Tokyo University of Agriculture Repository / 東京農業大学リポジトリ

東京農業大学博士（国際バイオビジネス学

Kunwar, Abin

3812

3813

Farm Management Study of Orange Production and Distribution System in Nepal

吉田, 実花

3818

YOSHIDA, Mika

3819

氏 名 吉 田 実 花
学位（専攻分野の名称） 博 士（農学）
学 位 記 番 号 甲 第 747 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 29 年 3 月 21 日
学 位 論 文 題 目 高品質な国産リンゴ果実供給に向けた長期貯蔵法の検討およ
び内部褐変の発生抑制
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士（農学） 馬 場 正
教 授・博士（農学） 山 口 正 己
教 授・農 学 博 士 河 合 義 隆
博士（農学） 今 堀 義 洋＊
論文内容の要旨
日本においてリンゴは周年供給されている。収穫は 8
月の早生種に始まり，中生種，晩生種へとリレーされ
11月まで続く。その後は主品種ʻふじʼを中心とした
貯蔵果実へと移行し，年内は低温貯蔵した長野県産が主
流，年明けから主として青森県産に代わる。3月までは
低温貯蔵果，4月以降は低温にガス濃度調整を組み合わ
せた CA貯蔵果となり 7月頃まで販売される。
貯蔵リンゴの栽培地である青森県では，長期貯蔵用の
リンゴは有袋栽培果実を早期収穫する。しかし，長期貯
蔵を念頭に，最適な栽培法，収穫熟度や貯蔵環境を達成
できたとしても，貯蔵後半になると果実に内部褐変等の
貯蔵障害が発生する。貯蔵障害の発生には品種，栽培条
件や収穫日，貯蔵条件，果実のエチレン生成量，活性酸
素による酸化ストレスなどが関与していると考えられ
る。貯蔵障害の発生を抑制する方法が開発できれば，安
定した長期貯蔵につながる。
本研究では，まず第 1章において，周年供給される市
販リンゴの果実品質を評価した。内部品質の 1つとし
て，最近の健康機能性成分への関心の高まりを踏まえ
て，ORAC（Oxygen radical absorbance capacity）値
を評価した。第 2章では早期収穫した青森県産，熟度の
進んだ長野県産果実を用いて，長期貯蔵に適した温湿度
環境の検討を行うとともに，内部褐変の発生を調査し
た。さらに，第 3章では貯蔵限界要因となる内部褐変を
発生部位ごとに分類し，その発生に影響するといわれて
いる収穫日を変えてエチレン作用阻害剤 1-MCPを処理
し，内部褐変発生への効果を明らかにした。その際，内
部褐変の有無と過酸化水素生成量，アスコルビン酸含
量，果心内エチレン濃度などの関連について調査した。
最後の第 4章では，雪の冷熱を利用した「雪室」および
地下の室の壁面に石を積んだ「石室」での貯蔵に 1-
MCP処理を組み合わせて，長期貯蔵を試みた。
第 1章 周年供給されている市販リンゴの果実品質
9∼12月に流通している長野県産ʻつがる ，ʼʻ 紅玉 ，ʼ
ʻジョナゴールド ，ʼʻ シナノゴールド ，ʼʻ ふじʼおよび
ʻクリプスピンク （ʼ商標名 : ピンクレディ）について，
2013年収穫果で品質を調査した。その結果，果実重，
Brix，滴定酸度，果肉硬度，ORAC 値に関して，品種
間で有意差がみられた。ORAC値は黄色品種ʻシナノ
ゴールドʼで 8.6mmol TE/gFWであったのに対して，
ʻ紅玉ʼおよびʻふじʼでは 15.7mmol TE/gFW と高く
なった。また，同一品種内でのばらつきをʻふじʼ15
果で調査した結果，ORAC値に 1.7倍程度の違いがみら
れた。
2016年 1月から 7月に購入した青森県産ʻふじʼの
品質を調査した。その結果，Brixは 12.6%から 14.6%，
滴定酸度は 0.25%から 0.31%を示した。青森県産果実
の Brixは長野県産果実の 16%に比べてやや低く，長期
貯蔵を前提とした早期収穫が果実品質に影響しているこ
とが示唆された。
第 2章 異なる温湿度条件で貯蔵したリンゴの果実品質
新規開発の海上コンテナ用冷蔵庫（NDRC）をリン
ゴの長期貯蔵に利用するため，設定条件の検討を行っ
た。その結果，本コンテナは温度制御精度が高く−1℃
設定が可能であること，高湿度条件で果実の重量減少が
抑制されることを確認した。これを受けて，−1℃に設
定した NDRCに加湿器を設置し，青森県産ʻふじʼ果
実の長期貯蔵を行った。貯蔵期間中，外気温は−8.5℃
─ 64 ─
＊大阪府立大学大学院 生命環境科学研究科 教授
から 13.6℃まで変動したが，NDRCの庫内温度は貯蔵
期間中を通して−1.0±0.5℃以内で推移し，推定される
リンゴの凍結温度−2.6℃を下回ることはなかった。湿
度も 90%以上を保持できた。貯蔵 6か月後の果実品質
を調査したところ，約 4割の果実で内部褐変が発生した
が，酸素濃度 2.5% および二酸化炭素濃度 1.5% の CA
貯蔵庫で貯蔵（4か月間 CA貯蔵後 2か月間普通冷蔵）
した果実と遜色ない品質を保持できた。
青森県産果実に比べて栽培期間が最大 40日程度長く，
熟度の進んだ長野県産ʻふじʼ果実の貯蔵最適条件を調
査するため，2013年に長野県上伊那郡で暦日にもとづ
いた適期に収穫されたʻふじʼ果実を用いて貯蔵試験を
行った。果実は 3℃設定の普通冷蔵庫および 3℃，−1
℃，−2℃設定の低温高湿庫で 6か月間貯蔵した。貯蔵
6か月後に重量減少率，Brix，滴定酸度および果肉硬度
を測定した。貯蔵中の温度は普通冷蔵庫で 2.4±0.9℃，
低温高湿庫でそれぞれ 2.7±0.5℃，−1.0±0.6℃，−1.9
±0.4℃，湿度は普通冷蔵庫で 89.4±8.4%，低温高湿庫
ではいずれも≧95.0%であった。貯蔵 6か月後に普通
冷蔵庫でのみ果皮にしわが，−2℃低温高湿庫でのみ果
心部の凍結がみられた。また，しわおよび凍結がなかっ
た 3℃および−1℃の低温高湿庫でも，4割程度の果実で
内部褐変がみられた。3℃と−1℃の低温高湿庫を比較す
ると，−1℃で滴定酸度および果肉硬度を保持していた。
以上より，早期収穫した青森県産，熟度の進んだ長野
県産とも，温度制御精度の高い冷蔵庫を使って−1℃の
低温と，90%以上の高湿度を維持することで 6か月間
果実品質を保持できた。ただし，現在流通している CA
貯蔵果同様，4割程度の果実が内部褐変により商品性を
喪失した。
第 3章 貯蔵リンゴにおける内部褐変の発生とその制御
内部褐変についてさらに調査するため，2014年に適
期とその前後 1週間の 3回に分けて収穫した長野県産
ʻふじʼ果実に，1000ppbの濃度で 1-MCP処理を行い，
3℃設定の普通冷蔵庫および−1℃設定の低温高湿庫に 6
か月間貯蔵した。貯蔵終了後に，棚もちを想定して
20℃，71%RHで 7日間保存し，果皮のしわの発生有無
および果心・果心線・果肉の 3部位に分けた内部褐変障
害の発生について調査した。貯蔵中の温湿度は普通冷蔵
庫で 4.4℃，49.2%，低温高湿庫で−0.8℃，≧95.0% で
あった。普通冷蔵庫では果皮のしわの発生により多くの
果実が商品性を喪失した。低温高湿庫の果実では，果心
褐変の発生は収穫適期で少なく，1-MCP処理により抑
制された。一方，果肉褐変は収穫が遅い果実で多く，1-
MCP処理により増加した。ただし，適期までに収穫す
れば果肉褐変の発生が少ないので，1-MCP処理との併
用で内部褐変の発生は 2割程度に抑制された。
2015年に収穫した長野県産ʻふじʼを−1℃で 6か月
間貯蔵した後，7日間 20℃，67%RH で保存した。果
心，果肉の褐変発生の有無と，それぞれの部位における
過酸化水素含量，アスコルビン酸含量および果心内のエ
チレン濃度との関係を調査した。その結果，部位に関わ
らず，過酸化水素生成量およびアスコルビン酸含量と褐
変の発生には関連が認められなかったが，果心内エチレ
ン濃度は，果心もしくは果肉に褐変が発生した果実で低
かった。褐変が発生した果実では正常な代謝機能が失わ
れており，貯蔵後に 20℃に昇温しても果心内エチレン
濃度が上昇しなかったと考えられる。褐変発生における
過酸化水素をはじめとする活性酸素の役割や，部位に
よって 1-MCP処理の効果が異なった要因についてはさ
らなる調査が必要である。
第 4章 自然エネルギーを利用した貯蔵技術の開発
2014年に長野県産ʻふじʼ果実を適期と前後 1週間
の 3回に分けて収穫し，雪室貯蔵と 1-MCP処理を組み
合わせて，6か月間の長期貯蔵を試みた。貯蔵中の雪室
の平均温湿度は 0.9℃，≧95%RHであった。貯蔵後に 7
日間 20℃，71%RHで貯蔵した。果皮のしわおよび部位
別の内部褐変障害の発生を調査した。その結果，雪室で
はしわの発生が抑制され，果心褐変の発生は 1-MCP処
理により抑制された。しかし果肉褐変の発生は，収穫が
遅かった果実において 1-MCP処理により増加したこと
から，雪室を用いて目標の 6か月後まで高品質な果実を
提供するためには，適期までの収穫と 1-MCP処理が必
要であった。
雪室の利用は積雪地域に限定される。そこでより汎用
性の高い貯蔵方法として，地下の室の壁面に石を積んだ
石室を利用して 6か月間の長期貯蔵を試みた。2015年
に適期と前後 1週間の 3回に分けて収穫した長野県産
ʻふじʼ果実を，1-MCP 処理を行った後石室で貯蔵し
た。貯蔵中の石室の平均温湿度は 8.4℃，≧95.0% で
あった。その結果，貯蔵 6か月後の内部褐変は適期より
1週間早い収穫と 1-MCP処理により抑制できたが，貯
蔵 6か月後の滴定酸度と果肉硬度はいずれも低下した。
このことから，貯蔵 5か月目までであれば，高品質な果
実を供給できることがわかった。
本研究は熟度の進んだ長野県産果実について，品質保
持とともに内部褐変の発生を抑制する貯蔵法を検討し
─ 65 ─
た。温度制御精度の高い冷蔵庫で−1℃の低温を実現し，
90%以上の高湿度を維持できれば，6か月間品質保持が
可能であった。しかし，4割の果実で内部褐変が発生し
た。その抑制には，適期までの収穫と 1-MCP処理が有
効であることを示した。さらに，自然エネルギーを利用
した雪室と石室の利用を提案した。1-MCP処理を組み
合わせることで石室では 5か月間，雪室では 6か月間の
貯蔵が可能であった。このように，熟度の進んだ長野県
産果実でも，5∼6か月間品質保持できる貯蔵法が明ら
かとなった。これらの研究成果は，1∼5月における高
品質リンゴ果実の安定供給に貢献するものである。
審査報告概要
国産リンゴは貯蔵技術の開発によって周年供給されて
いるが，1月から 7月に出回る果実は，長期貯蔵性を考
慮して早期収穫されている。申請者は，熟度の進んだ高
品質なリンゴ果実の長期貯蔵条件の確立を試みた。長期
貯蔵には酸度と硬度の低下が問題となり，これを安定し
た−1℃の低温と高湿度条件によって，6か月間保持で
きることを明らかにした。ただし貯蔵後期には 4割程度
の果実に内部褐変が発生した。その発生抑制のために
は，収穫適期までに収穫し貯蔵前にエチレン作用阻害剤
1-MCPを処理することが有効であり，この方法で内部
褐変を 2割程度まで抑えることに成功した。このように
貯蔵前処理と貯蔵中の温湿度管理で，5月まで高品質な
リンゴ果実を提供できた。さらに，自然エネルギーを利
用した雪室と石室での貯蔵も提案し，石室で 5か月間，
雪室で 6か月間の貯蔵が可能であることを実証した。
以上，本論文は熟度の進んだリンゴ果実の長期貯蔵法
を確立し，高品質なリンゴ果実の安定供給に貢献したも
のである。よって，審査員一同は著者に博士（農学）の
学位を授与する価値があると判断した。
─ 66 ─


高品質な国産リンゴ果実供給に向けた長期貯蔵法の検討および内部褐変の発生抑制

東京農業大学博士（生物産業学

山本, 敦也

3838

YAMAMOTO, Atsuya

3839

知床半島におけるオショロコマの食性に関する生態学的研究

東京農業大学博士（バイオサイエンス

谷水, 俊之

3955

TANIMIZU, Toshiyuki

3956

神経科学的手法とin silico 解析法を用いた社会記憶と社会識別制御機構の解析

増渕, 隆仁

3957

MASUBUCHI, Takahito

3958

- 1 - 
 
氏 名   増 渕 隆 仁 
学位（専攻分野の名称）   博 士（生物産業学） 
学 位 記 番 号   甲 第 752 号 
学 位 授 与 の 日 付   平成 29 年 9 月 30 日 
学 位 論 文 題 目   ゼニガタアザラシの対網行動と採餌戦略に関する研究 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（獣医学） 小 林 万 里 
               教 授・水 産学博士 塩 本 明 弘 
               准 教 授・博士（地球環境科学） 白 木 彩 子 
                    博士（学術） 金 岩   稔＊ 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
【研究の背景と目的】 
本研究の研究対象であるゼニガタアザラシ(Phoca vitulina stejnegeri)は，定住性の強いアザ
ラシであり，周年決まった上陸岩礁を休息・育児・換毛に利用する。第二次世界大戦後，脂
や毛皮，肉などの商業的な需要の高まりによる乱獲や沿岸の道路整備や護岸整備による生息
環境の悪化に伴い，1970 年代には個体数が 400 頭未満にまで激減し，環境省レッドデータ
ブックの絶滅危惧種 IB 類に掲載された。しかしその後の保護政策により，個体数を回復さ
せ，2015 年には準絶滅危惧種にダウンリストされた。日本におけるゼニガタアザラシの上
陸場は，北海道太平洋側の沿岸に存在し，襟裳岬と厚岸以東(以下，道東地域)に 11 ヶ所の
上陸場が存在する。mtDNA の研究から襟裳岬と道東地域のアザラシの間には遺伝的な交流
がほとんどないとされており，襟裳岬に生息するゼニガタアザラシは地域個体群であると推
測されている。道東域は 200km ほどの範囲の海岸線に 10 か所の上陸場が点在する。それに
対して，襟裳岬は，本種の日本における全生息個体の半数以上が利用している最大の上陸場
であるにもかかわらず，陸地から 500m－2,000m に連なった岩礁上のみに上陸する。そのた
め，襟裳岬は生息範囲が狭く，他の地域に比べ，個体群密度が高い場所であると考えられる。
そのため，個体数増加に伴って，襟裳岬周辺の秋サケ定置網(以下，サケ定置網)において漁
業被害量や漁業被害範囲，混獲数の増加が顕著になり，アザラシと漁業間の軋轢が深刻化し
ている。ゼニガタアザラシにおける漁業被害の形態は，網を破られるというような被害はほ
とんどなく，ほとんどがサケの頭部や腹部などのサケの一部を食いちぎる被害 (トッカリ食
い) である。被害を受けた魚は商品としての価値がなくなり，経済的な損失となる。さらに，
網の外においてサケが定置網に入るのを妨害するという見えない被害も存在するとも言わ
れている。また，襟裳地域の秋サケ定置網は金庫網部分を沈めない浮き網形式で，垣網の終
わりから金庫網までの部分の天井部分に網が存在しない。このため，アザラシが入網した際
＊三重大学 准教授 
- 2 - 
 
に，定置網外へ脱出することや網目から吻を出して呼吸することが容易で，定置網内で溺死
することはほとんどない。そのため，繰り返し定置網内を来網し，アザラシが侵入から脱出
までを学習し，サケ定置網内を自由に出入りしていると考えられる。本種の漁網に対する行
動・食性などの基本的な生態の解明は，今後の鰭脚類との軋轢を軽減するためにも必要不可
欠で有用な知見となる。しかし，水中で生活するゼニガタアザラシの行動や広範囲で長期的
な被害実態を明らかにすることは困難であった。本研究ではじめて超音波テレメトリー手法
やアンケート調査を導入することにより，水中での行動を可視化し，被害を定量化すること
を可能にした。 
そこで本研究ではそれらを利用して，北海道襟裳地域のゼニガタアザラシに着目し，(1)
秋サケ定置網の食害範囲，混獲数とアザラシの定置網滞在行動範囲を把握し，(2) サケの採
餌行動様式を踏まえて，定置網混獲個体の食性分析からサケを採餌している個体の特徴を明
らかにし，(3)アザラシの対網行動から定置網への常習性を明らかにすることで，漁網を利
用する本種のサケ定置網への依存性と学習過程，採餌戦略を明らかにするとこを目的に行っ
た。 
 
【第 1 章】アザラシによる食害・混獲範囲と定置網滞在行動 
襟裳地域の定置網操業中に，水中の行動観察に有効な超音波テレメトリー手法を用いてア
ザラシの定置網への滞在行動(定置網へ連続的に留まる行動)を観察し，同時に，サケ定置網
を対象とした長期的かつ広範囲に漁業被害アンケートを行い，2 つの視点の調査からアザラ
シと被害との関連性や定置網の被害状況について明らかにすることを目的に行った。超音波
発信機を 72 個体に装着し，2012 年－2015 年，9 月－11 月のえりも漁業協同組合管轄の定置
網 20 ヶ統(A-T 定置網)に 40 台の受信機を設置し，対網行動を追跡した。同時に，定置網操
業者に形状別の被害サケ尾数，混獲アザラシ数の記録を記入するアンケートを依頼し，比較
を行った。その結果，上陸場から近い定置網中心に多くの滞在が確認され，上陸場東側の定
置網で有意に多く滞在が確認された。特に上陸場から東側で一番近い M 定置網で顕著であ
った。また推定平均滞在時間は滞在が確認された定置網内で，有意な差があるとはいえず，
推定平均 32 分(1,950.85 秒)ほどの滞在を繰り返していることが明らかになった。また被害
量・混獲数共に滞在行動と同様に東側の M 定置網に集中しており，推定平均被害割合は
20.56%であった。そのため，M 定置網に対する依存度の高さや襟裳地域全体における漁業
被害範囲の偏りを示すことができた。加えて被害形状は，頭なしが多く可食部を多く被害が
半数ほど占めることが明らかになった。  
 
【第 2 章】採餌行動様式を踏まえた混獲個体の食性把握 
アザラシ類は，決まった採餌空間を繰り返し利用することが報告されており，定置網等の
- 3 - 
 
漁網等の集魚性の高い場所を，常習的に利用することが示唆される。しかし，襟裳地域の定
置網では，トッカリ食いと呼ばれるサケ胴部分の可食部を残すような被害形態が多く観察さ
れ，矛盾が生じている。また，定置網に来網する個体の特徴もまた，直接採餌行動が観察で
きないため評価が難しい。そこで本研究では，飼育下において魚の採餌様式を明らかにし，
襟裳地域のアザラシの胃内容分析を併せてサケを採餌・利用している個体の特徴ついて考察
する。採餌様式分析は，ニシン(Clupea pallasii)，シロザケ(Oncorhynchus keta)，ミズダコ
(Octopus dofleini)を当歳獣に給餌し食べ方を記録し，エソグラム作成，採餌時間計測を行っ
た。胃内容分析は，襟裳地域にて収集されたゼニガタアザラシの胃(n=384)から餌生物を同
定し，採餌数，採餌重量(g)，採餌熱量(kJ)を算出し，各餌生物の相対重要度割合(IRI%)を算
出した。また，サケ定置網混獲個体の採餌数，採餌重量(g)，採餌熱量(kJ)から混合分布クラ
スタリング手法で潜在変数を探索した。加えて，推定した採餌熱量と一日当たりの総要求熱
量と比較を行った。 
クラスタリングの結果，9 のクラスターに分けられた。その中にサケを選好して採餌して
いるクラスターが存在し，大型個体(平均体重 83.64kg，平均年齢 8 歳)が多く，平均尾数 2.57，
平均重量 2,284.82g，平均 16,512.95kJ であった。また，サケ採餌クラスターのみが，成獣１
日当たりの総要求熱量と同程度の餌生物を採餌していた。加えて，実際に胃内から出現した
サケは主に胴部分であり，サケの頭部を含む丸ごと 1 尾のサケが出現した個体は，15 個体
中 1 個体のみで，サケ出現尾数 36 尾に対して 5 尾のみであり，残りは頭がないサケであっ
た。そのため，頭がないサケが多く観察されるという漁業被害の形態の結果と矛盾する結果
となった。一方，採餌様式分析の結果から，ニシンとミズダコの給仕初日の採餌時間はニシ
ン１尾で 3 分，ミズダコは 3 時間以上かかり 70％ほどしか採餌できなかった。しかし，給
餌最終日の採餌時間はそれぞれ，2.34 秒，1,662 秒と，採餌を学習すると短時間で採餌する
ことが出来るようになった。一方，シロザケは給仕最終日でも 3 時間以内に採餌することが
出来ず，シロザケの採餌を学習する(可食できるようになる）には長い期間が必要であるた
め，当歳獣にとって利用しにくい魚種であることが明らかになった。加えてシロザケ給餌実
験では，まずサケの頭を取る行動が見られ，その後時間をかけて胴部を少しずつ食べていた。
その際，生じた給仕初期のサケの残骸は，被害形状(頭なし)と酷似していた。そのため，サ
ケの被害は，サケを選好している個体に消費されている潜在的な被害と当歳獣が学習過程で
サケをうまく採餌出来ずに網内に残留する被害が存在することが示唆された。 
 
【第 3 章】定置網操業前・操業中の対網行動 
人工物な構造物である定置網の存在がアザラシの生態にどのように影響しているかを知
ることは，今後の漁網と海生哺乳類との間の軋轢を解消するために重要な知見となりうる。
そこでアザラシの定置網への滞在行動を定置網設置前である操業前と操業中を比較し，アザ
- 4 - 
 
ラシの対網行動から定置網への常習性を明らかにすることを目的に行った。 
調査は 2011 年から 2015 年の 7 月から 11 月に，超音波発信機を計 89 個体に装着し，襟裳
岬上陸場から東側の 3定置網(M/N/O定置網)に受信機を設置する事で対網行動の観察を行っ
た。滞在をくりかえす間隔(滞在間隔)と滞在し続ける時間(滞在時間)算出したところ，操業
前の滞在間隔と滞在時間は，操業中と有意に異なることが明らかになり，操業が開始すると
アザラシの滞在行動は変化することが考えられた。加えて，定置網操業期間における追跡時
間中の各定置網への総滞在時間でクラスタンリングを行った結果，定置網に費やす時間が長
い個体(滞在クラスター1)と短い個体(滞在クラスター2)に区分された。アザラシは，夜間に
採餌する報告も併せて，滞在クラスター1 の 2 歳以上は毎晩定置網に来遊し滞在しており，
非常に強い常習性をもつ個体が存在し，常習的に餌場として定置網を利用していることが考
えられた。また，滞在クラスター1 の当歳獣は，毎日，複数回定置網来遊するが，滞在する
時間帯に傾向は見られなかった。そのため，定置網を学習過程である可能性が示唆された。 
 
【総合考察】 
本調査地の定置網はシロザケを漁獲対象種としている。シロザケの平均標準体長は
60-75cm にもなる大型魚である。給餌実験の結果から，当歳獣は，シロザケ採餌には長い時
間の学習が必要であり，採餌開始時に頭部を噛みつき胴から切り離すことが示された。また，
食性分析の結果から，混獲個体の約半数(n=193/384)が当歳獣であったにもかかわらず，当歳
獣の胃内からサケは出現しなかった。加えて，滞在クラスター1 の当歳獣は，１日に複数回
定置網に時間帯に関係なく来遊していることが確認された。そのため，当歳獣の中にも定置
網の場所や構造は学習している個体が存在し，何度も時間帯に関係なく定置網に時間を費や
すことでサケの採餌を学習していると考えられた。また，これら当歳獣において採餌経験を
積む過程でトッカリ食いと呼ばれる頭無しの被害を生じ，アンケート調査結果の頭無し形状
の被害数が多い結果に反映されている可能性が考えられた。一方，食性分析の結果から，サ
ケを採餌しいている個体は，大型個体であり，対網行動の結果からも滞在クラスター1 の 2
歳以上の個体は，定置網に決まった時間に常習的に来網しており，餌場として強く依存して
いると考えられた。そのため，サケ採餌個体および 2 歳以上の定置網学習個体は，定置網(サ
ケ)スペシャリスト個体であると示唆された。加えて，2 歳以上でもサケが出現しなかった個
体や定置網への来網頻度が低い個体も存在し，依存度と学習度合は個体や齢ごとに異なると
考えられた。バルト海では，ハイイロアザラシ雄成獣が 45mile(72.4km)離れた定置網の侵入
に特化し，採餌していることが報告されている。また、定置網利用個体数は，その地域の生
息個体数の 1%未満であると考えられている。本研究は，バルト海の報告とは異なり，多く
の当歳獣も定置網に来遊・滞在していることが明らかになった。この結果は，上陸場のごく
近く(3km)に定置網という集魚性の高い人工物が存在していることが起因していると考えら
- 5 - 
 
れた。加えて，襟裳地域の定置網は浮き網構造であり，定置網を餌場として学習していない
個体でも溺死すること少なく，何度も来網が可能な特殊性も併せて学習を助長し，より定置
網(サケ)スペシャリストになりやすい環境であると考えられた。  
 本研究では評価しにくく実態が不明であった漁業被害を，観察できる被害(アンケート調
査;1 章)と直接観察の難しい被害(胃内容物;2 章)にわけて，さらに直接観察が難しい水中での
アザラシ行動に有効な超音波テレメトリー手法を導入することで定置網への滞在頻度(対網
行動)を併せることで評価することが出来た。また，本研究で得た，餌生物別の学習にかか
る期間の違いや人工物に対する常習性や依存性は，今後の漁業と海生哺乳類の軋轢を解消す
るために重要な知見となり得る。また，今後の定置網への漁業被害軽減を考える上で，アザ
ラシに定置網に複数回滞在し学習することを防ぐこと，定置網の依存性の高い個体を選択的
に管理することが重要であると考えられた。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
 本論文は，北海道襟裳地域のゼニガタアザラシに着目し，(1)秋サケ定置網の食害範囲，
混獲数とアザラシの定置網滞在行動範囲を把握し，(2) サケの採餌行動様式を踏まえて，定
置網混獲個体の食性分析からサケを採餌している個体の特徴を明らかにし，(3)アザラシの
対網行動から定置網への常習性を明らかにすることで，漁網を利用する本種のサケ定置網へ
の依存性と学習過程，採餌戦略を明らかにすることを目的に行った。本研究の結果から，上
陸場のごく近く(3km)に定置網という集魚性の高い人工物が存在し，襟裳岬周辺の定置網は
浮き網構造であり，定置網を餌場として学習していない個体でも溺死することは少なく，何
度も来網が可能な特殊性も併せて学習を助長し，より定置網(サケ)スペシャリストになりや
すい環境であると考えられた。今後の定置網への漁業被害軽減を考える上で，アザラシに定
置網に複数回滞在し学習することを防ぐこと，定置網の依存性の高い個体を選択的に管理す
ることが重要であると考えられ，ゼニガタアザラシと共存を考える上でも，有用な知見とな
る。よって，審査員一同は博士（生物産業学）の学位を授与する価値があると判断した。 


ゼニガタアザラシの対網行動と採餌戦略に関する研究

東京農業大学博士（環境共生学

齊藤, 雄司

3816

SAITO, Yuji

3817

氏 名 齊 藤 雄 司
学位（専攻分野の名称） 博 士（環境共生学）
学 位 記 番 号 甲 第 746 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 29 年 3 月 20 日
学 位 論 文 題 目 夏期ハウス栽培農作業時における熱中症の発生状況およびそ
の予防対策
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士（医学） 樫 村 修 生
教 授・博士（農芸化学） 古 庄 律
教 授・博士（身体教育学） 上 岡 洋 晴
博士（医学） 星 秋 夫＊
論文内容の要旨
1． 研究の背景と目的
日本国内において，地球温暖化の影響は健康や社会に
大きな影響を与えており，気象庁気象研究所や国立環境
研究所（2011）の予測では，今後も夏の高温化が進み，
熱中症発症の増加が予測されている。その特徴のひとつ
として，熱中症は高温多湿な環境下で体内の水分や塩分
のバランスが崩れることで発症するが，加齢とともに体
温調節機能が低下することにより体内に熱が蓄積され，
高齢者で発症が多発している。とくに農業分野において
は，国内農業従事者の平均年齢が 2015年に 66.4歳に達
していることから，高齢化による熱中症発症の危険性が
高まっている。農業現場における熱中症死亡事故件数
は，2006年から 2015年の間に合計 172件あり，年々増
加傾向にある。過去，農業現場の作業環境に関する研究
において，鈴木ら（2011）は，加齢による体温調節反応
の低下から農作業時の熱中症発症の危険性を指摘してお
り，また澤井ら（2011）および登内ら（2013）は，ハウ
ス栽培作業中の暑熱環境曝露による作業負担増大の問題
を示した。前述の農作業現場における熱中症の死亡件数
の内，農業ハウス等施設内では 19件（11.0%）発生し
ており，いずれも 70歳以上の高齢者の発症であった。
国際競争や高品質化する消費者の要望に応えるため，天
候に左右されず，高度な技術を活用できる農業ハウスや
ガラス室栽培は興隆しており，国内農業生産延べ面積の
減少に反して，今後もハウス栽培は期待されている。近
年，農林水産省はハウス内作業における熱中症発症の予
防喚起を行っている。しかしながら，農林水産省におけ
る熱中症予防対策は，厚生労働省が進めている建設業や
製造業における独自の具体的対策に比べ，他省庁の予防
対策の活用と農林水産省生産局発行の農作業安全のため
の指針に留まっている。
農業における熱中症対策が遅れている原因としては，
個人経営農家が中心であり，個々の従事経験と知識から
熱中症を自己判断する傾向があるため組織的対策が講じ
られにくい業態であること，また農業従事者の生活習慣
や食習慣等を含めた複数側面から調査した研究が従来な
いことが影響していると考えられる。そこで本研究で
は，高齢化が進む農業において，年間を通じて高温化で
の作業が求められ，とくに熱中症対策が必要とされるハ
ウス栽培農業従事者を対象として，熱中症発生に係るア
ンケート調査，および農業現場での体温調節反応に関す
る実験を以下のように実施した.その結果から，農作業
時の熱中症発症に起因する因子を多面的に解析し，以下
の 3点を明らかにすることを目的とした。
（1）ハウス栽培農業従事者における熱中症の認識，発生
の実態，水分捕給状況を明らかにする.
（2）ハウス栽培農業従事者における既往状況，生活習慣
および食習慣の調査から，熱中症発症に係る要因を明ら
かにする。
（3）夏期暑熱環境下ハウス栽培農作業現場において，実
際の農業従事者における体温調節反応の変化を測定し，
熱中症発症の危険性を評価する。
これらの調査から，ハウス栽培農業従事者における熱
中症発症の危険性の実態を明らかにし，農業従事者に対
する具体的予防対策を提示する。
2． 研究方法
（1）｢ハウス栽培農業従事者における作業時の熱中症の
発生および水分補給の実態｣
本研究は，2013年 6月初旬から同年 7月末までの 2ヶ
─ 60 ─
＊桐蔭横浜大学大学院スポーツ科学研究科 教授
月を調査期間として，埼玉県春日部市と周辺市町，山口
県宇部市と周辺市町村在住のハウス栽培農業従事者 257
名にアンケート調査を行った。調査項目は，熱中症とい
うことばや症状の認知の有無，夏期農作業中の熱中症既
往経験の有無であり，既往判断は，専門医師によるもの
ではなく，従事者本人の主観的なものであった。その回
答は，罹ったことのある主観的既往，罹っていない主観
的非既往，罹ったことがあるかわからない者を既往不明
として分類した。また，熱中症の症状 13項目の発症有
無は，重症度別に軽度（Ⅰ度）: 中等度（Ⅱ度）: 重度
（Ⅲ度）に，熱中症の自覚症状を定義分類し，本来の医
学的熱中症の評価とし，作業中に何らかの症状を発症し
た者は客観的既往，症状なしは客観的非既往とした。水
分補給状況は，作業前，作業中および作業後に分類し比
較した。
（2）「ハウス農業従事者における熱中症既往と生活およ
び食習慣の関連」
本研究は，研究（1）のアンケート調査時において，
基本属性（性別，年齢，身長，体重，基礎疾患），生活
習慣（睡眠，喫煙，飲酒），食生活（朝食，朝食時の味
噌汁・スープ，作業前の水分補給の種類）について実態
を調査し，13項目の症状の発症経験をもつ客観的既往
を重症度別に，軽度 : 中等度＋重度 : 症状なしに分類
し，c2二乗検定を行った。
（3）｢夏期暑熱環境下ハウス栽培作業時における農業従
事者の体温調節反応｣
本研究は，2013年 8月下旬から 9月上旬，埼玉県お
よび神奈川県の畑作地帯の専業農家のハウス栽培従事
者，男性 20名（65歳以上 7名，65歳未満 13名）を対
象に，ガラス型ハウス内作業（95% 以上は花卉栽培お
よび土壌作り）を，8時から 12時頃の晴天日に行った。
作業者の体温調節反応を調べるため，作業前後の体重お
よび鼓膜温，作業時の心拍数，汗中塩分濃度，水分補給
量，口渇感（VAS 法）を測定した。合わせて，ハウス
内外環境（乾球温度，相対湿度，黒球温度，WBGT）
も測定した。 以上の調査に当たっては事前に大学倫理
委員会の承認を得た後，対象者に対して十分な説明と理
解を得た上で実施した。
3． 結果および考察
（1）「農業従事者におけるハウス栽培作業時の熱中症の
発生および水分補給の実態」
ハウス栽培農業従事者の熱中症の知識は，“熱中症”
のことば自体の認知が 97.3%，“諸症状”の認知は 90.3
%であった。症状の認知について，年齢別は 65歳未満
93.9%に対して，65歳以上が 85.6%であり，多くの従
事者が認識している回答であった。自己申告による熱中
症の主観的既往状況は，既往者 29.6%，非既往者 49.0
%，症状がわからない者 20.2%であった。主観的非既往
の中で，医学的な症状 13項目を既往した，いわゆる客
観的既往者が 55.6%存在し，症状がわからない者のな
かには客観的既往者が 80.7%存在した。主観的既往と
客観的既往には食い違いがみられ，実際は熱中症に呈し
ていても，熱中症ではないと判断している者の存在が明
らかになった。
水分補給について，作業前の補給者 79.9% は，作業
中群の補給者 86.6%および作業後の補給者 86.6%に対
して有意に少なかった（p＜0.05）。また，水分補給者
は，65歳以上で作業前 80.0%，作業中 90.0%，65才未
満で作業前 79.9%，作業中 90.0%であり，それぞれ作業
前が作業中より有意に少なかった（p＜0.05）。夏期暑熱
環境下では，各種農作業時の熱中症予防のために水分補
給の必要性が啓発される中で，水分未補給者は，作業前
19.7%，作業中 7.5%および作業後で 9.7%存在した。水
分補給に対して体内の水分吸収時間や水分補給率を考慮
すると，作業前に水分未補給者は，作業時の大量な発汗
により脱水症状や体内の塩分不足を引きおこす危険性が
懸念される。
（2）「ハウス農業従事者における熱中症既往と生活およ
び食習慣の関連」
研究（1）において，ハウス栽培農業従事者の熱中症
発症の誘因となる生活習慣および食習慣に注目し，アン
ケート調査の結果から既往要因を分析し予防対策を検討
した。
1）既往者と非既往者の属性の比較
65歳以上において，非既往者 61.1%は，中等度＋重
度者 38.9%に比較して有意に多く（p＜0.05），65歳未
満では非既往者 43.3%は，中等度＋重度者 56.7%に比
較して有意に少なかった（p＜0.05）。65歳以上の高齢
者は，加齢による体温調節機能の低下などが熱中症症状
を憎悪させる可能性が示唆された.
2）生活および食習慣が熱中症既往に与える影響
睡眠 7時間未満は，非既往者は 26.2%，軽度者 73.8%
であり，軽度の既往者に睡眠 7時間未満が有意に多かっ
た（p＜0.05）。毎日の朝食では，欠食者が非既往者 23.8
%，軽度者 76.2%であり，軽度者に欠食が有意に多かっ
た（p＜0.05）。
睡眠 7時間未満は，非既往者 38.4%，中等度＋重度者
61.6%であり，中等度＋重度者に 7時間未満が有意に多
かった（p＜0.05）。毎日の朝食は，欠食者が非既往者
─ 61 ─
33.3%，中等度＋重度者 66.7%であり，中等度＋重度者
に欠食が有意に多かった（p＜0.05）。作業前に補給する
水分の種類は，全体ではお茶と水が 8割を超えていた
が，スポーツドリンク補給者は，非既往者 15.0%に比
較して中等度＋重度者 85.0%であり有意に多かった（p
＜0.05）。本研究において，ハウス栽培農業従事者の生
活および食習慣の中で熱中症発症の誘因は，日常生活に
おける睡眠時間，朝食摂取および作業前の塩分を含んだ
水分補給であることが示された。水分補給では，中等度
＋重度者の一部の既往者は，熱中症に罹った経験から，
補給する水分や塩分を考慮し，スポーツドリンクを摂取
している者が見られた。しかし，本研究におけるハウス
農業従事者では，重症度に関係なく作業前の水分未補給
者や塩分を含まないお茶と水の水分補給者が多く存在
し，作業前の水分補給方法の改善が急務と考える。
（3）「夏期暑熱環境下ハウス栽培作業時における農業従
事者の体温調節反応」
ハウス内WBGTおよび乾球温度は，平均 29.0℃±1.1
℃および 34.4℃±2.5℃で熱中症発症の厳重警戒の環境
下で実施された。作業時の心拍数は平均 108.3±5.6拍/
分であり，相対的作業強度は平均 49.3±2.5%であった。
作業中の時間当たりの発汗量は 432.16±146.81g/hr，推
定塩分損失量は 0.55±0.35g/hr，作業による時間当たり
の鼓膜温上昇量は 0.27±0.10℃/hrであった。発汗量に
対する水分補給率は，36.2±7.8% であった。また，作
業終了時の脱水率および口渇感は，それぞれ 2.15±0.15
%（0.92∼3.51%）および 56.0±17.9% に達した。さら
に，年齢と脱水率，体温上昇量，推定汗中塩分損失量の
間には，それぞれ正の相関関係がみられ（p＜0.05），年
齢と水分補給率および口渇感変化量の間には，それぞれ
負の相関関係がみられた（p＜0.05）。
本研究では，夏期ハウス栽培農作業時の高齢作業者は
若齢作業者に比べ，多い発汗量に対して水分補給率が低
く，そのため脱水率が高くなり，また推定汗中塩分損失
量も極めて高く，熱中症のひとつである熱けいれんなど
の症状を呈する可能性が示唆された。農作業の経過にと
もなう口渇感の上昇の低下は，若齢作業者に比較して高
齢作業者が多いことから，高齢作業者はのどの渇きを感
じていなくても，作業時の発汗量を補う量（1時間に
ペットボトル約 1.5本分の水分）を，休憩を挟みなが
ら，また作業中であっても数回に分けて小まめに摂る必
要がある。また，高齢作業者は，発汗量の増加にともな
い，汗中塩分損失量も多いことから，それを補完する塩
分を含む十分な水分補給の必要性も示された。また，作
業環境面からの熱中症予防対策として，ハウス内作業現
場では温湿度計だけでなく熱中症発症の危険性を警報で
きるWBGT計の設置も合わせて必要であると考える。
4． まとめ
本研究において，ハウス栽培農業従事者における具体
的な熱中症予防対策を検討するため，農業従事者に対し
てアンケート調査ならびに夏期暑熱環境下ハウス内農作
業時の体温調節反応の測定を実施し，下記のことが明ら
かになった。
（1）研究 1では，ハウス栽培農業従事者には，熱中症に
罹っているにもかかわらず，自分では熱中症発症に，気
づいていない者の存在が示された。作業前の水分未補給
者は，作業中，作業後に比べ多く存在し，熱中症の知識
について再教育する必要性が明らかになった。
（2）研究 2では，中等度および重度の熱中症既往の誘因
として，睡眠時間 7時間未満，朝食の欠食が示され，ま
た，農作業前の水分補給の種類は，塩分を含まないお茶
と水が 8割を占めたことなどが明らかになった。日常生
活の中で，十分な睡眠時間の確保等の体調管理を行い，
作業前の食事の工夫や水分補給方法の改善などの教育と
管理の必要性が明らかになった。
（3）研究 3では，夏期暑熱環境下のハウス栽培農作業時
における高齢農業従事者は，発汗量および汗中塩分損失
量の多さに対し，口渇感の感度低下により水分補給量が
減少し，これが脱水率を高くし，体温上昇率が大きくな
り，熱中症発症の危険性が高くなることが示された.高
齢農業従事者は，若齢農業従事者以上に，多くの発汗に
より損失した水分と塩分の補給のため水分補給の量と頻
度を多くする必要性が明らかになった。
本研究の結果から，作業前の水分補給と睡眠の不十分
さや，塩分を含んだ水分補給の不足等，農業従事者の生
活および食習慣が，熱中症発症の誘因に影響することが
明らかになった。また，口渇感の低下等，従事者の年齢
に準じた体質の違いが影響することも明示化された。こ
れらの結果から，ハウス栽培農業従事者に対する熱中症
予防対策は，症状や予防対策等一般的な熱中症に係る正
確な知識や最新情報の周知とともに，従事者の年齢，体
調や作業環境，生活および食習慣等，個々の状況に則し
た予防対策の検討が重要であると考えられる。
─ 62 ─
審査報告概要
近年，ハウス農業従事者が，夏期の農作業時に熱中症
で死亡および救急搬送される事故が多くみられるように
なってきたが，農林水産省における熱中症予防対策が極
めて遅れている現状があり，ハウス農業に特化した熱中
症予防対策を具体的に提示することは，緊急の課題に
なっている。本研究は，まず，ハウス農業従事者に対し
て熱中症発生の状況について現状調査を実施し，熱中症
の症状に対する認識不足や予防対策の知識不足を明らか
にし，熱中症に対する知識と具体的予防対策が必要であ
ることが明示した。また，ハウス栽培農業従事者を対象
に，夏期の作業時の体温調節に関する医学生理学反応の
測定を実施し，とくに，高齢農業従事者ほど，作業時に
口渇感の低下から水分補給率の低下と発汗量の増加が生
じ，結果として脱水率が高くなり高体温になり，熱中症
発症の危険性が高くなることを明らかにし，高齢者に対
する具体的な熱中症予防対策を提示することができた。
本研究は，ハウス栽培農業従事者の熱中症に関する研究
として新規性があり学術的価値の高い研究であるととも
に，農業現場で遅れている具体的な熱中症予防対策を提
案でき社会的価値もある研究として評価された。よって
審査員一同は，博士（環境共生学）の学位を授与する価
値があると判断した。
─ 63 ─


夏期ハウス栽培農作業時における熱中症の発生状況およびその予防対策

石毛, 太一郎

3967

ISHIGE, Taichiro

3968

- 1 - 
 
氏 名   石 毛  太 一 郎 
学位（専攻分野の名称）   博 士（畜産学） 
学 位 記 番 号   乙 第 925 号 
学 位 授 与 の 日 付   平成 29 年 7 月 20 日 
学 位 論 文 題 目   ニホンウズラの host defense peptide 遺伝子の同定と多様性解析
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・農 学 博 士 半 澤   惠 
               教 授・農 学 博 士 野 村 こ う 
               教 授・農 学 博 士 河 野 友 宏 
               准 教 授・博士（畜産学） 平 野   貴 
                    博士（畜産学） 椎 名   隆＊ 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
 自然免疫の主要な液性因子の１つが，宿主防御ペプチド（Host defense peptide，以下
HDP と略）である。HDP は分子量 5~100 kDa のカチオンペプチドであり，多細胞生物が
有害微生物を排除するペプチドとして多細胞生物の進化と共に高度に進化した。特に脊椎動
物の HDP は獲得免疫との共進化をとげ複雑で大きな分子ファミリーを形成し，またその機
能も微生物の細胞膜を破壊する抗菌活性に加えて，抗エンドトキシン活性，炎症制御，なら
びに獲得免疫の惹起など免疫応答の極めて多様な側面に関与することが指摘されている。 
鳥類において Granulysin/NK-lysin（以下 NKL と略），Liver expressed antimicrobial 
peptide2（以下 LEAP-2 と略），Cathelicidin（以下 CATH と略）および Avian β-defensin 
（以下 AvBD と略）の 4 群は，それらの機能や含有量から主要な HDP と考えられる。ニワ
トリ（Gallus gallus，Gg）ではこのうち NKL のアミノ酸置換および AvBD の遺伝子座数
多型が病原微生物に対する抵抗性に関与することが指摘され，HDP を活用した抗病性の向
上が検討されている。 
ニホンウズラ（Coturnix japonica，Cj）は，本邦で家畜化された唯一の家禽であると共
に，ニワトリのパイロットバードとして小格，早熟で，産卵能力も高い。また，品種が確立
しておらず，近交系の作出が困難であるなどニワトリに比べて改良度が低く，またニワトリ
に比べ重篤な感染症に対しても不顕性感染を示すことがあることより，これら遺伝子におけ
る検索に適していると考えられる。 
 そこで本研究では，ニホンウズラを対象に前述の 4 群の主要 HDP 遺伝子領域を同定し，
その遺伝子構造を決定し，mRNA 発現を確認すると共に，抗病性（抗菌活性）に関与しう
る遺伝的多様性を明確にすることを目的とした。各 HDP 遺伝子領域の同定と塩基配列の決
定にはキャピラリーシーケンサーと共に次世代シーケンサー（NGS）を使用した。また
mRNA 発現の確認には RT-PCR 法を用いた。さらに DNA 多型解析には，来歴の異なる 6
＊東海大学 准教授 
- 2 - 
 
系統（A，B，ND，K，Y，P）99 個体のニホンウズラを供試した。 
 
1．NKL  
１）遺伝子領域 
 ニワトリ NKL（GgNKL）との synteny 領域（13,679bp）にニホンウズラ NKL（CjNKL）
遺伝子（1,311bp）を同定した。CjNKL は GgNKL と同様に 4 つのエキソンで構成され，
open reading flame（ORF）の塩基配列および推定アミノ酸配列は GgNKL と 81.1%およ
び 72.1%の類似性を示した。CjNKL の mature peptide の推定アミノ酸配列（117aa）には
GgNKLに比べて 2aaあるいは 1aaの欠損があったが，NKLに特徴的な saposin like type-B 
domain および Proline を保持していた。また，免疫系：脾臓，胸腺，ファブリキウス嚢お
よび骨髄，消化器系：舌，食道&そ嚢，十二指腸，膵臓，空腸，回腸，盲腸，結腸および肝
臓を含む 16 臓器において CjNKL の mRNA の発現を確認した。以上のことより，CjNKL
は，NKL の機能的な orthologous であることが示唆された。 
 
２）成熟型ペプチドの多型解析 
CjNKL の mature peptide の 31 番目（抗菌活性領域）のアミノ酸にグリシン（G）から
アスパラギン酸（D）への置換（G31D，以下 31G および 31D と略）を検出した。31D は
調査した 6 系統 99 個体のうち B および ND 系を除く，A，K，P および Y 系に 0.05，0.03，
0.69 および 0.05 の頻度で認められた。31G および 31D を含む抗菌活性領域のペプチド
（30aa）を合成し，大腸菌に対する抗菌活性試験により，31G は 31D より抗菌活性が高い
ことを明らかにし，この差は net charge に起因することを示唆した。 
 
2．LEAP-2  
１）遺伝子領域 
 ニワトリ LEAP-2（GgLEAP-2）との synteny 領域（27,626bp）にニホンウズラ LEAP-2
（CjLEAP-2）遺伝子（1,749bp）を同定した。CjLEAP-2 は GgLEAP-2 と同様に３つのエ
キソンにより構成され，ORF の塩基配列および推定アミノ酸配列は GgLEAP-2 と 92.6%お
よび 90.8％の類似性を示した。CjLEAP-2 の mature peptide の推定アミノ酸配列（40aa）
は GgLEAP-2 と一致し，LEAP-2 に特徴的な liver-expressed antimicrobial peptide 2 
precursor を保持していた。また，消化器系：十二指腸，空腸，回腸，肝臓および腎臓を含
む 5 臓器において CjLEAP-2 の mRNA の発現を確認した。以上のことより，CjLEAP-2 は
LEAP-2 の機能的な orthologous であることが示唆された。 
 
 
- 3 - 
 
２）成熟型ペプチドの多型解析 
 CjLEAP-2 の mature peptide を coding する塩基配列（120bp）に DNA 多型は認められ
なかった。したがって LEAP-2 の抗菌作用は特定な抗原の認識に特化しているか，あるい
は何等かの固有な機能を有するため，負の選択圧が働き多型が検出されなかったとも考えら
れる。 
 
3．CATH 
１）遺伝子領域 
 ニワトリ CATH（GgCATH）遺伝子群との synteny 領域（12,460bp）に同じ順序・方向
でタンデムに座位する 4 種類のニホンウズラ CjCATH 遺伝子：CjCATH3（809bp），CjCAH2
（1058bp），CjCATHB1（1137bp）および CjCATH1（800bp）を同定した。これら 4 種の
CjCATHs は，ニワトリ GgCATHs と同様にいずれも 4 つのエキソンにより構成され，ORF
の塩基配列および推定アミノ酸配列は相同な GgCATHs と 76.1〜95.2%および 62.3〜
94.7%の類似性を示した。CjCATH3（29aa），CjCAH2（32aa），CjCATHB1（40aa）およ
び CjCATH1（26aa）の mature peptides の推定アミノ酸配列のアミノ酸残基の数は各々
orthologous である GgCATHs と一致し，各々71.9〜100%の類似性を示すと共に，いずれ
も CATH に特徴的な cathelicn domain を保持していた。さらに各 CjCATHs はアミノ酸配
列の系統樹解析において，他鳥類の各 CATHs と共に，CATH1/3，CATH2 および CATHB1
の 3 つの clade を形成した。また，いずれの CjCATHs も骨髄において mRNA の発現が確
認され，CjCATH2 を除く 3 種の CjCATHs の mRNA はファブリキウス嚢を含む複数の臓
器で検出された。以上のことより，これら CjCATHs は CATHs の機能的な orthologous で
あることが示唆された。 
 
2）成熟型ペプチドの多型解析 
 CjCATH3，CjCATH2，CjCATHB1 および CjCATH1 の mature peptide の塩基配列にそ
れぞれ 0，10，2 および 1 個の SNPs が検出された。これらのうち，CjCATH2 では 6 個が，
CjCATHB1 では 1 個がアミノ酸置換を伴い，特に CjCATH2 の CjCATH2*02 allele 由来の
I145F および Q148H は，ND 系を除くすべての系統で確認され，抗菌活性に影響を及ぼす
可能性が示唆された。また，CjCATHB1 の CjCATHB1*04 allele 由来の P245H は，K 系のみ
で確認され，抗菌活性に影響を及ぼす可能性が示唆された。したがって，CjCATH2 および
B1 の allele（CjCATH の haplotype）間で抗菌活性が異なる可能性が示唆された。Intron
を含めた SNPs に基づき CjCATH3，CjCATH2，CjCATHB1 および CjCATH1 に 6，4，4
および 6 種類の allele が，さらにこれら allele の組合せによる 9 種類の haplotype が確認
された。K 系では 4 種すべて，B 系では CjCATHB1 を除く 3 種の CjCATH に系統特異的
- 4 - 
 
な allele が検出され，それらの組合せおよびこれに加えて ND 系に系統特異的な haplotype
が認められた。 
 
4．AvBD 
１）遺伝子領域 
 ニワトリ AvBD（GgAvBD）遺伝子群との synteny 領域（56,812〜70,343bp）に概ね同
じ順序・方向でタンデムに座位する 12〜16 個のニホンウズラ CjAvBD 遺伝子：CjAvBD13
（3,141〜4,545+4n（GGAA の繰り返し配列）），CjAvBD12（892〜895bp），CjAvBD11（2,315
〜2,322bp），CjAvBD10（2,034〜2,041bp），CjAvBD9（2,381〜2,426bp），CjAvBD8（2,273
〜2,279bp），CjAvBD101*1~5（1,554〜1,803bp），CjAvBD2（1,726〜1,757bp），CjAvBD1
（1,784〜1,801bp），CjAvBD5（1,406〜1,423bp），CjAvBD4（1,401〜1,412bp）および
CjAvBD14（540〜552bp）を同定した。CjAvBD 領域には，ニワトリ GgAvBD3 および
GgAvBD7 の orthologous は認められず，また GgAvBD6 に相同な CjAvBD101 は 1〜5 個
の遺伝子座数多型を示した。CjAvBD4 を除く CjAvBDs は，各々相同な GgAvBDs と同じ
exon-intron 構造を有し，ORF の塩基配列および推定アミノ酸配列は相同な GgAvBDs と
78.0〜97.1%および 66.0〜95.5%の類似性を示した。CjAvBD13（65aa），CjAvBD12（45aa），
CjAvBD11（80aa），CjAvBD10（41aa），CjAvBD9（42aa），CjAvBD8（41aa），CjAvBD101
α，β，θ（41aa），CjAvBD2（39aa），CjAvBD1（40aa），CjAvBD5（41aa），CjAvBD4
（38aa）および CjAvBD14（44aa）の mature peptides の推定アミノ酸配列において，
CjAVBD101	ߙ，ߚ，ߠは 1aa 短く，CjAvBD14 は 5aa 長かったのを除き，他の CjAvBDs の
アミノ酸残基の数は各々orthologous である GgAvBDs と一致し，58.5〜92.9%の類似性を
示した。またいずれの CjAvBDs の推定アミノ酸配列も，AvBD に特徴的なβ-defensin motif
を保持していた。さらに CjAvBD は mature peptide のアミノ酸配列の系統樹解析において，
他鳥類の AvBDs と共に orthologous である遺伝子毎に clade を形成した。CjAvBD8 の
mRNA は肝臓でのみ確認され CjAvBD4 の mRNA は肝臓と骨髄でのみ確認された。また，
CjAvBD9 の mRNA は一部消化系臓器など上皮系組織を含む臓器の一部で mRNA 発現が確
認された。CjAvBD1，CjAvBD5 および CjAvBD10 の mRNA は，免疫系，消化器系および
呼吸系など，上皮系組織を含む多くの臓器で確認された。以上のことより，これら CjAvBDs
は AvBDs の機能的な orthologous であること，ならびにその遺伝子構成には種特異性があ
ることが示唆された。 
 
２）成熟型ペプチドの多型解析 
CjAvBD1 および CjAvBD12 の PCR 産物の塩基配列に 18 個および 13 個の SNPs が検出
された。これら SNPs に基づき CjAvBD1 および CjAvBD12 に 9 および 8 種類の allele が，
- 5 - 
 
さらにこれら allele の組合せによる 10 種類の haplotype が確認された。A 系および K 系で
は CjAvBD1 および CjAvBD12 共にそれぞれ系統特異的な allele が検出され，それらの組合
せを含む 3 種類の系統特異的な haplotype が認められた。 
 これらのうち，CjAvBD1 と 12 のホモ接合個体を確認した 7 種類の haplotype の CjAvBD
領域（56,812〜70,343bp）の塩基配列を精査したところ，それらの遺伝子構成は CjAvBD101
を除き同一であった。また，すべての CjAvBDs の ORF に haplotype 間 SNPs が確認され
た。特に CjAvBD4，CjAvBD13 および CjAvBD14 の mature peptide に net charge を変化
させるアミノ酸置換を確認した。一方，CjAvBD101 は塩基配列の相同性と系統樹解析に基
づきα，βおよびθの 3 種類に大別され，各 haplotype における遺伝子座数は 0〜1，0〜2
および 0〜3，計 1〜5 個であり，また allele 間で mature peptide に net charge を変化させ
るアミノ酸置換が確認された。 
 
5．結論 
１）ニホンウズラの主要 4 種 HDP の遺伝子構成およびそれらの mRNA 発現は基本的には
ニワトリの orthologous と相同であることが示唆された。しかし，CjAvBD 領域の遺伝子構
成には CjAvBD3 および CjAvBD7 の欠損および GgAvBD6 の orthologous：CjAvBD101 重
複変異が認められ，このことがニホンウズラ特異的な微生物制御をもたらす可能性がある。 
２）6 系統 99 個体は，CjNKL の 2 種類の alleles，CjCATHs の 9 種類の haplotypes およ
び CjAvBD の 10 種類の haplotypes の組合せによる多型カタログに基づき，67 種類に分類
された。これらの組合せの中には複数の HDP，すなわち CjNKL，CjCATH2，CjAvBD4，
CjAvBD13 および CjAvBD14 の抗菌活性領域の net charge の変化を伴う非同義置換，なら
びに CjAvBD101α，βおよびθの遺伝子座数多型を含み，これらの変異が多様かつ進化速
度の速い微生物に対する種としての柔軟な対応に繋がる正の選択圧の結果とも考えられる。
また，これらの多様性は抗菌活性の多寡に基づく病原微生物に起因する疾患感受性，ならび
に消化管内をはじめ生体各所に形成される細菌叢の構成に影響する可能性がある。また
HDP は抗菌活性のみならず，免疫調節因子としての機能も知られている。したがって，
LEAP-2 にのみ DNA 多型が認められなかったことは，その機能的特異性に起因するとも考
えられる。 
 以上要するに本研究は，ニホンウズラの主要 4 種 HDP 遺伝子とその多様性に関する基礎
的知見を明確にすることを示した。したがって本研究の成果は，今後のニホンウズラ HDP
遺伝子の解析を一段と進展させるのみならず，家禽の抗病性育種に大いに貢献するものと考
えられる。 
 
 
- 6 - 
 
審 査 報 告 概 要 
 
 本研究はニホンウズラ自然免疫の液性因子である宿主防御ペプチド（Host defense 
peptide:HDP）のうち，主要な 4群，すなわち NK-lysin（NKL），Liver expressed antimicrobial 
peptide2（LEAP2），Cathelicidin（CATH）および Avian β-defensin（AvBD）を対象に，そ
れらの遺伝子構成および遺伝的多様性を調査したものである。ウズラのこれら 4 群の HDPs
の遺伝子構成および mRNA 発現は基本的にはニワトリの直系遺伝子と同等であることを明確
にした。また多様性解析により，一部の遺伝子群（LEAP2，ならびに一部のCATHsおよびAvBDs）
は極めて高度に保存され，一定（かつ必須）の生物活性が維持されている一方，他の遺伝子
群（NKL，ならびに一部の CATHs および AvBDs）は，微生物の多様な進化に対応しうるアミ
ノ酸置換や遺伝子座数多型など生物活性に影響する遺伝的多様性を示すことを明確にし，そ
の一端として NKL のアミノ酸置換が大腸菌に対する抗菌活性に影響することを確認した。こ
れら 4HDPs の同定と生物活性に影響しうる多様性を整理した本研究の成果は，これら HDPs
の遺伝的多様性が抗微生物活性や腸内細菌叢への影響を明確にすることにより，抗病性育種
の重要な指標になりうるものと評価される。よって，審査員一同は博士（畜産学）の学位を
授与する価値があると判断した。 


ニホンウズラのhost defense peptide 遺伝子の同定と多様性解析

東京農業大学博士（国際農業開発学

Poyesh, Dawlat Shah

3808

3809

氏 名 Poyesh Dawlat Shah
学位（専攻分野の名称） 博 士（国際農業開発学）
学 位 記 番 号 甲 第 742 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 29 年 3 月 20 日
学 位 論 文 題 目 Effect of 1-MCP treatment on ethylene regulation
and quality of some fruits and vegetables
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士（農学） 小 塩 海 平
教 授・博士（農学） 弦 間 洋
教 授・博士（農学） 志和地 弘 信
教 授・博士（農学） 高 根 務
論文内容の要旨
Fruits and vegetables are important sources of
vitamins, minerals, sugar, fiber and other precious
properties. According to World Health Organization
(WHO) recommendation, an adult person has to con-
sume at least 400g of fruits and vegetables on daily
bases (WHO, 2003). Owing to the diverse climate of
the country, there grown plenty of fruits and vegeta-
bles in Afghanistan, and they constituted 37% of total
export of Afghanistan in 2015-16.
Because of the important role of fruits and vegeta-
bles in Afghanistan both for diets and economics, the
postharvest loss of fruits and vegetables is one of the
most urgent issues to solve to improve physical and
financial life quality of Afghanistan people. Due to the
lack of modern storage facilities and cold chain trans-
portation system in the country, it is important to
control ethylene evolution after harvest, which may
trigger the subsequent senescence process of fruits
and vegetables. It is one of the simplest and easy ac-
cessible ways to apply 1-Methylcyclopropene (1-MCP)
to fresh fruits and vegetables.
Hence, I studied the ethylene regulation by the
usage of 1-MCP in tomato (Solanum lycopersicum) cv.
Red Ore at green and pink stages, asparagus spears
(A. officinalis) c.v.“UC 157”, apple (Malus domestica)
c.v.“Fuji”at ripe stage and Japanese apricot (Prunus
mume) c.v.“Nanko”at green and yellow stages in
order to know the efficiency and possible mechanism
to suppress ethylene action to reduce post-harvest
losses.
1. Effect of 1-MCP on Ethylene Regulation and
Quality of Tomato
Application of 1-MCP decreased ethylene production
at green stage, but it conversely increased ethylene
production at pink stage. Analysis of ACS (1-Amino-
cyclopropane-1-Carboxylic Acid Synthase) and ACO
(1-Aminocyclopropane-1-Carboxylic Acid Oxidase) in
tomato fruits showed that ACS activity was decreased
significantly, while the ACO activity remained un-
changed at green stage by 1mL/L 1-MCP treatment.
On the contrary, ACS activity was increased and ACO
activity remained unchanged when treated with 1
mL/L 1-MCP at pink stage. In both cases, however, the
shelf life of tomato increased regardless of altered
ethylene production by 1-MCP treatment ; respira-
tion, changes in color, firmness and loss in weight were
all decreased or delayed. As a result, it could be con-
sidered that ethylene production was decreased by 1-
MCP through the inhibition of autocatalysis phase I
ethylene production in case of mature green tomato
fruit, while ethylene production was increased in pink
stage tomato fruit by 1-MCP treatment through the
suppression of autoinhibition system of phase II ethyl-
ene production. The different reaction of tomato fruit
ethylene production triggered by 1-MCP at mature
green and pink stage and its possible mechanism
controlled by ACS activity changes are a very new
finding.
─ 46 ─
2. Effect of 1-MCP on Ethylene Regulation and
Quality of Asparagus
Application of 1-MCP on asparagus positioned
vertically and horizontally increased ethylene produc-
tion while the respiration rate remained unchanged.
Rising up of horizontally placed asparagus spears
could be strongly suppressed by 1-MCP application.
The results suggest that 1-MCP treatment might be a
useful tool to prevent asparagus rising up by blocking
ethylene receptors, keeping its freshness at the same
time.
3. Effect of 1-MCP on Ethylene Regulation and
Quality of Apple
The results suggest that the application of 1-MCP
dramatically blocks both the ethylene production and
its action of apple fruit. Meanwhile, the application of
1-MCP improves marketability, preserving the quality
of apple fruit by decreasing respiration, delaying in
changes of color, preventing from softening and re-
duction in the loss of weight.
4. Effect of 1-MCP Treatment on Ethylene Regu-
lation and Quality of Japanese Apricot
The results suggest that the application of 1-MCP on
both green and yellow stages of Japanese apricot didn’t
change the ethylene production. However, the action
of ethylene was blocked as a result of 1-MCP appli-
cation, and the respiration and softness were de-
creased at both green and yellow stages. On the other
hand, the application of 1-MCP delayed changes in
color especially at green stage. Hence, 1-MCP treat-
ment could be more helpful to apply at younger stage
rather than ripe stage.
Conclusion
The findings of this research suggest that 1-MCP
treatment can regulate ethylene action and preserve
the quality of some fruits and vegetables. Judging
from the results of this study, it can be considered that
the climacteric rise of fruits could be triggered by
autocatalysis phase I ethylene production in case of
mature green tomato fruit, while fruit over-ripening
might be avoided by autoinhibition system II ethylene
production in case of pink stage. In both stages, the
action of ethylene was stopped by 1-MCP treatment,
preserving such quality parameters as respiration,
changes in color, softness, loss in weight and so on. In
addition, 1-MCP is generally recognized as safe
(GRAS) based on the approval by Environmental
Protection Agency (EPA) in 2002, and European Union
in 2005 as non toxic chemical with negligible residue.
It might be greatly useful especially in developing
countries, because treating fruits and vegetables with
1-MCP is easy way and it doesn’ t need any special
skills and costs.
和文要旨
アフガニスタンでは総輸出額に占める果実と野菜の割
合が 37%と高く（2015-16），輸出産業としてはもちろ
ん，長期の戦争によって疲弊した人々の生活を支えるた
めの栄養源として，国内需要も高い。しかしながら，近
代的な貯蔵施設やコールドチェーンシステムが存在しな
いため，収穫後のロスが大きく，安全で簡便な解決方法
が模索されている。
1-MCPはエチレン受容体との親和性が高く，成熟・
老化の遅延に有効で，人体に対する安全性も高く，アフ
ガニスタンをはじめとする途上国において収穫後鮮度保
持に貢献することが期待されている。本研究では，トマ
ト，アスパラガス，リンゴ，ウメに 1-MCPを処理し，
エチレン生成量の変化と鮮度に関する検討を行った。
その結果，トマトでは緑熟期果実では 1-MCP処理に
より自己触媒的エチレン生成促進効果がブロックされて
エチレン生成量が低下する一方，ピンク期果実では自己
触媒的エチレン阻害効果がブロックされてエチレン生成
量が増加することが明らかとなった。これらは ACC酸
化酵素ではなく ACC合成酵素の活性の変化によるもの
であった。いずれの場合も，エチレンの作用は阻害さ
れ，呼吸量，果皮色の変化，果実硬度の軟化が抑制さ
れ，鮮度保持効果が高いことが明らかとなった。
アスパラガスの場合，1-MCPを処理すると，水平に
おいた場合の起き上がり角度が小さくなり，エチレン生
成量が抑制され，鮮度保持に有効であった。
リンゴの場合，1-MCPはエチレン生成量を抑制し，
呼吸量，果皮色の変化，軟化，果実重の減少を抑え，鮮
度保持に有効であった。
ウメ果実では，1-MCPを処理してもエチレン生成量
に差は見られなかったものの，エチレン作用はブロック
され，鮮度保持効果が顕著であった。
以上の結果，1-MCP処理が果実や野菜の鮮度保持に
─ 47 ─
有効であることが示され，現地における利用可能性が示
唆されるとともに，自己触媒的なエチレン生成がフィー
ドバック機構によって制御されていることが，新知見と
して明らかとなった。
審査報告概要
1-MCPは安価で安全性の高いエチレン作用阻害剤で
あり，生鮮品の貯蔵・流通のためのインフラストラク
チャーが未整備のアフガニスタンなどで，今後の普及が
期待されている。ポイッシュ氏は 1-MCPをトマト，ア
スパラガス，ウメ，リンゴに処理し，いずれも貯蔵期間
の延長と品質向上に有効であることを見出し，とくに未
熟のトマトやウメ果実，水平置きしたアスパラガスで効
果が大きいことを報告した。1-MCPを処理すると未熟
なトマト果実ではエチレン生成が減少し，ピンク期のト
マト果実ではエチレン生成が高まるが，これらはいずれ
も ACCシンターゼの活性の変化に起因していることを
発見した。これらの知見と発見は学術的に価値の高いも
のと認め，審査員一同は学位請求者に博士（国際農業開
発学）の学位を授与する価値があると判断した。
─ 48 ─


Effect of 1-MCP treatment on ethylene regulation and quality of some fruits and vegetables

菊池, 正芳

3814

KIKUCHI, Masayoshi

3815

氏 名 菊 池 正 芳
学位（専攻分野の名称） 博 士（環境共生学）
学 位 記 番 号 甲 第 745 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 29 年 3 月 20 日
学 位 論 文 題 目 都立文化財庭園における庭園ガイドボランティア導入による
多面的効果に関する実証的研究
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士（生物環境調節学） 濱 野 周 泰
教 授・博士（農学） 両 角 和 夫
教 授・博士（農学） 服 部 勉
名誉教授・農 学 博 士 進 士 五十八＊
博士（工学） 村 松 陸 雄＊＊
論文内容の要旨
研究の背景
少子高齢化が進む現代社会において，生活の豊かさに
対する価値観が変化し，物の豊かさから心の豊かさを求
める社会となりつつある。その動きは，市民の社会参
加，地域社会への貢献，自己実現といった具体的な社会
行動となって現れてきている。このような社会情勢の中
で，1997年に東京都が管理する 9個所の都立庭園が公
益財団法人東京都公園協会（当時，財団法人東京都公園
協会，以下公園協会とする）に業務委託されることに
なった。都立庭園は全てが国や東京都により文化財保護
法による文化財（史跡，名勝等）として指定された文化
財指定庭園（以下，文化財庭園とする）である。従来は
文化財として保全を主体とした施設管理であったが，公
園協会への業務委託を契機に，東京都における都立庭園
の管理が，文化財庭園の活用に目を向けた管理手法にも
取り組むこととなった。この転換期に誕生したのが都立
庭園ガイドボランティアであった。
そして，この都立庭園ガイドボランティアは，市民と
の協働による文化財庭園の新たな管理手法というだけで
はなく，そこで活動することに生きがいを感じ，自己実
現の場所ともなっていた。そのことは都立庭園ガイドボ
ランティアの活動が，高齢化社会の到来にあって，今後
望まれる生涯学習の場としても有効な取り組みであると
考えられる。そこで，本研究では，都立庭園ガイドボラ
ンティア誕生の経緯を明らかにし，文化財庭園の活用に
とって都立庭園ガイドボランティアは有効であるのか，
そして，都立庭園ガイドボランティアは文化財庭園での
活動に生きがいを感じ，自己実現を達成できたのかにつ
いて明らかにしたものである。
第 1章 都立庭園の管理経緯と都立庭園ガイドボラン
ティアの誕生
第 1章では，都立庭園の開園から現代に至るまでの経
過の中で施設管理，管理運営の実態を調査すると共に，
庭園管理に係る法制度や都立庭園に関する審議会などの
行政計画の文献調査を行うことにより，都立庭園創設の
時代，都立庭園利用の模索の時代，庭園施設改修の時
代，施設管理と管理運営の分離の時代に区分し，施設管
理・管理運営の変遷を通して，文化財として施設を修
復・保全するという保護に重点が置かれていた管理の中
で，どのような背景から「都立庭園ガイドボランティ
ア」が成立したのか，その経緯を明らかにした。その結
果，文化財に指定された都立庭園は文化財保護法に則っ
て管理され，所有者やその関係者の責務として，文化財
を公共のために保存・公開に努めなければならないとさ
れているが（第 4条 2），公開とは，文化財を単に見せ
るというだけではなく，その価値をより広く伝え，多く
の人に理解してもらうといった意味も含むものである。
そこで，文化財庭園の歴史的，文化的な価値や魅力を広
く市民に伝え，活用を促す取り組みとして，しかも，市
民の貴重な財産である文化財庭園を自らの手により守っ
ていくことが望ましいとの文化財保護法の考え方から，
文化財庭園の公開にあたり市民との協働で進めるために
生まれてきたものが「都立庭園ガイドボランティア」で
あった。
─ 57 ─
＊福井県立大学 学長
＊＊武蔵野大学工学部 教授
第 2章 庭園ガイドツアーに参加した来園者の意識から
みた有効性
第 2章では，都立庭園ガイドボランティアが定期的に
行っている庭園ガイドについて，文化財庭園の歴史的，
文化的価値や魅力が庭園ガイドツアー参加者に伝わって
いるのか，参加者の求める要求を満足させているのか等
についてアンケート調査により実態を把握し，都立庭園
ガイドボランティアの行う庭園ガイドに対しての有効性
を明らかにした。その結果，都立庭園ガイドボランティ
アは，設置当初の目的を果たし，庭園ガイドツアー参加
者に対して有効に機能していることが明らかになった。
庭園ガイドツアーに参加した人の満足度は非常に高く，
次回の来園時にも参加したいという参加者が多数いた。
満足した理由としては，「説明が分り易かった」ことを
多くの参加者が上げていた。また，庭園ガイドツアー参
加の理由としては，「庭園のことを深く知りたかった」，
「どのような説明があるか興味があった」が多く，実際
の庭園を見ながらのガイドに関心があった。また，庭園
ガイドツアーに参加して何を聞きたいかについては，
「庭園・建物の成立ち等の歴史について」，「庭園・建物
に係るエピソードなど」であり，ガイドの声を通した説
明を期待していた。
第 3章 都立庭園ガイドボランティアの意識調査
第 3章では，都立庭園ガイドボランティアとして活動
している人々に対して，ボランティアへの参加動機，活
動によって満足感は得られているのか，生きがいを感じ
ているのかなどのアンケートによる意識調査を実施し
た。その結果，都立庭園ガイドボランティアの約 80%
は 60歳以上の定年退職者であり，自分の好きな文化財
庭園について学習したい，社会の役に立ちたい，生きが
いを見つけたいという社会参加の目的から活動してい
た。そして，ボランティア活動によって生活にメリハリ
が出来るなど，活動が生活の一部となっており，ボラン
ティア活動に約 80%の人が生きがいを感じていた。ま
た，都立庭園ガイドボランティアのほぼ全員が，今後も
活動を継続していくことを望んでいるなど，都立庭園ガ
イドボランティアの活動に生きがいを感じ，活き活きと
生活していることが明かになった。特に，文化財庭園に
関する学習をさらに深めたいという姿勢や，文化財庭園
のガイドに対する社会的役割を実感するなど，文化財庭
園という文化，歴史的に価値ある施設に携われることに
特別の意識をもつ人が多かった。これらのことから，文
化財庭園の管理運営の役割の一端を担う都立庭園ガイド
ボランティアの人たちにとって，文化財庭園は社会参
加，自己実現の場として有意義な場所であることが明ら
かになった。
第 4章 文化財庭園の管理運営を「都立庭園ガイドボラ
ンティア」と協働する意義
第 4章では，文化財庭園を市民との共働により管理運
営する意義とともに，都立庭園ガイドボランティアの活
動が，社会参加，自己実現といった生涯学習の場として
有効な場であることの意義を明らかにした。そして，市
民との協働による文化財庭園の管理は，保護と活用が文
化財保護法の重要な二本の柱とされている中で，文化財
庭園の新たな管理手法として有効であることを明らかに
した。文化財庭園の歴史，文化的な価値や魅力を来園者
に伝え，理解を得るには，決められた内容の説明を行う
有料観光ガイドのような画一的な説明ではなく，きめ細
やかで，柔軟で，説得力のある説明が望まれる。都立庭
園ガイドボランティアが行う庭園ガイドは，市民が市民
に伝えるという仕組みであり，ボランティアであるから
こそ，庭園ガイドツアー参加者と同じ視点で物を見て考
えることができるため，きめの細かい，分かり易い説明
をすることができる。文化財庭園は，広汎かつ深い知識
や市民が関心を持つ地誌や植物誌やエピソードを楽しく
話せる語り部的ガイドによって，分かり易い説明で庭園
ガイドツアー参加者の満足度，理解度を高めていくこと
で，文化財庭園に対する理解と支持が広まり，文化財庭
園を次世代に引き継いでいくという大きな目的を達成す
ることができると考えられる。
まとめ
1．文化財庭園の管理が変革する中で都立庭園ガイドボ
ランティアは誕生した。
2．都立庭園ガイドボランティアは，文化財庭園の情報
を伝達する役目を果たしている。
3．都立庭園ガイドボランティアは，生涯学習の場とし
て有効な取り組みである。
4．都立庭園ガイドボランティアの活動は，市民協働に
よる新たな文化財庭園の管理を提示している。
これらのことから，文化財庭園は都立庭園ガイドボラ
ンティアの生涯学習の場，能力を向上させる場としての
役割を果たすとともに，市民である都立庭園ボランティ
アが活き活きと活躍することで文化財庭園の管理をより
良いものにするという相乗効果をもたらすことが期待で
きる。超高齢化社会を迎えつつある日本社会にあって，
生きがいを持って活き活きと生活できる社会活動と，文
化的財産を後世に継承していく上での 1つのモデルを描
─ 58 ─
くことができるものと考える。
審査報告概要
本研究は，都立文化財庭園保存活用施策の一環として
「庭園ガイドボランティア制度導入」が，文化財保護法
が示す管理と利用の両面に寄与するのみならず，ボラン
ティア自身の参画に伴う文化財理解の増進，仲間づくり
と自己実現など多面的効果を高めていることを実証し，
公共財産の活用と継承への新たな方向性であることを確
認した。本研究では，①東京市以来の文化財庭園の保存
管理に関する措置，計画等の分析を踏え，②庭園ガイド
ボランティア制導入への背景と成立を解明し，③ボラン
ティアによる庭園ガイドは庭園文化の情報伝達に大きく
寄与すること，④参画するボランテイア自身の生活の活
性化に有効であることを明らかにした。また，庭園ガイ
ドボランティアの意識と研修活動から，都立文化財庭園
は生涯学習の場となっていることを示し，文化財庭園の
情報伝達活動をとおして自己実現を果たしていることを
明らかにした。本研究は，都立文化財庭園に導入された
庭園ガイドボランティアが多面的な効果を発揮すること
を実証したもので，その内容は類例の文化財の維持管理
にも普遍性を持つと考えられる。よって，審査員一同は
博士（環境共生学）の学位を授与する価値があると判断
した。
─ 59 ─


都立文化財庭園における庭園ガイドボランティア導入による多面的効果に関する実証的研究

高橋, 剛

3788

TAKAHASHI, Go

3789

氏 名 高 橋 剛
学位（専攻分野の名称） 博 士（生物産業学）
学 位 記 番 号 甲 第 732 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 29 年 3 月 17 日
学 位 論 文 題 目 ex vivo処置を介さない新規ゲノム編集マウス作製法
「GONAD」の開発
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士（生物産業学） 亀 山 祐 一
准 教 授・博士（生物産業学） 和 田 健 太
博士（理学） 大 塚 正 人＊
医 学 博 士 佐 藤 正 宏＊＊
名誉教授・農 学 博 士 横 濵 道 成
論文内容の要旨
CRISPR/Cas9系は，細菌由来の獲得免疫システムを
応用した革新的なゲノム編集技術であり，従来の ES細
胞を介した Gene Targeting法に比べて極めて容易な遺
伝子改変マウスの作製を可能にした。一般的に，
CRISPR/Cas9系による遺伝子改変マウスは顕微注入法
により作製され，それには，1）卵管灌流による 1細胞
期受精卵の回収，2）CRISPR関連核酸溶液の受精卵へ
の顕微注入，3）偽妊娠マウスへの胚移植，といった ex
vivo 処置を必要とする。しかし，採卵，顕微注入およ
び移植には高度な技術が必要となること，また顕微注入
にはマイクロマニピュレーターといった高価な機器が必
要とされるため，Gene Targetingに比べて簡便な手法
となった現在もなお，誰もが容易に遺伝子改変動物を作
製できる環境にあるとは言い難い。
そこで筆者は，高度な技術と高価な機器を要せず，多
くの研究者が簡便且つ容易に実施できる，新規ゲノム編
集マウス作製法「Genome-editing via Oviductal Nucleic
Acids Delivery（GONAD）」を考案した。GONAD 法
は，1）卵管内に 2細胞期胚をもつ雌マウスの卵管を外
科的に露出させる，2）卵管内に CRISPR関連核酸溶液
を注入する，3）卵管全体へのエレクトロポレーション
（electroporation, EP）によって胚に核酸を導入する，
4）処置マウスを出産まで飼育する，というステップに
よって実施される。したがって，ex vivo処置を経ずに
ゲノム編集マウスを作出できると期待される。
本研究は，この GONAD法の確立を目的として，in
vitro/in situ EPによって卵管内 2細胞期胚への eGFP
mRNAおよび CRISPR/Cas9系 RNA（Cas9 mRNAと
sgRNA）の導入実験を実施し，ゲノム編集マウスの作
製からその有用性の実証を試みた。
第 1章 in vitro EP による卵管内 2細胞期胚への
RNA導入
本章では，EPによる卵管内受精卵への RNA導入が
可能かを検討するため，eGFP mRNA導入による eGFP
蛍光タンパクの発現を指標とした実験を行った。先ず，
過排卵処置を施した雌マウス（ICR）を雄マウス
（ICR）と交配させ，膣栓確認当日を妊娠 Day 0.5（1細
胞期胚）とし，卵管内に 2細胞期胚が存在する Day 1.5
の雌マウスを実験に用いた。
外科的処置により Day 1.5雌マウスの卵管を露出し，
eGFPmRNAを含む RNA溶液を呼気で液の出し入れを
操作出来る硬質ガラスピペットを用いて 1∼2mL程卵管
内に注入し，直ちに卵管全体を切除し，それを HBSの
入った EP用キュベットに投じ，in vitro EPを実施し
た。その後，2細胞期胚を卵管から回収し，胚培養およ
び eGFP蛍光の観察を行った。その結果，EPを実施し
た卵管から 27個の胚が回収され，回収胚の 59%（16/
27）が胚盤胞期胚まで発生し，その中の 25%（4/16）に
おいて eGFP蛍光が観察された。次に，RNA溶液を上
記同様に卵管内に注入した後，卵管を切除せず露出した
状態（in situ）のまま，ロッド型の電極を用いて in vivo
EP を実施し，翌々日，卵管を切除して受精卵を回収
し，それら組織と胚における蛍光を観察した。その結
果，蛍光の強度，部位は異なるものの，すべての卵管で
eGFP 蛍光が観察された。また，回収された正常胚の
─ 10 ─
＊東海大学 准教授
＊＊鹿児島大学 教授
26%（6/23）は，eGFP蛍光を示した。胚間の蛍光強度
に差異はあったが，胚盤胞期の内部細胞塊には均一な蛍
光強度が観察された。以上から，卵管への直接的な核酸
の注入と，続く in vivo EP（いわゆる，GONAD）に
よって着床前胚への核酸（mRNA）導入が可能である
こと，導入された mRNAは正常にタンパク質へと翻訳
され，生体内で機能（発現）することが明らかとなっ
た。
次に，CRISPR/Cas9系 RNA を用い，着床前胚にお
けるゲノム編集を試みた。実験には，CRISPR/Cas9系
RNAに加えて，一部の実験区では遺伝子導入の成否の
指標として eGFP mRNAを含む RNA溶液を用いた。
CRISPR/Cas9系 RNA は，内在性遺伝子である hypo-
xanthine guanine phosphoribosyl transferase（Hprt）
お よ び eukaryotic translation elongation factor 2
（eEF2）遺伝子に対応する single-guide（sg）RNA，さ
らに eGFP transgenic（Tg）マウス内の eGFP trans-
geneに対応する sgRNAを設計し，定法に従って Cas9
mRNAと共に合成した。また，RNAの 2細胞期胚への
導入は，Day 1.5雌マウス（C57BL/6N）の卵管に前述
した RNA溶液を注入し，卵管を切り出して in vitro EP
を実施することで行った。EP後，2細胞期胚を回収し
て，それらを胚盤胞期胚まで培養し，分子生物学的解析
を行った。その結果，T7 endonuclease I（T7E1）as-
sayによる変異スクリーニング，DNAシークエンシン
グによる塩基配列決定から，標的とした 3種の遺伝子す
べてにおいて少なくとも 1種の挿入/欠失変異（indel変
異）が検出された。さらに，eGFP mRNA を共導入し
た区では，eGFPシグナルが検出された胚においてのみ
indel 変異が確認された。以上から，CRISPR/Cas9系
RNAを用いた場合でも着床前胚でのゲノム編集は可能
であることが示された。また，共導入した eGFP mRNA
は，ゲノム編集個体の簡易スクリーニングに利用できる
ことが示唆された。そこで，CRISPR/Cas9系 RNA を
用いた GONAD を卵管内 2細胞期胚に適用させた。
Day 1.5での in situ EP後，Day 2.5で胚を回収し，そ
れらを胚盤胞期胚まで培養し，T7E1，DNAシークエン
シングによる変異解析を実施した。その結果，供試した
6 個体のマウスに由来する正常胚の 12%（6/49）は
eGFP 蛍光を示した。さらに，蛍光を示した胚の 83%
（5/6）では，標的遺伝子に indel変異が検出された。以
上の結果から，in situ EPを介した GONADによりゲ
ノム編集マウスの作製が可能であることが強く示唆され
た。
第 2章 GONAD法による KOマウスの作製
第 1章では，GONAD法による 2細胞期胚への RNA
導入とそれによるゲノム編集が可能であることを示唆し
た。そこで第 2章では，GONAD 処理によってゲノム
編集胚の正常な着床能と発生能，および妊娠の維持を確
認した。即ち，GONAD処理，妊娠中期（Day 13.5）お
よび妊娠満期（Day 19.5）に胎仔を回収し，分子生物学
的な解析を行った。この場合，CRISPR 系によるゲノ
ム編集の可否を簡便に判断するため，交配に使用する雄
マウスを eGFP Tgマウス（eGFP transgeneをホモに
持つ）とし，これを正常な非 Tg 雌マウスと交配させ
た。その結果，得られる子孫個体は全てヘテロ Tgとな
り，eGFPを恒常的に発現する。従って，eGFP遺伝子
をゲノム編集の標的とするような sgRNAを作成し，こ
れを Cas9 mRNAと共に上記交配で得られた雌マウス
卵管内に投じれば，その子孫（胎仔）の中にはゲノム編
集の結果，eGFP蛍光を減弱させたものが出現すること
が期待される。
3匹の雌マウスに GONADを施した後，Day 13.5で
胎仔を回収した。その結果，雌マウス 1個体から 14体
の胎仔を回収することができた。蛍光観察の結果，右子
宮角から回収された 6 個体の胎仔のうち，2 個体は
eGFP蛍光の完全な欠失，別の 2個体は蛍光の減弱が認
められ，残る 2個体は均一な蛍光が観察された。T7E1
assayによる解析では，正常な蛍光を示した 2個体を除
くすべての胎仔において indel 変異の存在が認められ
た。加えて，eGFPの減弱が観察された 2個体の DNA
シークエンシングから，複数の波形が混在した electro-
phoregram が検出され，複数の indel 変異が導入され
た，いわゆるモザイク胚であることが確認された。
最後に，Day 19.5胎仔における解析を行った。計 4
個体の雌マウスに対し GONADを行った結果，1個体
から 11体の胎仔の回収に成功した。右子宮角から回収
された 9個体のうち 2個体で完全な蛍光の欠失が認めら
れ，別の 1個体には蛍光の減弱が観察された。これら 3
個体について分子生物学的な解析を実施したところ，蛍
光欠失を示した 2個体のうち 1個体では，約 200-bpの
大きな欠失が検出された。また，残る蛍光欠失個体およ
び蛍光減弱個体では，複数の indel変異が導入されたモ
ザイクであることが判った。このモザイク個体から得た
PCR断片をサブクローニングし，塩基配列を調べたと
ころ，蛍光欠失個体には野生型配列を欠いた 4塩基欠失
および 1塩基挿入のアレルが確認され，蛍光減弱個体か
らは野生型配列および 3塩基欠失のアレルが検出され
た。以上から，GONAD 法によるゲノム編集マウス個
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体の作製が現実的に可能であることが強く示唆された。
本研究から筆者が開発した GONAD法によりゲノム
編集された出産間近の正常な胎仔が得られ，将来的にゲ
ノム編集マウスを簡便に作製できる方向性が示された。
本結果はゲノム編集マウスの作製法で必須であった従来
の zygote-microinjectionに基づく ex vivo処置（採卵・
顕微注入・胚移植）を回避できる点で，画期的な成果で
あると考えられた。さらに，そのような ex vivo処置に
必須であった他の処置（胚移植用偽妊娠雌および精管結
紮雄マウスの調達）も不要となる。この点は，動物実験
の基本原則である 3R’s（Replacement, Refinement and
Reduction）に叶うもので，GONAD法は今後推奨され
るべき重要な動物実験法の一つになり得るものと期待さ
れる。
審査報告概要
本研究は，高度な技術と高価な機器を要せず，多くの
研究者が簡便かつ容易に実施できる新規ゲノム編集マウ
ス作製法（GONAD法）を確立するため，in vitro / in
situエレクトロポレーションによる卵管内 2細胞期胚へ
の eGFP mRNA 導入ならびに CRISPR/Cas9系 RNA
導入実験を行い，Transgene を標的とした遺伝子ノッ
クアウトによるゲノム編集マウスの作出を試みたもので
ある。その結果，GONAD 法によりゲノム編集された
出産間近な正常胎仔を得て，ゲノム編集マウスを簡便に
作出できる方向性を示している。本結果は従来の手法で
必須であった ex vivo処置（採卵・顕微注入・胚移植）
を回避できる点で，画期的な成果と考えられる。
GONAD法は動物実験の基本原則である 3R（代替・洗
練・削減）に叶うものであり，今後推奨されるべき重要
な動物実験法の一つになり得ると期待される。これらの
研究成果などを詳細に検討した結果，審査員一同は博士
（生物産業学）を授与する価値があると判断した。
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ex vivo処置を介さない新規ゲノム編集マウス作製法「GONAD」の開発

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