Tokyo University of Agriculture Repository / 東京農業大学リポジトリ

東京農業大学博士（バイオサイエンス

赤池, 康範

4355

AKAIKE, Yasunori

4356

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氏 名   赤 池 康 範 
学位（専攻分野の名称）   博 士（バイオサイエンス） 
学 位 記 番 号   甲 第 804号 
学位授与の日付   令和 3年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   cyclin A-CDKの活性亢進が誘導する細胞周期制御機構の解析
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農学） 朝 井   計 
               教 授・農 学 博 士 千葉櫻   拓 
               教 授・博士（農学） 小 川 英 彦 
                    理 学 博 士  正 井 久 雄＊ 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
【背景・目的】 
細胞増殖は生命において根源的な事象であり，細胞内で起きる多くの事象は最終的に細胞
増殖に関与している。真核生物の細胞周期を進行させると同時に，周期性をもたらしている
のが cyclin- cyclin 依存性キナーゼ（CDK） 複合体である。哺乳動物の主要な cyclin-CDK
複合体は，cyclin D-CDK4/6 が G1 期，cyclin E-CDK2 が G1/S 期，cyclin A-CDK1/2 が S
〜M 期，cyclin B-CDK1 が G2/M 期と機能する時期が分かれている。その中で cyclin A 
(CycA)-CDK は，他の cyclin-CDK に比べ S〜M 期に幅広く機能しているが，M 期中期以降
にプロテアソームによる CycA の急速な分解が誘導される。私は，細胞周期の長い時期で発
現しているにもかかわらず，M 期中期から G1 期中期まで非常に強固な分解制御を受ける
CycA のユニークな発現制御の生理的意義に注目し研究を進めた。 
既に CycA の M-G1 期における分解シグナルを欠損した変異体の解析より，３種の CDK
阻害因子（p21, p27, p107）による CDK 活性の抑制制御が見出され，分解抵抗性 CycA 変異
体を上記 CDK 阻害因子欠損（3-KO）マウス細胞で発現させることにより，M-G1 期におけ
る CycA-CDK の恒常的活性化と染色体倍数化が示されていた。さらに詳細な細胞生物学的
解析より，M-G1 期の CycA-CDK 活性制御破綻による染色体倍数化は，S 期での中心体過剰
複製とそれに伴う細胞分裂のスキップにより誘導されることが示唆された。以上より
CycA-CDK 活性制御は細胞周期の恒常性維持にとって非常に重要であることが考えられる。
しかし，これまでの研究で用いられた 3-KO 細胞はマウス由来であり，CycA-CDK 活性制御
の普遍的な生理的意義を解明するためにはヒト細胞での解析が不可欠である。そこで，本研
究ではヒト細胞における CycA-CDK 活性制御破綻が及ぼす細胞周期への影響を解析するこ
とで，CycA-CDK 活性制御の生理的意義の理解を深めることを目的とした。 
 ＊公益財団法人東京都医学総合研究所 所長 
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【方法・結果】 
第１章 ヒト細胞株において CycA-CDKの活性亢進が細胞周期へ及ぼす影響の解析 
 ヒト細胞での CycA-CDK 活性制御破綻による細胞周期への影響を解析するにあたり，
種々のヒト細胞株において分解抵抗性 CycA 変異体（CycAΔ80）を発現させた際の細胞周期
への影響，CDK 活性，CKI の発現量について細胞株間比較を行った。さらに，CycA-CDK
活性亢進による影響のCDK活性依存性をCycA及びCDK2変異体を用いて検証した。まず，
アデノウイルスゲノムが導入されたトランスフォーム細胞株である HEK293，がん細胞株
である MDAH041, U-2 OS, HT1080, Saos-2，および正常細胞株である WI-38 について
CycAΔ80の細胞周期への影響をFACS解析により検証した。CycAΔ80発現により，HEK293
とMDAH041においてCycA野生型（WT）発現では見られないG2/M期停滞が誘導された。
また，両細胞株では他の細胞株に比べ p21 と p27 の両発現レベルが低いことと，
CycAΔ80-CDK の活性が CycA WT-CDK よりも亢進していることが示された。さらに，
CycA-CDK 活性亢進が G2/M 期停滞誘導の原因であるかについて，CDK2 非結合 CycA 変
異体および CDK2 非活性型変異体を用いて検証したところ，どちらの変異体においても
G2/M 期停滞の誘導が抑制されたことから，CycA-CDK 活性亢進が G2/M 期停滞誘導の原
因であることが示唆された。以上の結果から，ヒト細胞では CycA-CDK 活性制御の破綻
（CycA-CDK 活性亢進）により G2/M 期停滞が誘導されることが明らかとなった。 
 p21 と p27 の低発現ヒト細胞株において，CycAΔ80の発現により CycA-CDK 活性が亢進
し G2/M 期停滞を誘導することが示されたが，マウス細胞株 3-KO 細胞における CycA-CDK
活性制御の解析では，p21 と p27 に加えて p107 も CycA-CDK と結合することで，M-G1
期におけるCycA-CDK活性化を抑えることが示されている。ヒト細胞においてもp21とp27
の発現低下に加えて p107 を欠損することで，マウス由来 3-KO 細胞同様に CycAΔ80 によ
る染色体倍数化の誘導が予測される。そこで，p21 と p27 の低発現ヒト細胞株 (HEK293, 
MDAH041) において，CRISPR-Cas9 システムを用いた p107 のノックアウトによる擬似
的な 3-KO ヒト細胞を作製し，CycAΔ80 による細胞周期への影響を解析した。その結果，
由来する細胞株によって CycAΔ80による G2/M 期停滞への影響に違いはあるものの，マウ
ス由来の 3-KO 細胞で観察された染色体倍数化は誘導されなかったことから，p21 と p27
の低発現及び p107 の欠損による擬似的ヒト 3-KO 細胞においては，CycAΔ80 による
CycA-CDK 活性亢進条件下であっても細胞分裂スキップによる染色体倍数化は誘導されな
いと示唆された。 
 
第２章 ヒト細胞における CycA-CDK活性亢進による G2/M期停滞誘導機構の解明 
 ヒト細胞株において，CycAΔ80による CycA-CDK 活性亢進が G2/M 期停滞を誘導するこ
とが示されたが，その分子メカニズムについては不明であった。それを解明する端緒として，
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上記細胞株 HEK293 と MDAH041 において CycAΔ80による G2/M 期停滞誘導強度に違い
があることに着目した (MDAH041 では HEK293 ほどの G2/M 期停滞が誘導されない)。両
細胞株の違いとして，HEK293はアデノウイルスDNAがゲノムDNA内に導入されており，
アデノウイルス由来のタンパク質である E1A が発現していることが挙げられる。そこで，
E1A の CycAΔ80 による G2/M 期停滞誘導への関与について解析し，CycA-CDK 活性亢進
による G2/M 期停滞誘導機構解明への足掛かりとした。 
 E1A の CycAΔ80による G2/M 期停滞誘導への関与について，HEK293 での E1A ノック
ダウン条件下と MDAH041 での E1A 共発現条件下における FACS 解析及び Histone H1 キ
ナーゼ活性測定による比較解析を行った。その結果，HEK293 において E1A siRNA 濃度依
存的に CycAΔ80による G2/M 期停滞の抑制がみられ，CycA-CDK2 複合体量及び CDK2 活
性も低下した。一方で，MDAH041 においては E1A 共発現により G2/M 期停滞誘導の促進
と CycA-CDK2 複合体量及び CDK2 活性の増大が示された。以上の結果から，E1A は
CycA-CDK2 複合体形成の促進により CycA-CDK 活性亢進を強く誘導することで G2/M 期
停滞誘導を促進することが示唆された。 
 過去の論文で「CDK2 は p53 非依存的な G2/M 期チェックポイント制御に必要である」
という報告がされている。本研究においても，前述のように E1A による CycA-CDK2 活性
亢進が G2/M 期停滞を促進する結果を踏まえると，CDK2 活性亢進により G2/M 期チェッ
クポイントを制御する ATR-Chk1 経路が活性化し，G2/M 期停滞が誘導されているのでは
ないかと考えた。そこで，CycAΔ80による G2/M 期停滞誘導と ATR-Chk1 経路の関係性に
ついて解析を進めた。ATR-Chk1 経路特異的な種々の阻害剤添加条件下で FACS 解析を行
った結果，CycAΔ80による G2/M 期停滞誘導が抑制され，ATR-Chk1 経路が関与している
ことが示唆された。さらに，ノコダゾールによる M 期同調と Chk1 特異的阻害剤添加タイ
ミングの組み合わせにより，CycAΔ80 による G2/M 期停滞が ATR-Chk1 経路を介して M
期前中期以前に誘導されていることが示唆された。また，CycAΔ80 発現による CDK1 抑
制的リン酸化レベルの上昇，CycAΔ80 と抑制的リン酸化を受けない CDK1 変異体または
抑制的リン酸化を解除するホスファターゼ cdc25Aとの共発現によるG2/M期停滞の抑制も
示された。これらの結果より，CycAΔ80 による CycA-CDK2 活性亢進が ATR-Chk1 経路
を活性化することで，cdc25A のホスファターゼ活性を抑え，CDK1 の抑制的リン酸化が促
進される結果，G2/M 期停滞が誘導されていることが強く示唆された。 
 
第３章 E1Aによる CycA-CDK2活性促進機構の解析 
 第２章より E1A が CycA-CDK2 活性化を促進することが示されたが，E1A による細胞周
期制御に関しては，pRb の不活化を介した E2F の活性化や転写因子との結合・転写活性化
能の促進が良く知られているものの，CDK 活性との関連性は報告されていなかった。そこ
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で，E1A の機能ドメインである CR ドメインに注目し，CR ドメインを選択的に保持するス
プライシングバリアントを用いた機能解析により，E1A の CDK2 活性化促進機構を解明す
る端緒とした。 
 まず，アデノウイルスゲノムが染色体に導入されている HEK293 より E1A のスプライシ
ングバリアントをクローン化した。取得した E1A スプライシングバリアントは 13S (保持
する CR ドメイン：CR1, CR2, CR3, CR4)，12S (CR1, CR2, CR4)，10S (CR2, CR4) であ
った。各バリアントによる CycAΔ80の G2/M 期停滞誘導促進能を検証したところ，13S が
最も強い促進能を示した。さらに，各バリアントの CDK2 活性化促進能を比較した結果，
13S に結合する CDK2 の活性が最も高く，G2/M 期停滞誘導促進能の結果と一致した。ま
た，E1A は Rb ファミリーである p107 を介して CycA-CDK2 と複合体を形成することが知
られており，上記バリアントは全て p107 との結合に関与する領域である CR2 を保持して
いる。そこで，E1A の CycA-CDK 活性化促進における p107 依存性の検証として，CR2 変
異体 dl1108 と各バリアントの比較解析を行った。dl1108 と 10S において p107 及び CDK2
との結合，また E1A に結合している CDK2 の活性の低下が示され，CR2 に加えて CR1 が
p107 及び CDK2 との結合や CDK2 活性化促進に関与すること，E1A と CDK2 との結合に
は p107 の結合が重要であることが示唆された。さらに，13S と 12S の CDK2 結合能と活
性化促進能の比較の結果，両者とも同等に CDK2 と結合するにも関わらず 13S が 12S に比
べて CDK2 活性を促進したことから，13S のみが保持する CR3 は CDK2 結合能とは独立
した CDK2 活性化促進能を有することが示唆された。CR3 は zinc finger motif を持ち，転
写因子との結合を介して転写活性化を促進することが知られているが，CDK を活性化する
機能は新規の発見である。 
 
【総括および考察】 
 本研究により，ヒト細胞において CycA-CDK 活性制御破綻（CycA-CDK 活性亢進）が細
胞周期チェックポイント ATR-Chk1 経路の活性化を介して細胞周期の G2/M 期停滞を誘導
することが明らかとなった。本研究に至る研究背景として，マウス由来 3-KO 細胞での
CycA-CDK 活性亢進による染色体倍数化においても，細胞周期停滞として細胞分裂阻害が
誘導されている。しかし，細胞分裂阻害時の表現型として，ヒト細胞では細胞周期進行が停
滞するのに対しマウス細胞では分裂をスキップして次の G1 期に進行する違いがある。この
違いの原因は未だ不明であるが，可能性としてマウス由来 3-KO 細胞で確認されている中心
体数の異常が挙げられる。本研究で CycAΔ80 により G2/M 期停滞が誘導された HEK293
は多極化しておらず，CycA-CDK 活性亢進による中心体数異常は誘導されないことが考え
られる。CycA は中心体に局在することも知られており，Cdc6 や Mcm5, Orc1 の中心体局
在を誘導して中心体複製を抑制する報告がある一方で，CycA が Mps1 の中心体局在を安定
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化させ，中心体過剰複製を促進することも報告されており，ヒト・マウス間でのこれらの制
御機構や各因子の関係性の違いは不明である。また，分裂期に中心体成熟や紡錘体形成など
に関与する Plk1 高発現マウス細胞において，中心体数の異常と細胞周期チェックポイント
の迂回により異数体化するという報告もあり，中心体数制御は細胞周期制御の破綻に大きく
関わっていると考えられる。ヒト・マウス細胞間の中心体関連因子等の比較解析をすること
で，生物種間の CycA-CDK 活性亢進に対する表現型の違いの原因が明らかになるであろう。 
 また，M 期進行阻害剤と細胞周期チェックポイント阻害剤の併用実験により，本来 CycA
が分解される M 期前中期よりも早い時期に，分解抵抗性 CycAΔ80による CycA-CDK 活性
制御破綻がチェックポイントを活性化し細胞周期進行を抑えることが示唆され，細胞周期制
御破綻自体が異常な細胞増殖を抑える防御システムの存在が明らかとなった。即ち，ヒト細
胞にとって前中期以降の CycA の発現は非常に不都合な現象であり，CycA-CDK 活性制御
の重要性を示していると考えられる。さらに，本研究で初めて見出された E1A による
CycA-CDK 活性化促進能が最終的に細胞周期チェックポイントの活性化に繋がることは，
がんウイルスタンパク質であり細胞周期進行を促進する E1A の機能とは矛盾するように見
える。しかし一方で，E1A は増殖シグナル経路を阻害することでがん抑制因子となること
も報告されていることから，本研究で示された E1A の細胞周期チェックポイント活性化へ
の関与は E1A のがん抑制機能の 1 つかも知れない。E1A による CycA-CDK 活性化促進能
のアデノウイルスにとっての意義についても未知であり，今後さらに研究を進める価値があ
ると考える。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
本研究では，細胞周期中心制御因子であるサイクリン A (CycA)-CDKの活性制御破綻がヒ
トがん細胞株の細胞周期に及ぼす影響を解析した結果，CycA-CDKの活性亢進が細胞周期チ
ェックポイントを活性化し，細胞分裂を阻害することを明らかにした。さらに，アデノウイ
ルス E1Aタンパク質が CycA-CDKの活性増強を介して細胞分裂阻害をさらに強く誘導するこ
とを見出し，古くから細胞増殖・がん化促進因子として知られている E1Aの新規機能を提唱
した。本研究で得られた結果は，細胞周期制御の破綻が細胞の増殖やがん化を阻止する機構
を示したものとして先駆的であり，ウイルスによる発がんを制圧する応用に向けた展開も期
待できる。これらの研究成果などを詳細に検討した結果，審査委員一同は博士（バイオサイ
エンス）の学位を授与する価値があると判断した。 


cyclinA-CDKの活性亢進が誘導する細胞周期制御機構の解析

米谷, 達哉

4359

KOMETANI, Tatsuya

4360

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氏 名   米 谷 達 哉 
学位（専攻分野の名称）   博 士（バイオサイエンス） 
学 位 記 番 号   甲 第 806号 
学位授与の日付   令和 3年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   がん抑制因子 p27Kip1の新規な機能制御機構の解析
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農学） 朝 井   計 
               教 授・農 学 博 士 千葉櫻   拓 
               教 授・博士（医学） 中 澤 敬 信 
                    博士（医学）  神 武 洋二郎＊ 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
【背景・目的】 
悪性腫瘍すなわちがんとは生体内で非制御的に増殖する細胞集団であり，日本において最
も死因率の高い疾患である。p27Kip1 (以下 p27) は細胞周期を負に制御する細胞周期阻害因
子であり，がん抑制因子の一つとして知られている。多くのがんにおいて p27 タンパク質
発現量は低レベルに保たれており，プロテアソームによる分解制御即ち量的な抑制制御に関
する知見が多く挙げられている。しかしながら，ある程度の p27 発現量を保持するがんも
存在することから，p27 制御系は量的な制御のみでは説明できない。 
当研究室の先行研究において，マウス線維芽由来正常細胞 NIH/3T3 は p27 高発現下にお
いて増殖を著しく停滞させることに比較し，ヒトがん細胞 U-2 OS（骨肉腫由来）と HT1080
（繊維肉腫由来）は p27高発現下であっても増殖があまり抑制されないことが発見された。
つまり，がん細胞において量的ではなく質的な p27 の機能抑圧機構および抑圧因子の存在
が示唆され，そのような因子は p27 と相互作用する可能性が高いと考えられた。そして，
p27 相互作用因子の網羅的探索が行われ，候補因子が多数得られていた。 
本研究では，質的な p27 機能抑圧因子の同定と抑圧メカニズムの解明を目的とし，得ら
れた p27 相互作用候補因子から「1. p27 特異的な相互作用因子の探索」と「2. その因子が
p27 機能を抑圧する機構に関する分子遺伝学的解析」を行った。さらに，「3. がん細胞種間
における p27 機能抑圧に関する一般性・特異性」の検証を行った。p27 の質的な機能抑圧
機構の解明は，がん化や腫瘍増大メカニズムに関する理解を深めると共に，新しい観点から
のがん治療に貢献すると考える。 
 
 
 ＊近畿大学 産業理工学部生物環境科学科 教授 
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【方法・結果】 
第１章 p27特異的な相互作用因子の探索 
p27 機能抑圧因子は p27 と相互作用する可能性が高いと考え，プロテオーム解析により
p27 相互作用因子の探索が行われた結果，29 種の候補因子が得られていた。はじめに，そ
の 29 種の因子の中から真に p27 と相互作用する因子を効率良く探索すべく yeast 
two-hybrid assay（以下 Y2H）による相互作用解析を行った。候補因子の cDNA はがん細
胞 U-2 OS 由来 cDNA から単離し，prey タンパク質発現ベクターに導入した。また，p27
野生型と cyclinへの結合能を欠損した p27 RXL変異型を baitタンパク質発現ベクターに導
入した。Y2H の結果，nucleophosmin isoform 1（以下 NPM1）が p27 と相互作用するこ
とが見出された。また同時に NPM1 は p27 RXL とは相互作用しないことも示された。この
ことから NPM1 は p27 タンパク質の cyclin が結合する部位に結合する事が予測された。次
に，動物細胞内における p27-NPM1 の相互作用解析を共免疫沈降法により行った。対象細
胞として，Tet-on systemを用いた p27誘導発現系 (Tet-on p27) が導入されたがん細胞U-2 
OS と HT1080，正常細胞 NIH/3T3 を用いた。その結果，3 細胞種において p27-NPM1 の
相互作用が確認されたが，その相互作用は正常細胞よりもがん細胞 2 種で強く観察された。
以上より，新規な p27 相互作用因子として NPM1 を同定した。 
 
第２章 NPM1による p27機能抑圧に関する分子遺伝学的検証 
2-1 NPM1 による p27 の質的な機能抑圧 
NPM1 は核小体タンパク質であり，リボソーム生合成等に関与する。また，がん抑制因
子 p53 の上流因子である p14 alternative reading frame（以下 ARF）の機能を阻害するこ
とで細胞増殖を促進すること，多くのがん細胞で高発現していることが報告されている。そ
こで，本研究の研究対象であるがん細胞 U-2 OS と HT1080，正常細胞 NIH/3T3 と MRC-5
（ヒト肺線維芽由来）における NPM1 のタンパク質発現量を比較した。その結果，U-2 OS，
HT1080 の NPM1 タンパク質発現量は NIH/3T3 の約 1.7 倍，MRC-5 の約 2.5 倍であるこ
とが示された。 
本研究では NPM1 のがん細胞における高発現に注目し，この高発現が p27 の質的な機能
抑圧に寄与すると予測した。そこで，NPM1 高発現正常細胞株と NPM1 低発現がん細胞株
を作製することによる分子遺伝学的検証を行った。上記の仮説が正しければ，p27 依存的な
増殖抑制が NPM1 高発現正常細胞株では緩和され，NPM1 低発現がん細胞株では促進され
ると考えられる。NPM1 高発現正常細胞株は NIH/3T3 Tet-on p27 に NPM1 高発現系を，
NPM1 低発現がん細胞株は U-2 OS，HT1080 Tet-on p27-EGFP に shRNA による NPM1
ノックダウン系を，それぞれレトロウイルスベクターにより安定導入して作製した。それら
の細胞株を用いて p27 誘導発現下または非誘導発現下で細胞増殖を比較し，増殖率（p27
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誘導下の細胞数 / p27 非誘導下の細胞数）を算出することで p27 の機能評価を行った。そ
の結果，正常細胞 NIH/3T3 Tet-on p27 の NPM1 高発現株は非高発現株と比較し増殖率が
有意に上昇した。一方で，がん細胞 U-2 OS，HT1080 Tet-on p27-EGFP の NPM1 ノック
ダウン株は非ノックダウン株と比較し増殖率が有意に低下した。また，NPM1 タンパク質
発現量依存的な p27 タンパク質発現量の大きな変化は確認されなかった。これらのことか
ら，がん細胞における NPM1 の高発現が p27 機能を質的に抑圧することが示唆された。さ
らに，がん細胞の高発現 NPM1 による p27 機能抑圧が腫瘍増大に与える影響を検証するた
め，異種移植実験を行った。ヌードマウスに HT1080 Tet-on p27-EGFP の NPM1 ノックダ
ウン株または非ノックダウン株を皮下移植し，p27 誘導発現下または非誘導発現下で腫瘍成
長を観察した。その結果，p27 誘導発現下での HT1080 Tet-on p27-EGFP NPM1 ノックダ
ウン株由来の腫瘍の増大は，非ノックダウン株由来の腫瘍の増大と比較し有意に抑制された。
以上のことから，がん細胞における NPM1 の高発現は p27 機能の抑圧を介してその細胞増
殖だけでなく腫瘍増大を促進することが示唆された。 
2-2 がん細胞における p27 の局在解析 
前述の NPM1 による ARF の機能阻害は NPM1 が ARF に結合し核小体に隔離すること
で生じる。そこで同様に p27 も NPM1 により核小体に隔離されるのではないかと考えた。
NPM1 と p27 の局在解析を行い，がん細胞特異的な p27 の局在異常の有無を検証した。そ
の結果，p27 は NIH/3T3 では核質に局在するのに対し，U-2 OS では核質に加え核小体に
も局在し，NPM1 と共局在することが観察された。p27 は本来核質で機能するタンパク質
であり，核小体局在は異常な局在であると考えられた。 
2-3 ARF-NPM1-p27 の関係性 
一方で，NPM1 と ARF は拮抗関係にあり，ARF が NPM1 のポリユビキチン化とそのタ
ンパク質の分解を促進するという報告がある。また，ARF は多くのがん細胞において欠損
または発現抑制されていることが知られている。故に，ARF の抑制が NPM1 による p27
の機能抑圧に関与しているのではないかと考えた。はじめに，本研究の対象がん細胞である
U-2 OS と HT1080 の ARF タンパク質発現を解析した。その結果，ARF タンパク質発現は
ポジティブコントロールの Saos-2（ヒト骨肉腫由来）では明確に検出できるのに対し，が
ん細胞 U-2 OS，HT1080 ではプロテアソーム阻害剤処理下でも検出されなかった。このこ
とから，がん細胞 U-2 OS と HT1080 において ARF の遺伝子欠損またはプロテアソーム分
解以外の発現抑制が考えられた。次に，この ARF の抑制が高発現 NPM1 による p27 機能
抑圧に寄与するのか検証するため，がん細胞 U-2 OS へ ARF を一過的に導入し p27 の局在
を観察した。その結果，がん細胞 U-2 OS において ARF 導入依存的に NPM1 のタンパク質
発現量の低下と同時に p27 の核小体から核質へ局在の変化が確認された。つまり，ARF の
遺伝子欠損または発現抑制が p27 の核小体局在に寄与することが示唆された。 
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以上のことから，がん細胞において ARF の遺伝子欠損または発現抑制に起因する NPM1
の高発現が p27 機能を抑圧し，細胞増殖と腫瘍増大を促進することが示唆された。 
 
第３章 がん細胞種間における p27機能抑圧に関する一般性・特異性 
新規がん細胞を加えた p27 機能抑圧の検証 
本研究のこれまでの研究は２種のがん細胞 U-2 OS と HT1080 を対象としていた。がん
は由来する組織や臓器によってその細胞特性が異なっており，治療標的分子も様々である。
本研究の応用性を拡大するため，がん細胞種間における p27 の質的な機能抑圧の一般性を
検証した。新たに 3 種のヒトがん細胞 DAOY（髄芽腫由来）と A431（上皮がん由来），
MDAH041（Li-Fraumeni 症候群線維芽由来）を加え p27 誘導発現系を導入し，p27 機能
評価のため細胞増殖検定を行った。その結果，p27 誘導発現下において，DAOY と A431
は大きな増殖抑制を示さなかったが MDAH041 のみ顕著な増殖抑制を示した。このことか
ら，全てのがん細胞において p27 機能が抑圧されるわけではないことが示唆された。 
また，それらのがん細胞種における ARF-NPM1-p27 の相関性を調べるため，NPM1 と
ARF のタンパク質発現量を解析した。その結果，3 種のがん細胞間で NPM1 タンパク質発
現量に大きな差は観察されなかったが，MDAH041 のみ ARF タンパク質の発現が検出され
た。つまり，p27 発現依存的な増殖抑制を示さない細胞種では ARF の発現が抑制されてお
り，増殖抑制を示した細胞種では ARF が発現していたことから，種々のがん細胞株におい
て p27 機能と ARF のタンパク質発現に相関性があることが示唆された。また，ARF 発現
の有無に関わらず NPM1 のタンパク質発現量に差がなかったことから，p27 が機能するた
めには NPM1 の低レベルの発現または ARF の発現が必要であることが示唆された。 
 
【総括】 
本研究において NPM1 を新規な p27 相互作用因子として同定し，がん細胞における
NPM1 の高発現が p27 機能を質的に抑圧し細胞や腫瘍の増殖を促進することを発見した。
しかしながら p27 と NPM1 の相互作用部位の正確な同定が必要と考える。なぜならば，
p27-NPM1 相互作用部位を標的とした阻害分子の細胞内導入により，p27 の機能が回復す
る可能性があるためである。つまり，新規な抗がん剤の開発に寄与すると期待される。 
また，p27 が機能するためには ARF の発現が重要であることを見出した。ARF の発現が
NPM1 発現量の減少または p27-NPM1 相互作用阻害に寄与すると考えられるが，特に後者
においては詳細な解析が進んでいない。ARF は多くのがんで遺伝子変異や発現抑制により
不活化していることから，それらのがんにおいて p27が機能していないことが予測される。
つまり，p27 の機能回復は多種のがん治療に寄与する可能性があり，本研究における ARF
の関わる p27 制御機構の発見と今後の更なるメカニズム解明はその糸口になると期待され
- 5 - 
 
る。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
本研究では，多くのがんにおいて発現量が低下しており，その発現量とがんの悪性度との
負の相関が知られている CDK阻害因子・がん抑制因子 p27について，量的制御によらない質
的な機能制御を明らかにし，その原因因子として新規なp27相互作用因子NPM1を見出した。
そして分子遺伝学的解析より，NPM1が p27に結合して核小体に隔離することにより CDK阻
害機能を抑制し，細胞・腫瘍の増殖を促進することを明らかにした。さらに，種々のがん細
胞株での比較解析により，主要がん抑制因子である ARFが足場依存的増殖条件において p27
機能の促進に寄与することを示し，ARFの欠損が p27機能の低下を介して原発巣での発がん
に関与するモデルを提唱した。本研究で得られた結果は，新規な p27機能制御を示すのみな
らず，がんの発生における他のがん抑制因子との機能ネットワークを示唆するものとして先
駆的なものであり，p27機能回復をターゲットとする抗がん剤等の創薬応用に向けた展開も
期待できる。これらの研究成果などを詳細に検討した結果，審査委員一同は博士（バイオサ
イエンス）の学位を授与する価値があると判断した。 


がん抑制因子ｐ27kip1の新規な機能制御機構の解析

松本, 英里

4371

MATSUMOTO, Eri

4372

AMPKの新規基質SRタンパク質の同定とその機能解析

森谷, 千星

4382

MORIYA, Chise

4383

- 1 - 
 
氏 名   森 谷 千 星 
学位（専攻分野の名称）   博 士（醸造学） 
学 位 記 番 号   甲 第 817号 
学位授与の日付   令和 3年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   国酒酵母の分類学的研究 
論 文 審 査 委 員   主査 准 教 授・博士（農学） 中 山 俊 一 
               教 授・博士（醸造学） 門 倉 利 守 
               准 教 授・博士（農芸化学） 石 川 森 夫 
               教 授・農 学 博 士 鈴 木 健一朗 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
清酒，泡盛，焼酎は日本の「國酒」に位置付けられ，国酒醸造に用いられる酵母や国酒醸
造工程などで分離された酵母をまとめて国酒酵母（清酒酵母，泡盛酵母，焼酎酵母）と呼ん
でいる。これらの酵母は，世界標準の酵母分類学書である The yeasts, a taxonomic study
では Saccharomyces cerevisiae に分類されている。S. cerevisiae はパンやビール，ワイン
などのヒト関連環境から花や樹木，土壌，虫などの自然環境に至る広範な環境に生息してい
ることから，世界中の各環境から分離された，他の種では類をみない数千以上の株の複合群
となっている。最近は S. cerevisiae の多様性の解明のために，各国が自国の産業および生
態学的に重要な酵母を，表現性状を合わせたゲノム情報に基づく系統解析により，集団レベ
ルで特徴付けている。しかし，日本の産業および生態的に重要な国酒酵母については，全国
の蔵で利用されている協会酵母など系統的に限られた数株による検討に留まっていること
から，国酒酵母の分類学的位置は不明瞭となっている。従って，国酒酵母を集団レベルで生
理・生化学・系統学的に特徴付け，日本の醸造酵母の分類学的位置を明確にすることで，時
代とともに変わる産業のニーズに左右されることのない微生物資源としての価値を国内外
に示す必要がある。そして，これらの情報を基に同種内でも限られている国酒醸造に適した
酵母の識別を可能にすることで，様々な菌株を用いた国酒醸造の実現を可能にし，多様化す
るニーズに応えることにより醸造業に貢献できるものと考えられる。 
本研究では，国酒醸造工程から分離された株や，分離当時に国酒酵母に関連した学名の記
載のある株，全国の蔵で利用されている協会酵母の株など，多様な国酒酵母 96 株（清酒酵
母 43 株，泡盛酵母，19 株，焼酎酵母 43 株）を用いて，現在の分類基準に則して生理・生
化学および系統学的に新たな解析を行い，国酒酵母の分類学的特徴を明確にした。 
 
 
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- 2 - 
 
1．The yeasts, a taxonomic study 第 5版の Key to species による国酒酵母の分類学的特徴
付け 
第 1 章では，現在酵母の同定が The yeasts 第 5 版に基づいた配列解析により行われてい
るのに対して，国酒醸造では酵母の表現性状が重要であることから，The yeasts 第 5 版の
Saccharomyces 属の種の同定指標である Key to species 7 項目の試験を用いて，国酒酵母
の表現性状による分類を行った。7 項目のうち，ビタミン欠如培地での生育試験において，
S. cerevisiae は生育しないとされているのに対し，国酒由来の酵母の 90 株は生育した。こ
の性質を The yeasts 第 5 版における Saccharomyces 属の 7 種の standard description と
比較したところ，Saccharomyces 属のいずれの種の性質にも一致しなかった。これらのこ
とから，国酒酵母は典型的な S. cerevisiae，およびその他の Saccharomyces 属の各種と比
較しても，表現性質上特異な一群を形成していることを新たに明らかにした。また，この性
質から，The yeasts 第 5 版で再同定すると，ビタミン非要求であることにより国酒由来の
酵母 90 株が Torulaspola 属や Lachancea 属とも類似していることを見出した。これらの属
は，表現性状が分類基準の The yeasts 初版で Saccharomyces 属に分類された背景を有し，
発酵環境でもよく分離されていることから国酒酵母との関連性が示唆された。 
 
2．国酒酵母の特性と Saccharomyces 属酵母の分類への応用 
第 1 章では，分類学に基づいて Saccharomyces 属の中で，国酒酵母一群の表現型による
識別が可能であることを明らかにした。国酒醸造では，それぞれの酒類の醸造に適した酵母
を清酒酵母，泡盛酵母，焼酎酵母に区別して利用している。清酒酵母については以前より特
徴付けがなされ，その識別手法が確立されている一方で，泡盛および焼酎酵母はその段階に
至っていない。そこで第 2 章では，この国酒酵母群内の細分化とその実用的な識別法を確立
することを目的に，清酒酵母の分類指標 15 の指標を用いて各酒類の酵母の特徴付けを行っ
た。SSU rRNAの ITS領域の 301番目の塩基，Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
によるアイソザイムパターンの 2 項目では，国酒酵母が一群として S. cerevisiae と区別さ
れ，イーストサイジン耐性，AWA1 遺伝子断片の検出の 2 項目では，その群内が実用的な
グループに細分化された。そのため，第 1 章の結果と合わせた 11 項目の指標により，
Saccharomyces 属の中で，国酒酵母を実用に合理的な清酒酵母，泡盛酵母，焼酎酵母 1，焼
酎酵母 2 の 4 グループに分けられることを新たに見出し，新しい実用的な識別法を確立し
た。 
 
3．The yeasts 第 5版に基づく国酒酵母の系統分類 
最新版の The yeasts 第 5 版では，複数の遺伝子領域を組み合わせた多重遺伝子解析によ
り分類体系の再構築がなされているが，それに基づく国酒酵母の検討は行われていない。そ
- 3 - 
 
こで第 3 章では，The yeasts 第 5 版の系統分類に採用されている 5 つの遺伝子を用いて，
国酒酵母の系統解析を行った。Saccharomyces 属の系統分類に採用されている 26S rRNA
遺伝子の D1/D2 領域および ITS 領域を用いて，国酒酵母 96 株に，データベース上の株も
含めた S. cerevisiae 116 株，Saccharomyces 属のその他の種 10 株を加えた計 222 株によ
る系統解析を行った。S. cerevisiae クレードの中で，国酒酵母 96 株および S. cerevisiae 36
株（樹木や果実などの自然環境由来の株，西アフリカの酒類の株）と基準株を含む S. 
cerevisiae 75 株（パン，ワイン，ビール，実験室，臨床由来の株）が分岐した。第 1 章の
The yeasts 第 5 版の Key to species の結果を併せると，分類学的には国酒酵母が，S. 
cerevisiae の基準株を含む主要な産業酵母とは異なる一群を形成していることを新たに明
確にした。一方，S. cerevisiae の野生酵母や西アフリカの酒類酵母は，系統的に国酒酵母に
近いことが示唆された。また，The yeasts 第 5 版の系統分類に採用されているその他の遺
伝子の中でも，COX2 は国酒酵母内を協会清酒酵母，その他の清酒酵母，泡盛および焼酎酵
母の 3 つに区別可能であり，国酒酵母の実用の識別に有用な遺伝子を見出した。 
 
4．ゲノム情報に基づく国酒酵母の系統学的検討 
現在はゲノムによる解像度の高い系統解析が一般となっているが，国酒酵母の集団レベル
での位置付けは示されていない。そこで第 4 章では，これまでに解析した国酒酵母のうち系
統的な特徴を有する代表株 27 株の De novo シーケンス解析を行い，パンやワイン，ビール
などの主要な産業酵母，樹皮や土壌，果実などの野生酵母，西アフリカの酒類関連酵母，分
離源および地理的起源の類似した中国の酒類酵母など，多様な起源の S. cerevisiae 73 株を
加えた系統解析を行った。2910 遺伝子の系統解析により，国酒酵母が，S. cerevisiae の一
般的な 5 つのクレード（Wine/European，West African，North American，Malaysian，
Sake/Asian）とは異なる，1 つの独立したクレードを形成した。これまでアジアの酒類の株
は Sake/Asian に位置することが一般的とされてきた中で，独立した国酒酵母の集団として
の系統学的な位置付けを新たに示し，国酒酵母がコアゲノム領域で固有の系統学的特性を有
することが示唆された。分岐に寄与した遺伝子は，幅広い生物種が保持し，DNA 複製スト
レス時に発現が増加するような重要な機能の遺伝子や，醸造特性に関与する機能の遺伝子で
あった。また，国酒酵母クレード内の分岐は分離源を反映し，実用に合理的であったことか
ら，これらの遺伝子は各酒類醸造に適した酵母の識別に有用であると考えられた。 
 
5．ゲノム情報に基づく国酒酵母の特徴付け 
第 5 章では，第 4 章で解析した多様な国酒酵母のゲノム情報を利用して国酒酵母の遺伝
的特徴を検討した。S. cerevisiae のゲノムリファレンス株である実験室酵母 S288c に対し
て，国酒酵母が特異に有する 7 遺伝子（BIO1，BIO6，EHL2，KHR1，機能未知 3 遺伝子）
- 4 - 
 
を抽出した。データベース上の S. cerevisiae 772 株の中で，国酒酵母の他に 7 遺伝子を有
する株は，主に中国や韓国の，穀物と麹を原料に造られる伝統的な醸造酒から分離された株
であった。BIO1，BIO6，EHL2 はビオチン生合成に関与する遺伝子であることが報告され
ていることから，第 1 章で明らかにした国酒酵母の特徴的な表現性状であるビタミン要求性
が，ゲノムの特徴からも裏付けられた。また，他の生物種を含めたビオチン生合成関連遺伝
子の系統解析により，醸造に関連する細菌や糸状菌がそれらの遺伝子を有し，加えて第 1
章で国酒酵母と表現性質上類似した Torulaspola 属や Lachancea 属も有していることを明
らかにした。これらから，国酒酵母の表現型－遺伝子型の特徴であるビオチン要求性は，麹
や乳酸菌など多様な微生物の相互作用を利用して造られる特有の醸造環境下で，環境への適
応として，関連する微生物とともに独自に進化した可能性が推察された。 
 
6. マッコリ酵母の分離と特性 
第 5 章では，中国と韓国の伝統的な醸造酒から分離された酵母が，国酒酵母と類似した遺
伝的特徴を有することを明らかにした。中国の酒類酵母が集団で解析されているのに対して，
韓国の代表的な醸造酒であるマッコリの酵母は，ゲノム公開株が 2 株のみであることに加え
て，性質などの情報も不足している。そこで第 6 章では，4 種類の韓国産生マッコリから酵
母を分離し，第 2 章の 11 項目に基づいて性質を検討した。分離した 12 株は 11 項目の試験
で，9 株が典型的な S. cerevisiae と同様の性質を示し，3 株は泡盛および焼酎酵母に類似し
た性質を示した。この 3 株は同じ韓国産生マッコリから分離されたことから，マッコリ醸造
が主に典型的な S. cerevisiae によって行われ，国酒酵母に類似した性質を示す酵母が混在
することを明らかにした。 
 
7．総括 
本研究では，生理・生化学的性状による分類において，The yeasts 第 5 版の
Saccharomyces 属 Key to species に基づき，国酒酵母が典型的な S. cerevisiae およびその
他の Saccharomyces 属の種に対して，表現性質上特異な一群を形成していることを明らか
にした。また，清酒酵母の分類指標 4 項目を合わせた 11 項目により，国酒酵母内を実用に
合理的な 4 グループに区別し，実用的な識別法を確立したとともに，系統分類に有用なデー
タを提供した。系統分類においては，ゲノム情報に基づいて国酒酵母が S. cerevisiae の中
で，独立した 1 つのクレードを形成することを明らかにし，国酒酵母がコアゲノム領域で固
有の系統学的特性を有することが示唆された。また，国酒酵母クレード内の分岐は分離源を
反映したことから，これらの遺伝子が各酒類醸造に適した酵母識別マーカーとして有用であ
ることを示した。一方，サブテロメア領域の遺伝的特徴は，東アジア特有の醸造環境におい
て，環境への適応として独自の進化を成したことが推察された。以上より，本研究は酵母分
- 5 - 
 
類学に基づく新たな観点から国酒酵母を生理・生化学・系統学的に特徴付けたことにより，
日本の産業および生態的にも重要な国酒酵母の特性を明確にし，国酒酵母の分類体系におけ
る特徴的な位置付けを新たに確立した。これは，国酒酵母の微生物資源としての価値を確立
し，今後の国酒酵母の研究の基盤となるとともに，多様な菌株を用いた国酒醸造への応用に
より，醸造業の発展に寄与するものと考えられる。また，産業的に重要な S. cerevisiae の
細分化を標準化することにより，国酒酵母をモデルに複雑な種に対する新たな概念を提供で
きるものと考えられる。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
日本の国酒醸造に用いられる国酒酵母（清酒酵母，泡盛酵母，焼酎酵母）は世界的な酵母
の分類学書では Saccharomyces cerevisiae に分類されているが，実際には S. cerevisiae とは異
なる点が多く分類学的位置は不明瞭となっている。本研究では現在の酵母の分類基準に則し
て生理・生化学および系統学的に新たな解析を行い，国酒酵母の分類学的特徴を明確にした。
生理・生化学的性状による分類では，国酒酵母が表現性質上特異な一群を形成し，実用に合
理的なグループに区別する新な識別法を確立した。系統学的な分類では，ゲノム情報より国
酒酵母が S. cerevisiae の中で独立した一つのクレードを形成することを新たに明らかにした。
また，ゲノム解析による国酒酵母内の分岐が分離源を反映したことから，各酒類醸造に適し
た酵母の識別マーカーとして有用な遺伝子を明らかにし，環境への適応として国酒酵母が共
通の特異的な遺伝子を有したことを示した。これらの研究成果は，酵母分類学に基づく新た
な観点として，日本の産業および微生物生態学に重要な国酒酵母の特性を分類学だけでなく，
実用的な醸造業にも提供するものであり，審査委員一同は博士（醸造学）の学位を授与する
価値があると判断した。 


国酒酵母の分類学的研究

小山, 翔大

4367

KOYAMA, Shota

4368

卵白タンパク質分子の加熱による高次構造変化およびゲル形成機序に関する研究

田中, 純平

4378

TANAKA, Jumpei

4379

- 1 - 
 
氏 名   田 中 純 平 
学位（専攻分野の名称）   博 士（醸造学） 
学 位 記 番 号   甲 第 815号 
学位授与の日付   令和 3年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   Saccharomyces cerevisiae における TTC 染色機構に関する研究
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（醸造学） 門 倉 利 守 
               教 授・農 学 博 士 鈴 木 健一朗 
               准 教 授・博士（工学） 数 岡 孝 幸 
               准 教 授・博士（農学） 中 山 俊 一 
 
 
 
 論 文 内 容 の 要 旨  
 
2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloride (TTC)は無色の化合物であり，還元されることで赤色を呈
する 1,3,5-triphenylformazan（TPF）に変化する。この性質を用いて生体活性を測定する方法
を TTC 染色試験といい様々な分野において用いられている。醸造分野においては清酒醸造
に適した清酒酵母は TTC 染色性を示す一方，野生酵母は TTC 染色性を示さないことが知ら
れており清酒醸造好適酵母の選別や醪中の清酒酵母の識別等に用いられてきた必要不可欠
な手法の一つである。 
 TTC を還元する酵素は Chlamydomonas 属ではミトコンドリアの電子伝達系における
NADH デヒドロゲナーゼ（Complex I），ラットではシトクロム c オキシダーゼ（Complex IV）
において還元されることが報告されている。一方，酵母 Saccharomyces cerevisiae においては
呼吸欠損株において TTC 還元能を失うことから電子伝達系が関与していることが示唆され
ているものの，電子伝達系のどの酵素が TTC を還元しているのか明らかにされていない。
そのため TTC 染色性が酵母のどの様な性質を反映しているのか，TTC 染色性と発酵産物に
どのような関係性があるのかも不明である。そこで本研究では，S. cerevisiae において TTC
還元を担う酵素を特定するとともに，TTC 染色性と醸造特性の関係を解明することを目的
とした。 
 
1. 実験室酵母を用いた TTC 還元部位の特定 
 TTC が他生物において電子伝達系で還元されるという報告や酵母において呼吸欠損株の
TTC 染色性が低下するという報告から，酵母においても電子伝達系で TTC が還元されると
推測し電子伝達系に関与する遺伝子の破壊株を用いて TTC染色試験に供することで TTCを
還元する酵素の特定を試みた。親株として一倍体の実験室酵母 BY4741 を用い，栄養要求性
マーカー遺伝子の相同組み換えにより遺伝子破壊を行った。初めに NADH デヒドロゲナー
- 2 - 
 
ゼ（Complex I に相当）をコードする遺伝子 NDI1 を破壊する際，マーカー遺伝子に LEU2
を用いた破壊株では TTC 染色性が親株と同程度であったのに対し，マーカー遺伝子として
URA3 を用いた株では驚くべきことに TTC 染色性が上昇した。さらに，培養する際の培地へ
のウラシル添加によっても LEU2をマーカー遺伝子として用いたNDI1破壊株は TTC染色性
が向上した。また，同様に電子伝達系においてユビキノンに電子を供給する酵素をコードす
る遺伝子群 NDE1，NDE2，GUT2，DLD1，CYB2 について URA3 をマーカー遺伝子とした破
壊株においても TTC 染色性が向上した。この様にユビキノンに電子を供給する遺伝子の破
壊株において，URA3 が相補されウラシル代謝が正常であれば TTC 染色性が向上したことか
ら，これらの酵素は TTC 還元に直接関与しないことが示唆された。また，URA3 が相補され
た二倍体実験室酵母 BY4743U も URA3 を有さない株と比較し TTC 染色性が向上し，ウラシ
ル代謝が正常であることが TTC 染色に重要であることも明らかとなった。 
 電子伝達系における TTC 還元に関与する酵素を包括的に解明するため，BY4741 を親株と
しカナマイシン耐性遺伝子を用いて構築された電子伝達系に関する遺伝子破壊株をウラシ
ル添加培地にて培養し TTC 染色試験に供した。電子伝達系において上流に位置する NADH
デヒドロゲナーゼをコードする NDI1，NDE1，NDE2 やコハク酸デヒドロゲナーゼ（Complex 
II）をコードする SDH1 といったユビキノンに電子を供給する酵素をコードする遺伝子群の
破壊株において TTC 染色性は低下しなかった。一方，ユビキノンより下流に位置するユビ
キノール-シトクロム c オキシドレダクターゼ（Complex III）をコードする COR1，QCR7，
RIP1，シトクロム c オキシダーゼ（Complex IV）をコードする COX4，COX7，COX9，さら
に Complex III の一部でありシトクロム c オキシダーゼへ電子を受け渡すシトクロム c をコ
ードする CYC1 の破壊株において TTC 染色性が低下した。このことから，酵母において TTC
を還元する部位は電子伝達系のユビキノール-シトクロム c オキシドレダクターゼあるいは
シトクロム c オキシダーゼであることが示唆された。ユビキノール-シトクロム c オキシド
レダクターゼやシトクロム c オキシダーゼに関与する遺伝子 COR1，COX4，CYC1 を URA3
が相補され TTC 染色性が向上した BY4741U を親株として改めて破壊し TTC 染色試験に供
したところ，カナマイシン耐性遺伝子を用いて取得された遺伝子破壊株と同様に TTC 染色
性が低下した。これらのことから，酵母において TTC はユビキノール-シトクロム c オキシ
ドレダクターゼあるいはシトクロム c オキシダーゼにより還元されることが示唆された。 
 ユビキノール-シトクロム c オキシドレダクターゼ（Complex III）とシトクロム c オキシ
ダーゼ（Complex IV）は Super Complex を形成することが報告されており，一方の遺伝子破
壊により他方の活性に影響を与えるため遺伝子破壊株の TTC染色試験ではユビキノール-シ
トクロム c オキシドレダクターゼとシトクロム c オキシダーゼのどちらが TTC を還元して
いるか特定することは難しかった。そこで，どちらの酵素が TTC を還元しているか解明す
るため，ユビキノール-シトクロム c オキシドレダクターゼとシトクロム c オキシダーゼの
- 3 - 
 
酵素活性および TTC 還元活性を測定した。酵素活性測定のため BY4741U を親株とした
COR1，COX4 破壊株のミトコンドリアの取得を試みたが，グリセロールを炭素源とした培
地での呼吸条件での培養において，COR1 と COX4 破壊株はどちらもほとんど生育せず，ミ
トコンドリア量も酵素活性の測定に必要な十分量を確保することが出来なかった。そこで，
酵素活性の測定には BY4741U のミトコンドリアを用い，ユビキノール-シトクロム c オキシ
ドレダクターゼとシトクロム c オキシダーゼの阻害剤である Antimycin A，KCN をそれぞれ
用いることで，各酵素をコードする遺伝子が破壊された状態を疑似的に再現した。 
ユビキノール-シトクロム c オキシドレダクターゼの酵素活性は，Antimycin A の添加によ
り 12.9 ± 1.9 U/mg から 0.4 ± 0.2 U/mg へと低下した。また，ユビキノールを電子供与体
とした TTC 還元活性も同様に Antimycin A の添加により 90.8 ± 8.5 U/mg から未検出へと
減少した。一方，シトクロム c オキシダーゼの酵素活性は，KCN の添加により 26.0 ± 0.2 
U/mg から 0.9 ± 0.2 U/mg へと低下するのに対して，還元型シトクロム c を電子供与体とし
た TTC 還元活性は KCN の添加に関わらず検出されなかった。これらのことから，TTC を
直接的に還元しているのはユビキノール-シトクロム c オキシドレダクターゼであることが
示唆された。さらに，ユビキノールを電子供与体とした TTC 還元活性測定の際に KCN を添
加すると TTC 還元活性が 164.0 ± 13.2 U/mg へと 1.8 倍に増加した。これは KCN によりシ
トクロム cオキシダーゼ活性が阻害されることで本来シトクロム cオキシダーゼに向かう電
子がユビキノール-シトクロム c オキシドレダクターゼによって TTC により受け渡されるよ
うになり TTC 還元活性が上昇したと考えられ，ユビキノール-シトクロム c オキシドレダク
ターゼが TTC を直接還元することが強く示唆された。 
 
2. TTC 染色性の異なる株の代謝解析 
TTC 染色性に関与する遺伝子がどのように発酵特性に関与しているかは不明であり，TTC
染色性が酵母のどのような性質を示しているのかは明確にされていない。そこで，TTC 染
色性を示す BY4741U，TTC 染色性を示さない BY4741，BY4741U の COR1 破壊株
（BY4741Ucor1），COX4 破壊株（BY4741Ucox4）の 10%グルコースを含有する YM 培地
での増殖能や代謝産物を比較することで TTC 染色性と発酵特性の関係を解明することを試
みた。その結果，BY4741Ucor1 と BY4741Ucox4 は増殖能，グルコース消費量，エタノ
ール生成量，有機酸生成量において親株 BY4741U と同等であったのに対して，ura3 欠損株
である BY4741 は親株である BY4741U と比較して培養 48 時間で増殖能は 47.4%，グルコー
ス消費量は 49.5%，エタノール生成量は 38.8%に低下しコハク酸の生成量は 395.3 mg/Lと 3.8
倍に増加していた。 
一方，産業的には二倍体酵母が用いられることが一般的であるため，二倍体実験室酵母
BY4743 を用いて同様に分析を行った。BY4741Ucor1 と BY4741Ucox においては発酵能
- 4 - 
 
に変化が見られなかったのに対し，ura3 欠損株では発酵能や代謝産物に変化が見られたこ
とから，ura3 欠損株の発酵能や代謝産物を測定したところ，一倍体と同様に URA3 相補株と
異なる性質を示した。そこで，さらに詳しい代謝物質を測定し，URA3 相補により TTC 染色
性が回復した原因を解明するため，培養 9 時間目の ura3 欠損株 BY4743 と URA3 相補株
BY4743U に関してメタボローム解析を行った。その結果，BY4743U では BY4743 と比較し
て URA3 がコードするオロチジン 5'-一リン酸デカルボキシラーゼの活性が回復し，ピリミ
ジン系の核酸が増加していることが確認された。また，BY4743U は BY4743 と比較してミ
トコンドリアの TCA 回路に属するクエン酸，2-オキソグルタル酸，リンゴ酸が，それぞれ
2.0 倍，4.1 倍，7.4 倍に増加しており，ミトコンドリアのアルギニン代謝における中間物質
である N-アセチルグルタミン酸や N-アセチルオルニチンもそれぞれ 3.5 倍，10.6 倍に増加
し，さらにミトコンドリアに局在していることが報告されているミリスチン酸も未検出から
増加していた。これらミトコンドリアに関与する代謝物質量が増加していたことから，URA3
の相補によりピリミジン塩基代謝が回復することでミトコンドリア全体の機能が活性化し，
電子伝達系における TTC 還元活性も上昇したと考えられる。このように，TTC 染色性は酵
母においてミトコンドリアの完全性を示し，TTC 染色性を示さない株の中にも COR1，COX4
破壊株や URA3 破壊株のようにミトコンドリアの機能が低下した原因によって様々な性質
を持つ株が存在することが示唆された。 
 
3. 一倍体清酒酵母及びその接合により取得した二倍体株による清酒醸造 
 これまで実験室酵母を親株として TTC染色性に影響を与える遺伝子と TTC 染色性の異な
る株の発酵能を明らかにしてきた。しかしながら清酒醸造に用いられる清酒酵母は実験室酵
母とは遺伝的背景が異なり諸性質も異なるため TTC 染色性と清酒醸造特性の関係を明らか
にするためには清酒酵母を親株として TTC 染色性を示さない遺伝子破壊株を取得し清酒を
仕込む必要がある。また，一般的な清酒酵母は二倍体であるため遺伝子破壊の作業は困難を
伴う。そこで，先の研究で取得された清酒酵母 K701 の一倍体株について清酒小仕込み試験
を行い親株の二倍体清酒酵母に近い性質を示し遺伝子破壊の親株として用いる株を選抜し
た。一倍体清酒酵母に関し，清酒小仕込み試験を行い，アルコール量，グルコース濃度，日
本酒度，酸度，アミノ酸度，有機酸，香気成分を分析したところ，MAT a 型では K701-H12
が，MAT alpha 型では K701-H3 が親株である K701 に近い性質を示した。さらに，各一倍体
を特徴づけている遺伝子変異を特定するため全ゲノム解析を行い，SNPs と染色体数を解析
したところ，K701-H12 と K701-H3 において清酒醸造に影響を与えると考えられる SNPs は
存在せず，染色体は K701-H3 の VII 番染色体の前半を除いて重複していなかった。そのた
め，VII 番染色体に存在する遺伝子を除いて，これらの株を遺伝子破壊株の親株に用いるこ
ととした。 
- 5 - 
 
4. TTC 染色性低下清酒酵母の清酒醸造特性 
清酒酵母 K701-H3 を親株として TTC 染色性に影響を与える遺伝子 URA3，COR1 の破壊
株を取得し清酒醸造を行うことで TTC 染色性と清酒醸造の関係性の解明を試みた。COR1
破壊株ではエタノール発酵能は親株と同等であったが，コハク酸量が 488.4 mg/L と親株と
比較して 73%に減少していた。一方，URA3 破壊株では親株と比較してエタノール発酵が遅
延し，留後 20 日目でアルコール度数 15.4%と親株と比較して 94.3%に低下した。また清酒
のリンゴ酸が 449.5 mg/Lと 5.0倍に，フマル酸が未検出から 269.4 mg/Lに，コハク酸が 1237.0 
mg/L と 1.9 倍に増加した。このように，TTC 染色性を示さない株でも清酒醸造に用いると
ミトコンドリア機能が低下した原因によって異なる酒質を与えることが明らかとなり，TTC
染色性を示さない酵母を用いることで主にミトコンドリアにおいて生産される有機酸の組
成が変化した新たなる呈味を有する清酒の醸造が可能である可能性が示された。 
 
5. 総括 
 本研究では以上のように酵母における TTC 染色に関与する酵素を特定し，それらの破壊
株で清酒を仕込むことで TTC 染色性と清酒醸造の関係を解明することを試みた。初めに遺
伝子破壊と酵素活性測定により，これまで未解明であった TTC を還元する部位が電子伝達
系のユビキノール-シトクロム c オキシドレダクターゼであることを明らかにした。また，
URA3 の破壊によっても TTC 染色性が低下することを発見した。そこで，一倍体清酒酵母に
おいてこれら遺伝子を破壊し，清酒を仕込んだ結果，同様に TTC 染色性を示さない URA3，
COR1 破壊株において，それぞれ発酵能や有機酸量の変化等の異なる性質を示し，TTC 染色
性が等しい株でも様々な性質を持つこと，また TTC 染色性を示さない株でも清酒醸造が可
能であり，有機酸量等，新しい酒質をもたらす清酒酵母の育種が可能であることが明らかと
なった。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
本研究は，酵母の識別法の一つである 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) 染色機構
を解明し，さらには本染色機構と清酒醸造との関連性についての研究である。まず，実験室
酵母について電子伝達系に関与する遺伝子群の破壊株を用いた TTC 染色と電子伝達に関わ
る酵素の活性比較によってTTCがubiquinol-cytochrome oxidaseによって還元されることを明
らかにした。また，電子伝達系の遺伝子のみならずウラシル代謝に関わる遺伝子破壊も染色
性に関与することを見出した。電子伝達系の遺伝子破壊は発酵能や発酵産物に影響を及ぼさ
なかったが，ウラシル代謝に関わる遺伝子破壊は発酵能が低下することやコハク酸生成量が
- 6 - 
 
増加することを見出した。これらの結果は清酒酵母を用いた研究でも同様であった。 
TTC 染色法は古くから用いられてきた酵母の識別法だが，その染色メカニズムは不明で
あり何を評価しているかや清酒醸造との関わりは不明であった。未解明であった TTC 染色
機構とその醸造特性を明らかにした本結果は，清酒品質の向上や醸造技術の発展の基盤とな
る。これらのことから，審査委員一同は博士（醸造学）の学位を授与する価値があると判断
した。 


Saccharomyces cerevisiaeにおけるTTC染色機構に関する研究

Muhammad Reza Cordova

4443

4444

Study on macro and microplastics debris in Indonesian water: Current condition and problem

谷本, 連

4525

TANIMOTO, Ren

4526

- 1 - 
 
氏 名   谷 本  連 
学位（専攻分野の名称）   博 士（バイオサイエンス） 
学 位 記 番 号   甲 第 839号 
学位授与の日付   令和 3年 9月 30日 
学 位 論 文 題 目   体外培養系モデルによる哺乳類卵胞形成機構の解明
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農学） 小 川 英 彦 
               教 授・博士（畜産学） 尾 畑 やよい 
               教 授・博士（医学） 中 澤 敬 信 
                    医 学 博 士  小 川 毅 彦＊ 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
【背景・目的】 
卵母細胞形成は哺乳類では胎仔期に始まり，卵巣内で顆粒膜細胞，莢膜細胞といった体細
胞と共に卵胞と呼ばれる構造を形成し，相互に作用しながら卵母細胞は受精後の胚発生に必
要な母性因子を獲得する。顆粒膜細胞と莢膜細胞は卵母細胞へシグナル分子や物質を供給す
るほか，ホルモンの産生と授受により視床下部・脳下垂体と協調して卵胞の成長を制御する
機能を有する。そのため，機能的な卵母細胞を産生するには正常な卵胞形成が必須である。 
哺乳類では，生涯を通じて産生され続ける精子とは対象的に，卵母細胞は胎仔期に一斉に
減数分裂を開始し，増殖せず減少の一途をたどる。例えばヒト胎児では数百万個の卵母細胞
が存在するが，多くが死滅して出生時には数十万個まで減少し，排卵に至る成熟卵子はおよ
そ 500 個程度にとどまる。しかし，なぜ卵母細胞が死滅するのか，死滅する卵母細胞は選別
されているのかは不明であり，こうした現象に限らず，卵母細胞ならびに卵胞の形成過程に
ついては未解明な点が多い。これは，卵母細胞に数的な制限があること，また，哺乳類では
卵母細胞形成が胎仔期に始まるため，観察や操作が困難なことなどが一因している。卵子形
成の全過程を達成する体外培養系は，卵子／卵胞形成機構解明のツールとして，あるいは有
用動物の卵子資源の増産に貢献しうると考えられる。しかし，哺乳類では，体外培養で卵胞
形成を遂行することができず，卵胞形成期以降の卵巣／卵胞の体外培養系しか成功例がない。 
そこで本研究は，胎齢 12.5 日のマウス胎仔生殖巣を始点として培養を行った場合に卵胞
形成不全が生じる機構を解明するとともに，生体内において正常な卵胞形成が保証される機
構の追究を目的とした。 
 
 
 ＊横浜市立大学 大学院医学研究科 教授 
- 2 - 
 
【方法および結果】 
1. マウス胎仔卵巣の体外培養系における卵胞形成異常上流因子の特定 
始原生殖細胞（PGC）のみを含む胎齢 12.5 日（E12.5）マウス胎仔卵巣を単離し，10％ウ
シ胎子血清（FBS）添加 α-MEM（基礎培地）中で培養した。出生後 10 日（P10）の生体内
由来の卵巣では二次卵胞が多数存在したが，これに相当する day17 の培養卵巣内では，PGC
は卵母細胞に分化・成長しているものの正常な二次卵胞がほとんど形成されていなかった。
これらの卵巣では，1 つの卵胞に複数の卵母細胞が含まれる Multiple-Oocyte Follicle（MOF）
や，基底膜が球状に閉じておらず，多数の卵胞が房状に接続した異常な構造が大多数を占め
た。この形態的な異常の原因を探るため，卵胞形成が起こる前の day7 の培養卵巣と P0 マウ
スの卵巣のトランスクリプトーム解析を行った。その結果，発現している全 13,460 遺伝子
のうち，両者間の発現量に有意差があること（p < 0.05，t 検定），発現量を示す log2RPKM
が 5 以上であること，かつ両者間の発現量比を示す Fold Change が 3 倍以上であることの 3
条件を満たす 547 の発現変動遺伝子（DEG）を抽出した。これら DEG に共通する上流遺伝
子を検索するため，Ingenuity Pathway Analysis によるネットワーク解析を行った。その結果，
エストラジオール，SP1 および CTNNB1 と，いずれもエストロゲン受容体（ER）と相互作
用を有する因子が有意水準の高い上位 3 因子として挙げられた。このことから体外培養卵巣
では生体内と比較してエストロゲンレベルが異なることが卵胞形成不全の一因であると予
想された。そこで ER に対する阻害剤である ICI182780（ICI）を培地に 10 μM 添加したとこ
ろ，二次卵胞の形態が劇的に改善された。day17 において単離された二次卵胞数により卵胞
形成を評価したところ，ICI 無添加の基礎培地条件で卵巣あたり平均 2.7 個（n = 7）しか回
収されなかったのに対し，10 μM ICI 添加条件では平均 46.3 個（n = 6，p < 0.001）と大幅に
向上した。また FBS を使用せず，血清代替物 SPS を使用して培養したところ，平均 19.7 個
（n = 3，p < 0.05）の二次卵胞が回収され，ICI 添加条件には及ばないものの卵胞形成が改善
した。このことから，FBS 中に含まれるエストロゲンあるいはエストロゲン様物質が体外培
養卵巣における異常な卵胞形成の原因となっていることがわかった。 
 
2. 培養卵巣における卵母細胞シスト崩壊時期の特定 
PGC は卵巣内で不完全な細胞質分裂を伴う体細胞分裂によって増殖し，卵母細胞は互い
に細胞質が接続した卵母細胞シストという構造を形成する。卵母細胞シストは原始卵胞形成
に先立って崩壊し，卵母細胞同士の接続が失われた単一卵母細胞となる。そこで，培養卵巣
における二次卵胞の形成異常が卵母細胞シスト崩壊の進行の異常を伴っているか否かを解
析した。ICI 添加条件および基礎培地条件において，day7 から day13 の期間でホールマウン
ト蛍光免疫染色法により卵巣中の卵母細胞を抗 DDX4 抗体で標識した。全卵母細胞中の単
一卵母細胞の割合を計測した。その結果 ICI 添加条件では day10 で有意に単一卵母細胞の割
- 3 - 
 
合が増加し（n = 6，p < 0.05），以降もこの傾向が継続した。最終的に day13 では ICI 添加条
件では単一卵母細胞の割合は約 76％に達した一方で，基礎培地条件では約 48％に留まった
（n = 6，p < 0.05）。このことから ER の阻害は卵母細胞シスト崩壊の遅延を改善することが
明らかになった。以上により胎仔卵巣はエストロゲン感受性があり，エストロゲンシグナル
が卵母細胞シスト崩壊を遅延させることが明らかとなった。また，この遅延は異常な卵胞形
成の一因であると示唆された。 
 
3. 培養卵巣において卵胞形成異常をもたらす ER の同定 
 マウスでは ER として ESR1，ESR2 および GPER1 の 3 種類のタンパク質が報告されてお
り，ICI は ESR1 および ESR2 に対するアンタゴニストである一方，GPER1 に対するアゴニ
ストであることが知られている。これらの ER のいずれのシグナル経路が卵胞形成を阻害す
るのかを解明するため，それぞれに対する特異的アンタゴニストまたはアゴニストを用いて
卵胞形成を解析した。その結果 ESR1 に対する特異的アンタゴニスト（MPP）10 µM 存在下
で培養した場合に卵巣あたり平均 27.6 個（n = 5）の二次卵胞が回収され（基礎培地: 平均
2.7 個），卵胞形成が改善した（p < 0.05）。一方，ESR2 に対する特異的アンタゴニスト（PHTPP）
1 µM存在下またはGPER1に対する特異的アゴニスト（G-1）1 µM存在下で培養した場合は，
それぞれ卵巣あたり平均 5.3 個（n = 4）および 12.7 個（n = 3）しか二次卵胞が回収されず，
基礎培地を用いた場合と比較して有意な上昇は認められなかった（p > 0.05，p 値はダネット
検定による）。以上のことから，培養卵巣における卵胞形成の異常は主に ESR1 を介して生
じることが明らかとなった。 
 
4. 培養卵巣において卵胞形成異常を引き起こすエストロゲン標的因子の同定 
4-1. 培養卵巣において顕著な発現異常を引き起こす遺伝子の検証 
前述のトランスクリプトーム解析で得られたDEGについて，Gene Ontology解析を行った。
その結果，「gonad development」といった生殖巣形成に関係する 3 種類のタームが有意に濃
縮された。これらのタームに含まれる遺伝子のうち，最も発現変動幅の大きかった Amh（培
養卵巣で生体由来卵巣の約 11 倍高い）に着目し，遺伝子発現解析を行った。ICI（ESR1 お
よび ESR2 に対するアンタゴニストかつ GPER1 に対するアゴニスト），MPP（ESR1 特異的
アンタゴニスト），PHTTP（ESR2 特異的アンタゴニスト）または G-1（GPER1 特異的アゴ
ニスト）存在下で培養した卵巣から day7 で total RNA を抽出し，Amh の遺伝子発現量を
qRT-PCR 法で解析した。その結果，ICI，MPP，PHTPP，または G-1 を添加した場合に，Amh
の発現量は基礎培地条件のそれぞれ，22％，45％，94％または 88％となり，ICI または MPP
を添加した場合に有意に抑制された（p < 0.001，ダネット検定）。さらに興味深いことに，
これらの Amh の発現量は，それぞれの条件で培養した場合の二次卵胞回収数と高い負の相
- 4 - 
 
関を示した（R2 = 0.973，p = 0.0015，ピアソンの積率相関分析による）。次に AMH タンパク
の発現をホールマウント免疫蛍光染色法により経時的に解析した。基礎培地で培養した卵巣
では生体の P0 に相当する day7 に AMH が発現を始めており，生体由来の卵巣に比べ 6 日以
上の早期化が認められた。AMH は卵母細胞周囲に存在する前顆粒膜細胞または顆粒膜細胞
で発現していることが明らかになった。一方，ICI 添加条件では AMH の発現早期化が大幅
に改善され day11 以降で発現が認められた。 
4-2. AMH が卵胞形成に及ぼす影響の解析 
 AMH が異常な卵胞形成を誘導するかどうかを検証するため，10％SPS 添加 α-MEM にリ
コンビナントヒト AMH を添加して卵胞形成を評価した。その結果，AMH 濃度依存的に卵
胞形成は阻害された。AMH 無添加条件で卵巣あたり 22.6 個の二次卵胞が回収されたのに対
し，100 ng/ml および 500 ng/ml AMH 添加条件では，それぞれ，卵巣あたり 10.6 個（p < 0.05）
および 2.2 個（p < 0.001）の二次卵胞しか回収できなかった（p 値はダネット検定による）。
したがって AMH は卵胞形成を阻害することが明らかになった。 
4-3.ER の Amh への結合の検証 
ESR1 が Amh の発現を制御しうるかを検証するため，抗 ESR1 抗体を用いた ChIP-qPCR を
実施した。ESR1 と Amh プロモーターおよびポジティブコントロールとして ESR1 と Greb1
プロモーターとの相互作用を定量した。その結果，day9 の培養卵巣では同時期の P2 マウス
の卵巣に比べ，ESR1 が Amh プロモーター領域に約 4.5 倍，Greb1 プロモーター領域に約 7.1
倍それぞれ有意に集積していた。したがって培養卵巣では ESR1 が Amh プロモーターに濃
縮して結合していることが明らかとなり，Amh の転写を直接制御していることが示唆された。 
以上より E12.5 マウス胎仔の卵巣を始点とした培養卵巣では，FBS に含まれるエストロゲ
ンまたはエストロゲン様物質を ESR1 が受容し，ESR1 が Amh の転写を誘導すること，さら
に前顆粒膜細胞における day7 以前の異常に早熟な AMH の発現が卵胞形成不全を誘導する
ことが示された。 
 
5. 生体内において卵胞形成時にエストロゲンシグナルを制御する候補因子の同定 
これまでの解析から培養に用いた FBS 中にエストロゲンが含まれ，これによって卵胞形
成が阻害されると推察された。そこで FBS 中のエストロゲンを LC/MS 法により定量した。
その結果，代表的なエストロゲンであるエストロン，エストラジオールおよびエストリオー
ルに加え，植物エストロゲンであるゲニステイン，ダイドゼンおよびクメエステロールが
0.9 – 21.9 pg/ml の濃度で検出された。既報ではマウス胎仔血中エストラジオール濃度は
E17.5 に最大約 200 pg/ml で循環しており，出生後に急速に濃度が低下するとされる。これ
に比して培地中のエストロゲン濃度は意外にも低かった。つまり培養卵巣は非常に高いエス
トロゲン感受性を有すると考えられた。そこで qRT-PCR 法による Esr1 の発現解析を行った
- 5 - 
 
ところ，Esr1 の発現量は培養卵巣よりもむしろ生体由来卵巣で 30％程度高く，新生仔卵巣
でも同等以上のエストロゲン感受性を有すると推測された。胎仔血中には母体および胎盤で
産生されたエストロゲンが循環しているはずであり，生体内の卵巣で AMH の発現が誘導さ
れない理由は不明であった。ここで，生体内ではエストロゲン感受性を低下させる機構が存
在していると仮説を立て，エストロゲン結合能を有する α-フェトプロテイン（AFP）に着目
した。AFP は胎仔の肝臓および卵黄嚢で一過性に発現するアルブミン様のタンパク質で，胎
仔血漿タンパク質の主要な成分である。エストロゲン要求性細胞株 MCF7 では培地に AFP
を添加することで増殖が抑制されることが知られている。このことから AFP は血中のエス
トロゲンを中和する能力があり，卵巣へのエストロゲンシグナルを遮断していると考えた。
そこで基礎培地に 18 μg/ml の濃度で AFP を添加して胎仔卵巣を培養したところ，Amh の発
現量が約 1/3 に抑制され（p < 0.05，t 検定），さらに卵巣あたり約 23.2 個の二次卵胞が回収
され，卵胞形成が改善した（p < 0.001，基礎培地: 約 2.8 個）。これらの結果から，培養卵巣
において AMH の早期発現ならびに卵胞形成異常が誘導される理由は，AFP のような卵巣外
で産生されるエストロゲンシグナルを遮断する分子が欠けているためであると考えられた。 
 
【総括および考察】 
本研究では，E12.5 胎仔卵巣を培養した場合，エストロゲンシグナル下流遺伝子の発現が
変動すること，また ESR1 を介して Amh が早期に発現すること，AMH は卵胞形成を阻害す
ることが明らかになった。さらに抗エストロゲン作用を有する化学物質や生体内で生理活性
を有する AFP を培地に添加することで卵胞形成が回復することが示された。1940 年代より，
妊娠中の母親が高濃度のエストロゲンに暴露されることで生まれてくる子の生殖系列に異
常が生じることが知られてきたが，その作用機序は全く明らかにされてこなかった。本研究
では，卵胞形成異常を誘導するエストロゲンシグナルパスウェイの一端が解明された。また，
体外培養系をモデルとして，マウス胎仔血中には生理的なレベルでエストロゲンが循環して
いるが，AFP がエストロゲンと強力に結合してエストロゲンシグナルを遮断し，卵巣が保護
されていると推察された。この仮説の検証は今後の課題として残されたが，本研究で確立さ
れた体外培養系が，生体内における卵母細胞および卵胞の形成過程の統合的な理解に繋がる
ことが期待される。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
卵子形成の全過程を達成する体外培養系は，卵子／卵胞形成機構解明のツールとして，あ
るいは有用動物の卵子資源の増産に貢献しうる。しかし，哺乳類では，体外培養で卵胞形成
- 6 - 
 
を遂行することができず，卵胞形成期以降の卵巣／卵胞の体外培養系しか成功例がない。本
研究では，マウス胎仔生殖巣を始点として培養を行った場合に卵胞形成不全が生じる機構を
解明するとともに，生体内において正常な卵胞形成が保証される機構の追究がなされた。そ
の結果，培養卵巣における卵胞形成異常は，エストロゲン受容体 ESR1 を介して顆粒膜細胞
で Amh/AMH の異常な早期発現を誘導すること，これによって卵母細胞シスト崩壊遅延を伴
う卵胞形成異常を生じることが明らかとなった。一方，生体内では血中を循環するエストロ
ゲンを AFP が中和することで正常な卵胞形成が保証されている可能性が示唆された。哺乳
類では胎生期の高濃度エストロゲン暴露が，出生後の雌性生殖系列に異常をもたらすことが
古くから知られていた。本研究では，エストロゲンの下流で卵胞に異常が生じる機構の一端
が初めて明らかにされた。また，ESR1 の遮断によりマウス胎仔生殖巣の体外培養で卵胞形
成を遂行することが可能となった。発表会では，研究意義，命題の立証，考察が十分に説明
されており，研究成果は生殖生物学分野に資すると認められたことから，審査員一同は谷本
連氏に博士（バイオサイエンス）の学位を授与するに相応しいと判断した。 


体外培養系モデルによる哺乳類卵胞形成機構の解明

DENIS PASTORY, RUBANGA

4396

4397

Integration of ICT and Artificial Intelligence Techniques to Enhance Tomato Production

SARVESH, MASKEY

4394

4395

Approaches for Enhancing Composting Process of Farmyard Manure in Dhankuta District, Nepal

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