Tokyo University of Agriculture Repository / 東京農業大学リポジトリ

東京農業大学博士（生物産業学

加藤, 美緒

3792

KATO, Mio

3793

氏 名 加 藤 美 緒
学位（専攻分野の名称） 博 士（生物産業学）
学 位 記 番 号 甲 第 734 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 29 年 3 月 17 日
学 位 論 文 題 目 北海道稚内市抜海港に来遊するゴマフアザラシに関する生態
学的研究
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士（獣医学） 小 林 万 里
教 授・水産学博士 塩 本 明 弘
准 教 授・博士（地球環境科学） 白 木 彩 子
水産学博士 谷 口 旭＊
論文内容の要旨
【研究の背景と目的】
日本沿岸には 5種のアザラシ類が来遊・生息する。そ
のうち，北太平洋の固有種であるゴマフアザラシ（Phoca
largha）の分布域の南限は北海道にあり，北海道では
本種が最も多く目撃される。本種は海氷域で繁殖を行
い，海氷期を境に冬季と夏季では異なる生活をし，広域
を移動する回遊性のアザラシである。
北海道近海では，戦後から 1980年代まで商業的なア
ザラシ猟が盛んに行われてきたが，需要の低下によって
1980年代後半以降には衰退し，本種への捕獲圧は減少
した。その結果，オホーツク海や間宮海峡における本種
の生息個体数は増加傾向となったと考えられている。オ
ホーツク海は北半球における海氷域の南限であり，最南
限である北海道周辺海域は海氷変動の影響が最も早く現
れる海域でもある。ゴマフアザラシは繁殖を海氷に依存
するため，海氷の変化は本種の分布や繁殖等に直接的影
響を与えると予測される。
1990年代後半以降には，北海道日本海側に来遊する
ゴマフアザラシの来遊域が南下・拡大し，2000年代以
降には来遊期間も長期化した。特に礼文島，稚内市抜海
港，焼尻島の個体数増加は顕著であり，海氷の流入しな
い日本海側にはそれまで来遊しないとされていた成獣の
来遊が確認され，礼文島においては周年滞在する個体も
確認されている。これまでほとんど本種の来遊が確認さ
れていなかった地域で急激な個体数増加や長期滞在化が
引き起こされ，それに伴い漁業との軋轢が深刻化してい
る。本種の過剰な個体数増加は上陸場周辺の資源を枯渇
させ，周辺の海洋生態系を大きく変化させる可能性があ
ると考えられた。
近年本種による上陸場の利用状況が変化しつつある北
海道日本海側において，新たに形成された上陸場の利用
状況を明らかにすることは，今後の個体数管理などの行
政施策にも有用な知見であると考えられる。北海道日本
海側の稚内市抜海村に位置する抜海港は，近年日本海側
で新たに形成されたゴマフアザラシの上陸場の 1つであ
る。顕著に個体数増加が見られ，新上陸場の中で最も利
用個体数が多く，滞在期間も長期化しており，漁港や行
内の人工物に依存するという特殊性を持つ。そのため，
抜海港は日本海側における本種の利用状況の変化に大き
く関与しているのではないかと考えられる。しかし，そ
の利用実態については明らかでなく，来遊する個体の利
用海域や繁殖海域，採餌パターンなど，本種の生態を知
るために必要不可欠な情報が不足している。そこで本研
究では，抜海港を利用する個体の（1）個体数の年変動
および季節変動を明らかにすること，（2）利用海域と採
餌パターンを把握すること，（3）繁殖海域を推定するこ
とによって，抜海港および周辺海域の利用状況を把握す
ることを目的とした。
【第 1章】個体数の年変動および季節変動
抜海港において個体数調査を行い，近年の確認個体数
の季節変動および年変動を明らかにすることを目的とし
た。調査は 2003年 10月から 2009年 9月まで，主に本
種の上陸が確認される 11月から翌年 4月にかけて行い，
日毎に個体数をカウントした。個体数の季節変動の推定
には LOESS（Locally weighted smoothing）法を用い
た。
その結果，抜海港へはオホーツク海の海氷が形成され
始めるのと同時期に来遊しはじめ，北海道周辺海域に海
氷が出現し始める 12月から翌 1月頃に確認個体数が
─ 16 ─
＊三洋テクノマリン（株）生物生態研究所長
ピークとなった。オホーツク海の海氷面積が最も拡大す
る 2月から 3月頃には個体数が減少した。本種はオホー
ツク海において 3月から 4月頃に海氷域で繁殖を行うた
め，繁殖に参加する個体が海氷域へ移動したと考えられ
た。海氷の大部分が消失する 5月頃には多くの個体が退
去した。このように，抜海港を利用する本種の確認個体
数は，オホーツク海の海氷形成と密接に関わっており，
海氷域で繁殖を行う本種の生態を反映したものであるこ
とが示唆された。
また，2003年から 2009年まで，抜海港の冬季の確認
個体数は年々増加する傾向であった。大規模なアザラシ
猟の衰退後，オホーツク海や間宮海峡における本種の生
息個体数は増加傾向にあると考えられていることから，
抜海港における個体数の増加は 2海域における生息個体
数増加の影響であると考えられた。さらに，本研究の観
察期間中，抜海港内は漂砂が堆積し，防砂堤や防波堤が
整備され，本種の上陸可能な面積は徐々に変化・拡大し
ていた。本種は港内の状況変化に対応しながら上陸場所
を変化させていたことから，抜海港においては上陸可能
な場所の面積拡大によって，個体数増加が促進されたと
考えられた。
【第 2章】冬季から春季における利用海域と採餌パター
ンの把握
抜海港を利用するゴマフアザラシについては，いつど
こへ移動し，どこで採餌を行っているのかといった利用
実態について明らかにされておらず，滞在期間中の採餌
海域など不明瞭な点が多い。本研究では，衛星発信器を
用いて抜海港を利用する個体の冬季から春季における滞
在海域および上陸・潜水行動を分析し，抜海港周辺海域
の利用状況を明らかにすることを目的とした。2009年 2
月から 2013年 2月まで（主に 12月と 2月に実施）に計
23個体の未成獣（オス 18個体，メス 5個体）に衛星発
信器を装着した。衛星発信器は SRDL（Sea Mammal
Research Unit社製，UK）を使用した。取得された位
置情報をより多く分析に使用するため，速度と距離，角
度を考慮したフィルタリング（SDA-filter）を行った。
各個体の日毎の滞在海域を，抜海港からの移動距離と
方位を考慮して分類した。行動の変化点を明らかにする
ために，CPA（Changepoint analysis）分析を用いて
抜海港からの最大円距離（移動距離）の変化点を分析
し，一貫した行動をしていたと仮定される期間を分け
た。変化点の検出には PELT（Pruned Exact Linear
Time）法を用いた。さらに，個体ごとに分けられた期
間ごとの平均移動距離と最頻方位から「滞在海域」を大
別し，各個体の海域利用パターンを分類した。
その結果，抜海港を中心に北は間宮海峡，南は積丹半
島まで南北約 1,000kmの広範囲に分布していることが
明らかになり，主に 7つの海域利用パターンが確認され
た。抜海港から離れ，他海域の上陸場を利用する個体も
存在したが，その他に抜海港を上陸場としながら周辺海
域を採餌海域として周期的に利用するパターンが少なく
とも 4パターン確認された。どのパターンにおいても抜
海港は上陸場として利用され，抜海港周辺海域，利尻南
西沖，石狩湾，間宮海峡を主な採餌海域としていた。抜
海港から各採餌海域への移動距離は，20km 未満，約
100km，約 250km，約 500km と多岐にわたり，海域
間の移動周期は 1日，約 2週間，約 3週間，約 5週間と
様々であった。抜海港周辺海域のみ，あるいは抜海港周
辺海域と間宮海峡を利用するパターンにおいては，各上
陸場と採餌海域の距離が近い範囲で上陸と採餌を行って
いることが推察された。一方，利尻南西沖あるいは石狩
湾を採餌海域とするパターンにおいては，上陸場と採餌
海域を明確に使い分け，抜海港を上陸場としながら各採
餌海域の異なる深度帯で採餌を行っていた。
以上のことから，どの採餌パターンにおいても主に抜
海港が上陸場として利用され，採餌海域は日本海側の広
範囲に存在することが明らかになった。しかし，抜海港
から 100km以上移動する採餌パターンはどれも一長一
短であると考えられ，上陸行動と採餌行動は生理的な限
界にあるものと考えられた。また，抜海港においては個
体数の急激な増加に伴って，採餌パターンが多様化した
と推察された。
抜海港を上陸場として利用するこれらのパターンの個
体数割合は 12月以降に減少し，日本海側の他の上陸場
へ移動する個体や，あるいはオホーツク海や間宮海峡へ
移動して日本海側から退去する個体の割合が増加したと
考えられた。5月頃には日本海側から退去していた。
【第 3章】繁殖海域の推定
抜海港においては，近年明らかに体サイズの大きな個
体や早産個体が確認されており，成獣の来遊が推察され
る。本研究では，衛星発信器を用いて抜海港に来遊する
個体の利用海域および繁殖海域を推定することを目的と
した。2009年 2月から 2013年 2月まで（12月と 2月に
実施）に本種の学術捕獲を行い，衛星発信器を装着し
た。そのうち，日本海側から他海域への移動が確認さ
れ，その後 1か月間以上他海域に滞在した 4個体（メス
1個体，オス 3個体）について分析を行った。衛星発信
器は SRDL（Sea Mammal Research Unit社製，UK）
─ 17 ─
を使用した。各個体の利用海域を区分するため，北海道
日本海側，間宮海峡，オホーツク海の 3海域に区分し，
海域間の移動や移動時期について分析した。また，半月
ごとに各個体の位置情報と海氷分布を比較した。
本研究において，抜海港を利用する個体の利用海域の
季節変化が明らかになった。成獣は海氷域を利用し，上
陸割合が高かったのに対し，未成獣は沿岸域を利用し，
上陸割合は低い傾向が見られ，成長段階による分布域や
上陸割合の差が明らかになった。1970年代，北海道近
隣における本種の繁殖海域はオホーツク海南部と根室海
峡の海氷域であるとされていた。しかし，本研究におい
て抜海港に来遊する本種の繁殖海域は，少なくともオ
ホーツク海と間宮海峡の 2海域の海氷域であることが示
唆された。また，未成獣についても，オホーツク海側の
サハリン東岸から北海道沿岸，あるいは間宮海峡側のサ
ハリン西岸の二手に分かれることが示された。以上のこ
とから，抜海港には少なくともオホーツク海由来の個体
と間宮海峡由来の個体が来遊してきていることが示唆さ
れた。
【総合考察】
本研究において，北海道日本海側においてはオホーツ
ク海や間宮海峡の生息個体数増加によって，日本海側へ
の来遊個体数が増加したことに加え，抜海港において
は，上陸可能な場所の面積拡大や上陸場の安全性が，個
体数増加をより促進させた要因であることが推察され
た。そして，抜海港特有の過剰な上陸個体数の増加は，
上陸競争や餌競争を激化させ，採餌海域を外洋に広げた
と考えられた。そのため，抜海港を利用する個体は，他
の上陸場では見られていない過剰な個体数増加によっ
て，日本海側の広範囲を採餌海域として利用するように
なり，採餌パターンが多様化したと考えられた。
北海道日本海側においては，これまで本種の来遊が確
認されていなかった地域での個体数増加や長期滞在化に
伴い，漁業との軋轢が深刻化している。漁業被害の深刻
化に伴い，2015年には「北海道アザラシ管理計画（北
海道 2015）」が策定され，2017年 4月から 2年間計画
でアザラシ類による漁業被害の軽減と，人とアザラシ類
の共存を目的とした管理計画が実施されることになっ
た。
抜海港は，本種にとって安全な避難場所的な役割を
担っており，面積が拡大したことによって，いつでも上
陸可能な好適な休息場所になったと考えられる。そのた
め，抜海港は上陸拠点となり得，抜海港を中心に日本海
側全域を採餌海域として利用するようになったことが推
察される。本研究において，北海道日本海側に来遊して
くる個体の多くにとって抜海港が上陸場として重要であ
るだけでなく，上陸場周辺のみならず日本海側全体が採
餌海域になっているという特殊性を明らかにできた。こ
れは，今後北海道日本海側で本種を管理していく上で，
抜海港が重要であることを示す有用な知見であると考え
られる。
審査報告概要
本論文は，近年北海道日本海側で来遊個体数が急増
し，来遊域が南下・拡大したことで，漁業産業との軋轢
が激化しているゴマフアザラシの生態学的な知見を示す
ため，日本海側における本種の新たな上陸場である稚内
市抜海港の上陸場に着目し，個体数変動，採餌パター
ン，利用海域および繁殖海域を明らかにすることによっ
て，抜海港および周辺海域の利用状況を把握することを
目的として遂行された。本研究の結果から，北海道日本
海側に来遊する本種の多くにとって，抜海港が上陸場と
して重要であること，また，抜海港の上陸場周辺のみな
らず，日本海側全域が採餌海域になっているという特殊
性を明らかにされた。この成果は，漁業被害が深刻化し
ている北海道日本海側において，今後本種を管理してい
く上で，抜海港が重要であることを示す有用な知見とな
る。よって，審査員一同は博士（生物産業学）の学位を
授与する価値があると判断した。
─ 18 ─


北海道稚内市抜海港に来遊するゴマフアザラシに関する生態学的研究

東京農業大学博士（食品栄養学

鈴木（小久保）, 友貴

3971

SUZUKI (KOKUBO), Yuki

3972

新体操選手における体内鉄不足状態と食事性たんぱく質摂取の意義

東京農業大学博士（国際農業開発学

Phung Minh Loc

3973

3974

- 1 - 
 
氏 名   Phung Minh Loc 
学位（専攻分野の名称）   博 士（国際農業開発学） 
学 位 記 番 号   乙 第 928 号 
学 位 授 与 の 日 付   2017 年 12 月 20 日 
学 位 論 文 題 目   Studies on insecticide resistance of the brown planthopper  
                       (Nilaparvata lugens) on rice in the Mekong Delta, Vietnam 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農学） 足 達 太 郎 
               教 授・博士（農学） 入 江 憲 治 
               教 授・博士（農学） 小 塩 海 平 
               教 授・博士（農学） 志和地 弘 信 
               教 授・博士（農学） 山 田 隆 一 
                    博士（農学） 松 村 正 哉＊ 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
1. Introduction 
The brown planthopper (BPH), Nilaparvata lugens is a serious pest affecting rice in East Asian 
countries including Vietnam. To deal with this pest problem, farmers have been relied mainly on 
chemical pesticides. High pressure of pesticide use has led to increase in pesticide tolerance of BPH. 
The major cause of recent outbreaks of BPH is thought to be the development of insecticide 
resistance.  
This study aimed to: (1) Understand the status of pesticide use for controlling the BPH by farmers 
from the main rice production areas in the Mekong Delta through direct interview; (2)  Evaluate the 
bio-efficacy of some commonly used insecticides by farmers for controlling the BPH under field 
conditions; (3) Determine the current status of insecticide susceptibility of three BPH’s populations 
to some active ingredients from different classes or modes of action collected from three major rice 
production provinces of Tien Giang, Can Tho and An Giang in the Mekong Delta. 
 
2. Present status of pesticide use by farmer in controlling brown planthopper in some Mekong 
Delta provinces 
In this chapter, the following research activities were included: Firstly, three representative rice 
production areas (An Giang, Can Tho and Tien Giang provinces) were selected to conduct the survey 
on farmer practices of rice production, focusing on pesticide use at household level relying on given 
questionnaires. The surveys were carried out in the Spring–Winter season (December 2014 to 
February 2015). 
The results indicated that a majority of respondent farmers improperly used and managed 
＊国立研究開発法人 農研機構 九州沖縄農業研究センター 生産環境研究領域 虫害グループ長 
- 2 - 
 
pesticides. The surveys demonstrated that there were four main insect pests that farmers had known 
in the rice fields, 15 active ingredients of insecticides, 11 fungicides and 6 herbicides were used to 
control rice pests. Seven types of common insecticides were used to control the BPH, including 
pymetrozine, thiamethoxam, fenobucarb, dinotefuran, fipronil, imidacloprid and mixture of 
pymetrozine and buprofezin. Especially, in the last 5 years, farmers used 10 different groups of 
insecticides with different modes of action for controlling different insects in rice field. More 
importantly, high proportion of farmers have been found to spray insecticides many times per a rice 
season (4-6 sprays per season) and use higher dose than label recommendation from 1.5 to 2 times. 
 
3. Bio-efficacy evaluation of some insecticide against rice BPH in the rice field 
Based on the interviewed results, the most commonly used insecticides were chosen to evaluate 
their bio-efficacy against BPH under field conditions. Two experiments were conducted from 2014 
to 2015 in two seasons. The trials were carried out in randomized complete block design, three 
replications with 8 treatments (7 active ingredients including buprofezin, imidacloprid, dinotefuran, 
sulfoxaflor, pymetrozine, fipronil, fenobucarb, and an untreated control). 
The results indicated that, most of the insecticides tested, including buprofezin, imidacloprid, 
fenobucarb, fipronil, sulfoxaflor were low effective for controlling BPH (less than 65% efficacy). 
Only two active ingredients tested (dinotefuran and pymetrozine) were still effective (higher than 
70% efficacy). The decline in insecticide efficacy in this study may be due to overuse of these 
insecticides for a long time, leading to the development of insecticide resistance. 
 
4. Insecticide resistance status of BPH in the Mekong Delta 
Status of the insecticide susceptibility of three BPH populations from  three provinces of the 
study site was evaluated. Ten active ingredients were tested. The insecticide susceptibility of BPH 
was carried out using topical and dipping application methods. The number of dead BPH was 
recorded at 24h for topical application method and at the 120h for dipping application method after 
treatment of insecticides in order to determine LD50 (Lethal dose required to kill 50% of the 
population), LC50 (Lethal concentration required to kill 50% of the population), Ri (Resistance index) 
and RR (Resistant ratio) values. 
Results showed that: LD50, LC50 and Ri of insecticides on three sources of BPH populations were 
significantly higher than the susceptible strain. It can be concluded that BPH at these three locations 
were highly resistant to fenobucarb, imidacloprid, profenofos and nitenpyram, and beginning 
resistant to dinotefuran and sulfoxaflor at the time tested. There were significant differences in LD50 
values for fenobucarb, imidacloprid, profenofos, dinotefuran, nitenpyram and sulfoxaflor in the BPH 
- 3 - 
 
populations collected from the three provinces compared to susceptible BPH population (control) in 
both years of study (χ2 test , P ≤ 0.05); however, there was no significant differences in LD50 values 
among three tested populations of BPH. 
Regarding RR of the three BPH populations to pymetrozine and emamectin benzoate in 2015 were 
lower than that in 2014 with the resistance in a range of low to medium levels. Nevertheless, the RR 
of three BPH populations collected from the three provinces for buprofezin and thiosultap sodium 
was medium and high levels, respectively. 
 
5. General discussion 
The low efficacy of active ingredients of insecticides such as fenobucarb, imidacloprid and 
profenofos against the BPH populations from three representative rice production provinces 
obviously demonstrates the development of resistance to those active ingredients in the populations. 
The incidence of chemical resistance in the region could be due to a number of reasons, such as 
high selection pressure of inexpensive insecticides, traditional calendar spraying, easy acceptance of 
recommendations by local pesticide distributors, following the chemical used by neighboring 
farmers. The present study demonstrated that BPH could not appear the cross-resistance between 
imidacloprid and dinotefuran at the study time (2015 – 2016). This fact suggests that neonicotinoid 
substitutes could be compatible for controlling BPH. The low efficacy of newly released active 
ingredient of sulfoxaflor could be due to the similar chemical structure and mode of action with 
imidacloprid and probably because of cross resistance between the two active ingredients. 
 
和文要旨 
 
１．緒言 
トビイロウンカは，ベトナムをふくむ東アジア諸国における水稲作の重要害虫である。本
種の防除は化学合成殺虫剤の散布に依存している。しかし近年，殺虫剤の多用による殺虫剤
抵抗性の発達により，本種の大発生が多発するようになった。そこで本研究では，ベトナム
のメコンデルタ地方において，（1）トビイロウンカに対する殺虫剤の施用状況を農民への聞
きとり調査により把握したうえで，（2）主要生産地である Tien Giang，Can Tho，An Giang
の各州で多用されている殺虫剤の有効性を圃場条件下で評価し，（3）各州で採集されたウン
カ個体群について，それらの殺虫剤の有効成分に対する抵抗性発達の現状をあきらかにした。 
 
２．メコンデルタ地方のトビイロウンカ防除における化学合成殺虫剤の施用状況 
聞きとり調査の結果，Tien Giang，Can Tho，An Giang の各州では，ウンカの防除を目
- 4 - 
 
的として，ピメトロジン，チアメトキサム，フェノブカルブ，ジノテフラン，フィプロニル，
イミダクロプリドと，ピメトロジンとブプロフェジンの混合物，計 7 種類の殺虫剤が使用さ
れていることがわかった。これらの薬剤の推奨施用回数は１シーズン 1.5～2 回であるのに
対し，現地では 1 シーズン 4～6 回もの散布がおこなわれていることが判明した。 
 
３．メコンデルタ地方で使用されている殺虫剤のトビイロウンカに対する有効性 
前章で，同地方において一般的に使用されていることが判明したものをふくむ 7 種類の殺
虫剤の殺虫効果について，2014～15 年の 2 シーズンにわたって圃場実験をおこなった結果，
ジノテフランおよびピメトロジンでは，トビイロウンカに対する殺虫効力が 70%以上であ
ったの対し，ブプロフェジン，イミダクロプリド，フェノブカルブ，フィプロニル，スルホ
キサフロルでは 65%未満であった。こうした殺虫効力の低下は長期にわたるこれらの薬剤
の多用によるものとかんがえられた。 
 
４．メコンデルタ地方で採集されたトビイロウンカ個体群の殺虫剤抵抗性 
上記の 3 州で採集されたウンカ個体群について，10 種類の殺虫剤有効成分に対する抵抗
性を局所施用法および浸漬法をもちいた室内生物検定により評価した結果，感受性系統と比
較して各個体群とも半数致死薬量（LD50），半数致死濃度（LC50），抵抗性指数（Ri）が有
意に高かった。これらの個体群はフェノブカルブ，イミダクロプリド，プロフェノフォス，
ニテンピラムに対する抵抗性を獲得したものとかんがえられる。2015 年の採集個体群のピ
メトロジン安息香酸塩に対する RR（抵抗性比）は 2014 年の採集個体群のそれよりも低く，
低ないし中程度の抵抗性をしめした。いっぽう，ブフェロフェジンとチオスルタップについ
ては，それぞれ中ないし高程度の RR が観察された。 
 
５．総合考察 
メコンデルタ地方で稲作のさかんな 3 つ州で採集したトビイロウンカ個体群に対して，フ
ェノブカルブ，イミダクロプリド，プロフェノフォスなどの殺虫剤の活性成分の有効性が低
いことは，それら個体群が実際に薬剤抵抗性を獲得していることをしめしている。 
 こうした抵抗性個体群の出現は，安価な殺虫剤の選択，薬剤の慣習的なカレンダー散布，
近隣の農家が使用している薬剤への同調業者の推奨する薬剤の安易な受けいれなどによる
ものとかんがえられる。 
 本研究の結果より，トビイロウンカがイミダクロプリドとそのほかのネオニコチノイド系
殺虫剤，たとえばジノテフランとのあいだで交差抵抗性を有しないことが実証された。この
ことは，ネオニコチノイドの代替品がウンカの防除に有効であることを示唆している。 
 
- 5 - 
 
審 査 報 告 概 要 
 
 ベトナム南部のメコンデルタ地方では，イネの主要害虫であるトビイロウンカを管理する
ため，化学合成殺虫剤の使用が一般的である。本論文では，詳細な現地調査をもとに，同地
方ではいくつかの殺虫剤が推奨される施用回数をはるかにこえて散布されていること，その
一方で，ブプロフェジン，イミダクロプリド，フェノブカルブ，フィプロニル，スルホキサ
フロルといった化学合成殺虫剤の圃場における殺虫効果が低下していることをあきらかに
した。さらに室内実験の結果，イミダクロプリドやニテンピラムといったネオニコチノイド
系殺虫剤やブプロフェジンなどの昆虫成長制御剤に対する高い抵抗性が，同地方で採集され
たトビイロウンカ個体群において発達していることがあきらかとなった。研究テーマの妥当
性，研究方法の適切性，論旨の妥当性，独創性，体裁にかんがみて，本論文はいずれも東京
農業大学大学院農学研究科の学位論文審査基準をみたしており，審査員一同は博士（国際農
業開発学）の学位を授与する価値があると判断した。 


Studies on the insecticide resistance of the brown planthopper (Nilaparvata lugens) on rice in the Mekong Delta, Vietnam

東京農業大学博士（バイオサイエンス

秋山, 友了

3796

AKIYAMA, Tomonori

3797

氏 名 秋 山 友 了
学位（専攻分野の名称） 博 士（バイオサイエンス）
学 位 記 番 号 甲 第 736 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 29 年 3 月 20 日
学 位 論 文 題 目 Microbacterium sp. HM58-2株のヒドラジド代謝機構の
解析
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士（農学） 矢 嶋 俊 介
教 授・農 学 博 士 吉 川 博 文
教 授・農 学 博 士 新 村 洋 一
博士（農学） 殿 塚 隆 史＊
論文内容の要旨
Introduction
ヒドラジン（H2NNH2）は有機合成化学の分野にお
いて，還元剤，求核剤として重要な化合物である。ヒド
ラジン誘導体のうち，ヒドラジンとカルボン酸が脱水縮
合した構造をもつ化合物をヒドラジド（R1C（=O）NR2
NR3R4）と呼ぶ。マレイン酸ヒドラジドはマレイン酸
（C2H2（COOH）2）とヒドラジンによって合成され農薬
や除草剤に用いられるが，逆反応により発生するヒドラ
ジンに発がん性があるため食物中に含まれるマレイン酸
ヒドラジドの残留量に制限が設けられている。また iso-
nicotinic acid hydrazide（pyridine-4-carbohydrazide）
は安価で入手しやすい結核の治療薬として有名である
が，複数の副作用が引き起こされることが知られてい
る。天然のヒドラジド誘導体としてはマッシュルーム
Agaricus bisporus の有する agaritine（2-[4-(Hydroxy-
methyl)phenyl]-glutamohydrazide）が知られている。
しかし，これらの物質の生体における代謝や生合成につ
いては未解明な部分が多い。Isonicotinic acid hydra-
zideはラットの肝臓の P450によって isonicotinic acid
と hydrazine に分解されることや，ウサギが有する
amidaseにより分解されることが示唆されているが，
その詳細は明らかとなっていない。
2012年に C=N結合をもつ化合物の分解が可能な酵素
を見いだすためにヒドラゾンやヒドラジドを資化できる
微生物のスクリーニングが行われた。ヒドラジン誘導体
のうち，4-hydroxybenzoic acid 1-phenylethylidene hy-
drazide（HBPH）を唯一の炭素源とした培地で生育可
能な微生物，Microbacterium sp. HM58-2株が単離され
た。更に，本菌が有するヒドラジド分解活性をもとに，
HBPH を加水分解し 4-hydroxybenzoate（PHB）と
acetophenone hydrazone を生じる hydrazidase が単
離，同定された。
現在，有機合成により様々な化合物が工業的に作られ
医薬品・農薬・染料・塗料などに用いられているが，そ
れらによる環境汚染が問題となる場合がある。一部の非
天然化合物は難分解性であるため環境中に滞留しやす
く，また，人体や野生動物に悪影響をあたえる環境ホル
モンとして働く場合もあることが知られている。除草剤
中に含まれ，塩化有機物を燃焼させた際にも発生するダ
イオキシン類は，発癌性，生殖毒性，免疫毒性などが危
惧されている。また，殺虫剤として使用されている
dichloro-diphenyl-trichloroethane（DDT）には発がん
性があることや，環境ホルモンとして働くことから使用
が制限されているが，すでに使用された DDTの残留が
問題となっている。このような化合物を分解，無毒化し
て環境を修復する手法として，微生物や植物を利用する
生物環境浄化（バイオレメディエーション）が試されて
いる。このように生物の有する潜在的な能力を探索，解
析することで，様々な応用につながる可能性がある。
ヒドラジド化合物は比較的合成が容易なことや，原料
のヒドラジンやカルボン酸も入手が簡単なことから様々
に利用されている。一方で，天然にはほとんど存在しな
いため，一般的には生物はヒドラジドを代謝する機構を
持っていないと考えられる。これまでに，生物によるヒ
ドラジドの分解についてはいくつか報告があるが，生物
がどのようにヒドラジドを認識し，代謝しているかにつ
いてはほとんど知られていない。HBPHも人工的に合
成されたヒドラジドであり，天然に存在しないと思われ
るため，Microbacterium sp. HM58-2株がなぜ HBPH
を炭素源に生育できるのか大変興味深い。また，本菌を
─ 23 ─
＊東京農工大学大学院 農学研究院 教授
利用することにより人工的に製造され，環境に蓄積した
ヒドラジド化合物の検出や浄化技術への応用の可能性も
考えられる。そこで本研究では，Microbacterium sp.
HM58-2株のヒドラジド代謝機構の解明を目指し，ヒド
ラジド代謝関連遺伝子の特定とその蛋白質構造機能解析
を行った。
Microbacterium sp. HM58-2株のゲノム解析とヒド
ラジド応答
Microbacterium sp. HM58-2株の有する hydrazidase
以外のヒドラジド代謝関連遺伝子を探索するために，
Microbacterium sp. HM58-2 株のゲノム配列解析を
ショートリード型のシーケンサーを用いて行った。その
結果，Microbacterium sp. HM58-2株の約 3.46Mbpの
ドラフトゲノムを得ることができた。ゲノムのアノテー
シ ョ ン を Microbial Genome Annotation Pipeline
（MiGAP）version 2.19で行ったところ 3,565の遺伝子
コード領域と，3つの rRNA領域，45の tRNA領域を
推定することができた。遺伝子の大部分が M. testa-
ceum StLB037の遺伝子で注釈付けられた。M. testa-
ceum StLB037のゲノムは約 3.98Mbに 3,532の遺伝子
コード領域があり，このことから HM58-2株のドラフ
トゲノムシークエンスは全長をほとんどカバー出来てい
ると推定した。Hydrazidase遺伝子の前後に one com-
ponent system転写因子 IclRと ABCトランスポーター
を構成するサブユニット遺伝子群が位置していた。これ
らの遺伝子発現の HBPHに対する応答を調べるため，
培地の炭素源を HBPH，glucoseそれぞれに限定した際
の遺伝子の発現量を RT-qPCR にて測定した。その結
果，すべての遺伝子の発現が glucose培地では抑えられ
ているものの，HBPHを添加する事により遺伝子の発
現が誘導された。これは Microbacterium sp. HM58-2
株が hydrazidase とその上流と下流に位置する遺伝子
を同様の機構により転写調節し，HBPHを代謝する際
にはそれらを同時に利用していることが考えられた。そ
こで，Microbacterium sp. HM58-2株のヒドラジド代謝
機構を解析するために IclR, hydrazidase, ABCトラン
スポーターの基質認識に関して，以降の解析を行った。
Microbacterium sp. HM58-2株由来 SBSの基質特異
性
Microbacterium sp. HM58-2株が HBPHを資化する
ためには，まず化合物を菌体内に取り込む必要がある。
そのための仕組みとして hydrazidase とともに遺伝子
発現が誘導される ABC トランスポーターが考えられ
た。そこで，ABCトランスポーターの構成要素のうち，
基質の認識に最も重要であると考えられる基質結合サブ
ユニット（SBS）について，その基質特異性を Biacore
X100 を用いて測定した。SBS と HBPH の解離定数
（Kd値）をアフィニティー解析により測定した。RU値
を縦軸に，アナライト濃度を横軸にとり，各濃度で測定
した結果をプロットすると，良好なカーブフィッティン
グが描けた。ここから SBSと HBPH の Kd値を算出す
ると 19.93mM であった。一方で，SBS と PHB の Kd
値について，HBPHをアナライトとした時と同様に測
定したが SBS と PHB の Kd 値は算出できなかった。
これは，SBSと PHBの Kd値が大きすぎるためだと考
えられる。このことから，この ABCトランスポーター
は hydrazidase に分解される前の基質を特異的に輸送
していると推察した。
Hydrazidaseの立体構造と基質特異性
Microbacterium sp. HM58-2株のスクリーニングにあ
たっては，ヒドラジド化合物として HBPHが使用され
た。そこで，HBPHを分解する hydrazidaseがどのよ
うな化合物を分解するのか，その基質特異性を明らかに
するため，hydrazidase および S179A 変異体と 4-hy-
droxybenzoic acid hydrazide（HBH）複合体の結晶構
造をそれぞれ 1.6Åと 1.8Åの分解能で決定した。野生
型と変異体どちらもホモ 2量体で構成されていた。
Amidase signature enzyme familyで高度に保存され特
徴づけされた Ser-cisSer-Lys触媒 3残基は，野生型 hy-
drazidase の結晶構造でも S179-cisS155-K80の 3残基
として確認された。Hydrazidase と 3次構造の類似検
索を行う Dali serverから得られた amidaseの構造とを
重ね合わせたところ，これらの全体構造はよく重なった
が，基質結合ポケットの周りの二つの領域で違いが見ら
れた。これらの amidaseのアミノ酸配列アライメント
において，この二つの領域は amidase signature では
保存されていない C末端に位置し，構造の多様性を生
むことで酵素の基質特異性の違いを起こしていると思わ
れた。変異体の構造中には HBHの電子密度が鮮明に確
認された。HBHの 4位の水酸基は水分子と水素結合を
形成しており，その水分子はさらに H336と別の水素結
合を形成していた。また，水素結合が C129のカルボニ
ル酸素と HBHのアミド基との間で形成されていた。基
質結合における H336および C129残基の役割を調べる
ため，C129A，C129S，および H336A 変異体の酵素活
性を測定した。その結果 hydrazidase 活性は著しく低
下し，野生型に比べてそれぞれ 10%，30%，1%となっ
─ 24 ─
た。このことから，これらの残基は hydrazidase の基
質認識に重要な残基であると考えられた。
アポ体と想定していた野生型 hydrazidase の活性部
位に鮮明な電子密度が見られた。実験中に使用している
試薬に電子密度に合致する化合物はなかった。また，電
子密度の形状は環状化合物が触媒残基の S179と共有結
合していることを示していた。変異体 S179Aに結合し
ていた HBHと同様に，この化合物は C129と水素結合
を形成し，さらに水分子を介して H336とも相互作用し
ていた。これらのことからも，hydrazidase において
C129と H336はその基質特異性の決定に重要であると
考えられた。本研究で使用されている hydrazidaseは，
人工合成基質 HBPHを加水分解するが，酵素の天然の
基質は同定されていない。また，結晶構造から 4-hy-
droxybenzoateを基質の部分構造として持つことが必要
であると考えられた。野生型の hydrazidase に結合し
ていた未知の化合物は Microbacterium sp. HM58-2株
が本来利用している基質の候補かもしれないが，さらな
る解析が必要である。
Microbacterium sp. HM58-2株由来 IclR（Mi-IclR）
の立体構造解析
Microbacterium sp. HM58-2株では，培地へのHBPH
添加により hydrazidaseや ABCトランスポーターの遺
伝子発現が誘導された。これらの遺伝子の上流に位置し
ている IclRファミリーの転写因子は，one component
systemとして，基質を受容し転写制御を行うことが知
られており，この転写因子がヒドラジド代謝の遺伝子制
御に関わっていると考えた。そこでまず，Mi-IclRの基
質特異性を明らかにするために，Micro Scale Thermo-
phoresisを用いて HBPH及び 4-hydroxybenzoate（PHB）
との Kd値を測定した。その結果，それぞれの Kd値は
60-200mM, 152mM と算出された。さらに，Mi-IclR が
基質を受容した際の構造変化を調べるため，アポ体と
Mi-IclR/PHB複合体（ホロ体）の X線結晶構造解析を
行い，それぞれ 2.1Åと 2.0Åの分解能で構造を決定し
た。Mi-IclRのサブユニット構造は Protein Data Bank
に登録されている他の IclRと同様に，N末端側の helix-
turn-helix（HTH）型 DNA結合ドメイン（DBD, 残基
Met1-Leu67）と C 末端側の基質結合ドメイン（SBD,
Ser79-Trp250）が短いリンカーヘリックス（Gly68-
Gly78）で連結されていた。ホロ体においては，SBD
の基質ポケットにおいて，基質である PHBの電子密度
がはっきりと確認できた。PHB は N127, L128, S141,
S142と直接水素結合を形成し，S142, I196（主鎖）とは
水を介して水素結合していた。また，ベンゼン環は
L135, I196, V220の疎水性残基と疎水結合していた。ア
ポ体とホロ体でドメインごとに大きな構造変化はなかっ
たが，基質結合ポケットの近くで僅かに変化が見られ
た。R130から R134にかけての領域はアポ体ではルー
プ構造をしていたが，ホロ体では bシート構造をして
いた。これは，ループ上に位置する L135が基質を認識
することで，ループ構造ごと基質ポケットに引きつけら
れ，その結果構造変化が起きたためと考えられる。アポ
体とホロ体は同様にリンカーヘリックスの部位で 2量体
の各サブユニットが交差する X型の全体構造をとって
いたが，両者ではドメインの相対的位置が大きく変化し
ていた。アポ体とホロ体の各 A鎖の DBDを重ね合わせ
てみると，B 鎖の DBD はよく重なるが，SBD はリン
カーヘリックスを軸に約 105度回転していた。リンカー
ヘリックスと SBDの間の Gly78がヒンジの役割をし，
この位置で屈折し，SBDが回転していた。アポ体とホ
ロ体の DBD，SBD はそれぞれきれいに重なるため，
DBD と SBD はともに剛体として動いていることが
解った。さらに，ホロ体では DBDと SBDの位置関係
を決定するような水素結合が，DBDのループに位置す
る D24と SBDの R130の間で見られた。この水素結合
はアポ体では R130の位置が定まらず形成出来ないと推
察され，基質が結合することによって生じるMi-IclRの
DBD と SBD の位置関係が変わる構造変化の要因に
なっていると考えられた。基質が結合したホロ体の
DBD, SBDを含む全長構造は今回の Mi-IclRで初めて
明らかとなったが，IclR family間の構造比較により，
このような構造変化は共通していると考えられ，基質が
結合した際に転写活性を変化させる要因になっていると
考えられた。
Mi-IclRの結晶構造はアポ体の時に 4量体，ホロ体で
2量体を形成していた。この構造変化が結晶のパッキン
グによる影響かどうかを調べるため，溶液中の PHBの
有無によるMi-IclRの量体形成をゲル濾過カラムクロマ
トグラフィーにより測定した。その結果，PHBを含ま
ない溶液中では 4量体を，PHBを含む溶液中では 2量
体を形成しており，結晶構造と一致した。Mi-IclRのア
ポ体は SBDの DBDと反対側にある aへリックを界面
にし，2量体を単位として結合している。しかし，ホロ
体ではこの aへリックが構造変化によりペアを組むダ
イマーと近接出来なくなっていた。そのため，アポ体と
ホロ体で量体形成に違いが出たと考えられる。
細菌の遺伝子発現制御においては，いくつかの su-
perfamily を含む多くの例が知られている。そこで，
─ 25 ─
Mi-IclR に基質が結合した際の構造変化について IclR
family 以外の one component system 転写因子との比
較を行った。One component system転写因子のうち，
tetracycline repressor（TetR）, lactose operon repressor
（LacI）, LysR type transcriptional regulators（LTTRs）
について詳細な研究がされている。Mi-IclRとの比較の
結果，これらの転写因子は familyによってそれぞれ異
なる構造変化により転写活性を制御していた。その中で
基質を結合することで DBD を軸に SBD が回転し，2
量体構造や量体形成を変化させるMi-IclRの構造変化は
他のシステムとは異なる，新しい転写調節のメカニズム
である可能性が考えられた。
最後に
Microbacterium sp. HM58-2株ゲノム配列から明らか
となったオペロン遺伝子のタンパク質について，X線結
晶構造解析を主要な手段として用い，その基質特異性の
解析を含めヒドラジド代謝機構の解明を行った。これら
の結果から，本菌は ABCトランスポーターで取り込ん
だ HBPHを hydrazidaseにより分解し，分解産物であ
る PHBを転写因子である IclRが受容することでオペ
ロン遺伝子の発現を促進していると考えられた。また，
ゲノム解析の結果から本オペロンの近傍に benzoate代
謝パスウェイが存在することも確認でき，生じた PHB
がこのパスウェイを介して資化されると考えられた。
Microbacterium sp. HM58-2株が自然界でどのような化
合物を代謝するためにこれらの遺伝子を用いているかに
ついては，さらなる解析が必要である。一方で，本研究
で明らかとなったヒドラジド代謝関連遺伝子を制御する
ことで，Microbacterium sp. HM58-2株を用いたヒドラ
ジド化合物のセンサーや浄化システムの開発が期待され
る。
審査報告概要
本研究では，非天然物化合物であるヒドラジド化合物
を唯一の炭素源として生育可能な，Microbacterium sp.
HM58-2株におけるヒドラジド代謝機構の解明を行っ
た。ゲノムシーケンスによる代謝関連遺伝子の同定，Ｘ
線結晶構造解析による代謝関連蛋白質の立体構造解析の
結果から，基質認識メカニズムなどを明らかにした。特
に，one component system型転写因子である IclRにつ
いて，基質結合による構造変化を初めて捉えることに成
功した。これらの結果から，化合物の取り込みから分
解，資化にいたるまで，代謝およびその制御メカニズム
を明らかにした。
主査および副査から審査報告がなされ，専攻内可否を
審議した。その結果，学位請求論文の研究内容や発表会
での質疑応答が十分であることが認められた。よって，
審査員一同は博士（バイオサイエンス）の学位を授与す
る価値があると判断した。
─ 26 ─


Microbacterium sp. HM58-2 株のヒドラジド代謝機構の解析

白築, 章吾

3820

SHIRATSUKI, Shogo

3821

氏 名 白 築 章 吾
学位（専攻分野の名称） 博 士（畜産学）
学 位 記 番 号 甲 第 748 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 29 年 3 月 21 日
学 位 論 文 題 目 卵胞発育と低酸素環境が顆粒層細胞の代謝と増殖に及ぼす影
響
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士（農学） 岩 田 尚 孝
教 授・博士（畜産学） 桑 山 岳 人
助 教・博士（農学） 白 砂 孔 明
農 学 博 士 橋 本 周＊
博士（農学） 塚 本 智 史＊＊
論文内容の要旨
顆粒層細胞はホルモン分泌や卵子の成長および成熟を
制御する雌の生殖周期の確立に重要な役割を担う細胞で
あり，卵胞の発育に伴いその数を爆発的に増加させる。
また顆粒層細胞は卵胞基底膜の内側に存在しており，排
卵直前になるまで，卵胞内への血管網の侵入が生じない
ため顆粒層細胞を取り巻く環境は低酸素環境であると考
えられている。このような環境下で顆粒層細胞の代謝や
増殖がどのように変化するのかを以下の 3点に分けて検
討した。1）異なる卵胞ステージにおける網羅的遺伝子
発現解析 2）低酸素環境が顆粒層細胞の解糖やミトコ
ンドリア代謝および細胞増殖シグナリングに与える影響
について解析する事によって，卵胞の発育に伴う顆粒層
細胞の遺伝子発現の変化や低酸素環境が顆粒層細胞の代
謝能や増殖能に与える影響について明らかにし，3）
SIRT1が低酸素環境下の顆粒層細胞の代謝能および増
殖能に与える影響について検討をおこなった。
1）卵胞ステージがブタ顆粒層細胞の遺伝子発現に与え
る影響
まず卵胞のステージの進展に伴い顆粒層細胞内でどの
ような因子が働くのかを初期胞状卵胞（EAF，0.5-0.7
mm），小卵胞（SAF，1-3mm）および大卵胞（LAF，
3-5mm）に分けて顆粒層細胞を採取し，それぞれ次世
代シーケンサーを用いて検討した。遺伝子発現は Inge-
nuity Pathway Analysis（IPA）により解析し，IPAに
実装された Upstream Regulator機能を用いて卵胞の発
育に従いどのような因子が上流因子として働くかを予測
した。また有意に発現が増加した遺伝子の中から解糖お
よび酸化的リン酸化（OXPHOS）に関与する遺伝子群
を抽出し発現比率を比較した。EAF-SAFでは 5種類の
因子が上流因子として予測され，SP1，TP53，NR3C1
がそれぞれ抑制され，HIF1aおよび STAT3は活性化し
た。また SAF-LAF にかけては 6種類の因子が予測さ
れ，すべての因子 1（SP1，CTNNB1，TP53，SP3，JUN
および HIF1a）が抑制された。EAF-SAF間では卵胞ス
テージの進展に伴い，解糖に関わる遺伝子群は有意に増
加した。またこの傾向は SAF-LAF間でも同様に観察さ
れた。一方，OXPHOS 関連遺伝子群の発現は EAF-
SAF間で卵胞ステージの進展に伴い，有意に増加した。
しかしながら SAF-LAF間ではその差は消失した。また
同様に HIF1関連遺伝子群においてはその発現が増加す
る傾向が観察された（p＝0.075）。HIF1は卵胞発育に
重要な血管新生や解糖に関与する遺伝子を制御する転写
因子であることから次章においては HIF1を中心とした
転写制御が顆粒層細胞の代謝や増殖にどのような影響を
与えるかを検討した。
2）低酸素環境が顆粒層細胞の代謝と増殖に及ぼす影響
ウシ卵巣より小卵胞を選抜し顆粒層細胞を採取後，低
酸素（5%酸素濃度）および高酸素（21%酸素濃度）に
分け 24時間培養し，顆粒層細胞の代謝や増殖にどのよ
うな影響を及ぼすかを検討した。網羅的遺伝子発現解析
を用いてどのような因子の発現が両酸素環境下で増加し
ているのかを解析したところ，低酸素応答に関与する因
子（HIF1a，HIF2aおよび HIF1b）が上流因子として
予測され，HIF1により転写制御を受ける遺伝子の発現
─ 67 ─
＊ IVFなんばクリニック 研究部門 部長
＊＊放射線医学総合研究所 主任研究員
割合を両酸素区で比較したところ，低酸素区において有
意に高い値となった。また HIF1 の制御因子である
HIF1aの発現ならびに下流因子の VEGFの発現をウェ
スタンブロッティングにより解析したところ，低酸素環
境下において有意に高い値となった。また解糖，電子伝
達系，TCA回路を構成する因子の発現比を両酸素区で
比較したところ，TCA回路に関与する遺伝子群には有
意差が見られなかったものの，解糖に関与する遺伝子群
は低酸素区で有意に高くなり，電子伝達系に関与する遺
伝子群の発現割合は高酸素区で有意に高くなった。また
解糖の指標として解糖の律速酵素である Phospho fruc-
tokinase活性ならびにグルコース消費量を計測したと
ころ低酸素区で有意に高い値となった。一方でミトコン
ドリアにける酸化的リン酸化の指標として膜電位活性，
ATP 量，Mitochondrial mass，リン酸化 Acetyl Co-A
Carboxylase量およびミトコンドリア DNAコピー数を
計測したところ，高酸素区において全ての検討項目が増
加した。また増殖活性および細胞増殖に重要な AKT-
mTORC1パスウェイに関与する因子をウェスタンブ
ロッティングにて検討したところ低酸素区において
AKT，mTORおよび S6RPのリン酸化量が増加し，増
殖活性が促進された。また低酸素区において発現が増加
した VEGFに対する中和抗体を用いて VEGFの働きを
抑制したところ，低酸素環境下においても増殖活性およ
び AKT-mTORC1のリン酸化レベルが低下した。以上
のことから低酸素環境は顆粒層細胞のミトコンドリアに
おける酸化的リン酸化を抑制し，解糖活性を促進させ，
細胞増殖を促進させることがわかった。
3）SIRT1が低酸素環境における顆粒層細胞の代謝と増
殖に与える影響
細胞の増殖と代謝を共通してコントロールする因子と
して SIRT1が挙げられる。SIRT1は NAD+依存型の
脱アセチル化酵素であり，ミトコンドリアの新生や b
酸化を調整し，mTORC1を抑制することが知られてい
る。そこで SIRT1の発現量をウェスタンブロッティン
グにて解析した所，低酸素環境下において有意に低下し
ていた。また SIRT1と共役してミトコンドリアの新生
を促す転写コアクチベータである PGC1aの発現および
転写因子である NRF2の発現量を免疫染色にて比較し
たところ，PGC1aおよび NRF2の発現は低酸素区で低
下していた。また NRF2の下流因子である Cytochrome
C oxidase関連遺伝子の発現が低酸素区で有意に低下し
ていた。低酸素環境下における SIRT1の働きを検証す
るために，Resveratrol を用いて SIRT1を活性化させ
たところ，ミトコンドリア DNA の複製に関与する
TFAMの発現量が有意に増加し，ミトコンドリア DNA
コピー数および ATP 量が増加した。また mTOR のリ
ン酸化レベルおよび増殖活性が有意に低下した。これら
の事から低酸素環境における SIRT1の発現レベルの低
下は顆粒層細胞のミトコンドリアや細胞増殖の調節に影
響を及ぼしているものと考えられる。
4）総 括
本研究では卵胞ステージの成長に伴い活性化する上流
因子の同定を目的に，顆粒層細胞を対象とした網羅的遺
伝子解析を行った。その結果 EAFから SAFへと成長
する過程において HIF1が上流因子として予測され，卵
胞の発育に伴い解糖系遺伝子の発現が活性化することを
見出した。この結果を受け，低酸素環境下で顆粒層細胞
を培養し，代謝や増殖がどのように変化するのかを検討
した。低酸素環境下では HIF1 により制御を受ける
VEGFや解糖関連遺伝子を含む下流因子の発現が増加
し，HIF1の制御因子である HIF1aおよび VEGFのタ
ンパク発現量が増加した。また解糖に関与する遺伝子群
の発現割合は低酸素環境下で増加する一方で，電子伝達
系に関与する遺伝子群の発現割合は低下した。この結果
を裏付けるように解糖能の亢進およびミトコンドリアで
の代謝能の低下が観察された。また細胞増殖能は低酸素
環境下で AKT-mTORC1シグナリングの活性化を伴い
増加した。この時 HIF1の下流因子である VEGFが低
酸素環境下における細胞増殖を制御することがわかっ
た。一方で代謝と増殖能を共通して制御する SIRT1に
着目し，低酸素環境下における SIRT1の働きが顆粒層
細胞の代謝と増殖にどのような影響を及ぼすかを検討し
た。SIRT1の発現量は低酸素環境下で低下しており，
SIRT1と共役する因子でありミトコンドリアの新生に
関与する PGC1a や NRF2の発現量も同様に低下して
いた。これらの結果を受け，低酸素環境下で Resvera-
trolを用いて SIRT1を活性化させたところミトコンド
リアの活性が増加し，リン酸化 mTORの抑制を伴い増
殖能が低下した。これらの結果から低酸素環境下では解
糖能の亢進とミトコンドリアでの代謝能の低下が引き起
こされ，低酸素環境下における HIF1の活性化が VEGF
を介した顆粒層細胞の増殖に必須である事が示唆され
た。また低酸素環境下における SIRT1の低下が顆粒層
細胞の代謝能の変化および細胞増殖に影響を及ぼす可能
性が示唆された。
─ 68 ─
審査報告概要
顆粒層細胞は雌の生殖周期の確立に重要な役割を担う
細胞であり，卵胞の発育に伴い低酸素環境でその数を増
加させる。本研究ではまず網羅的遺伝子解析を用いて，
異なる発育ステージの卵胞より顆粒層細胞を採取し，卵
胞の成長に変動する上流因子を検討した。結果として低
酸素応答性の転写因子である HIF1が上流因子として予
測され，解糖系遺伝子の発現量が卵胞の成長に伴い増加
した。また，低酸素環境下による解糖能の増加，ミトコ
ンドリア代謝能の低下，VEGF-AKT-mTORC1経路の
活性化を伴う増殖能が亢進することを明らかにした。さ
らに，低酸素環境における HIF1の活性化と SIRT1の
低下が顆粒層細胞の代謝と増殖の制御に重要である可能
性を示した。これらの研究成果等を詳細に検討した結
果，審査員一同は博士（畜産学）の学位を授与する価値
があると判断した。
─ 69 ─


卵胞発育と低酸素環境が顆粒層細胞の代謝と増殖に及ぼす影響

国正, 重乃

3840

KUNISHO, Shigeno

3841

氏 名 国 正 重 乃
学位（専攻分野の名称） 博 士（農芸化学）
学 位 記 番 号 乙 第 924 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 29 年 3 月 20 日
学 位 論 文 題 目 ゆば形成のメカニズムの解明ならびに品質向上に関する研究
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・農 学 博 士 髙 野 克 己
教 授・博士（農芸化学） 内 野 昌 孝
教 授・博士（農芸化学） 野 口 智 弘
教 授・博士（農芸化学） 渡 部 俊 弘
論文内容の要旨
わが国では年間 500万 tの大豆が消費され，400万 t
は食用油脂に，100万 tが味噌，醤油，納豆，豆乳，豆
腐および「ゆば」などの様々な大豆加工品の製造に利用
されている。「ゆば」は，豆乳を加熱すると形成される
被膜であり，平安時代に中国より伝来したと言われ，今
日精進料理の素材として寺院が多い京都や日光などが
「ゆば」の代表的な産地となった。「ゆば」作りは，加熱
した豆乳の表面に形成された被膜を棒で引き上げる簡単
な操作であるが，その品質は被膜形成と共に豆乳液面か
らの水分蒸発量，すなわち製造時の温度や湿度などの環
境条件によって「ゆば」の硬さや収量が安定せず不良率
が高くなる。また，引き上げた「ゆば」（生ゆば）には
大豆由来の耐熱細菌が存在し，一般細菌数が 1g当たり
103∼104個と多く腐敗が早く，このため「乾燥ゆば」や
「揚げゆば」として加工し利用されて来た。生ゆばの風
味を提供するため，耐熱性細菌を死滅させるレトルト殺
菌が導入されたが，同殺菌によって「ゆば」が溶解する
など課題が多い。「ゆば」の形成機序が未解明であるた
め，製造条件と「ゆば」の品質との関係については十分
に研究されていない。
「ゆば」の形成については，岡本らが大豆分離タンパ
ク質（SPI）溶液を加熱するとタンパク質の被膜が生成
されること，同被膜中に大豆の主要タンパク質の b-コ
ングリシニンおよびグリシニンがジスルフィド結合
（SS結合）によって重合化したものが存在することを
報告している。このことから，「ゆば」はこれらのタン
パク質が SS結合することによって形成するとされて来
たがその後詳細な検討は行われず，両タンパク質のサブ
ユニットの挙動，重合物の会合による被膜化の機序，
「ゆば」中でタンパク質に次いで約 14%含有される脂質
の「ゆば」形成への影響および関与など，「ゆば」形成
の機序は未だに解明されていない。
本研究では，未解明であった「ゆば」の形成機序を解
明すると共に，その成果を基に「ゆば」の製造上におけ
る課題および品質の改良に関する研究を行った。以下に
研究成果の概要を記述した。
Ⅰ．「ゆば」を形成するタンパク質の確認と結合挙動に
ついて
1． タンパク質被膜の形成挙動
豆乳および豆乳と同じタンパク質濃度 3.0%（w/v）に
調整した SPI溶液 40mlを 90℃で加熱し，タンパク質
被膜の形成挙動を観察した。加熱時間 20分で 1枚目の
被膜が形成され，その後約 15分毎に被膜が形成された。
SPI 溶液より調製した被膜は，豆乳より調製した「ゆ
ば」に比べ薄く透明度が高かった。SDS-PAGEでは，
何れも同様に大豆主要タンパク質のグリシニンの酸性サ
ブユニット（GA），塩基性サブユニット（GB）および
b-コングリシニンの a，a’，bサブユニットが検出され
た。
なお，豆乳および SPI溶液に SH基修飾剤である N-
エチルマレイミド（NEM）10mMを加え，90℃にて加
熱したところ，両者共に被膜の形成はみられなかったこ
とから，SS 結合による各タンパク質分子間の結合が
「ゆば」形成の基本になっていることが確認された。
2．「ゆば」形成に関わるタンパク質の結合挙動
「ゆば」の骨格であるタンパク質被膜を構成する大豆
主要タンパク質のグリシニンの GA，GBおよび b-コン
グリシンの a，a’，bサブユニット分子同士の結合挙動
について，対角線電気泳動法にて解析を試みた。豆乳
40mlを 90℃で加熱し，タンパク質被膜を形成させた。
タンパク質被膜 10mg を 5M 尿素溶液 10ml にて溶解
し，SDS-PAGE（一次元 : 非還元）に供したところ GA
および GB の他，高分子量バンドが確認された。さら
─ 104─
に，サブユニットの解析を行うため，ジチオスレイトー
ル（DTT）にて還元処理した後に二次元目の SDS-
PAGEに供した。その結果，対角線上には a，a’，bサ
ブユニットおよび GAおよび GBが確認され，分子内結
合を示す対角線右上にはタンパク質のバンドはみられな
かった。一方で，分子間 SS結合を示す対角線左下には
一次元目の SDS-PAGE における 200kDa および 70
kDaを示す分子量に 2つのレーンが確認され，200kDa
は a，a’，GAおよび 17kDa，70kDaは GA，GBおよ
び 17kDaのバンドが検出されたことから，これらのタ
ンパク質分子が 1分子ずつ SS結合にて結合し，2つ加
熱複合体が形成されることが示唆された。
以上，豆乳を加熱すると，大豆タンパク質の a，a’，
GA および 17kDa，また GA，GB および 17kDa のタ
ンパク質分子間で SS結合が形成され，これらの加熱複
合体が被膜の骨格となっていることが明らかになった。
さらに，これらの加熱複合体同士および加熱複合体と他
のタンパク質が会合し「ゆば」の被膜となることが推察
された。
Ⅱ．「ゆば」形成におけるタンパク質分子間相互作用に
ついて
先の実験結果から，「ゆば」は大豆タンパク質の a，
a’，GAおよび 17kDaからなる 200kDaと GA，GBお
よび 17kDaからなる 70kDaの 2種の複合体が骨格と
なっていることが明らかになった。膜状の「ゆば」が形
成されるためには，これらの複合体が凝集することが必
要である。そこで，複合体の凝集に関わる分子間相互作
用の影響について検討を行った。
1．「ゆば」の形成と分子間相互作用の関係
「ゆば」形成に及ぼすキレート結合，水素結合，イオ
ン結合および疎水性相互作用の影響について検討した。
それぞれの結合に影響を与える，エチレンジアミン四
酢酸二ナトリウム（EDTA），尿素，塩化ナトリウム
（NaCl）およびチオシアン酸ナトリウム（NaSCN）を
それぞれ豆乳に添加し，「ゆば」の形成状態を観察する
と共に重量，タンパク質量を測定した。
EDTAでは 20mM添加によって豆乳中のタンパク質
が沈殿し，「ゆば」は形成されなかった。尿素の添加で
は，「ゆば」重量は 1Mで 86%，2Mで 76%，5Mで 52%
と濃度の増加によって低下した。NaCl（50∼300mM）
および NaSCN（50∼200mM）の添加で，「ゆば」の重
量は約 10∼40%およびタンパク質量は約 5∼20%増加
した。
キレート結合を阻害すると被膜は形成されず，塩凝固
性の大豆タンパク質の特性に対し塩類との結合が重要で
あることが示唆された。水素結合はタンパク質分子の立
体構造の基本的な結合であり，尿素による水素結合切断
の増加に従い依存的に被膜形成が低下したことから，水
素結合の総量が被膜形成に影響を与えるものと推察し
た。大豆タンパク質に親水性を付与する NaClおよび疎
水性相互作用低下剤の NaSCN によって「ゆば」形成
性が向上した。両作用はタンパク質分子間および複合体
間の距離を広げることから，「ゆば」形成性を阻害する
予想に反する結果であった。
2． NaClおよび NaSCNのタンパク質間相互作用への
影響
大豆タンパク質の親水性の増加および疎水性相互作用
の低下によって，「ゆば」形成性が向上したので，その
要因を探るため NaClおよび NaSCNを添加した豆乳に
おいてタンパク質表面疎水性度を Nakaiらの方法にて，
遊離 SH基量を 7-クロロ-4-ニトロベンゾ-2-オキサ-1，
3-ジアゾル（NBD-Cl）法にて測定した。50および 300
mM の NaCl 添加によってタンパク質の表面疎水性度
は，それぞれ約 1.2および 1.4倍に，遊離 SH 基は約
1.1倍増加した。50および 200mM の NaSCN 添加に
よってタンパク質の表面疎水性度はそれぞれ約 1.1およ
び 1.2倍，遊離 SH基は 50mMNaSCNでは増加はみら
れなかったが，200mM NaSCNでは約 1.1倍に増加し
た。このような現象は，NaClがタンパク質分子間の電
気的な反発力を弱め，また NaSCN による疎水性相互
作用の低下によって，タンパク質分子間の会合力が小さ
くなり，分子表面に露出する遊離 SH基が増加したもの
と推察した。
3． NaClおよび NaSCNの「ゆば」形成への影響
SH残基はタンパク質内部の疎水性領域に存在する。
また，タンパク質は熱変性によって疎水性領域が露出
し，疎水性の高い領域同士が会合すると共にさらに露出
した SH残基によって分子間 SS結合が生じて凝集し，
不溶化が促進される。
そこで，NaClおよび NaSCNによってこの増加した
SH残基が，「ゆば」形成に与える影響について検討を
した。50mM NaCl および 200mM NaSCN の添加に
よって「ゆば」の重量はそれぞれ約 21および 11%増加
し，また被膜形成に要する時間はそれぞれ 2.5および 2
分間短縮し，「ゆば」形成速度が速くなった。
Ⅲ．「ゆば」形成における脂質の影響
1．「ゆば」と SPI溶液から調製した被膜の比較
豆乳およびタンパク質量を豆乳と同等に調整した SPI
─ 105─
溶液を 90℃にて加熱し，形成した被膜を回収後，重量，
厚みおよび硬さならびに外観を比較した。「ゆば」では，
1枚の重量が 1263mg，厚みは 2.0mm，硬さは 27.7gf
であった。一方，SPI 被膜ではそれぞれ 471mg，1.0
mmおよび 11.7gfであり，「ゆば」に比べ軽く，薄く，
柔らかかった。また，「ゆば」では白濁していたのに対
し SPI被膜では高い透明度を示した。「ゆば」形成に，
脂質が大きな影響を及ぼすことが示唆された。そこで，
「ゆば」形成における脂質の影響を検討するため，SPI
溶液に大豆油を 0∼3%添加し，超音波ホモゲナイザー
にて乳化処理後，被膜を調製した。その結果，SPI溶液
では大豆油の増加に伴い被膜の重量は増加し，白く厚い
被膜が形成することが確認できた。また，豆乳と同含量
の脂質 2%では，「ゆば」と同等の破断力 27.3gfを示し，
被膜形成性およびその性状に脂質が大きな影響を及ぼし
ていることが明らかになった。
さらに，これらの被膜断面を電子顕微鏡にて観察した
結果，「ゆば」では，気相に接した表面が密な組織に
なっていたが，溶液に接していた裏面は多孔質な層に
なっていることが確認された。一方，SPI被膜は薄く，
被膜全体の組織が密であり，大豆油 3%SPI 被膜は，
「ゆば」と同様の組織を示したことから，「ゆば」が多孔
質な構造を形成することに脂質の存在が重要であること
が明らかになった。
2．「ゆば」中の脂質とタンパク質の観察
「ゆば」を凍結用包埋剤で満たした後，−80℃に凍結
させ，約 10mm の厚みに切片を切り出し，フッ化バリ
ウム（BaF2）ではさみ，赤外顕微鏡・IRイメージング
システム（FTIR-イメージング）にて測定した。その結
果，「ゆば」を構成するタンパク質相内に脂質が油滴と
して存在していることが確認された。
3．「ゆば」におけるタンパク質と脂質の存在状態の解
析
「ゆば」中における脂質の存在状態とタンパク質との
関係について検討するため，豆乳を超遠心分離（156,000
×g，30分間，4℃）に供し油層画分，可溶画分および
不溶画分に分画した。各画分のタンパク質について
SDS-PAGE（Me+）にて解析した。その結果，油層画
分に可溶および不溶画分にみられない 17kDaのタンパ
ク質が検出された。このバンドを切り出し LC/MS/MS
で分析を行い，Mascot データーベースを使用し，
NCBI Protein BLASTにて相同検索行った結果，大豆
のオイルボディ表層に存在する 16.5kDaのオレオシン
1-likeと同定した。先述（Ⅰ．2）の対角線電気泳動に
おいて 2つのタンパク質複合体の 17kDaタンパク質と
の関係が推察されたので，同様に LC/MS/MS解析に供
したところ，オレオシン 1-like と同定された。大豆オ
レオシンにはこのほか 24kDaおよび 18kDaが存在す
るが，オレオシン 1-likeのみにシステイン残基が存在
する。
このことから，「ゆば」の構成成分である脂質はオレ
オシンで覆われ油滴として存在し，オレオシン 1-like
が「ゆば」の骨格タンパク質と SS結合することにより
「ゆば」中に取り込まれていることが明らかになった。
Ⅳ．「ゆば」製造における品質の向上および生産性の効
率化
「ゆば」は豆乳を長時間加熱するため，その引き上げ
枚数の増加に伴い，「ゆば」が褐変化する。「ゆば」の色
調を維持するため，引き上げ枚数を制限するので収量が
低くなる。また，「ゆば」の硬さが安定しないため，形
状不良率も高い。さらに，「ゆば」には，大豆由来の耐
熱性芽胞形成細菌（B.licheniformis，B.subtilis）が存
在するため，冷蔵で 2∼3日しか日持ちがしない。冷凍
では融解時に「ゆば」に離水が生じ，ゆば本来の食感が
失われる。レトルト殺菌を試みたが，「ゆば」の一部が
溶解するなど形状不良が発生し，高温耐性の「ゆば」が
求められている。
1． NaCl添加「ゆば」の官能試験および品質評価
NaClの添加によって「ゆば」形成性を向上すること
が確認できたため，「ゆば」の品質に与える影響につい
て検討した。NaCl 添加濃度は，食味に適した 50mM
とした。まず，NaCl添加による「ゆば」の物性および
色調への影響を測定した。NaCl添加によって破断距離
および破断荷重とも無添加に比べ大きく増加した。色調
は NaCl添加によって明度（L値）がやや高く，赤色値
（a 値）は低く，黄色値（b 値）が高く，くすみが少な
く鮮やかな黄色を呈する「ゆば」が形成された。官能試
験では色および味，硬さについていずれも NaClを添加
した「ゆば」の方が好まれる傾向にあり，二者間に嗜好
差が認められた。
以上の結果より，50mMNaCl添加によって，「ゆば」
が硬くなり，色調も改善され食味評価および商品価値が
向上した。
Ⅴ． 総 括
「ゆば」の製造現場における問題点の解決を図るには，
「ゆば」の形成機序の解明は重要であるが，これまでの
研究では詳細な「ゆば」形成機構は未解明で有り，また
「ゆば」に多く含まれる脂質との関係性などは検討され
─ 106─
ていなっかった。
本研究によって「ゆば」は，タンパク質分子間の SS
結合や疎水性相互作用などによるタンパク質被膜の形成
と共に，タンパク質被膜に脂質が取り込まれることに
よって，破断力が増加し，膜厚になることが確認でき
た。また，大豆オイルボディの被膜タンパク質であるオ
レオシン 1-likeと豆乳中の a，a’，GAおよび GBタン
パク質分子が SS結合にて会合することによって，被膜
の骨格組織に脂質が取り込まれることが明らかとなっ
た。「ゆば」形成に関して，タンパク質被膜のより詳細
な形成機序ならびに脂質との関係性を解明するととも
に，その成果を基に製造工程の改良およびレトルト耐性
を付与した高品質「ゆば」を開発し，廃棄される「ゆ
ば」および豆乳量を減少させ，経費を削減することが出
来た。
審査報告概要
ゆばの形成メカニズムの詳細は不明で，ゆばの生産性
および品質の向上に大きな隘路となっていた。本研究で
は，ゆば形成における大豆タンパク質分子の相互の結合
関係を明らかにし，さらに脂質がゆばの形成に不可欠で
あること，タンパク質被膜への脂質の取り込み機序を解
明すると共に得られた知見を基に製造現場における品質
および生産効率の向上を実現した。加熱豆乳中 SS結合
にて 200kDaおよび 70kDaのタンパク質加熱複合体が
形成され，被膜の骨格となっていること，構成タンパク
質分子を解析し主要タンパク質の他 LC/MS/MS解析に
より油貯蔵体滴表面に存在するオレオシン 1-likeと同
定した。このことより，油滴はオレオシン 1-lileを介し
タンパク質被膜に取り込まれることが明らかとなった。
また，タンパク質分子間の会合力を弱めると，タンパク
質の分子表面に SH残基の露出量が多くなりタンパク質
分子間の SS結合が促進されゆば形成性および硬さが向
上すること，同効果に NaClの添加が有効であることを
見出した。この知見を基に製造現場においてゆば製造の
改善を行い，皮膜形成性の向上による廃豆乳の削減，品
質の安定化によるゆばの不良率低減などにより，生産効
率を向上させた。
以上，ゆば形成をタンパク質分子レベルで解明し，そ
の内容は学術的にも高く評価される共に，生産現場の課
題を解決した実践的な研究でありゆば生産に大きく寄与
した。よって審査員一同は，国正氏に博士（農芸化学）
の学位を授与する価値があると判断した。
─ 107─


ゆば形成のメカニズムの解明ならびに品質向上に関する研究

芹田, 龍郎

3794

SERITA, Tatsuro

3795

行動学並びに脳内イメージング手法を用いた転写因子CREB活性化による学習能力向上機構の解析

坂下, 陽彦

3798

SAKASHITA, Akihiko

3799

氏 名 坂 下 陽 彦
学位（専攻分野の名称） 博 士（バイオサイエンス）
学 位 記 番 号 甲 第 737 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 29 年 3 月 20 日
学 位 論 文 題 目 マウスにおける始原生殖細胞の性特異的運命決定の分子機構
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・農 学 博 士 河 野 友 宏
教 授・博士（農学） 小 川 英 彦
教 授・博士（畜産学） 尾 畑 やよい
博士（理学） 宮 戸 健 二＊
論文内容の要旨
【緒 言】
哺乳動物の性分化は，性染色体の構成により遺伝的性
に支配され，XX は雌に XY は雄となる。雄型生殖巣
（XY）の支持細胞において Y染色体上から一過性に発
現する SRYが雄への性分化を決定する。マウスでは，
胎齢 11.5日に SRY が発現すると SOX9や FGF9など
の下流の雄性決定因子の発現を逐次的に誘起し，生殖巣
支持細胞は精巣形成および精子形成を支持するセルトリ
細胞へと分化する。一方雌型（XX）の生殖巣では，
SRYによる卵巣決定因子（WNT4，RSPO1）の発現抑
制が生じず，FOXL2および FST による卵胞形成が誘
導される。雄型もしくは雌型に構築された体細胞環境に
支持され，雌雄始原生殖細胞（PGC）は性特異的な運
命を獲得する。したがって，生殖巣の体細胞環境は雌雄
生殖細胞の発生を支持する。生殖細胞および生殖巣の相
互作用については，突然変異もしくは人為的遺伝子欠損
によって生じる性転換マウスの事例がある。性転換マウ
スは，PGCの性染色体構成と異なる生殖巣環境を持つ。
例えば，Sry遺伝子の機能欠失によって生じる XY性転
換雌マウスでは，Y染色体を保有しているのにもかかわ
らず雌型の生殖巣環境が構築され，生殖細胞は卵子様に
分化する。このことは，生殖細胞の性特異的な運命決定
（卵子あるいは精子への分化）は，自身の性染色体構成
ではなく生殖巣環境の性に依存していることを示してい
る。しかしながら，これらの性転換マウスは生殖細胞形
成過程において生殖細胞数の低下，染色体の不対合およ
び分配異常の多発を含む様々な異常を示し，不妊である。
上述のとおり，PGCにおける性分化の分子基盤に関
する研究は進展しているが，雌雄生殖細胞形成プロセス
を理解する上で残された課題も少なくない。例えば，
（1）発生のどの時期からどのような制御因子およびネッ
トワークが働き生殖細胞の性特異的な運命が決定するの
か理解されていない。（2）Y 染色体には性決定遺伝子
Sryの他にもタンパク質コード遺伝子が存在するが，そ
れらの PGCの性分化および生殖細胞形成における作用
については不明な点が多い。さらに，（3）性転換雌マウ
スの PGCの性染色体の構成と生殖巣環境の性の不一致
が卵子形成異常を引き起こすのか，その分子生物学的背
景は不明である。
【研究目的】
本研究は，マウス生殖細胞の性特異的運命決定のプロ
セスを制御する分子機構の解明を進め，生殖細胞形成や
それらの機能獲得に対する理解を深めることを目的に，
以下の一連の実験を実施した。（1）包括性および定量性
に優れた RNA-seq法を用いて，生殖巣到達直後の雌雄
PGCのトランスクリプトーム解析を行った。これによ
り，この時期の雌雄 PGCが示す遺伝子発現プロファイ
ルを明らかにし，体細胞の性に依存した明確な性分化が
すでに雌雄 PGCにおいて開始されているか検証を行っ
た。（2）性特異的発現遺伝子群を同定し，これらの in
silico解析を介して機能的生殖細胞形成を支持する制御
因子およびネットワークの同定を試みた。（3）さらに，
ゲノム編集技術である CRISPR/Cas9システムを用いて
Sry欠損 XY性転換雌マウスを作出し，性転換 XY雌マ
ウス由来 PGCのトランスクリプトーム解析を実施して
XY卵子形成異常の分子機構を追究した。
【結果および考察】
1． マウス雌雄 PGCsにおける性特異的発現遺伝子群
の獲得機構の解明
RNA-seq法により E13.5雌雄 PGCsの遺伝子発現プ
─ 27 ─
＊国立成育医療センター研究所 生殖医療研究部室長
ロファイルを次世代シークエンサー（NGS）により解
析した。雌雄 PGCs間で発現量に差がある遺伝子群を
検出（2 fold changeおよびModerated t-test, p＜0.05）
した結果，651 個の雌特異的発現遺伝子群（Female
specific expressed genes : FSGs）および 428個の雄特
異的発現遺伝子群（Male specific expressed genes :
MSGs）の同定に成功した。これにより，この時期の雌
雄 PGCsは，すでに性特異的な運命決定のプロセスに
あることが初めて明らかになった。加えて，同定された
FSGsおよび MSGsの生物学的意義をさらに詳細に解
析するため，DAVID web toolを用いて，各性特異的発
現遺伝子群の GO解析を行った。その結果，雌雄 PGCs
間で，「Regulation of transcription」および「Regula-
tion of transcription, DNA dependent」などの termを
もつ転写制御因子群が最も多く濃縮されていることが判
明した。さらに興味深いことに，FSGsには，Hand1，
Cdx2および Gata3といった胚体外組織への分化を制御
する転写制御因子群が，MSGs には，Otx2，Olig2 お
よび Heltなどの神経細胞分化に関与する転写制御因子
群が多く濃縮されており，FSGs および MSGs 間に機
能的な差異があることが明らかになった。これらの雌雄
特異的な転写制御因子が，現在までに報告されている転
写制御機構とは全く異なる方法によって，生殖細胞の性
特異的な分化を支持している可能性が考えられる。ま
た，雌雄 PGCs全転写産物のパスウェイ解析の結果，
雌雄 PGCs双方で，細胞周期に関与する「MAP kinase
pathway」の全制御因子および「Ras signaling path-
way」の生存および細胞死に寄与する双方の因子が検出
された。これにより，E13.5雌雄 PGCsが転写不均質性
をもった細胞集団であることが強く示唆された。
2． マウス雌雄 PGCs集団における転写不均質性の証明
1. におけるパスウェイ解析の結果，E13.5雌雄 PGCs
は高い転写不均質性を保有する細胞集団であることが示
された。そこで C1 Single-Cell Auto Prep Systemを用
いて E13.5雌雄 PGCのシングルセル RNA-seqライブ
ラリ構築を行った結果，67（雌）および 77（雄）サン
プルのシングル PGC RNA-seqライブラリの構築に成功
した。雌雄 PGC集団内における生物学的遺伝子発現変
動を明らかにするため，シングルセル PGC RNA-seq
データセットにおける発現遺伝子の k-meansクラスタ
リング解析を行った。各サンプル間で fpkm値が 2倍以
上異なる遺伝子群を変動遺伝子群（Highly variable
genes）として定義し抽出を行った結果，雌性 PGC間
において 1472個，一方雄性 PGC間において 3590個の
変動遺伝子群が検出された。また，これらの発現変動遺
伝子群を対象に GO解析を行った結果，アポトーシス
関連およびタンパク質代謝に関与する termをもつ遺伝
子群が多く濃縮されていることが明らかになった。さら
に，アポトーシス関連遺伝子群の発現状態によって各シ
ングルセル RNA-seqデータセットをクラスタリング解
析した結果，外因性アポトーシスパスウェイに関与する
因子は，ほとんどの雌雄 PGCサンプルで低発現状態を
示していた一方で，ミトコンドリア性アポトーシスパス
ウェイに関与する Casp2，Bax，Casp9，Apaf1，Cyct
および Cyc1 や Common apoptosis effector である
Casp3，Casp6 および Casp9 の発現は，雌雄 PGC サ
ンプル間で高い生物学的ばらつきが検出された。このこ
とは，ミトコンドリアを介した内因性アポトーシスパス
ウェイが，一部の雌雄 PGCsにおいて働いていること
を示唆している。また，クラスタリング解析の結果か
ら，この時期の約 60%の雌性 PGCsにおいてアポトー
シス経路が活性化しており，残りの 40%の細胞群では
アポトーシス誘導因子もしくは Common apoptosis ef-
fectorの発現が検出されなかった。これらのアポトーシ
ス陰性を示す細胞の割合は，出生後に生存する卵子数と
おおよそ一致するため，これらのシグナル因子がトリ
ガーとして働き，周産期における卵母細胞削減プロセス
を制御している可能性が示唆された。
3． Sry欠損性転換雌マウスにおける生殖細胞特性
CRISPR/Cas9システムを用いて作出した Sry欠損性
転換雌マウスの表現型は全て完全な雌型を示し，半陰陽
性を示す個体は検出されなかった。しかしながら，これ
らの妊孕性を B6N雄マウスとの交配試験によって評価
した結果，Sry欠損性転換雌マウスでは交配による膣栓
は確認されるものの，検証を行った全ての個体で妊娠は
成立しなかった。卵巣組織の病理組織解析の結果，Sry
欠損性転換雌マウスの卵胞は 6週齢で大部分が退行して
いることが判明した。したがって，Sry欠損性転換雌マ
ウスは解剖学的雌の表現型を持ち生殖行動を行うのにも
関わらず，不妊であることが確認された。次いで，この
生殖細胞の消失が発生どの時期から生じているか明らか
にするため，胎仔期および新生仔期の生殖巣中に存在す
る卵子数の計測を行った結果，検証を行った全てのス
テージで Sry欠損性転換雌マウスの生殖細胞数は有意
に減少していた。これにより Sry欠損性転換雌マウス
の生殖細胞の選択的削減は胎仔期から開始し，最終的に
は卵巣内の生殖細胞は枯渇し妊孕性を失うと結論づけら
れた。
次に，性転換雌マウスにおける生殖細胞の特性を明ら
かにするため，胎仔期（E13.5）および新生仔期（P1）
─ 28 ─
の XYsry-雌性生殖細胞を対象に RNA-seq法によるトラ
ンスクリプトーム解析を行い，XYsry-卵子形成に対する
潜在的阻害因子の同定を試みた。E13.5 XYsry-雌性
PGCsの発現変動遺伝子群を抽出した結果，4568個の
発現変動遺伝子群が検出された。また P1の非成長期卵
母細胞（NGOs）RNA-seq データセットにおいても同
様の解析を行った結果，P1において検出された発現変
動遺伝子数は E13.5における遺伝子数より大幅に少な
く，779個であった。このことは，転写異常が蓄積され
た XYsry-雌性生殖細胞が P1より以前に消失してしま
い，野生型に近い遺伝子発現プロファイルを保有する
NGOsのみが残存していることを示唆している。これ
らの発現変動遺伝子群の生物学的意義を詳細に解析する
ために GO解析を行った結果，E13.5 XYsry-雌性 PGCs
において Up-regulated genesとして検出された遺伝子
群には，「Wnt receptor signalling pathway」および
「Cell death」などの term が濃縮されており，Down-
regulated genes 内には，「Cell cycle process」および
「Meiosis」などの term が濃縮されていた。これによ
り，E13.5 XYsry-雌性 PGCsにおいてWNTシグナルお
よびアポトーシスの亢進と細胞周期および減数分裂移行
の遅延が生じている可能性が示唆された。さらに免疫染
色の結果，E13.5 XYsry-PGCs 核内には，WNT シグナ
ル活性化による安定化した b-cateninタンパク質が存在
し，これが細胞周期における G1/S期移行を阻害してい
ることが明らかになった。さらに E13.5 XYsry-PGCsに
おいて減数分裂関連遺伝子群の発現低下が観られること
から，WNTシグナルの亢進が減数分裂への移行も阻害
していることが示唆された。加えて，Repetitive ele-
ments の発現解析を行った結果，ほとんどの因子が，
XYsry-雌性生殖細胞で約 4∼10倍の発現上昇を起こして
いることが明らかになった。また，これらの発現抑制に
関与する H3K9me3修飾酵素およびヘテロクロマチン化
因子の発現は，XYsry-雌性生殖細胞において有意に減少
していた。これらの発現減少によって，XYsry-雌性生殖
細胞で Repetitive elementsの発現上昇が誘起されるこ
とが考えられる。加えて，Repetitive elementsの発現
上昇が XYsry-卵子の減数分裂進行にどのような影響を
与えているか免疫染色によって検証を行った結果，
XYsry-卵子において DNA傷害の蓄積および染色体不対
合などの異常が多く検出された。これにより，XYsry-雌
性生殖細胞における Repetitive elements の発現上昇
が，正常な減数分裂進行を妨げることが示唆された。こ
れらの生殖細胞形成過程における異常が何によって引き
起こされているか明らかにするため，本来雌型（XX）
の生殖細胞が保有していない Y染色体に焦点を当て，Y
染色体短腕部に位置する 12個のコード遺伝子の発現解
析を行った。その結果，Ube1y1，Eif2s3y，Uty，Ddx3y
および Rbmyの発現が，E13.5および P1の XYsry-雌性
生殖細胞において検出された。これらのタンパク質コー
ド遺伝子の発現が，XYsry-雌性生殖細胞形成を阻害して
いる可能性が示唆される。今後 CRISPR/Cas9システム
を用いてこれらの雌性生殖系列における存在が真に卵子
形成を妨げるかどうか，さらなる解析が必要である。
【結 論】
本研究は，生殖巣到達直後のマウス E13.5雌雄 PGCs
がすでに性特異性を保有していることを明らかにし，ま
た雌雄 PGCsそれぞれの細胞運命獲得は PGCs自身が
もつ性特異的な転写制御ネットワークによって支持され
ることを示した。加えて，Sry欠損性転換雌マウスをモ
デルとした解析によって，性染色体の構成と生殖巣環境
の性の不一致に起因する XYsry-卵子形成不全の初動と
その進行にかかわる分子機構を初めて明らかにした。本
研究により得られた知見は，哺乳類における機能的雌雄
生殖細胞形成において必須な生殖細胞の性特異的運命獲
得機構の理解に対する新たな洞察を与えただけでなく，
ヒトにおける性分化疾患（disorders of sex develop-
ment, DSDs）の発症機構の理解にも役立つことが期待
される。
審査報告概要
坂下陽彦氏の論文では，哺乳類生殖細胞の性分化機構
の分子基盤を明らかにするため，1）生殖巣の性差が生
じた直後（妊娠 13.5日目）の雌雄マウス胎仔始原生殖
細胞のトランスクリプトーム解析が実施された。また，
2）Y染色体上の性決定遺伝子 Sryをゲノム編集により
欠失させた性転換 XY雌胚が作製され，表現型解析およ
び Sry欠損 XY雌始原生殖細胞におけるトランスクリ
プトーム解析が行われた。その結果，マウス胎仔の生殖
細胞では，雄では体細胞分裂期特有の遺伝子群が，雌で
はアポトーシス促進遺伝子群や減数分裂関連遺伝子群が
活性化しており，雌雄生殖細胞に特異的な発生プログラ
ムが転写レベルですでに起動していることが明らかにさ
─ 29 ─
れた。さらに，Sry欠損性転換マウスでは完全な雌表現
型を呈するものの妊性を欠いており，顕著な卵母細胞の
衰退が不妊の原因であることが明らかにされた。さら
に，Sry欠損 XY始原生殖細胞では卵母細胞の発生プロ
グラムが惹起されているが，正常な XX始原生殖細胞の
遺伝子発現プロファイルとは異なり，機能的な卵母細胞
の分化が進行できないと結論づけた。
よって審査員一同は，これらの研究成果が，生殖細胞
の性分化機構を解明する一途になったと判断し，坂下陽
彦氏に博士（バイオサイエンス）の学位を授与する価値
があると判断した。
─ 30 ─


マウスにおける始原生殖細胞の性特異的運命決定の分子機構

竹尾, 駿

3822

TAKEO, Shun

3823

ウシの加齢に伴う卵胞液の性状変化と卵子の質低下の関係

有馬, 忍

3832

ARIMA, Shinobu

3833

氏 名 有 馬 忍
学位（専攻分野の名称） 博 士（農学）
学 位 記 番 号 乙 第 920 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 29 年 2 月 20 日
学 位 論 文 題 目 栽培きのこに発生する病害の病原特定，発生生態および防除
に関する研究
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士（農学） 根 岸 寛 光
教 授・博士（農学） 篠 原 弘 亮
教 授・博士（林学） 江 口 文 陽
論文内容の要旨
本研究はきのこ生産上の重要な生育阻害要因である微
生物に注目し，細菌および糸状菌に起因する子実体の病
害に関する研究を行ったものである。すなわち，生産地
における発生実態を調査し，病原菌の特定および同定，
感染経路の解明，防除法の開発を目的とした。
1994年から 2014年にかけて，ほだ木上のシイタケ子
実体が生育中に褐変または黒変し，異臭を放って腐敗す
る症状の発生情報が寄せられた。発生調査を行ったとこ
ろ，本症状は大分県内 11市 2町の林内ほだ場，人工ほ
だ場およびビニールハウス，合計 32か所で確認された。
また，生産者の約 60%は，本症状の発生を散発的に認
めていることがアンケート調査から判明した。本症状
は，一般的に使用されている市販 9品種の幼子実体から
成熟子実体に認められ，激害発生地は大きな経済的被害
を受けていた。発生地の環境および気象条件を調査した
結果，激害の発生は高湿度ほだ場において降雨の多い秋
期と春期に多かったが，中∼軽害の発生は乾燥傾向のほ
だ場においても発生することがわかった。本症状の発生
したほだ木を，試験場に持ち帰って継続調査を行った結
果，2013年 11月に持ち帰ったほだ木は 2014年 10月か
ら 2015年 4月にかけて，本症状を呈する子実体のみが
認められた。また，別の調査地から 2014年 12月に持ち
帰ったほだ木は，2015年 2月から 4月に本症状の発生
を確認した。さらに，本症状の発生が植菌時期の違いに
よって異なった事例や試験場内の人工ほだ場において交
配した 1系統のみに本症状の発生が確認された。以上の
ことから，本症状の発生が見られたほだ木からは，翌
シーズンも本症状が発生すること，シイタケ菌の生理的
活性および感受性の違いが重要な発病因子であると考え
られた。
本症状は，既知のシイタケ褐変腐敗病および黒腐細菌
病に酷似することから，細菌の起因によるシイタケ子実
体の病害と判断し，発生地から持ち帰ったサンプルを用
いて細菌の分離を行った。優先的に分離された細菌は，
普通寒天培地で白色，円形の集落を形成した。分離菌
（LE1001）の高濃度懸濁液をほだ木上のシイタケ幼子実
体に塗布接種した結果，接種 4日目に菌傘および菌柄の
一部が褐変し，7日目には子実体全体が異臭を放って褐
変した。以上のことから，分離菌をシイタケの褐変腐敗
症状の原因菌と特定した。
しかし，ほだ木を用いた接種試験は実施時期が限定さ
れ，生育条件の同じ幼子実体を揃えることおよび接種後
のほだ木管理が困難であった。そこで，分離菌のシイタ
ケに対する病原性を効率的に検定する方法として，菌床
シイタケを用いた方法の開発を行った。接種試験には除
袋後 4または 5日目に 1時間の散水を行った菌床を用
い，ネジ込み式で針の交換が可能なガスタイトシリンジ
で，分離菌の細菌懸濁液（約 109cfu/mL）0.1mL をシ
イタケ幼子実体に注入接種すると，接種 5日目に成長停
止または菌柄内部の褐変が高率に認められた。さらに，
接種 10日目には成長停止した幼子実体は異臭を放って
腐敗することを確認した。また，きのこ病原細菌 Pseu-
domonas tolaasii（814）を菌床シイタケに接種したと
ころ，同様な症状が発生することを確認した。したがっ
て，菌床シイタケを用いた注入接種法は，分離菌のシイ
タケに対する病原性を確認するための簡易方法として効
率的であると判断し，季節を問わず接種試験が可能に
なった。
褐変腐敗したシイタケからの分離菌 20菌株の細菌学
的性質を調査した結果，既知のシイタケ褐変腐敗病菌
Ps. fluorescensおよび黒腐細菌病菌 Ps. tolaasiiとは異
なり，エノキタケ褐色腐敗病菌 Erwinia sp. に酷似する
ことがわかった。さらに，16S rRNA 遺伝子解析の結
果，分離菌はイギリス，ニュージーランド，韓国および
─ 88 ─
エジプトで発生したツクリタケの菌柄内部壊死病菌
Ewingella americanaと 99%以上の相同性を示すこと
が判明した。以上のことから，ほだ木上のシイタケ子実
体が褐変腐敗する症状は，Ew. americanaに起因する
細菌性の病害と判断した。これまでに Ew. americana
によるシイタケの病害報告はないので，病名をシイタケ
腐敗病（Brown rot）と命名することを提案した。
シイタケ腐敗病菌 Ew. americanaを効率的に分離す
るため，選択培地の作製を行った。植物病原細菌
Erwinia属菌の選択培地 D3培地を基礎培地とし，炭素
源および窒素源を検討したところ，きのこに広く含まれ
る糖アルコールである D（+）アラビトールを添加する
と選択性が高く，カザミノ酸ビタミンフリーを窒素源と
することで集落の色調が安定することがわかった。さら
に添加剤の検討を行い，A-D3培地【蒸留水 : 1000mL,
D（+）アラビトール : 10g, カザミノ酸ビタミンフリー :
5g, 塩化リチウム : 7g, グリシン : 3g, 塩化ナトリウム :
5g, 硫酸マグネシウム七水和物 : 0.3g, ドデシル硫酸ナ
トリウム : 50mg, ブロモチモールブルー : 60mg, 寒天 :
15g, pH 7.2】を開発した。A-D3培地上で Ew. ameri-
canaを 28oCで 72時間培養すると，直径 0.8−1.0mm，
周囲が白色を呈する黄色集落を形成した。A-D3培地の
平板効率は 66%と高く，褐変腐敗した子実体から分離
された 93%の黄色集落は，Ew. americanaの血清と沈
降帯を形成したことから，生態的調査に使用できると判
断した。
シイタケ腐敗病菌 Ew. americanaの感染場所を明ら
かにするため，伏せ込み環境からの A-D3培地を用いた
分離を行った結果，原木生育地やほだ場の土壌，伏せ込
み中のほだ木表面およびシイタケ子実体から Ew. amer-
icanaが分離された。また，発病ほだ木をストレプトマ
イシン水和剤 1000倍液に 6時間浸漬する処理すると，
シイタケ子実体の褐変腐敗症状は認められず，Ew.
americana は分離されなかった。これらの試験結果か
ら，原木生育地の土壌に生息しているシイタケ腐敗病菌
Ew. americanaは，伏せ込み期間中にほだ木の樹皮表
面で増殖し，幼子実体に感染することでシイタケ腐敗病
が発生すると推察された。以上のことを総合的に考察す
ると，シイタケ腐敗病の防除はシイタケ菌の生理的な活
性を低下させることなく，ほだ木表面に生息する Ew.
americanaの生育密度を低下させることが効果的な対
策であると考えられる。
施設栽培されたクロアワビタケ，ヤナギマツタケ，ヒ
ラタケ，エノキタケ，エリンギおよびヤマブシタケの変
色または腐敗した子実体から A-D3培地を用いて分離す
ると，Ew. americana（LE1001）と同じ集落形状を示
す細菌が分離された。分離菌は 16S rRNA 遺伝子解析
の結果，Ew. americanaと 99%以上の相同性を示した。
これら分離菌を菌床シイタケに接種した結果，病原性を
有することが確認された。さらに，菌掻き直後のヒラタ
ケ栽培ビンに接種すると，菌傘の一部またはすべてが黄
褐色に変色した子実体が発生し，接種後の温度が高いと
激しい病徴を呈した。一方，Ps. tolaasii（814）をヒラ
タケの栽培ビンに接種すると，ヒラタケ子実体の菌傘上
に褐色の斑点が生じ，徐々に融合して広がり，菌傘全体
が黄褐変することが確認され，Ew. americanaを接種
した病徴とは明らかに異なった。以上のことから，Ew.
americana は自然栽培のシイタケに加えて，施設栽培
のヒラタケに対して生育阻害要因になることがわかっ
た。
1997年夏，大分県内においてビン栽培のエリンギ子
実体が白色の糸状菌に覆われ，軟化腐敗する症状の発生
情報が寄せられた。発生調査を行った 2か所の栽培地で
は，従来ブナシメジまたはヒラタケの生産を行っていた
が，今後需要の増加が見込まれるエリンギ栽培を試験的
に開始した。当時エリンギは国内での栽培事例は少ない
が，ブナシメジやヒラタケ栽培に準拠する方法で栽培が
可能であったことから，生産者は本格的な導入に移行し
ていた。しかし，エリンギ子実体が白色糸状菌に覆われ
る症状が徐々に見られ，菌掻き後の栽培ビンに白色糸状
菌の蔓延が散見されるようになると，経済的な被害は急
速に大きくなった。
エリンギ子実体上で生育する白色糸状菌は，ポテトデ
キストロース寒天培地で分離培養が可能で，培地上に多
量の分生子を形成することから，分生子を健全なエリン
ギ子実体に接種する方法で病原性の確認を行った。分離
菌（OMI 9801）の分生子懸濁液（約 106個/mL）を生育
中のエリンギ幼子実体に噴霧接種すると，3日後の子実
体上に白色糸状菌の生育が認められ，7日後には子実体
全体を覆い，軟化腐敗したことから原病徴が再現され
た。また，再分離菌と接種菌の培養性状は一致したこと
から，エリンギ軟化腐敗症状の原因菌を特定した。原因
菌は培養および形態的特徴から，既知のエノキタケおよ
びブナシメジのわたかび病菌と同一種 Cladobotryum
variumと同定した。C. variumによるエリンギの病害
は報告例がないことから，本病をエリンギわたかび病
（White mould）と命名した。
エリンギわたかび病菌 C. variumの分生子をエリン
ギの生育工程毎に噴霧接種すると，約 102個/mL以上の
濃度で子実体の変性が見られ，原基形成期に感染すると
─ 89 ─
激しい病徴を発現することがわかった。また，エリンギ
培養段階に接種すると，約 106個/mLの接種では栽培ビ
ンの側面に拮抗線が見られ，これらの栽培ビンからは健
全なエリンギ子実体は生育しなかった。しかし，約 106
個/mL以下の接種では，菌掻き時の栽培ビンに外観上
異状を認めなかったが，約 102個/mL以上の濃度で接種
した栽培ビンからは，変性した子実体の発生が認められ
た。したがって，低濃度で感染した培養ビンを種菌とし
て利用すると，短期間でエリンギわたかび病が拡大する
可能性が示唆された。
エリンギわたかび病菌 C. variumの分生子をエノキ
タケ，ブナシメジおよびヒラタケの栽培ビンに接種する
と，各子実体上において C. variumが生育することを
確認した。発病調査を行った 2箇所の栽培施設では，同
一発生舎においてエリンギとヒラタケまたはブナシメジ
を同時に栽培していたが，生産者はエリンギ栽培を開始
する以前に，ヒラタケおよびブナシメジに白色糸状菌が
生育する症状を稀に認めていた。したがって，C. varium
はエリンギ栽培を開始する以前からヒラタケおよびブナ
シメジの発生舎に生息し，新たに同一発生舎で栽培した
エリンギに対して，激しい生育阻害を起こしと推察し
た。
きのこの菌床栽培は閉鎖的な施設で行われるため，一
旦病害が発生すると大きな経済的被害を及ぼすことが知
られている。発病確認後の対策として，変性子実体や培
養不良ビンの早期除去を基本とする栽培環境の清浄化が
行われている。そこで，エリンギわたかび病が発生した
栽培施設において，有効な清浄方法を確立する目的に，
エリンギわたかび病菌 C. variumの分生子発芽および
菌糸伸長に及ぼす薬剤の影響を調査した。C. variumの
分生子を有効成分 500mg/mL のヒビテン，オスバンお
よびミクロトール Hで 5分間処理することで，発芽は
完全に阻害された。しかし，これらの薬剤はエリンギ菌
糸の生育を阻害するので，使用場面は限定されることが
わかった。C. variumの菌糸伸長阻害効果は，ベンレー
トおよびパンマッシュで高く，エリンギの原基形成期に
使用する被覆資材を薬剤処理することでエリンギわたか
び病の発病は防止され，その効果は持続することを確認
した。以上のことから，エリンギわたかび病の伝染防止
には，これらの薬剤を適正濃度に使用し，施設内の消毒
を行えば有効であると考えられる。また，エリンギわた
かび病の発病は，エリンギの培養期間の影響を受けるこ
とが判明し，エリンギ菌株間で耐性に差があることもわ
かったことから，耐病性品種の作出によって，発病を防
止する可能性を示すことができた。
本論文は，原木栽培のシイタケを褐変腐敗させる細菌
および菌床栽培のエリンギに寄生する糸状菌を，基質上
で生育中の幼子実体に接種する方法で病原性を確認し，
原因菌の同定，感染経路の特定および防除方法の検討を
行ったものである。これらの研究成果は，きのこ生産地
で発病の防止または軽減させる対策を講じるための基礎
的かつ応用的な知見が含まれ，きのこの安定生産に大き
く貢献するものである。
審査報告概要
きのこ栽培産業は近年発展の一途を遂げているが，そ
の主要な生産阻害要因として病害の発生が世界各地で認
められるようになってきた。申請者はこれら病害の中で
病原が特定されていなかったシイタケ子実体の褐変腐敗
症状およびエリンギの軟化腐敗症状に着目し，その病原
を明らかにして病名を確定させるとともに，発生生態を
調査して病害発生抑制のための防除指針を策定した。特
にシイタケ腐敗症状については，既報の病原に加えてそ
れまでわが国に発生の認められていなかった新たな病原
細菌を見出し，これを Ewingella americanaと同定し
腐敗病と命名した。また栽培環境や野外での発生状況を
入念に調査して病害発生の経路を推定し，病害発生抑制
手段として新たなほだ木の管理手法を提案した。さらに
エリンギのわたかび症状については，他種のきのこに発
生するわたかび病と同様 Cladobotryum variumが病原
であることを確定するとともに，エリンギでは初発生と
なるためわたかび病と命名し，エリンギをはじめとする
種々のビン栽培きのこでの本病発生を抑制するための管
理手法を提案した。以上，本論文は栽培きのこ類につい
て大きな被害を与える病害の病原を明らかにするととも
に，栽培環境の改善や消毒手法について生産現場におけ
る具体的な手法を提案して病害発生を抑制することに大
きく貢献したものであり，審査員一同は著者に博士（農
学）の学位を授与するに値すると判断した。
─ 90 ─


栽培きのこに発生する病害の病原特定，発生生態および防除に関する研究

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