播を担う核酸や，生体内で利用されるエネルギー
の保存および運搬を担う ATP，また生物の基本単位で
ある細胞を形作る細胞膜の主要な構成成分であるリン脂
質などの構成要素として全ての組織，細胞に存在してい
る。このように生理機構で最も本質的な役割を果たして
いる元素の一つであることから，リンが生命に必須な元
素であると考えられているものの，その生理機構や役割
については明らかにされていない。そこで本研究では，
マウスを用い低リン飼料を与えることでリン栄養飢餓状
態を誘導し，この実験環境下におけるマウスを解析する
ことによりリンの生理的役割やその機能について検討を
試みた。また，普遍的に存在するリンの欠乏は栄養飢餓
状態であり，一つの元素の飢餓ストレスに対し生体がど
のように対応するかについて検討を行った。
【実 験】
＜リン酸飢餓状態でのマウスの発生・成長に関する研究＞
方法）離乳後から低リン飼料（通常飼料の 2割以下のリ
ン含有量）により飼育し，体重および産仔数などについ
て検討を行った。
結果）低リン飼料群（Low phosphorus diet : LPD）と
通常飼料群（Normal phosphorus diet : NPD）では離
乳後の体重増加に違いは認められなかった。また，自然
交配により産仔を得ることができ，その産仔数にも有意
な差は認められなかった。しかしながら，LPD の仔
（LPD-2）では，乳仔期の体重増加が NPDの仔（NPD-
2）に比べ遅く，成長に従い NPD-2群と LPD-2群間の
体重差は大きくなった。
考察）離乳後の個体成長に低リン飼料を与えたことによ
る大きな影響は認められなかったものの，仔どもの成長
に影響が認められた。乳仔期の唯一の栄養源は母体から
分泌される母乳であることや，成長に伴い通常飼料を摂
取している NPDの仔である NPD-2との体重の差が大
きくなることから LPD-2群の体重増加の遅滞が母乳に
原因があると考えられた。
＜母乳成分の比較とリン摂取制限による母乳への影響に
ついての検討＞
乳仔期において仔の体重増加の遅滞が認められたた
め，母乳に原因があると考え，母乳の成分について比
較，検討を行った。
方法）母乳の成分を比較するにあたりまず，SDS-ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）を用い
て母乳中タンパク質成分を分離し，組成について比較を
行った。次に，母乳におけるリン摂取制限の影響を検討
するために誘導結合プラズマ質量分析法（ICP-MS）を
用いて母乳中のリン成分について定量し，比較した。さ
らに，透過型電子顕微鏡（TEM）解析により母乳中成
分の超微形態学解析を行った。
結果）まず SDS-PAGEの結果から，LPDの母乳（Low
phosphorus milk : LPM）では NPD の母乳（Normal
─ 25 ─
＊国立成育医療研究センター
＊＊首都大学東京准教授
phosphorus milk : NPM）より b-カゼインタンパク質
が少ないことが示唆された。次に，ICP-MSの解析の結
果から LPDの母乳中のリン濃度が NPDのそれよりも
低いことが示された。そして，TEM 解析の結果から
LPMの脂肪滴の膜の脆弱性や，カゼインタンパク質と
思われる粒子が NPMに比べわずかに少なく，また，カ
ゼイン粒子が LPMでは大きくなりにくい傾向があるこ
とが示唆された。
考察）母乳中に含まれるカゼインの大きな役割の一つと
してリンの運搬があげられる。リンはカゼインの微粒子
と結合し，カゼイン微粒子を凝集させカゼインタンパク
質を形成している。リンの摂取制限により LPD体内の
リンが減少したことにより，カゼインタンパク質の形成
に関して，大きさ，数ともに制限されたのではないかと
推測された。
＜関節および骨形成に対する影響＞
脊椎動物において，生体内のほとんどのリンは骨組織
内に存在することが知られている。そこで，低リン環境
下での骨に対する影響について解析を行った。
方法）まず，NPD および LPD の膝関節のパラフィン
切片と超薄切片を作製し，光学顕微鏡，偏光顕微鏡，透
過型電子顕微鏡を用いて形態学的解析により解析を行っ
た。また，軟骨組織に変成がみられたことから，定量
PCR（polymerase chain reaction）と，免疫蛍光染色
法を用いて膝関節内の 1型および 2型コラーゲンの発現
解析を行った。さらに生体内のリン制御因子として知ら
れる繊維芽細胞増殖因子（Fibroblast growth factor :
FGF）23が骨形成等への関与が示唆されることから，
血中の FGF23タンパク質についてウェスタンブロット
法を用いて解析を行った。
結果）膝関節の HE 染色の結果，膝関節軟骨における
異染色性が認められ，偏光顕微鏡による複屈折特性の解
析の結果，LPDの軟骨組織の変成が示唆された。さら
に膝関節におけるコラーゲン発現解析の結果，LPDで
は 1型および 2型コラーゲンの発現異常が認められた。
考察）以上の結果から，LPDの膝関節において遺伝子
発現異常を伴う，骨化の亢進が考えられた。リンとカル
シウムの化合物であるリン酸カルシウムが骨の主要な成
分であることから，本実験での低リン環境において，骨
基質の脆弱化や骨の伸長不良を含めた形成不全が予想さ
れたが，得られた結果では骨基質ではなく，軟骨成分が
骨化するという予想とは異なる結果が得られた。
FGF23はリン制御因子であると同時に，骨細胞の石灰
化への関与も示唆されていることから，低リン環境下に
おいて FGF23の発現が低下し，石灰化が亢進した可能
性も考えられたが，LPDの血中にも FGF23は検出され
た。ただし，今回 FGF23の検出にはウェスタンブロッ
トを用いており，ELISA法などによる定量的解析によ
り明らかにする必要がある。
＜生体機能の維持における無機リン酸重合体の生理的役
割＞
リンは全ての生物に必要な栄養素である。植物では種
子の中に大量にフィチン酸としてリンを大量に蓄積して
いることが知られており，大腸菌や酵母においてもスト
レス環境下でリンを重合させポリリン酸として蓄積して
いることが知られている。このポリリン酸は哺乳類の組
織内にも存在していることは知られているが，その機能
などについては明らかにされていない。そこで，遺伝子
改変マウスを用いてポリリン酸の哺乳類生体内における
機能と生理的役割について解析を行った。
方法）酵母由来のポリリン酸分解酵素遺伝子をマウスゲ
ノムに導入することで，体内でポリリン酸分解酵素を発
現させる遺伝子改変（Tg）マウスを作製した。この Tg
マウスについてエネルギー代謝を解析することで，ポリ
リン酸のエネルギー産生に対する役割について検討し
た。解析にあたっては，まずルシフェラーゼ法により組
織中の ATP量を測定し，さらに DAB染色によるミト
コンドリアの活性評価，および血中乳酸値の比較により
中心的なエネルギー産生経路である TCA回路の活性に
ついて解析を行った。
結果）組織中の ATP量について野生型（Wt）と Tgマ
ウスを比較した結果，Tg マウスで有意に ATP 量が減
少していることが明らかになった。次に DAB染色によ
りミトコンドリア活性について比較を行った結果，Tg
マウスではミトコンドリアの活性が低下していることが
示唆された。これらの結果から Tgマウスではミトコン
ドリアの活性が低下したことによって ATP産生量が減
少したものと考えられた。さらに解糖系回路の終末代謝
産物である乳酸の血中濃度を比較した結果，Tgマウス
で有意に増加していることが示された。
考察）以上のことから，Tgマウスではミトコンドリア
の活性が低下したことにより，ATP産生能が低下し，
組織中の ATP量が減少したと同時に，解糖系により産
生されたピルビン酸が TCA回路で代謝されなかったこ
とにより血中の乳酸値が上昇したと推測された。しか
し，ポリリン酸の分解によってミトコンドリア活性が低
下する原因は明らかでない。酸化的リン酸化反応にポリ
リン酸が関与していることは考えられる一方で，Tgマ
ウスでは重合体が分解されてはいるものの，リン酸量は
減少していないと考えられることから，リン酸供給量が
─ 26 ─
減少したことによる影響とは考えにくい。微生物を用い
た研究から，ポリリン酸には多様な機能が示唆されてお
り，その中には，キレート作用や発現制御，タンパク質
の機能制御なども含まれ，哺乳類のエネルギー代謝に関
してもポリリン酸が制御因子として関与している可能性
が高いと思われる。
＜ストレス環境下での生殖機能とエネルギー代謝の解析＞
普遍的に存在するはずの栄養素であるはずのリンの減
少は栄養飢餓状態とも考えられる。飢餓状態において生
物はエネルギー消費を抑制するために，種としては有性
生殖への投資の縮小，また個体では休眠などの生存戦略
が広くみられる。
方法）生殖機能を評価するために NPD-2間の自然交配
による産仔数と LPD-2間の自然交配によって得られた
産仔数を比較した。さらに新生仔の性比について PCR
を用いて Sry遺伝子を検出することにより解析した。
結果）自然交配により両群から産仔を得ることができ
た。しかし，LPD-2の産仔数の減少が示された。次に，
新生仔の性比を比較したところ，雄では NPD-2，LPD-
2間に有意な差は認められないものの，雌については
LPD-2で有意に減少していることが明らかになった。
このことから，LPD-2の産仔数の減少が新生仔の雌特
異的な減少に起因することが明らかになった。そこで，
胎齢 12.5日と 14.5日の時点で胎仔の性比を調べた結
果，12.5日では LPD-2 の胎仔にも性比の偏りはないも
のの，14.5日の時点では新生仔同様の性比の偏りが認
められた。
考察）該当時期はマウス胎仔にとって器官形成という発
生段階から個体成長の段階への移行期である。この移行
に伴い，胎齢 13日前後に軟骨形成がはじまり，徐々に
骨形成が始まる。この際，骨の主要な成分であるリン酸
カルシウムの需要度は高まることが推測される。さらに
リンはこの時期，代謝制御に関わるミクロ栄養としても
重要な役割を果たしているものと考えられる。骨の主要
成分の減少の結果として，骨形成不全や骨の縮小も考え
られた。しかしこのような結果がみられなかったことか
ら，リン低下を原因とした代謝異常が胎仔の死因ではな
いかと考えられる。
【結 論】
本研究の結果，ミネラルでありミクロ栄養に分類され
るリンは個体成長に利用されるエネルギーではないもの
の，エネルギー産生機構には大きな役割を果たしている
ことが示唆された。特に，リン需要期とも言える時期が
胎仔期から乳仔期に存在し，この時期，充分なリンが供
給されない状況では乳仔では成長の遅滞がみられる。こ
れはリンの減少が直接的な原因ではなく，それに伴うタ
ンパク質（カゼイン）の乳仔への供給量が減少するため
と考えられる。さらにこの時期に低リン環境に暴露され
た場合，成長後の軟骨の変成や産仔数の低下が引き起こ
されるという結果が得られた。
審査報告概要
平成 26年 2月 10日（月）11時 00分から 11号館 2
階バイオサイエンス専攻講義室にて，本専攻における学
位請求のための公開発表会を開催した。学位請求者中村
彰宏氏は，50分間の口頭発表を行い，その後 20分間の
質疑応答を受けた。発表終了後，12時 20分よりバイオ
サイエンス学科会議室において，主査，副査と専攻委員
による審査会議を開催し，提出論文の内容と本人発表な
らびに質疑応答について慎重に審査した。その結果，学
位請求者の経歴や学術業績が学位記申請の要項を満たし
ており，質疑に対する応答が適切だと判断した。さら
に，公表論文に関与した共同研究者との間で学位取得に
関して問題がないことを確認した。
よって，審査員一同は博士（バイオサイエンス）の学
位を授与する価値があると判断した。
─ 27 ─


マウスにおけるリン酸飢餓ストレスに対する生体反応に関する研究

東京農業大学博士（食品栄養学

吉岡, 泰淳

YOSHIOKA , Yasukiyo

氏 名 吉 岡 泰 淳
学位（専攻分野の名称） 博 士（食品栄養学）
学 位 記 番 号 甲 第 668 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 26 年 3 月 20 日
学 位 論 文 題 目 中国産食用茸ツブイボタケ（Thelephora vialis）含有 vi-
alinin Aの RBL-2H3細胞における TNF-c産生阻害メカ
ニズムの解明
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士（農学） 阿 部 尚 樹
教 授・農 学 博 士 上 原 万里子
教 授・博士（農芸化学） 冨 澤 元 博
教 授・博士（農学） 矢 嶋 俊 介
准 教 授・博士（薬学） 小野瀬 淳 一
准 教 授・博士（理学） 矢 島 新
論文内容の要旨
食材に含有される新規生体調節機能成分を明らかにす
るため，古くから生薬や薬膳などに用いられ生体調節機
能が知られているものの，その作用因子が未知である食
用茸，特にその種類が多い中国産食用茸に着目し，生体
調節機能因子の検討を行った。その過程において，ツブ
イボタケ（Thelephora vialis）の乾燥子実体より強い抗
酸化活性を有する複数の p-terphenyl化合物を見い出し
た（C. Xie et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2005）。
特に新規物質として構造決定した vialinin Aは，ラッ
ト好塩基球系 RBL-2H3細胞において，抗体を介する刺
激による炎症性サイトカイン TNF-a放出を IC50値 0.09
nM という低濃度で抑制した（J. Onose et al. Biol
Pharm. Bull., 2006）。この阻害活性は，臨床で使用さ
れている免疫抑制剤タクロリムス（IC50＝0.25nM）よ
りも強いものであった。炎症性サイトカイン TNF-aの
産生は病態との関連において，自己免疫疾患としてその
治療法の確立が急がれている関節リウマチとの関連性が
特に強く示唆されていることから，新たな産生阻害メカ
ニズムの解明は関節リウマチの効果的な治療法開発にも
つながるものであると共に，vialinin Aをプローブとし
て使用することで細胞内における未知の免疫制御機構の
解明につながる可能性を与えるものである。そこで本研
究では，標的分子探索プローブを用いることにより，
vialinin Aの細胞内標的分子を明らかにし，その分子と
vialinin Aおよび TNF-a産生との関連性を解明するこ
とを目的とした。
1． Vialinin 類の TNF-c 発現阻害活性メカニズムの
検討
有機合成的手法により vialinin A並びに atromentin
などツブイボタケ含有の p-terphenyl化合物の全合成を
達成し，これらの天然物並びに合成中間体を用いて構造
活性相関を検討した結果，vialinin Aのファーマコフォ
アを特定し，化学的に安定な構造を有する活性アナログ
である 5′, 6′-dimethyl-1,1′: 4′. 1″-terphenyl-2′, 3′, 4,4″-
tetraol（DMT, IC50＝0.02nM）を得た。TNF-a放出阻
害活性について詳細に検討したところ vialinin A及び
DMTは，細胞外への TNF-a放出は濃度依存的に抑制
するにも関わらず，細胞内での産生に対しては低濃度で
強力に抑制がみとめられるものの，濃度上昇に対し依存
性を示さないという特徴的な阻害様式を有することが観
察された。陽性対照として用いたタクロリムスなどは，
TNF-a放出及び産生ともに濃度依存的に抑制すること
から，vialinin A は，TNF-a の産生と放出それぞれを
別途に阻害するという新たなメカニズムにより強力な
TNF-aの放出阻害を誘導する可能性が強く示唆された
（J Onose et al. Cell. Immunol., 2012）。
2． Vialinin A標的分子の探索
Vialinin Aは新規経路による TNF-a発現阻害活性を
有することが示唆されたことから，vialinin A活性アナ
ログである DMTをリード化合物として biotin標識プ
ローブを調製し，RBL-2H3細胞中の vialinin A標的分
子の探索を検討することとした。
DMTの 4位のヒドロキシ基をメトキシ基及びメトキ
─ 40 ─
シメチル基に変更した 4-Me-O-DMT 及び 4-MOM-O-
DMT が，TNF-a 放出阻害活性試験においてそれぞれ
IC50値 0.35nM及び 0.34nMを与えることから，DMT
の 4位のヒドロキシ基部分に 1,2,3-トリアゾール環を含
むリンカーを介してビオチン標識したプローブ biotin-
DMT を調製した。Biotin-DMT は，IC50値 8.15nM の
TNF-a 放出阻害活性を示した。一方，DMT の 4位の
ヒドロキシ基にクマリニル基を蛍光発色団として導入し
た蛍光プローブを用いた細胞内取り込み実験を実施した
ところ，細胞内への透過性はリンカーの構造により影響
を受けることが示唆された。この知見を基にして RBL-
2H3細胞ライセートを用い，標的分子の探索を行うこ
ととした。さらに，別途 biotin-phenolを調製しこれを
対照として用いた。
RBL-2H3細胞ライセートを biotin-DMTで処理し，
ストレプトアビジンビーズへのアフィニティーを用いて
細胞内標的分子を抽出後，溶出を行い，SDS-PAGEに
て分画を行った結果，biotin-DMT処理サンプルの 100
kDa付近に特異的なバンドが検出された。このバンド
をMALDI-TOFMSスペクトルを PMF法により解析し
た結果，脱ユビキチン化酵素の 1つである ubiquitin-
specific peptidase 5 / isopeptidase T（USP5/IsoT, EC
3.1.2.15）と同定され，この分子が RBL-2H3細胞中の
vialinin A標的分子であると予想した。そこで，大腸菌
において，human USP5を発現させる系を構築し，re-
combinant hUSP5を調製した。hUSP5を用いて，via-
linin A及び DMTと biotin-DMTとの競合阻害実験を
行ったところ，vialinin A及び DMTともに biotin-DMT
の hUSP5への結合に競合することが認められた。この
結果から，biotin-DMTの hUSP5への結合は，vialinin
A及び DMTの結合と同様なサイトを介していることが
示唆された（K Okada et al. Bioorg. Med. Chem. Lett.,
2013）。
3． Vialinin A標的分子 USP5の発現と TNF-c産生
との関連性の検討
USP5が vialinin Aの標的分子であることが示唆され
たことから，vialinin A及び DMTの hUSP5に対する
酵素活性阻害試験を行った。hUSP5は細胞質内のフ
リーのポリユビキチン鎖をモノユビキチンへと加水分解
する活性を有していることから，市販のユビキチンテト
ラマー鎖を基質に用いて酵素活性阻害を検討した。その
結果，vialinin A及び DMTは，強力にテトラマーのポ
リユビキチン鎖の加水分解を阻害することが観察され
た。また，蛍光基質 Ub-AMCを用いて，vialinin Aの
hUSP5に対する酵素活性阻害実験においても，viali-
nin A は，強力に hUSP5酵素活性を阻害する（IC50 :
5.9mM）ことが認められた。
Vialinin A が hUSP5酵素活性阻害を示したことか
ら，他の市販脱ユビキチン化酵素（USP4，USP2 core，
USP8，UCH-L1，UCH-L2）に対する酵素活性阻害試
験も実施した。それぞれの脱ユビキチン化酵素に対する
IC50値は，USP4 : 1.5mM，USP2 core : 30mM，USP8 :
＞30mM，UCH-L1 : 22.3mM，UCH-L2 : ＞30mM を与
えたことから，半特異的な酵素阻害活性を示した。
Vialinin Aが複数の脱ユビキチン化酵素に対して酵素
阻害活性を示したことから，USP5 酵素阻害活性と
TNF-a 放出阻害活性との関係を明らかにするため，
RNA干渉を用いて複数の脱ユビキチン化酵素の発現と
TNF-a 発現の関連性について検討することとした。
Vialinin Aの標的分子である USP5，vialinin Aにより
強力な酵素活性阻害を受ける USP4，USP5と類似のド
メイン構造を有する USP13について，それぞれ数種の
siRNAを設計し，Lipofectamine RNAiMAXを用いて，
それぞれ USP5，USP4，USP13ノックダウン細胞を調
製した。それぞれの細胞を用いて，リアルタイム PCR
によるmRNAレベル及びウェスタンブロッティングに
よるタンパク質レベルでの各脱ユビキチン化酵素の発現
を検討したところ，それぞれ標的とする脱ユビキチン化
酵素の有意な発現減少を確認した。そこで，これらの
ノックダウン細胞を用いて，抗体を介する抗原刺激によ
る TNF-a放出試験を実施した。その結果，USP4及び
USP13をノックダウンさせた細胞からの TNF-a放出量
には有意な変化がなかったのに対し，USP5をノックダ
ウンさせた細胞からの TNF-a放出量には，有意な減少
が観察された。この結果から，次に USP5が TNF-aの
産生または放出のいずれに関与しているかを明らかにす
るため，まず，細胞内に残存する TNF-a量と細胞外に
放出された TNF-a量の和としての TNF-a産生に対す
る影響について検討を行った。その結果，USP5発現を
有意に減少させた細胞においては，TNF-a産生量の有
意な減少が観察された。さらに，転写レベルにおいても
TNF-a mRNA発現量に有意な減少を確認した。
USP5ノックダウン細胞において TNF-a mRNA発現
量の減少が観察されたこと，また TNF-a は転写因子
NF-kBにより転写誘導されることが知られていること
から，NF-kBの活性発現を制御する細胞質内 IkBの分
解量について検討を行った。NF-kBは細胞質内におい
て IkBと複合体を形成しており，ユビキチン-プロテア
ソーム系において IkB が分解されることにより，NF-
─ 41 ─
kBは核内に移行し，TNF-aの転写を誘導する。抗体を
介する抗原刺激 RBL-2H3細胞において，刺激後 5分か
ら 10分後に IkB の分解が起こり，TNF-a は転写誘導
されることが知られている。Vialinin Aで処理した細胞
での IkBの分解は，5分から 10分において有意な減少
が観察された。さらに，USP5ノックダウン細胞におい
て検討したところ，有意な IkBの分解の減少が認めら
れ，vialinin A 処理と同様の現象が観察された（Y
Yoshioka et al. PLoS ONE, 2013）。
4． 結 論
中国産食用茸ツブイボタケ（Thelephora vialis）より
新規物質として構造決定した vialinin Aは，TNF-aの
産生と放出それぞれを別途に阻害するという特徴的な阻
害様式をもつことが示唆され，それは臨床で免疫抑制剤
として使用されているタクロリムスなどとは異なること
から，未知の新規経路による阻害メカニズムの介在が予
想された。Vialinin Aの RBL-2H3細胞における TNF-
a発現阻害メカニズムの検討のため，biotin標識プロー
ブを調製し，vialinin A標的分子の探索を試みた結果，
脱ユビキチン化酵素の 1つである USP5を同定した。
Vialinin Aは，USP5を含む複数の脱ユビキチン化酵素
の酵素阻害活性を有することから，RNA 干渉を用い
て，それぞれの脱ユビキチン化酵素の発現と TNF-a発
現とを比較したところ，USP5をノックダウンさせた細
胞でのみ TNF-aの産生量及び放出量，転写量の減少が
観察された。さらに，TNF-aの転写因子 NF-kBの抑制
因子である IkBの分解についても検討した結果，viali-
nin A処理細胞と同様，USP5ノックダウン細胞におい
ても IkBの分解の減少が観察された。
これらの結果より，本研究において USP5の酵素活
性が炎症性サイトカイン TNF-a産生に関与していると
いう新たな制御機構を明らかにし，中国産食用茸ツブイ
ボタケの含有機能性因子である vialinin Aは細胞質内
の USP5の酵素活性を阻害することにより，IkB の分
解阻害を介して TNF-aの産生を阻害することにより抗
炎症作用を発現する可能性が示唆された。
審査報告概要
ツブイボタケに含有される vialinin Aが，TNF-aの
産生と放出，それぞれを阻害するという特徴的な阻害を
示すことを見いだし，その阻害メカニズム検討のため，
biotin標識プローブを調製，細胞溶解物中より標的分子
を分離し，USP5と同定した。RNA干渉を用いて，検
討を行ったところ，TNF-aの産生量及び放出量，転写
量の減少が USP5をノックダウンさせた細胞でのみ観
察され，さらに，TNF-aの転写因子 NF-kBの抑制因子
である IkBの分解についての検討から，vialinin A処理
と同様，USP5ノックダウン細胞においても IkB の分
解の減少が観察された。以上の結果により，USP5の酵
素活性が TNF-a産生に関与しているという新たな制御
機構を明らかにし，さらに，vialinin A は細胞質内の
USP5の酵素活性を阻害することにより，IkBの分解阻
害を介して TNF-aの産生を阻害することで抗炎症作用
を発現する可能性を示唆した。以上の結果は，新たな免
疫制御機構の解明に寄与するものである。
よって，審査員一同は博士（食品栄養学）の学位を授
与する価値があると判断した。
─ 42 ─


中国産食用茸ツブイボダケ（Thelephora vialis）含有vialinin AのRBL-2H3細胞におけるTNF-α産生阻害メカニズムの解明

志波, 優

SIWA, Yu

Establishment of methods for microbial genome analysis using next-generation sequencers and their applications for microbial genomics.

中里, 良一

NAKAZATO, Ryoichi

Study on Development and Application of a Resident-Driven, Resident-Sustainable Rice Terrace Conservation System

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